Test de activación de basófilos en el diagnóstico in...

Test de activación de basófilos en el diagnóstico

in vitro de la alergia a medicamentos

María Luisa Sanz Larruga

Departamento de Alergología e Inmunología Clínica

Clínica Universidad de Navarra

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

6.7% de los pacientes hospitalizados

0.32% reacciones fatales

6 -10% mediadas por mecanismos inmunológicos: reacciones alérgicas.

R Gruchala J Allergy Clin Immunol 2003;111:S548-59.

Reacciones adversas a medicamentos

Problema de salud

Alta morbimortalidad

14.7% de los pacientes de la consulta de Alergología

(3ª causa de consulta)

Reacciones inmediatas 65% de los casos

PM Gamboa. Alergológica 2005


Problemas en el

diagnóstico

Reacciones alérgicas a medicamentos

¿qué fármacos que puede

tolerar el paciente?

Limitaciones en el

tratamiento tras la retirada

del fármaco implicado

¿es una reacción alérgica?


-Los mas frecuentes:

Antibióticos

Antiinflamatorios

Antibióticos AINES

Otros

Anticonvulsivantes

Agentes

quimioterapeúticos

Heparina

Insulina

Protamina

Modificadores de la

respuesta inmune

Cualquier medicamento puede inducir una

respuesta alérgica... Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Inmediatas

-Periodo de latencia

- <1 hora

-Mecanismo inmunológico

- Hipersensibilidad

tipo I (IgE).

Reacciones de hipersensibilidad a medicamentos:

Clasificación clínica

No inmediatas

-Periodo de latencia:

horas- semanas

-Mecanismo inmunológico

-Hipersensibilidad

- tipo II,III, IV


Diagnóstico en alergia a fármacos

Establecer la relación causa-

efecto

Identificación del fármaco

causante de la reacción


In vivo

Pruebas cutáneas:

Prick

ID

Pruebas de provocación

Gold estándar

Riesgo!!

Pruebas serológicas:

- IgE específica

-Triptasa

Pruebas Celulares: pruebas de provocación ex vivo

-Test de Activación de Basófilos (TAB)

-Producción de sulfidoleukotrienos (sLT)

-Test de Liberación de Histamina (TLH)

In vitro

Diagnóstico in vitro de reacciones a fármacos de tipo inmediato Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

ImmunoCap (Thermofisher)

Immulite (Siemens)

Hytec-288 (Hycor)

Medicamentos disponibles

Peniciloil G

Peniciloil V

Ampiciloil

Amoxiciloil

Cefaclor

Clorhexidina

Quimopapaina

Gelatinas

Insulina humana y porcina

Folcocina

Suxametonio

SE 12.5-50%

ES >85% para BL

Determinación IgE esp Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Test de Activación de Basófilos (TAB)

en el diagnóstico in vitro de

alergia a fármacos


1879- Descrito en

humanos por Paul Ehrlich

Basófilo

Célula efectora de la

respuesta inmune Th2


Marcadores

identificación:

CCR3+(CD193)/CD3-

CD123+/HLA-DR-

IgE+/CD203c+

CRTH2+

• Identificación celular

• Ac monoclonales-

fluorocromos

Marcadores activación:

CD63

CD203c

p38 MAPK fosforilación

CD300

Citometría de flujo Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Publicaciones sobre TAB 1990 - 2014

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

19901992

19941996

19982000

20022004

20062008

20101990 1995 2000 2005 2010 2014


Ebo DG et al.

Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future

perspectives. Allergy, 2006: 1028-1039

CD63 CD203c

CD63 CD203c

Gp53 – LAMP-3 E-NPP3

Basófilos sin estimular: no

Basófilos sin estimular: si

Basófilos, monocitos, plaquetas

Solo basófilos

No- IL3 inducible

IL3- inducible

Act Max: 25-30 min

Act Max: 10-20 min

Associated to mediator release

No asociados a liberación de mediadores

Marcadores de activación de basófilos

Gp53 – LAMP-3

No- IL3 inducible

Act Max: 25-30 min

Asociados a liberación de mediadores


Ebo DG et al.

Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future

perspectives. Allergy, 2006: 1028-1039

CD63 CD203c

CD63 CD203c

Gp53 – LAMP-3 E-NPP3

No- IL3 inducible

IL3- inducible

Act Max: 25-30 min

Act Max: 10-20 min

Non associated to mediator release

Basófilos sin estimular: si

Solo basófilos

Basófilos sin estimular: no

Basófilos, monocitos, plaquetas

No- IL3 inducible

Act Max: 25-30 min

Asociados a liberación de mediadores

Marcadores de activación de basófilos Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

CD63 versus 203c

0.8%

65.9%

71.2%

31.6%

74.4%

94.4%

Control negativo

Control negativo

Anti IgE

Receptor Anti IgE

Parietaria

Ag

CD

20

3c

PE

C

D6

3 P

E

CD 63

203c

-CD63 is not expressed on resting basophils (clear separation between activated and non activated basophils) –CD203c is also expressed on resting basophils: activation brings a continuum

De Weck Al, Sanz ML

Clin Exp Allergy 2003 Jun;33:849-52.


0.8%

65.9%

71.2%

31.6%

74.4%

94.4%

Control negativo

Control negativo

Anti IgE

Anti IgE

Ag

Ag

CD

203c P

E

CD

63

PE

CD 63

203c

-CD63 is not expressed on resting basophils (clear separation between activated and non activated basophils) –CD203c is also expressed on resting basophils: activation brings a continuum

De Weck Al, Sanz ML

Clin Exp Allergy 2003 Jun;33:849-52.

CD63 versus 203c Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

R1

Región 1: Linfocitos

R2

Región 2: Células con receptores de IgE de alta afinidad

Software Fasc DIVA

Se mide la fluorescencia de 50000 células.

Análisis de Citometría de Flujo Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Análisis de CD63

Control Negativo

1.6%

75.%

Respuesta Ag-específica

84%

Control Positivo

Anti-IgE


Validación clínica del TAB en el diagnóstico de

alergia

Pacientes

Verdaderos alérgicos

provocación +

otras pruebas +

•Punto de corte

Curvas ROC :

Punto de corte(SE/ES óptimas)

para cada Ag

Curva COR

Los segmentos diagonales son producidos por los empates.

1 - Especificidad

1,00,75,50,250,00

Se

nsib

ilida

d

1,00

,75

,50

,25

0,00

Controles

Verdaderos no alérgicos

provocación -

otras pruebas -


Act bas %. IE

Inhalantes >15 >2

Látex >10 >2

Venenos >10 >2

Fármacos >5 >2

Alimentos >20 >2

Validación clínica del TAB en el diagnóstico de

alergia

IE= %activación basofilos Ag/ % activación basal


Reproducibilidad del TAB

CCI: Coeficiente de Correlación Intraclase

Ag Pacientes Determ x2 CCI p

Inhalant es 32 130 0.66 <0.0001

Betalactámicos 10 200 0.89 <0.0001

Pirazolonas 12 60 0.99 <0.0001

AINEs 10 200 0.92 <0.0001


TAB en el diagnóstico de alergia a fármacos

- Antibióticos Betalactámicos - Miorrelajantes - Pirazolonas - AINEs - Medios de radio contraste - Varios


TAB en alergia a fármacos

Antibióticos Betalactámicos


Sanz, 2002 Imm, ST + 58 30 50% 93% 63

Torres, 2004 Imm, ST + 70 40 48% 91% 63

Gamboa, 2004 Imm, ST - Prov + 23 30 39% 93% 63

Kvedariene, 2005 Imm 22 29 34% 83% 63

Erdmann, 2005 Imm 20 35% 63

Abuaf, 2008 Imm, ST + 47 20 63% 79% 203/63

Fernandez, 2008** Imm 41

ENDA, De Weck 2009 Imm ST +/- Prov + 181 81 50 97 63

Eberlein, 2010 24 15 55% 80% 63

Autores Pacientes Controles SE ES CD

TAB en alergia a Betalactámicos. Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

