ENZIMAS (SÓLO PARA INGENIERÍA AMBIENTAL)

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Las enzimas son proteínas especializadas en la catálisis de conversiones

químicas cuya acción puede tener lugar in vivo e in vitro. Al igual que el resto de

las proteínas, su función es óptima bajo ciertas condiciones, por lo que un pH

extremo (ácido o básico) o un calentamiento pronunciado las puede desnaturalizar

o destruir, o bien inducir en ellas un cambio conformacional que las desactive total

o parcialmente. Su actividad se ve afectada también cuando un inhibidor las

acompaña (ver más adelante). Las enzimas incorporan a un sustrato (la molécula

a transformar o reactivo) en una parte de su estructura llamada sitio activo o

dominio de la enzima, donde sufren la transformación química de manera

acelerada. Las enzimas no modifican cambios en el contenido en G ni de sustratos

ni de reactivos; tan sólo se limitan a abatir el valor de la energía de activación del

proceso en el que participan.

Por el tipo de reacción que catalizan (aunque este agrupamiento puede

variar de autor a autor), a las enzimas se les clasifica en:

. Enzimas que catalizan una oxidación o una reducción.

Un ejemplo es la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, que cataliza la

oxidación del carbonilo del gliceraldehido-3-fosfato 1 (el sustrato) a 1,3-

difosfoglicerato 2:

H O

OHH

O P

O

OO

O O

OHH

O P

PPi

NADH + H+NAD+

1 2

En esta reacción el NAD (3, siguiente página), el dinucleótido de adenina y

nicotinamida, es el agente oxidante (la enzima no se oxida; sólo hace que los

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componentes se reúnan en el sitio activo de la enzima). A este tipo de sustancias

auxiliares que intervienen directamente en la conversión química a menudo se les

conoce como coenzimas. La estructura del NAD es bastante compleja, pero la

parte que interviene directamente en el proceso redox es la del anillo de piridinio,

el cual acepta el hidrógeno de 1 en rojo en forma de anión hidruro (esto es, con

todo y el par de electrones, H:-) para que proceda la oxidación del carbono al que

se encuentra unido. En esta transformación no se genera anión hidruro libre, sino

que concertadamente se cede éste del sustrato al NAD, como se representa a

continuación:

N

H

NH2

O

O

OH OHO

POO

OP

O

OO

O

OH OH

N

N

N

N

NH2

3

N

H

NH2

O

O

OH OHO

POO

OP

O

OO

O

OH OH

N

N

N

N

NH2

4

HH

O

H2O

HO

OH H

O

OH

H

1

5

3 se transforma en 4, el NADH, la forma reducida del NAD. El oxígeno del agua en

azul es el que quedará formando parte de la estructura del producto oxidado 5, el

cual se fosforila con anión fosfato del medio para transformarse finalmente en 2. A

un anión fosfato de esta naturaleza los bioquímicos lo denominan “fósforo

inorgánico”, y lo representan mediante Pi:

HO O

OHH

O P

O

OO

O O

OHH

O P

PPi

1 2

O P

O

O

OH

O O

OHH

O P

P

O

O

OH OH+

¡puede estar o no protonado!

O

OO

Regresando a la reacción donde interviene el NAD+, advierte que se ha

liberado un protón de color azul, H+, proveniente del agua. Ésta es la esa razón

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3

por la que los bioquímicos representan indiscriminadamente las interconversiones

entre 3 y 4 como NAD+ NADH + H+, independientemente de si le es claro al

lector de dónde proviene el protón o no. Como colofón, mencionaremos que el

color rosa en los hidrógenos así marcados en 3 y 4 pueden ser reemplazados por

un grupo fosfato; en estos casos, se habla entonces del NADP+ y del NADPH

como los agentes involucrados en el proceso redox.

. Enzimas que catalizan una transposición o reacomodo de átomos

(el sustrato se transforma en un isómero). Un ejemplo es la metilmalonil coenzima

A isomerasa, que cataliza la migración de un grupo carboxilato de la metilmalonil

coenzima A (6) a un carbono contiguo para transformarse en succinil coenzima A

(7), proceso mediado por la coenzima B12 a partir de la cual se generan radicales

libres intermediarios.

