TESIS: PRESERVACIÓN DE LA INFORMACIÓN …

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUíMICAS

PRESERVACIÓN DE LA INFORMACIÓN CRISTALOGRÁFICA EN LOS CENTROS

METÁLICOS DE LA OXIDASA MULTICOBRE DE Thermus thermophilus (MCO-Tth)

T E S I S

QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS

P R E S E N T A:

Q.F.B. Eduardo Rosas Benítez

TUTOR PRINCIPAL: Dr. Enrique Rudiño Piñera, Instituto de Biotecnología, UNAM

MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR:

Dra. Adela Rodríguez Romero, Instituto de Química, UNAM Dr. Alfredo Torres Larios, Instituto de Fisiología Celular, UNAM

MÉXICO, D.F. Agosto, 2013

UNAM – Dirección General de Bibliotecas

Tesis Digitales

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2

Agradecimientos

Este proyecto se llevó a cabo en el Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos del

Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autonoma de México, bajo la dirección del

Dr. Enrique Rudiño Piñera. Fue financiado por CONACyT: proyecto No. 102370 y por el PAPIIT

IN204611.

Agradecesco primeramente al Dr. Enrique Rudiño por su amistad, comprensión y calidad

humana dentro y fuera de las aulas.

A mi madre por el soporte incondicional en esta asi como en todas las etapas de mi vida.

A mis amigos, especialmente a los que siempre estuvieron para darme ánimos.

A mis compañeros de laboratorio por el apoyo y amistad brindada, en especial a la Tec. Sonia

Rojas por el apoyo a lo largo del desarrollo del proyecto.

A la Dra. Adela Rodríguez del Laboratorio Nacional de Estructura de Macromoléculas LANEM

del Instituto de Química, UNAM por las facilidades prestadas y los comentarios asertivos que

ayudaron a dar forma a este trabajo.

Al Dr. Alfredo Torres por las sugerencias y recomendaciones sobre el desarrollo de este

proyecto.

A la Dra. Vivian Stojanoff y sus colaboradores por las facilidades prestadas durante la estancia

en el Sincrotrón de Brookheaven, NY.

Vive como si fueras a morir mañana,

aprende como si fueras a vivir siempre.

Mahatma Gandhi

3

Contenido

i. Lista de ilustraciones 5

ii. Lista de tablas 11

iii. Lista de ecuaciones 13

iv. Abreviaturas 13

v. Resumen 14

vi. Abstract 16

1. Introducción 17

1.1 Mecanismo catalítico 18

1.2 Sitio activo y estructura tridimensional de las MCOs 19

1.3 Generalidades de la difracción por rayos X 22

1.4 Daño por radiación 22

1.5 Preservación de los datos cristalográficos 28

1.6 Agentes radioprotectores o scavengers 29

1.7 Uso de datasets compuestos 36

1.8 Uso de líneas de alta y baja energía 38

1.9 Atenuación de la intensidad del flujo 40

2. Hipótesis 41

3. Objetivo General 41

3.1 Objetivos Particulares 41

4. Sección experimental 42

4.1 Sobreexpresión y purificación de la MCO-Tth recombinante 42

4.2 Cristalización 43

4.3 Colecta de datos 44

4.4 Procesamiento de la información 45

4

4.5 Dosis de radiación absorbida 47

5. Resultados y Discusión 49

5.1 Sobreexpresión y purificación de la MCO-Tth recombinante 49

5.2 Determinación cualitativa de los cobres T1 y T3 51

5.3 Cristalización 51

5.4 Impacto de la dosis de radiación absorbida en la MCO-Tth. 52

5.5 Evaluación en la ocupación del CuT2 modificando el flujo de

los rayos X en cristales de la MCO-Tth 67

5.6 Impacto del uso de altas energía y disminución del efecto

fotoeléctrico en la MCO-Tth. 72

5.7 Evaluación en la ocupación del CuT2 utilizando agentes

radioprotectores en la MCO-Tth. 77

6. Análisis y discusión de los resultados 84

7. Conclusiones 93

8. Perspectivas 95

9. Bibliografía 96

10 Apéndice 99

10.1 Cálculo del flujo 99

10.1 Consideraciones experimentales en una colecta de datos 110

5

i. Lista de ilustraciones

Figura 1. Comparación de la estructura de la MCO-Tth bajo distintas dosis de radiación absorbida. La estructura A,

resulta de la dosis más baja de radiación depositada (0.7 MGy), en la cual se observa la presencia de los cuatro

iones cobre (la ocupación del CuT2 es de 0.13). La estructura B, muestra el daño a una dosis de radiación absorbida

mayor (1.4 MGy), en la cual se presenta la depleción total del CuT2 del centro trinuclear de cobre (CTC). Cálculos

considerando un flujo de 4.2x1010

fotones/segundo (Serrano-Posada & Rudiño-Piñera, en preparación)………..pag 15

Figura 2. Diagrama esquemático de las MCOs, mostrando la distribución de los dominios estructurales y la relación

geométrica entre los diferentes iones cobre presentes en esta proteína (Solomon et al. 1996b)……………………………18

Figura 3. A Estructura general de la oxidasa multicobre de Thermus thermophilus (MCO-Tth) (código PDB 2XU9) y B,

representación estructural del sitio activo catalítico donde se muestra al cobre T1, el cual es responsable de la

remoción inicial de un electrón del sustrato, y más abajo los CuT2, CuT3 y CuT3´ formando el CTC, responsables de

la reducción del oxígeno molecular en agua……………………………………………………………………………………………………………20

Figura 4. A Residuos que coordinan a los cuatro iones cobre dentro de la MCO-Tth, así como residuos que se ha

considerado están involucrados en la transferencia de protones hacia el sitio activo, el Asp106, el cual también se ha

propuesto, desempeña un papel importante en la estabilización de las especies OH-/H2O vecinas al CuT2 y B,

representación del mecanismo catalítico de la MCO-Tth………………………………………………………………………………………..21