TAB

SE 50.7%

ES 93.3%

69 pacientes con reacciones

inmediatas a BL

PC positivas

30 controles

TAB en alergia a Betalactámicos Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Fiabilidad de las técnicas In vitro

Alergia a BL con pruebas cutáneas positivas

Sanz et al

CEA 2002

SE ES Pcorte

TAB 50.7% 93.3% >5%,IE>2

sLT(CAST) 47.7% 83.3% >100pg/ml,IE>2 ,IE>3

IgEesp (CAP) 36.7% 83.3% >0.35 kU/l

PPV NPV

TAB 19.4 98.9

sLT (CAST) 8.1 98.1

IgEesp (CAP) 6.4 97.7


http://es.wikipedia.org/wiki/Imagen:Penicillin-core.png

SE 65.2%

ES 83.3%

Sanz et al

CEA 2002

TAB

+

CAP

TAB

SE 50.7%

ES 93.3%

Alergia a betalactámicos con

pruebas cutáneas positivas


TAB en Reacciones

inmediatas a BL con PC

negativas

SE ES

TAB 39.1% 93.3%

sLT(CAST) 22.7% 83.3%

IgEesp (CAP) 36.7% 83.3%

>0.35 kU/l

J Invest Allergol Clin Immunol 2004

N=23


Pacientes N=70

Controles N=40

SE SP

TAB 48.6% 91.3%

CAP/RAST 44.3

Combinación 65.7

La sensibilidad del TAB es similar al inmunoensayo (CAP/RAST).

Cuando los usamos en combinación, la sensibilidad aumenta.


J Invest Allergol Clin

Immunol 2009

Objetivo

Evaluar el valor diagnóstico de las

pruebas celulares en alergia a BL

de tipo inmediato

181 pacientes alergia inmediata a BL

historia clínica y pruebas cutánes +/-

81 controles,

10 ENDA participantes

TAB en alergia a Betalactámicos

- IgE esp

- TAB

- sLT


sLT SE ES

Pacientes PC+ 41.7 % 83.3 %

Pacientes PC - 27.9 %

De Weck et al 2009

PC SE ES

77.4 % 100 %

181 pacientes

81 controles

sIgE SE ES

28.3 % 86.5 %

TAB SE ES

Pacientes PC+ 50 %

Pacientes PC- 37 % 97-89 %


TAB + sLT SE ES

64.3 % 73 %

No correlación!


De Weck , ENDA 2009


92% de los casos

75% de los casos

Diagnóstico

PC

IgE esp

TAB, sLT

+ -

Anamnesis

+ -

P Provocación

+ -


3.9% 81.8% 59.5% 28.7%

Basal Anti IgE Amox 1.2 mg/ml Amox 0.3 mg/ml

a) Ejemplo nº1

b) Ejemplo nº2

5.3% 47.3% 55.1% 40.2%

Basal Anti IgE PPL 25 mg/ml PPL 12.5 m g/ml


El TAB frente a cefalosporinas

positivo en el 77,7 % de los casos

Torres et al

CEA 2004

R1 - CO

N O

NH S

COOH

R2

A

Los resultados del TAB para alergia a cefalosporinas

son prometedores.


Paciente n 1 Paciente n 2

100 101 102 103 104

Anti-IgE FITC

a1024. M. Jose Palac24.001

11.7%

CD

63

-PE

anti-IgE-FITC 100 101 102 103 104

Anti-IgE FITC

a1014.Ana Isabel Indu14.001

66.3%

anti-IgE-FITC

CD

63

-PE

TAB

BASAL

AX (2.5 mg/ml)

AX/CA (2.5/0.625 mg/ml)

CA (0.625 mg/ml)

7.8

5.2

74.5

66.3

% células activadas (CD63+)

4.7

4.1

14.2

11.7

% células activadas (CD63+)


JACI

2010

JACI 2010


Análisis de los rangos de negativización del TAB.

