TOMA DE MUESTRAS Y LABORATORIO EN INFECCIONES ORALES

TEMARIO: CONSIDERACIONES

Infecciones asociadas :

Agentes asociados:

Metodología de búsqueda etiológica

Identificación y susceptibilidad

INFECCIONES

Manifestaciones orales de enfermedades sistémicas

Locales: Caries

Periodontitis

Ulceras orales

Candidiasis

Actinomycosis

Tuberculosis y otras

AGENTES

Porphyromonas gingivalis*

Tannerella (Bacteroides) forsythia

Aggregatibacter actinomycetencomitans*

Streptococcus spp (hasta nivel especie)

Etc etc

Dificil identificación

BACTERIAS - TINCION DE GRAM

POSITIVAS NEGATIVAS

COCACEAS BACILOS COCACEAS BACILOS

En racimo:

Staphylococcus spcoagulasa: (+) S. aureus (-) S. coag. neg. S. saprophyticus S. epidermidis

Tetradas:Micrococcus sp

En pares o cadenas:

Enterococcus sp

Streptococcushemólisis: () S. pneumoniae () S. viridans () muchas () S. pyogenes (A) () S. agalactiae (B) () S. grupo C (mitis) () S. grupo D (bouis) () S. grupo F () S. grupo G

Otros:

PeptoestreptococcusPeptococcusLeuconostocAerococcusLactococcusPediococcus

Difteromorfos:

CorynebacteriumPropionibacterium*

Grandes, con esporas:

Clostridium*Bacillus

Ramificados:NocardiaActinomyces*

Otros:ListeriaLactobacillusMicobacterias

Diplococos:NeisseriasBranhamella

Cocaceas anaer:

Veionellas*

Cocobacilos:

AcinetobacterKingellaPasteurellaBrucella

Enterobacterias: Fermentan glucosa Oxidasa -L(+): E. coli K. pneumoniae Enterobacter sp Citrobacter spL(-): Proteus sp Providencia sp Serratia sp Morganella sp Salmonella** Shigella** Yersinia**

No fermentadores:Acinetobacter spPseudomonas spAlcaligenes spFlavobacterium spStenotrophomonas Burkholderia sp

Fastidiosos:Haemophilus spAggregatibacterCardiobacteriumEikenellaKingellaCapnocytophagaBordetella

Fermentadores glucosa Oxidasa +Vibrio**Aeromonas**

Otros:Bacteroides*Fusobacterium*Prevotella*

* Anaerobios** Enteropatógenos

Medicina

EXÁMENES

Generales :

Hemograma

Proteina C Reactiva/VHS

Hemocultivos

Locales:

Gram /Cultivo tejido corriente/hongos

Reacción polimerasa en cadena

Sospecha de infección sistémica: derivar para manejo conjunto con

infectologos

DILEMAS

Dificultades de carácter técnico :1. Muestra no exenta de contaminación con fluido

oral y/u otro contaminante2. Medios de cultivo óptimos para el desarrollo de

los verdaderos patógenos no siempre disponible3. Identificación precisa de ellos limitada

1. Bioquímica tradicional

2. Bioquímica comercial (semi/automatizada)

3. PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

4. Determinación de susceptibilidad (no) estandarizada para todos.

5. Susceptibilidad in vitro v/s biopelículas

Microbiología endodóntica: últimos avances.

Rev. Estomatológica visión dental Vol9 N°3 2006 Lima Peru.

Luis Chavez de Paz, U. de Malmö, Suecia.

METODOLOGÍAS

1. Cultivo Ampliamente distribuido en laboratorios clínicos Identifica y apoya con determinación de susceptibilidad Tiempos de espera entre 48 a 96 hrs o más si se incluyen

anaerobios (7 días). Requiere conocimiento de microbiología oral para hacer

dgco apropiado… laboratorios de hospitales no preparados para ello!