Figura 5. Fenómenos físicos involucrados en la exposición de un cristal a los rayos X. Dispersión elástica o de

Thomson, inelástica o de Compton, efecto fotoeléctrico y generación de especies radiolíticas………………………………23

Figura 6. Especies radiolíticas producidas por el daño primario al agua. Especies dependientes de la temperatura,

pH y otros factores (Modificado a partir de Ward, 1988)………………………………………………………………………………………..24

Figura 7. Pérdida de las ocupaciones afinadas de las cisteínas libres y las cisteínas formando puentes disulfuro en

cristales de la proteína mirosinasa. Se muestra una notable disminución en el porcentaje de las cisteínas formando

puentes disulfuro al aumentar la dosis depositada (Modificado a partir de Burmeister, 2000)……………………………….25

Figura 8. Pérdida de la ocupación del CuT2 coordinado por dos histidinas en la MCO-Tth, se observa en la imagen A,

dicho cobre con una ocupación de 0.16 esto después una dosis de radiación acumulada de 0.7 MGy. Al aumentar la

dosis de radiación hasta 1.4 MGy, imagen B, se observa la escisión total del CuT2 (ocupación 0). (Cálculos

considerando un flujo de 4.2x1010 fotones/segundo (Serrano-Posada, H., Tesis Doctorado, pág. 65)……………………..26

Figura 9. Histograma del incremento relativo (%) de los PDAs para las cadenas laterales de distintos residuos en la

acetilcolinesterasa de Torpedo califórnica (TcAChE) como consecuencia de la irradiación en un sincrotrón. La

6

línea horizontal indica el aumento medio de los PDAs de las cadenas laterales. Los números a lo largo del eje x

indican el número de veces que se repite el residuo en la proteína. Las barras individuales muestran el incremento

promedio de cada residuo comparando un segundo dataset con un dataset de referencia (Modificado a partir de

Weik, et al. 2000)……………………………………………………………………………………………………………………………………………………27

Figura 10. A-D Reducción dependiente de la dosis absorbida de una molécula de nitrato. La densidad electrónica de

los aniones nitrato disminuye conforme aumenta la dosis de radiación depositada. Durante la reducción del anión

nitrato se observa la conservación de la densidad electrónica alrededor del puente disulfuro; E-F, a dosis más altas

(23.3 MGy) el NO3 reducido desaparece y de manera concomitante con esto aparece el daño en el puente disulfuro

(De la Mora et al. 2011)………………………………………………………………………………………………………………………………………….32

Figura 11. Intensidades relativas sumadas de datasets sucesivos graficados contra la dosis absorbida. El

decaimiento en la intensidad es exponencial con la dosis, comportamiento de un cristal nativo de lisozima

comparado con un cristal co-cristalizado con 0.5M de ascorbato (Modificado a partir de Barker et al. 2009)………..33

Figura 12. Tetradecabromuro de hexatantalio, Ta6Br2+

12. El clúster es compacto, de forma casi esférica con un radio

aproximado de 4.3 Å……………………………………………………………………………………………………………………………………………….34

Figura 13. Ciclofanos binucleares de cobre (Modificado a partir de Sugich-Miranda et al. 2010)……………………………35

Figura 14. Capacidad antioxidante de los complejos ciclofanos de cobre Cu2PO y Cu2PC por el método TEAC

(Modificado a partir de Sugich-Miranda et al. 2010)……………………………………………………………………………………………….36

Figura 15. A Estrategia de colecta de datos en múltiples cristales, se muestra la distribución de la dosis absorbida

de radiación por rayos X en función del ángulo de rotación en cristales individuales de peroxidasa de rábano. B,

construcción de datasets compuestos a partir de la información procedente de los datos individuales. Los datasets

compuestos representan las estructuras que recibieron distinta dosis de radiación depositada (Modificado a partir

de Berglund et al. 2002)………………………………………………………………………………………………………………………………………….37

Figura 16. Contribución relativa (%) al efecto fotoeléctrico, efecto Compton (dispersión inelástica) y efecto

Thomson (dispersión elástica) explorando distintas energías (keV) en un cristal de lisozima de dimensiones 0.1 x 0.1

x 0.1mm, usando un haz de tamaño constante. (Modificado a partir de Paithankar & Garman, 2010)……………………39

Figura 17. Disminución del flujo de los rayos X por efecto de los atenuadores. Se observa una reducción del 20% del

valor de flujo en cada ocasión que los rayos X atraviesan a los atenuadores en su camino desde la fuente hasta la

muestra y el detector, resultando de esta forma en una reducción del 80% del flujo después de la colocación de 4

atenuadores, lo que impacta en la dosis de radiación que recibe el cristal……………………………………………………………..40

7

Figura 18. Algoritmo de integración (XDS), escalamiento (XSCALE), conversión de formato (XDSCONV) modelado

(Coot) y afinamiento (Phenix/Refmac5) de los datos de colecta hasta la generación de una estructura afinada…….46

Figura 19. A Archivo de entrada (input) y B, archivo de salida (output). En ambos casos se muestran los parámetros

que deben de ser utilizados para el cálculo final de la dosis de radiación depositada, haciendo uso del programa

RADDOSE y usando como ejemplo los datos de una fosfofructocinasa de Thermotoga maritima (PPK) (Paithankar &

Garman, 2010)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..49

Figura 20. A Cromatograma de la muestra obtenida después de dializar al extracto bacteriano conteniendo a la

MCO-Tth, usando una columna de intercambio catiónico (SP Sepharose Fast Flow, GE Healthcare) y B,

electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE 12%. Carril 1 marcador de peso molecular Fermentas, carriles 2-4 las

fracciones obtenidas a partir de la purificación………………………………………………………………………………………………………50

Figura 21. A Cromatograma de la MCO-Tth después de la cromatografía de intercambio catiónico usando una

columna de exclusión molecular (SuperDex 75, GE Healthcare) y B, electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE 12%.