41 pacientes con reacción alérgica

inmediata a AX fueron seguidos

durante un periodo superior a 4

años.

TAB y RAST se realizaron en

intervalos de 6 meses.


TAB se negativiza antes que

el RAST!!



Alergia a quinolonas

Ciprofloxacino

Levofloxacino Moxifloxacino


//commons.wikimedia.org/wiki/File:Ciprofloxazin.svg

//commons.wikimedia.org/wiki/File:Levofloxacin.svg

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Moxifloxacin_Structural_Formulae_V.1.svg

TAB en alergia a quinolonas

Problema diagnóstico:

Falsos positivos en PC!!

N=38 pacientes

alérgicos a

moxifloxacin (N = 24),

ciprofloxacin (N =11)

levofloxacin (N = 3)

IgE espRIA

TAB


TAB en alergia a quinolonas

% positivos

RIA 31

TAB 71

Ambos 73.7

Reactividad cruzada

48.2% de los pacientes

positivos a más de una

quinolona en TAB

SE media 71%

CIP 60.5

MOX 31.6

LEV 21

SP 88%


TAB en alergia a quinolonas y tiempo desde la reacción

TAB TAB TAB

TAB RIA

Negativización de TAB y RIA al año!!


TAB Moxifloxacino

SE luz SE oscuridad

17.9% 35.7%

ES en ambas=90%

Mayorga C, Andreu I, Aranda A et el

Int Arch Allergy Immunol 2013; 160:377-83


N=34 pacientes alérgicos a

quinolonas

TAB con la quinolona de la reacción

TAB a quinolonas puede evitar la PP!!!

N=17(50%)

TAB positivo con la

quinolona de la

reacción

N=17(50%)

TAB neg

Se reintroduce otra

quinolona en 15 casos de

17 sin problemas


TAB a quinolonas puede evitar la PP!!!

SE= 50%

TAB+12.5% de

pacientes con PC neg



Alergia a Pirazolonas

Metamizol


//commons.wikimedia.org/wiki/File:Metamizol.svg

TAB

SE 42.3%

ES 100%

VPP: 100%

VPN: 99.4%

TAB en alergia a Metamizol

Allergy 2003;58:312-317

n=26 0.9% 84% 61% 54%

Basal Anti-IgE Metamizol

5mg/ml

Metamizol

1 mg/ml


SE 69.2%

TAB

+

PC

77%

TAB

+

PC

TAB

sLT

PC

76%

TAB en alergia a Metamizol

Pacientes 20/26

diagnosticados

CONCORDANCIA

Índice Kappa = 0.44


51 pacientes

56 controles

SE 54.9%

SP 85.7%

Después de 6 meses

en el 60% de ellos, el

TAB resultó negativo

El intervalo de tiempo parece ser crítico para la sensibilidad del TAB en

reacciones alérgicas a dipironas mediadas por IgE Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014


Hipersensibilidad a AINES

Ibuprofeno

Paracetamol Naproxeno

Aspirina


//commons.wikimedia.org/wiki/File:Bayer_Aspirin_ad,_NYT,_February_19,_1917.jpg

//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/cc/Naproxen.svg

//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/51/Ibuprofen.svg

//commons.wikimedia.org/wiki/File:N-Acetyl-p-aminophenol.svg

//commons.wikimedia.org/wiki/File:Aspirin-skeletal.svg

n=60

pacientes

30 controles

TAB en Hipersensibilidad a AINES

Clin Exp Allergy 2004


SE/ES

TAB en hipersensibilidad a AINES

Autor Pacientes Controles SE ES

Gamboa, 2004 60 30 63 93

Kvediane, 2005 15 10 25 80

Erdmann, 2005 20 - 30

Rodriguez-Trabado

2008 43 29 42 100

Celik 2009 10 10 70 45

De WECK ENDA 2009 152 136 57 92


10 pacientes

10 controles TAB SE ES

70 % 45 %

Alta dosis de ASA 5 mg/ml !!!