Identificación limitada a métodos utilizados: Clásico (batería bioquímica): generalmente hasta género en

muchos patógenos orales Semi-automatizado: regular concordancia, requiere

confirmaciones (ej. galerías API) Automatizado: buena concordancia, algunas especies no

posible identificar

METODOLOGÍAS

2. Biología molecular Limitado a laboratorios especializados y algunos

adicionados a laboratorios clínicos de rutina Métodología que permite identificar la mayor

diversidad bacteriana en boca Métodos diversos a revisar:

PCR tiempo real PCR multiple Identificación por ARNr16S Arrays

QUÉ ES LA BIOLOGÍA MOLECULAR O PCR

El proceso de detección de un agente infeccioso por amplificación genética se desarrolla de manera habitual en tres etapas:

1° Extracción y purificación de los ácidos nucleicos del microorganismo de la muestra biológica

2° Amplificación de un segmento seleccionado del genoma del microorganismo mediante reacción en cadena de la polimerasa, es decir, la PCR propiamente dicha.

3° Detección de los fragmentos amplificados en la PCR (amplicones) por electroforesis en gel de agarosa o mediante hibridación con sondas específicas. En general todo este proceso suele durar aprox 24 h .

PCR TIEMPO REAL

Los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la

amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.

Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación.

Al ser simultánea se acortan los tiempos. Promedio 50 minutos. .. Puede ser múltiple además.

PCR MULTIPLE

Reacciones que consiguen amplificar simultáneamente y en un único tubo diferentes secuencias diana, permitiendo la detección e identificación simultánea de distintos genes de interés.

Usos en dgco de sindromes clínicos como neumonia comunitaria, meningitis, etc.

ARRAYS

Los chips o arrays de ADN son una serie de sondas de ADN unidas a un soporte sólido en una disposición regular y prefijada.

El ácido nucleico diana que será detectado puede ser ADN o ARN y previamente a la hibridación debe ser marcado con una sustancia fluorescente o radiactiva.

La principal ventaja con respecto a PCR es que pueden detectarse en un único procesamiento miles de genes. Investigación de la patogenia bacteriana análisis de la evolución bacteriana y epidemiología estudio de los mecanismos de acción y de resistencia de los

antibióticos diagnóstico microbiológico de las enfermedades infecciosas.No disponible

clinicamente

ANÁLISIS DEL ARN RIBOSOMAL 16 S

Molécula muy antigua, presente en todas las bacterias actuales.

Estructura y función constantes durante un tiempo muy prolongado, de modo que las alteraciones en la secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios .

El tamaño relativamente largo de los ARNr 16S (1.500nt) minimiza las fluctuaciones estadísticas.

Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los ADNr 16S existen bases de datos amplias, en continuo crecimiento que se compara con lo obtenido

Directo de cultivo puro o de muestra tejido/fluido estéril.Útil en no cultivables o emergentes.

LIMITACIONES BIOLOGÍA MOLECULAR

No disponible en laboratorios clínicos generales

Identifica MO vivos y muertos

No posible relacionar rol patógeno

No reproducible en cultivo

No permite determinación susceptibilidad

Riesgos contaminación toma muestra y procesamiento

Patógeno único? --- PCR múltiple? ---numerosas PCR?

Identifica con mayor precisión y rapidez

Permite cuantificar

PCR DISPONIBLES

TOMA DE MUESTRAS

Preparación:

Reunir material, realizar órdenes de exámenes, etiquetar tubos.

Higiene de manos y colocación de guantes (precauciones estándar que puede incluir gafas y mascarilla).

4 manos

TOMA DE MUESTRAS

Sitio exacto de la lesión No poner en contacto con antisépticos Rápido Idealmente aspirar abscesos cerrados por punción o

raspado, cureta (preferir por sobre hisopado) o trozo tejido biópsico (sin preservantes).

Previo a inicio de tto ATB (idealmente). Inocular en medio de transporte aerobio/anaerobio Transporte t° ambiente inmediato (excepto virus 4°C)

DERIVACIÓN SEGÚN AGENTE BUSCADO

VIRUS: DETECCIÓN DIRECTA

detección elemento viral directamente desde la muestra (fase aguda 5-7 días)

frotar con fuerza mucosa para desprender células infectadas con hisopo. Conservación 4°C hasta 48 hrs o 7 días a -70°C.