Carril 1 y 2 (distintas concentraciones) con una banda única de ~50 kDa que corresponde al peso molecular

aproximado de la MCO-Tth. La proteína purificada exhibió el color azul característico de las MCOs, carril 3

marcador de peso molecular Fermentas…………………………………………………………………………………………………………………50

Figura 22. A Espectro UV-Visible de la MCO-Tth en 20 mM Tris pH 8.0. Se muestra la presencia de los cobres T1 y

T3, mediante sus picos característicos de absorción a 610 (CuT1) y 330 nm (CuT3). B, espectro de la MCO-Tth en su

forma apo (Serrano-Posada, H., Tesis Doctorado, pág. 34)……………………………………………………………………………………..51

Figura 23. Cristales de MCO-Tth crecidos a 4°C y una concentración de proteína de 20 mg/ml. Se presentan los

cristales crecidos en 0.1 M Hepes pH 7.5 y 60, 65 y 70% (v/v) de MPD, mediante el método de gota colgante

utilizando microseeding………………………………………………………………………………………………………………………………………….52

Figura 24. Incremento del volumen de celda unitaria en cristales de ferritina dependiente de la dosis de radiación

absorbida. Cada cruz representa el volumen calculado de la celda unitaria a partir de imágenes de 1°. El cristal es

regresado a su posición original cada 5°. La línea sólida representa un ajuste de mínimos cuadrados. Modificado a

partir de Ravelli et al. 2002……………………………………………………………………………………………………………………………………..55

Figura 25. Expansión del volumen normalizado a partir de la estructura 1 (1001) de la celda unitaria como producto

del aumento de la radiación en la MCO-Tth, se observa la dependencia casi lineal de dicho fenómeno…………………56

Figura 26. Pérdida de reflexiones únicas en un cristal de MCO-Tth, producto del daño por la radiación absorbida a

través de las 8 estructuras generadas……………………………………………………………………………………………………………………..57

8

Figura 27. A Incremento de los Parámetros de Desplazamiento Atómico (PDA) y B, incremento del valor B de

Wilson producto de la dosis absorbida de radiación. Se observa una dependencia casi lineal de los valores con el

incremento en la dosis de radiación……………………………………………………………………………………………………………………….58

Figura 28. Estructuras con diferente dosis absorbida de radiación del CuT2 y de los aminoácidos que lo coordinan

correspondientes a las estructuras 1 a 4 del cristal nativo (0.40 a 3.80 MGy) para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1

sigma representados en azul…………………………………………………………………………………………………………………………………..60


correspondientes a las estructuras 5 a 8 del cristal nativo (4.78-7.28 MGy) para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 sigma

representados en azul…………………………………………………………………………………………………………………………………………….61

Figura 30. Estructuras con diferente dosis absorbida de radiación del CuT3´ y de los aminoácidos que lo coordinan


sigma representados en azul…………………………………………………………………………………………………………………………………62




Figura 32. Comparación de la densidad electrónica en un mapa 2fo-fc de la tapa-antena o “loop” de la MCO-Tth

(residuos 294 a 307). Mapas 2fo-fc a 1 sigma………………………………………………………………………………………………………….64

Figura 33. Superposición de los mapas de densidad electrónica 2fo-fc de la primera estructura con 0.40 MGy

(densidad electrónica azul) de dosis de radiación acumulada y la última estructura generada con 7.28 MGy

(densidad electrónica rosa). Mapas 2fo-fc a 1 sigma………………………………………………………………………………………………65

Figura 34. Estructura del CuT2 y CuT3´ asi como de los aminoácidos que los coordinan correspondientes a los datos

procedentes del cristal nativo colectado en la línea X4A (0.29 MGy) para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 sigma



correspondientes a las estructuras A, cristal nativo atenuado imágenes 1 a 110 (0.02MGy) a 2.30Å; B, cristal nativo

atenuado imágenes 360 a 470 (0.08MGy) a 2.50Å; C, cristal nativo colectado en un ánodo rotatorio AR60 (0.13

MGy) a 2.0Å; D, cristal nativo AR120 colectado en un ánodo rotatorio (0.26 MGy) 1.60Å; E, cristal nativo colectado

en un equipo ánodo rotatorio AR240 (0.51 MGy) 1.70Å para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 sigma representados en

azul…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………70



9


MGy) a 2.0Å; D, cristal nativo AR120 colectado en un ánodo rotatorio (0.26 MGy) a 1.60Å; E, cristal nativo

colectado en un equipo ánodo rotatorio AR240 (0.51 MGy) a 1.70Å para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 sigma


Figura 37. Efecto del ruido del detector utilizado, se observa este como círculos concéntricos aleatorios a lo largo

de los patrones de difracción generados en el detector ImagePlate-Mar345, se puede observar la distribución

aleatoria de estas líneas a lo largo de las imágenes A y B, lo que impacta en la eficiencia del detector disminuyendo

este valor hasta 65%. Las imágenes C y D, corresponden a patrones de difracción de un detector ADSC Quantum 4R

utilizado en líneas de energía estándar (específicamente X4A) en las cuales no se observan rayas aleatorias y el cual

opera al 100% de eficiencia…………………………………………………………………………………………………………………………………….73

Figura 38. Eficiencia en la absorción de los fotones incidentes por parte de la película de fósforo del detector Image

Plate MAR345 y el detector MAR CCD en el rango de energías de 1-100 keV (Jakoncic et al. 2006)………………….…….74

Figura 39. Estructuras del CuT2 y de los aminoácidos que lo coordinan de la MCO-Tth en alta energía con diferente

dosis absorbida de radiación. En la imagen A1, se muestra a un cristal nativo (0.43 MGy), en la imagen A2, se

muestra al mismo cristal nativo (0.76 MGy), cuya dosis de radiación depositada corresponde a la suma de dosis de

la primera (A1) y segunda colecta (A2); la imagen de la estructura B, representa a un cristal nativo con 0.43 MGy de

dosis de radiación depositada y finalmente la imagen C, representa a otro cristal nativo 0.76 MGy. Mapas 2fo-fc a 1