Aislamiento celular con Percoll !!

TAB en Hipersensibilidad a AINES Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

TAB en Hipersensibilidad a AINES Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

TAB en Hipersensibilidad a AINES

pacientes asma/rinitis 59

AAS tolerantes 40

AAS no tolerantes 19

TAB

Indice activación mayor en intolerantes a AAS con reacciones

anafilácticas, respecto a grupo asma/rinitis

Punto corte IE>2.18

Anafilaxia Asma/rinitis

SE 80% 78%

SP 83% 50%



Alergia a agentes bloqueantes

neuromusculares (ABNM)

Causa predominante de anafilaxia peroperatoria

en Europa!!


TAB en alergia a agentes bloqueantes neuromusculares

(ABNM)

Autor

(Referencia)

Manifestaciones

clínicas

Número de

pacientes

TAB

SE

TAB

ES

Abuaf N

JACI 1999

Anafilaxia 41 64% 93%

Monneret G

Clin Immunol 2002


Sudheer P

Anesthesia 2005

Anafilaxia 21 79%*

36%**

100%

100%

Kvedariene V

Allergy 2006


Ebo D

Allergy 2006

Anafilaxia 14 91.7% 100%

Sainte Laudy Anafilaxia 49 68% 100%

Leysen

2011



TAB en alergia a agentes bloqueantes neuromusculares

(ABNM)

Autor

(Referencia)

Manifestaciones

clínicas

Número de

pacientes

TAB

SE

TAB

ES

Abuaf N

JACI 1999


Monneret G

Clin Immunol 2002


Sudheer P

Anesthesia 2005

Anafilaxia 21 79%*

36%**

100%

100%

Kvedariene V

Allergy 2006


Ebo D

Allergy 2006

Anafilaxia 14 91.7% 100%

Sainte Laudy Anafilaxia 49 68% 100%

Leysen

2011


*CD63

**CD203c


14 Pacientes con anafilaxia

perioperatoria y PC+ a

rocuronio

8 controles

TAB en ABNM Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

BAT Rocuronium

SE SP

91.7 100

El TAB constituye un método fiable para el diagnóstico de anafilaxia por ABNM.

La técnica también permite pruebas rápidas y simultáneas de diferentes ABNM

potenciales de reacción cruzada, y constituye una alternativa segura.

Excepto un paciente, todos

tenían TAB y PC negativos a

atracurio y cisatracurio.

5/14 pacientes toleraron la

administración de cisatracurio.

TAB en ABNM Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

TAB en ABNM

N=104 pacientes con

historia + de reacción

alérgica en anestesia

PC

IgE esp

TAB rocuronio


Abstract

BACKGROUND:

PC- y TAB-

Selección alternativa ABNM en 2ª anestesia tras

reacción en 1ª anestesia

100% seguridad No asi la

IgE esp!

272 pacientes anafilaxia peroperatoria

100 sometidos a 2ª anestesia g

PC+

TAB+

PC-

TAB-

alternativa relajante m.

TOLERAN


TAB EN EL DIAGNOSTICO

DE ALERGIA A MEDIOS DE

RADIOCONTRASTE


4/ 96 (4,6%)pacientes con

reacción anafiláctica a

medios de contraste yodado

mostraron reacción mediada

por IgE

PC + TAB +

TAB EN ALERGIA a medios de contraste

yodados

Identificación del grupo de monómeros

iónicos que tolera el paciente para un

siguiente intervención radiológica


TAB EN EL DIAGNOSTICO DE ALERGIA A MEDIOS DE

RADIOCONTRASTE

N=26 pacientes

43 controles

TAB

Curvas ROC

Auc 0.79 SI

SE: 46-62%

SP= 89-100%


TAB EN EL DIAGNOSTICO DE ALERGIA A MEDIOS DE

RADIOCONTRASTE

TAB

herramienta

útil en

confirmación

de

diagnóstico

de alergia a

medios de

contraste


N=8 (PC+ PP+)