CH3

HCH2

HH

SCoA

O

O

SCoAO

O

O*

coenzima B12

O

*

6 7

donde SCoA = coenzima A:

. Enzimas que catalizan la hidrólisis de un enlace en el sustrato. Un

ejemplo es la lactasa, que transforma la lactosa 8 en galactosa 9 y glucosa 10:

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4

8 9 10

O O

OOHOH

OH

HOHO

OH

OH

OH O O

O

OHOH

OH

HOHO

OH

OH

OHOH

+

enlace que se rompe

H-OH

H

En esta representación, el enlace en rojo aparece “quebrado” para facilitar la

comprensión de la estereoquímica de la unión glucosídica.

. Enzimas que catalizan reacciones en las que un cierto grupo

funcional es incorporado a la estructura del sustrato. Un ejemplo es la

hexoquinasa (o hexocinasa, según algunos autores españoles), que transforma la

glucosa 10 en glucosa-6-fosfato 11:

O

OH

HO

OH

OH

OH

ATP ADP + H+

O

OH

PO

OH

OH

OH

10 11

donde

ATP = adenosintrifosfato ADP = (adenosindifosfato)

Es posible reconocer en este punto que en la transformación de 5 a 2 hay también

una fosforilación, por lo que la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa puede ser

concebida también como promotora de la actividad de una transferasa,

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. Enzimas que catalizan la ruptura de un enlace. Un ejemplo es la 4-

hidroxifenilacetato descarboxilasa, que transforma el p-hidroxifenilacetato 12 en p-

cresol 13 escindiendo el enlace en rojo y liberando CO2:

HO

O

O+ H

HO

C

O

O

+

H H

12 13

H H

H

. Enzimas que catalizan la formación de un enlace. Un ejemplo es la

piruvato carboxilasa, que transforma el piruvato 14 en oxaloacetato 15. Advierte la

hidrólisis del ATP, proceso que promueve energéticamente la reacción.

O

O

O

O

O

OO

OC

O

O

+

ATP ADP + PiH

14 15

La actividad catalítica

enzimática puede entenderse

a partir de la gráfica de la

derecha, la cual muestra cómo

varía la velocidad o rapidez

inicial de conversión vi de una

cierta reacción en función de

la concentración de sustrato

presente [S], en condiciones

de trabajo ideales para la

enzima Es importante que

adviertas que cada punto de esta curva tuvo que ser obtenido midiendo vi en una

corrida experimental, o lo que es lo mismo, se tuvo que desarrollar una corrida por

cada punto de la curva. Una manera en la que puede hacerse esto consiste en

determinar cada vez qué tanto producto se ha formado luego de permitir que la

vi

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reacción transcurra durante un cierto tiempo (regularmente corto) a diferentes

concentraciones de sustrato. La formación de producto se estima así como

proporcional a vi. Los tiempos son cortos porque se supone que al inicio de cada

corrida experimental la enzima mostrará su capacidad máxima de conversión,

independientemente de la cantidad de sustrato que haya presente; si se mide

haciendo uso de tiempos de reacción largos para cada corrida, se corre el riesgo

de introducir variables indeseables, como reducción de la rapidez de reacción al

alcanzarse la posición de equilibrio conforme el tiempo avanza.

El alemán Leonor Michaelis y la canadiense Maud Leonora Menten,

expertos en el tema de la cinética enzimática, dan nombre a la ECUACIÓN DE

MICHAELIS Y MENTEN, que explica el comportamiento de la curva mostrada. La

ecuación indica que vi es función, además de la concentración del sustrato [S], de

otros dos parámetros:

vmáx, que define la mayor rapidez de conversión

que puede alcanzar la reacción en presencia de

la enzima.

Km, que es la concentración del sustrato a la que

se alcanza un valor de rapidez de conversión

igual a la mitad de vmáx.

La información se interpreta como sigue. En el punto

C de la curva el valor de [S] es grande, por lo que la

enzima tiene siempre disponible sustrato que

transformar. Así pues, la rapidez de la reacción estará

limitada únicamente por la capacidad de la propia

enzima para efectuar el trabajo catalítico. En este punto,

[S] >> Km, por lo que

En el punto A la concentración de sustrato [S] es escasa

(Km >> [S]), por lo que puede ahora escribirse:

Dado que vmáx y Km son constantes, su relación k

Leonor Michaelis (1875-1949, arriba) y Maud Leonora Menten (1879-1960, abajo).