Figura 40. Estructuras del CuT3´ y de los aminoácidos que lo coordinan de la MCO-Tth en alta energía con diferente






Figura 41. Estructuras del CuT2 y de los aminoácidos que lo coordinan correspondientes a las estructuras

procedentes de cristales sometidos a la técnica de soaking. A, 100mM NaNO3 1.5 minutos (0.41MGy) 1.50Å; B,

100mM NaNO3 7 minutos (0.36MGy) 1.80Å; C, 500mM NaNO3 1 minuto (0.40MGy) 1.60Å. Mapas 2fo-fc a 1 sigma



procedentes de cristales sometidos a la técnica de soaking. D, 100mM ascorbato 10 minutos (0.62MGy) 1.80Å; E,

100mM CuSO4 20 minutos (0.43MGy) 1.70Å; F, 5mM Cu2PC 3 minutos (0.58MGy) 1.82Å; G, 5mM Cu2PC 5 minutos

(0.64MGy) 1.80Å y H, 5mM Cu2PO 8 minutos (0.55MGy) 1.55Å. Mapas 2fo-fc a 1 sigma representados en azul…...82

10

Figura 43. Estructuras del CuT3´ y de los aminoácidos que lo coordinan correspondientes a las estructuras


100mM NaNO3 7 minutos (0.36MGy) 1.80Å; C, 500mM NaNO3 1 minuto (0.40MGy) 1.60Å; D, 100mM CuSO4 20

minutos (0.43MGy) 1.70Å. Mapas 2fo-fc a 1 sigma representados en azul……………………………………………………………..83


procedentes de cristales sometidos a la técnica de soaking. E, 100mM ascorbato 10 minutos (0.62MGy) 1.80Å; F,

5mM Cu2PC 3 minutos (0.58MGy) 1.82Å; G, 5mM Cu2PC 5 minutos (0.64MGy) 1.80Å y H, 5mM Cu2PO 8 minutos

(0.55MGy) 1.55Å. Mapas 2fo-fc a 1 sigma representados en azul…………………………………………………………………………..84

Figura 45. Impacto del agente precipitante MPD en la resolución máxima de las estructuras que lo contienen

reportadas en el PDB. Se compara la totalidad de estructuras presentes con MPD en esta base de datos (1,492) y el

promedio de la resolución en la cual se han publicado dichas estructuras, siendo este número 1.98Å (barras azules),

comparado con el número total de estructuras reportadas de 76,227 con un promedio de resolución de 2.19 Å

(barras rojas)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..…90

Figura 46. Espectros de absorción de rayos X mostrando la reducción del Cu+2

a Cu+1

después de la irradiación con

rayos X. El espectro correspondiente al cobre oxidado (línea sólida) corresponde al cristal de C. gallica antes de la

colecta de datos por rayos X, mientras el espectro reducido (línea discontinua) muestra la reducción del cobre

durante la colecta de datos (De la Mora et al. 2012)………………………………………………………………………………………………92

Figura 47. Diagrama esquemático de un PIN fotodiodo, donde se muestran las superficies semiconductoras

extrínsecas “P” y “N”, las cuales generan un potencial eléctrico que permite el movimiento de los fotones a través

de la superficie “Intrínseca”, permitiendo así la contabilización de los mismos como corriente eléctrica (Amperes).

(Modificado a partir de Owen et al. 2009)…………………………………………………………………………………………………………….100

Figura 48. Esquema de distribución general y posición del PIN fotodiodo como parte de la línea de colecta……….101

Figura 49. Comportamiento del flujo dependiente de la corriente del anillo de almacenamiento. Se presentan de

forma conjunta los datos de tres distintos días de calibración, utilizando un haz atenuado con 16 foils de aluminio,

una apertura de slits de 150x150 y una distancia cristal-detector de 250 mm……………………………………………………...106

Figura 50. Gráfica de disminución del valor de flujo (x 109 fotones/segundo) en la línea X6A cuando se modifica el

tamaño de los slits………………………………………………………………………………………………………………………………………………..107

Figura 51. Gráfica de disminución del valor de flujo (x 109 fotones/segundo) en la línea X6A cuando se atenúa

mediante el uso de distinto número de foils de aluminio………………………………………………………………………………….....108

11

ii. Lista de tablas

Tabla 1. Algunos de los agentes radioprotectores evaluados en la literatura y su efecto de protección en cristales de

proteínas………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..31

Tabla 2. Parámetros estadísticos de la colecta de datos, integración y escalamiento de 8 estructuras de la MCO-Tth

procedentes de un cristal nativo con diferentes dosis de radiación………………………………………………………………………..53

Tabla 3. Parámetros estadísticos del afinamiento de 8 estructuras de la MCO-Tth procedentes de un cristal nativo

con diferentes dosis de radiación……………………………………………………………………………………………………………………………54

Tabla 4. Parámetros estadísticos de la colecta de datos, integración, escalamiento y afinamiento de un cristal

nativo colectado en la línea X4A……………………………………………………………………………………………………………………………..66

Tabla 5. Parámetros estadísticos de la colecta, integración y escalamiento de los datos un cristal nativo de MCO-Tth

(Estructura 1: imágenes 1 a 110 y Estructura 2: imágenes 361 a 470), colectado dos veces en la misma zona del

cristal en la línea X6A atenuada y de tres cristales nativos de MCO-Tth (AR240, AR120 y AR60) en el equipo casero

ánodo rotatorio bajo distintos regímenes de tiempo de colecta de imágenes………………………………………………………..68

Tabla 6. Parámetros estadísticos del afinamiento de datos un cristal nativo de MCO-Tth (Estructura 1: imágenes 1 a