Microscopía óptica+tinción: visualización de él en células humanas por técn.inmunológicas (IF), enzimas (ELISA) o isótopos radiactivos (RIA). No disponible virus orales.

Cultivo viral: cultivos celulares en forma de monocapas a partir de tejidos animales o humanos. Detección viral se efectúa por

1. Efecto citopático o su neutralización con sueros con Ac frente al virus sospechado.

2. Adición de Ac para detección mediante inmunoflurorescencia (identifica Ag). Shell vial.

3. Biología molecular.

VIRUS

PCR para los virus sospechados desde

muestra o cultivo viralDisponible toda la

familia HerpesVHS 1 y 2

VVZCMVVEB

HHV-6 y 8Echo

Coxsakie

Celulas no infectadas de riñón de conejo

Celulas infectadas de riñón de conejo

VHS-1

HONGOS

1. Cultivo hongos (toma y transp similar a bacterias) Filamentosos: lento crecimiento. Levaduriformes: rápido crecimiento, contaminantes/flora

v/s patógenos. Ojo con: dermatofitos, dimórficos como Histoplasma (no

forman parte de la rutina de laboratorios) Metodología:

Siembra en agar sabouraud c/s CAF Morfología colonias, micromorfología. Levaduras: medios cromógenos, galerías identificación: API,

ID 32C; Sistemas automatizados: Vitek . Filamentosos: morfología colonia, tinción de colonia con

azul de lactofenol-

CHROMagar Candida. C. albicans ATCC 90028 (arriba)C. krusei ATCC 6258 (derecha)C. glabrata (abajo), C. tropicalis (abajo izq)C. parapsilosis ATCC 90018 (arriba izq)

Candida krusei

BACTERIAS

1. Cultivo corriente: Siembra en medios sólidos enriquecidos y diferenciales

(ASC-ACH-MC) y caldos (tioglicolato). Adicionar anaerobios si lo solicitan y muestra no está

aireada. Identificación a nivel especie solicitada.

2. Antibiograma: La mayoría de los lab: difusión con disco, insuficiente

para estomatología. Requerido por tipo de patógenos orales: CIM dilución

o bien E test por difusión.

IDENTIFICACION BACTERIANA

Identificación automatizada: sistema Vitek Alrededor de 94% identificación especies cocáceas Bajo nivel discriminación en alrededor 5% Menos 1% sin identificar Además incluye susceptibilidad con CIM Optimo para laboratorios clínicos no moleculares.

SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA

1. Susceptibilidad por difusión en agar:1. Con discos2. E-test (CIM)

2. Susceptibilidad por dilución1. En placa (agar)2. En caldo (tubos)3. Microdilución

SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA

1. Susceptibilidad por difusión en agar:1. Con discos2. E-test (CIM)

2. Susceptibilidad por dilución1. En placa (agar)2. En caldo (tubos)3. Microdilución

ANTIBIOGRAMA: NORMA CLSI

1. ANAEROBIOS: CIM1. Beta lactámicos sólos y en combinación2. Lincosamidas (clindamicina)3. Carbapenémicos4. Quinolonas (moxifloxacino)

2. STREPTOCOCCUS no beta hemolíticos (CIM)1. Penicilina 2. Cefalosporinas 3° gen3. Lincosamidas (discos)4. Quinolonas (discos)

3. Otros: de acuerdo a la rutina de laboratorio

CONCLUSIONES

Diagnostico de laboratorio de infecciones estomatológicas limitado a:

Automatización y tecnologías del Laboratorio

Conocimiento de patógenos orales de profesionales del laboratorio

Solicitud expresa de búsqueda de patógenos puntuales por odontólogos

Comunicación directa entre ellos oportuna

Toma de muestra de buena calidad

Gracias