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también lo es. Ello implica que a concentraciones bajas de sustrato, un aumento

en la concentración de éste inducirá un cambio en la rapidez de reacción

proporcional a k. Nos obstante, esta tendencia lineal irá desapareciendo poco a

poco, y grandes aumentos en la concentración de sustrato no verán reflejada un

aumento en la vi sustancial. y al llegar por ejemplo al punto B, donde [S] = Km

De curvas como la anterior mucha de la información cuantitativa que sería

posible extraer no resulta evidente, por lo que se acostumbra tratar los datos

experimentales de otra manera. Si se saca el inverso a la ecuación de Michaelis y

Menten se obtiene

separando términos

llegamos a

(

)

Si se grafican los valores experimentales obtenidos colocando 1/vi en el eje de las

“y” y 1/[S] en el de las “x” se obtiene una gráfica lineal en la que la pendiente será

Km/vmáx y la ordenada al origen 1/vmáx. La gráfica tiene el siguiente aspecto:

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A esta gráfica se le llama a veces DIAGRAMA DE DOBLE RECÍPROCO DE LINEWEAEVER-

BURK.

Un análisis cinético con esta gráfica puede distinguir om poner en evidencia

si una cierta sustancia ejerce una INHIBICIÓN COMPETITIVA o una INHIBICIÓN NO

COMPETITIVA. En la inhibición competitiva una sustancia presente en el medio

reactivo compite por el sitio activo de la enzima con el sustrato. Regularmente se

trata de sustancias con una considerable similitud estructural; por ejemplo, la

succinato deshidrogenasa es una enzima que deshidrogena al succinato 16 y lo

transforma en fumarato 17:

H

HH

H

HO

O

OH

O

- 2 H

H

H

O

O

O

O

16 17

Sin embargo, su actividad se ve disminuida por la presencia en el medio de

malonato 18, que guarda una considerable similitud estructural con el anión

succinato y que muestra también afinidad por el mismo sitio activo:

OO

OO

18

Por su parte, en la inhibición no

competitiva el inhibidor no compite por

el sitio activo de la enzima, sino que se

instala o une en otra región de la

enzima induciendo cambios (por

ejemplo conformacionales) que

modifican su estructura secundaria,

terciaria o cuaternaria, impidiéndole

funcionar normalmente.

Una gráfica de Lineweaver-Burk

como la de la izquierda muestra

claramente los efectos de ambos

fenómenos. Como es una gráfica de

doble recíproco, puede seguirse

interpretando como si fuese una gráfica de vi vs. [S]. En el sistema sin inhibidor

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(línea roja) la pendiente es positiva ya que, conforme aumenta [S] aumenta

también vi, aplicando lo mismo para sus recíprocos (si aumenta un inverso,

también lo hace el otro). En ambos casos, una inhibición dará lugar a gráficas con

una pendiente más positiva porque las rapideces iniciales vi y vi serán menores

para la misma concentración de sustrato [S], siendo entonces sus recíprocos 1/vi y

1/vi mayores consecuentemente (una línea vertical cruzará de abajo arriba antes

la línea roja que la verde y la azul).

Los valores de 1/vmáx coinciden en el caso de la línea roja y la verde porque

en ese punto, 1/[S] alcanza su valor mínimo, lo que implica que [S] sea máximo.

Un sistema bajo tales condiciones estaría conformado por una cantidad de

inhibidor muy pequeña en relación a la cantidad de sustrato presente. De esta

manera, el inhibidor no representaría competencia efectiva para el sustrato por el

sitio activo de la enzima, y el sistema se comportará como si el inhibidor se

encontrase ausente. La inhibición sólo se vuelve importante cuando [S] disminuye,

que es lo que se observa cuando se analiza la gráfica hacia su parte derecha (a

valores de 1/[S] elevados).

El inhibidor no competitivo desactiva a la enzima para la reacción a

cualquier concentración del sustrato, por ello la curva azul siempre supera a la

roja. Esto queda de manifiesto por un mayor valor de 1/vmáx, que implica una

menor rapidez vmáx cuando el inhibidor se halla presente; lo anterior es aplicable

en todo el intervalo de 1/[S]. Aquí, lo que se está afectando es la enzima completa,

y por ende, su funcionamiento general. Sin embargo, al no competir por el sitio

activo, el inhibidor competitivo no afecta el valor de Km (por ello coinciden en la

parte de abajo del sistema), dado que este valor está más bien relacionado con la

capacidad de la enzima para unirse al sustrato, Los inhibidores no competitivos lo

que afectan es la eficiencia de la enzima para transformar el sustrato en producto,

que se ve reflejado más bien en el valor de vmáx.