110 y Estructura 2: imágenes 361 a 470), colectado dos veces en la misma zona del cristal en la línea X6A atenuada

y de tres cristales nativos de MCO-Tth (AR240, AR120 y AR60) en el equipo casero ánodo rotatorio bajo distintos

regímenes de tiempo de colecta de imágenes………………………………………………………………………………………………………..69

Tabla 7. Parámetros estadísticos de la colecta e integración de los datos de cuatro estructuras a partir de tres

cristales nativos de MCO-Tth colectados en alta energía, con distintos tiempos de exposición por imagen……………75

Tabla 8. Parámetros estadísticos de la colecta, integración y escalamiento de los datos de tres cristales de MCO-Tth

con NaNO3 como radioprotector en distintas concentraciones (100 y 500mM) y tiempos de remojado (1, 1.5 y 7

minutos) en las líneas X4A y X4C…………………………………………………………………………………………………………………………….78

Tabla 9. Parámetros estadísticos del afinamiento de los datos de tres cristales de MCO-Tth con NaNO3 como

radioprotector en distintas concentraciones (100 y 500mM) y tiempos de remojado (1, 1.5 y 7 minutos) en las

líneas X4A y X4C……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..78

Tabla 10. Parámetros estadísticos de la colecta, integración y escalamiento de datos en la línea X6A de 5 cristales

sometidos a la técnica de soaking, haciendo uso de distintos agentes radioprotectores con distintas

concentraciones y bajo distintos tiempos de remojado………………………………………………………………………………………….79

12

Tabla 11. Parámetros estadísticos del afinamiento de datos en la línea X6A de 5 cristales sometidos a la técnica de

soaking, haciendo uso de distintos agentes radioprotectores con distintas concentraciones y bajo distintos tiempos

de remojado……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………80

Tabla 12. Parámetros comparativos de los cristales analizados durante el desarrollo de este trabajo……………………85

Tabla 13. Mediciones de la corriente en un PIN fotodiodo de superficie 300 x 300 µm. Datos de calibración de la

línea X6A (1)……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….…102


línea X6A (2)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….102


línea X6A (3)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….103


línea X6A (4)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….105

Tabla 17. Mediciones de la corriente en un PIN fotodiodo de superficie 51 x 51 µm. Datos de calibración de la línea

X6A……………………………………………………………………………………………………………………………………………….………………………105


X4A. ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….….105

Tabla 19. Mediciones de la corriente en un PIN fotodiodo. Calibración de la línea X4C……………………………………..…105

Tabla 20. Porcentajes de disminución del flujo al manipular la apertura de los slits de la línea X6A……………………..107

Tabla 21. Porcentaje de disminución del flujo al atenuar la línea X6A utilizando foils de aluminio…………………….…107

Tabla 22. Valores de flujo (fotones/segundo) bajo distintas variaciones experimentales (slits y atenuación por foils

de aluminio) tanto para las líneas X6A, X4A y X4C…………………………………………………………………………………………….….109

13

iii. Lista de ecuaciones

Ecuación 1. Mecanismo de reacción del nitrato frente a los electrones solvatados (De la Mora et al. 2011)………….32

Ecuación 2. A Mecanismo de formación del radical hidroxilo y B, reacción del ascorbato/ácido ascórbico frente a los

radicales hidroxilo (De la Mora et al. 2011)…………………………………………………………………………………………………………….33

Ecuación 3. Cálculo del flujo de rayos X a partir del valor de corriente detectada (ampereres) por un PIN fotodiodo

de superficie 300 x 300 µm. Considerando un factor de conversión de 377, derivado de la energía de los fotones

incidentes, así como de los coeficientes de atenuación y absorción de rayos X en el silicio puro………………………….101

iv. Abreviaturas

MCOs oxidasas multicobre

MCO-Tth oxidasa multicobre de Thermus thermophilus

PDB Banco de datos de Proteínas (por sus siglas en ingles)

MGy 1 x 106 (Gy); unidad S.I. para indicar la dosis de radiación ionizante absorbida

MPD 2-metil-2,4 pentanodiol

EPR resonancia magnética paranuclear (pos sus siglas en ingles)

CTC centro trinuclear de cobre

IP intermediario peróxido

IN intermediario nativo

ER estado de reposo

ETR estado totalmente reducido

keV 1 x 106 (eV); unidad S.I que representa la energía cinética que adquiere un electrón cuando es

acelerado por una diferencia de energía potencial de 1 voltio

IPTG Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido

PDAs parámetros de desplazamiento atómico

SDS-PAGE electroforesis en geles de poliacrilamida y SDS (por sus siglas en ingles)

Tris Tris(hidroximetil)aminometano

HEPES Acido 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazina etansulfonico

14

v. Resumen

Las oxidasas multicobre (MCOs por sus siglas en ingles) son enzimas que contienen iones cobre, los

cuales tienen un papel central en la catálisis de estas enzimas, interviniendo en la oxidación de diversos

sustratos y generando una transferencia de electrones a un átomo de oxígeno para su conversión en

agua con la adición de protones, todo esto bajo un mecanismo de reacción catalítica, que si bien ha sido

profusamente estudiado en diversos sistemas, aun no se encuentra caracterizado en su totalidad.

Adicionalmente, es muy común que las estructuras cristalográficas de las MCOs resulten en la pérdida,

parcial o total, de ocupación en uno o varios de los iones cobre. En nuestro grupo de trabajo se ha

determinado la estructura cristalográfica de la oxidasa multicobre de Thermus thermophilus (MCO-Tth)

(código PDB 2XU9). Sin embargo, la exposición a los rayos X produce modificaciones específicas en la

estructura: la ocupación de uno de los cuatro cobres catalíticos en esta metaloenzima, el CuT2, está

particularmente afectada, inclusive en dosis de radiación absorbida muy bajas (0.7 MGy) (Figura 1). Por

lo tanto en este proyecto se exploraron distintas condiciones como el uso de moléculas

radioprotectoras, el uso de líneas de alta energía en fuentes sincrotrónicas, así como la atenuación en

líneas estándar del flujo de rayos X. Todo lo anterior con el fin último de preservar la ocupación de los

cobres en estudios cristalográficos en MCOs, particularmente del CuT2 en los cristales de la MCO-Tth.