TAB+ en 5

SE =62,5

Sp= 100

TAB herramienta útil en el diagnóstico de reacciones

de hipersensibilidad a medios de contraste yodado



Alergia a corticosteroides


TAB en alergia a corticosteroides

Primer caso descrito de reacción anafiláctica tras

administración iv de MP

PC+

TAB + a MP



N=4 pacientes

alergia a

Metilprednisolona

PC+ 3

IgEesp+ 2

TAB + a MP en los 3 pacientes

con PC+ a MP

TAB- a HC y DX

TAB+MP



N=2 pacientes alergia a

corticoides

TAB discrimina respuesta con corticoides:

-Succinato de hidrocortisona

-Hidrocortisona


TAB en el diagnóstico de

alergia a otros fármacos


Clorexidina (sIgE)

Rifamicina (sIgE)

Gelatina succinilada, Pentastarch

Heparina y HBPM

Patent blue

Hialuronidasa

CsA (cromóforo: aceite de castor polietoxilado)

Expansores de plasma

Viscotoxina

Vacuna recombinante de Hepatitis B

Reacción de anafilaxia después de inseminación artificial.

Omeprazol

Pristinamicina

TAB en el diagnóstico de reacciones de anafilaxia o

anafilactoides a diferentes fármacos Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

TAB y sIgE puede identificar el fármaco

causante en más del 50 % de pacientes con

anafilaxias


0.1% 37% 55% 43%

Control Anti-IgE Omeprazol 1/40 Omeprazol 1/160


Primer caso de reacción alérgica inmediata a

la atropina en preparación oftalmológica

confirmada mediante TAB.

PC (id) con atropina +

TAB Atropina ( 0.3ug/ml) positivo

·3 controles neg


10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

Negative control

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4 C

D6

3 P

E

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

Anti-IgE FITC

11,11%

Anti-IgE FITC

Positive control (Anti-IgE)

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

CD

63

PE

81,90%

Anti-IgE FITC

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

CD

63 P

E

Etanercept 12.5mg/ml

44.3%

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

Anti-IgE FITC


10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

CD

63 P

E

24.47%

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

Anti-IgE FITC

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

CD

63 P

E


24.32%

Hipersensibilidad a Etarnecept

Ac humanizado anti receptor TNF alfa Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

TAB en otras aplicaciones


El tratamiento de cetiricina no

influye en el resultado del TAB

22 pacientes alérgicos a ácaros del

polvo y pólenes.

19 controles

TAB antes y después de 2 horas de

tratamiento con cetiricina

TAB y efecto del tratamiento Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

TAB y efecto del tratamiento

El tratamiento con antihistamínicos o corticoides no influye

en el resultado del TAB


Aplicación del TAB en reacciones tras

trasfusión

TAB útil en detectar reacciones tras trasfusión


TAB y reacciones tras trasfusión Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

-Método fiable y robusto para la investigación in vitro de la alergia de tipo

inmediato en alergia a medicamentos.

-No peligro para el paciente.

-Es capaz de reproducir los mecanismos de hipersensibilidad celular in

vivo en reacciones alérgicas de tipo inmediato, sin riesgo para el paciente.

-Única herramienta in vitro para algunos medicamentos

- Permite probar diferentes fármacos simultáneamente.

-Puede evitar las pruebas de provocación.

-Puede identificar medicamentos de react cruzada y alternativas

terapeúticas seguras

Ventajas del TAB


-No reactores (respuesta negativa a anti-IgE)

-Respuesta negativa no excluye que el paciente reaccione a los

metabolitos del medicamento

-Debe realizarse antes de que pasen 6-12-18 m (según

medicamento) desde la reacción

Limitaciones del TAB


-La relevancia clínica de diferentes procesos de

degranulación

-La utilidad de otros marcadores de activación

-Vias de activación del basófilo en la alergia a

medicamentos no mediadas por IgE

Investigacion en marcha … Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Test de activación de basófilos en el diagnóstico in...

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