La catálisis en metaloenzimas depende de la preservación de los metales, y al escindirlos durante los

experimentos de difracción de rayos X, pueden producirse cambios grandes o sutiles en la estructura que

pueden conducir a conclusiones biológicas equivocadas. Una vez conseguido este objetivo pretendemos

utilizar las estructuras generadas para intentar comprender de manera más amplia el mecanismo

catalítico de este grupo de enzimas. Esta última posibilidad se basa en el hecho de que en nuestro

laboratorio se logró describir parcialmente el mecanismo catalítico de la MCO-Tth, lo anterior utilizando

solamente datos cristalográficos y controlando la dosis depositada en los cristales. Sin embargo, la

temprana escisión del CuT2, debida a la susceptibilidad diferencial de los iones cobre en la MCO-Tth ante

la dosis de radiación depositada y a los flujos electrónicos concomitantes limitó el análisis del

mecanismo. Los resultados de este trabajo muestran la complejidad del sistema, sin embargo se puede

señalar que el proceso de daño a los CuT2 y T3´ es un proceso multifactorial, el cual puede ser evitado

mediante distintas estrategias; al reducir la dosis de radiación depositada a valores inferiores a 0.3 MGy,

mediante colectas de datos con tiempos cortos, para así evitar el aumento en la probabilidad de daño

secundario y mediante la pre-reducción del sistema de cobres con agentes reductores. También se

15

plantea el hecho de que el sistema cristalino de la MCO-Tth pueda encontrarse protegido del daño por

radiación mediante el efecto de scavenger del MPD.

Figura 1. Comparación de la estructura de la MCO-Tth bajo distintas dosis de radiación absorbida. La estructura A,

resulta de la dosis más baja de radiación depositada (0.7 MGy), en la cual se observa la presencia de los cuatro

iones cobre (la ocupación del CuT2 es de 0.13). La estructura B, muestra el daño a una dosis de radiación absorbida

mayor (1.4 MGy), en la cual se presenta la depleción total del CuT2 del centro trinuclear de cobre (CTC). Cálculos

considerando un flujo de 4.2x1010 fotones/segundo (Serrano-Posada & Rudiño-Piñera, en preparación).

16

vi. Abstract

Multicopper oxidases (MCOs) are a group of enzymes that contain copper ions, which play a central role

in the catalysis of this enzymes, intervening in the oxidation of different substrates through the

transference of electrons to an oxygen atom to generate water with the presence of protons, all this

under a catalytic reaction mechanism, although it has been extensively studied in various systems, is not

yet fully characterized. Previous observations showed that crystallographic structures of MCOs are

commonly affected by X-rays, resulting in a partial or total loss of occupancy in one or more copper ions.

The crystallographic structure of the Thermus thermophilus multicopper oxidase (MCO-Tth) (PDB code:

2XU9) has been determined successfully by our group, however the exposure to X-rays produces specific

modifications in the coordinates: the occupancy of one of the four catalytic coppers; CuT2, is particularly

affected even at low absorbed dose (0.7 MGy). In this work several approaches were evaluated in order

to preserve the occupancy of the metallic centers, especially for CuT2 in the MCO-Tth. The strategies

employed, included the use of radioprotectant molecules, high and low synchrotron energy data

collection as well as attenuation of the X-ray flux.

Metalloenzymes catalysis depends on the preservation of their metals, however during X-ray diffraction

experiments metal elimination may lead to wrong biological conclusions. Once achieved this objective

we intend to use the generated structures to try to understand more broadly the catalytic mechanism of

this group of enzymes. This last possibility is based on the fact that in our laboratory the catalytic

mechanism of the MCO-Tth was partially described, using only crystallographic data and controlling the

dose deposited in the crystals. However early cleavage of CuT2 due to differential susceptibility of

copper ions in MCO-Tth to deposited radiation dose and concomitant electron fluxes limited the analysis

of the mechanism. The results of this study show the complexity of the system, however it can be stated

that the process of damage to CuT2 and T3´ coppers is a multifactorial process, which can be avoided by

different strategies; by reducing the radiation dose deposited to values as low as 0.3 MGy, by short-time

data collections to avoid the increase in the probability of secondary damage and by the pre-reduction of

the copper system. There is also the fact that the crystalline system of the MCO-Tth can be protected

from radiation damage by scavenger effect of MPD.

17

1. Introducción

Las oxidasas multicobre (MCOs) son un grupo de proteínas con secuencias y estructuras similares que

intervienen en sistemas redox, siempre con la participación de varios iones cobre (Messerschmidt &

Huber, 1990), catalizando la oxidación de un gran número de compuestos fenólicos (Leontievsky et al.

1997). En esta familia se incluyen proteínas como las lacasas (p-difenol: di-oxígeno oxidoreductasas, EC

1.10.3.2), las ferroxidasas, las ascorbato oxidasas así como a la ceruloplasmina entre otras. También se

denominan proteínas multicobre azules, debido a su color azul característico, el cual se debe a la

interacción entre una cisteína y uno de sus iones cobre. Estas proteínas se encuentran presentes en

plantas superiores, hongos, bacterias e insectos participando en la síntesis y degradación de lignina, en la

respuesta a heridas en plantas, detoxificación, pigmentación, resistencia a concentraciones

potencialmente letales de cobre así como otros procesos fisiológicos (Mayer et al. 2002; Morozova et al.

2007).

Los átomos de cobre en estas proteínas multicobre han sido clasificados en tres tipos (T1, T2 y T3)

debido a sus propiedades espectroscópicas (Solomon et al. 1996a). Como ya se mencionó con

anterioridad, la interacción covalente fuerte entre un átomo de azufre de la cisteína que coordina al

CuT1 genera una transferencia de carga SCys → Cu+2, la cual proporciona el color azul característico de

esta familia de enzimas. El CuT2, o cobre normal, no presenta propiedades espectroscópicas, mientras

que los cobres T3 muestran una máxima absorción cerca de los 330nm, lo anterior debido a que se

encuentran antiferromagnéticamente acoplados por un hidroxilo (OH-). Los CuT1 y T2 son detectables

por resonancia paramagnética nuclear (EPR por sus siglas en inglés) (Solomon et al. 1996a).

El CuT1 se localiza en una cavidad del dominio 3, mientras que el centro trinuclear de cobre (CTC)

CuT2/T3/T3´ está en la intercara de los dominios 1 y 2. Los residuos que coordinan a estos últimos tres

iones cobre están distribuidos equitativamente en cada dominio (ocho histidinas, cuatro en cada

dominio) (Figura 2). Las estructuras cristalográficas reportadas de las MCOs sustentan que se trata de

moléculas monoméricas cuyos aminoácidos implicados en la unión a los cobres están altamente

conservados (Kumar et al. 2003). La arquitectura molecular, como ocurre en todas las oxidasas azules de

cobre, contiene dominios barril-β. El tercer dominio tiene una conformación β-sándwich, así como

cuatro regiones de alfa hélices cortas resultando en una estructura globular (Ducros et al. 1998)

18

Figura 2. Diagrama esquemático de las MCOs, mostrando la distribución de los dominios estructurales y la relación

geométrica entre los diferentes iones cobre presentes en esta proteína (Solomon et al. 1996b).

1.1 Mecanismo catalítico

Las lacasas o MCOs (usados como sinónimo por algunos autores, sin embargo en este trabajo

denominadas como MCOs) han sido estudiadas ampliamente desde distintas perspectivas, las que

incluyen puntos de vista bioquímicos, espectroscópicos, así como estructurales por difracción de rayos X.

Estas enzimas catalizan la oxidación de una amplia variedad de sustratos orgánicos e inorgánicos

acoplado a la reducción del oxígeno bimolecular a agua, dicha oxidación del sustrato mediante la

remoción de un electrón a la vez puede llevar a la generación de radicales libres, que en ocasiones dan

lugar a especies inestables, las cuales tienden a polimerizar para recuperar su estabilidad (Bourbonnais

et al. 1997). De esta manera, las MCOs acumulan electrones provenientes de reacciones de oxidación

individuales, cuando se tienen cuatro electrones, la enzima puede transferir estos electrones al oxígeno

molecular para formar como producto final de la reacción al agua (Andréasson et al. 1976). Los

electrones son transferidos desde el CuT1 hacia el CTC por un canal de ~13Å, el cual se detalla en el

apartado de Sitio Activo y Estructura Tridimensional de las MCOs, al llegar Inicialmente el O2 al CTC se

reduce en dos etapas de 2 e- cada una: la primera de ellas genera al intermediario peróxido (IP) y la

segunda representativa de la enzima totalmente oxidada genera al intermediario nativo (IN), la cual es la

única forma totalmente oxidada que es catalíticamente relevante. Mientras que la formación del IP es la

etapa limitante en la velocidad de reacción, el decaimiento del IP al IN es bastante rápido, como

resultado el IP no puede ser atrapado en la forma silvestre de la holoenzima (enzima con los 4 iones

cobre presentes) y debido a esto es difícil detectarlo bajo condiciones normales de reacción (Yoon et al.

2007). Estructuralmente en el IP un átomo de oxígeno del peróxido está coordinado al CuT3, mientras el

otro átomo de oxígeno se coordina al CuT2 y al mismo tiempo interactúa con el CuT3´. En la reacción del

19

O2 en el CTN, no hay H+ involucrados y por lo tanto la formación IP es independiente del pH (Yoon et al.

2007). Por el contrario en la conversión del IP al IN hay H+s involucrados y por lo tanto la reacción de

ruptura del enlace -O-O- es dependiente del pH (Palmer et al. 2002). En el CTC, un átomo de oxígeno del

IN está en la mitad del CTC y otro átomo de oxígeno, perteneciente al OH-, esta simétricamente ubicado

entre los dos cobres T3 (Augustine et al. 2010). Adicionalmente, el IN es precursor del estado de reposo

(ER) con un OH- coordinado entre los dos CuT3 y una molécula de H2O coordinada al CuT2. Sin embargo,

el decaimiento del IN al ER no es catalíticamente relevante, porque únicamente ocurre en ausencia de

electrones (Yoon et al. 2007). Por lo tanto bajo condiciones catalíticas, el IN no se detecta porque

reacciona rápidamente con el sustrato o agente reductor para formar el estado totalmente reducido

(ETR) que inicia el siguiente ciclo catalítico, evitando formar así el ER (Augustine et al. 2010). Sin

embargo, el ER es el estado más común en las estructuras cristalográficas de las MCOs determinadas a la

fecha, porque el ciclo catalítico de reducción del O2, inducida por rayos X, no es eficiente en el estado

cristalino y es precisamente esta característica la que ha hecho que este mecanismo pueda ser estudiado

por cristalografía de rayos X (Hakulinen et al. 2006). Es notable considerar que cuando alguno de los

cobres se pierde durante este proceso dinámico de transporte de electrones y coordinación de

intermediarios se ve interrumpida y por tanto el mecanismo catalítico se detiene.

1.2 Sitio activo y estructura tridimensional de las MCOs

El análisis de la estructura del sitio activo de las MCOs (Figura 3) muestra que el CuT2 y los dos cobres T3

(CuT3 y CuT3´) están cercanos entre sí formando un CTC (Leontievsky et al. 1997). El átomo de CuT1 está

presente como Cu+2 en el estado de reposo de la enzima, este se encuentra coordinado por dos

nitrógenos de dos histidinas y un azufre de una cisteína. La geometría de esta coordinación se describe

como una coordinación trigonal distorsionada bipiramidal, con una posición axial vacante donde el

sustrato tiene entrada (Ducros et al. 1998). Mientras que los dos átomos de CuT3 están coordinados

cada uno por tres histidinas (Ducros et al. 1998), el CuT2 está coordinado solamente por dos histidinas,

lo cual convierte a este último ion metálico en el más lábil de los cuatro cobres con respecto a su energía

de coordinación, esta afirmación quedo en evidencia en las estructuras cristalográficas de las MCOs de

Coprinus cinereus (código PDB 1HFU) y Trametes hirsuta (código PDB 3V9C), en las que el CuT2 se

encontró en ocupaciones fraccionales (Ducros et al. 1998). Es importante mencionar que el CuT2 se

encuentra localizado en el canal de salida de las moléculas de H2O (de manera específica a un canal de

25Å de longitud), producto del ciclo catalítico de la reducción del O2 y por lo tanto parecería estar más

expuesto al daño por dosis de radiación absorbida, debida a electrones hidratados que se generan como

20

resultado de la radiólisis de moléculas de agua en los experimentos de difracción de rayos X. De esta

forma y con el objetivo de determinar la dosis de radiación mínima requerida para la eliminación

completa del CuT2 en la estructura de la MCO de Coriolopsis gallica (C. gallica), De la Mora y

colaboradores (2012), mediante el estudio de estructuras a baja y alta dosis de radiación, demostraron

que el CuT2 es escindido de las estructuras cristalográficas a una dosis de radiación absorbida de entre

0.6 y 4 MGy.

Figura 3. A Estructura general de la oxidasa multicobre de Thermus thermophilus (MCO-Tth) (código PDB 2XU9) y B,

representación estructural del sitio activo catalítico donde se muestra al cobre T1, el cual es responsable de la

remoción inicial de un electrón del sustrato, y más abajo los CuT2, CuT3 y CuT3´ formando el CTC, responsables de

la reducción del oxígeno molecular en agua.

La oxidación del sustrato ocurre en una pequeña cavidad cercana al CuT1 y la reducción del O2 en el CTC

(Leontievsky et al. 1997). Los cuatro electrones extraídos a partir de los sustratos deben ser transferidos

del sitio del CuT1 al CTC que se encuentran a una distancia de ~13Å. El transporte se realiza por la vía

CuT1-Cys455-His444 o His446-CuT3 (los números entre paréntesis indican la numeración en la MCO-Tth): la

conexión más directa entre los sitios de oxidación del sustrato y de reducción del oxígeno molecular

(Figura 4). Dos canales de solvente generan un acceso al CTC, en donde uno de los canales le permite al

O2 difundir hasta el CTC específicamente en los dos cobres T3 donde se lleva a cabo su reducción,

mientras que el otro canal permite la salida del producto final agua, desde el CuT2 hasta el exterior de la

proteína (Bento et al. 2005).

De la Mora y colaboradores, (2012) en una MCO de C. gallica y Quintanar y colaboradores, (2005) en una

MCO de Saccharomyces cerevisiae (Fet3p) observaron la presencia de dos residuos ácidos conservados

A B

21

en la segunda esfera de coordinación de cada una de sus respectivas modelos de trabajo, los cuales se

encuentran localizados en las cercanías del CTC, los cuales desarrollan un papel fundamental durante la

catálisis del O2: Glu487 en Fet3p y Asp452 en Cg L, localizados en las cercanías del CTC ,donando los

protones necesarios en el ciclo catalítico, mientras que el Asp94 en Fet3p y Asp76 en C. gallica, permite la

desprotonación del agua unida al CuT2, y de esta manera, direccionando la transferencia de electrones

del CuT1 al CTC. Es preciso señalar que de la misma forma que sucede con otras MCOs azules, la MCO-

Tth presenta estos residuos ácidos conservados. El Glu451 numerado así en la MCO-Tth, es el encargado

de donar los protones necesarios para la reducción del O2, mientras que el Asp106 no parece estar

implicado en la trasferencia de H+ al CTC, sin embargo desempeña un papel importante en la

estabilización de las especies OH-/H2O coordinadas al CuT2 vía puentes de hidrógeno con una molécula

de H2O estructural, liberando el producto final que es agua del CuT2.

Figura 4. A Residuos que coordinan a los cuatro iones cobre dentro de la MCO-Tth, así como residuos que se ha

propuesto están involucrados en la transferencia de protones hacia el sitio activo, el Asp106, el cual también se ha

propuesto, desempeña un papel importante en la estabilización de las especies OH-/H2O vecinas al CuT2 y B,

representación del mecanismo catalítico de la MCO-Tth.

A B

22

1.3 Generalidades de la difracción por rayos X

La gran mayoría de estructuras 3D de macromoléculas son determinadas mediante el uso de

cristalografía (el 85% de los depósitos en el PDB fueron obtenidos por esta técnica y el 100 % de las

MCOs o lacasas), la cual emplea la difracción de rayos X en cristales. Cuando un cristal es expuesto a una

fuente de rayos X, estos últimos pueden ser absorbidos (dispersión inelástica), difractados por los

arreglos periódicos y ordenados de electrones presentes en los átomos del cristal (dispersión elástica)

(2% de interacción entre los rayos X y el cristal de proteína), o simplemente pasar de largo por el cristal

(98% de los rayos X incididos) (Nave, 1995 y Garman & Owen, 2006). El fenómeno de dispersión elástica

denominado también como dispersión de Thomson corresponde al 0.16% del total de rayos X incididos y

es responsable de la generación de un patrón de difracción el cual permite la determinación final de la

estructura cristalina 3D de la proteína (Figura 5). Sin embargo, durante los experimentos de difracción,

los rayos X pueden perder parte de su energía por interacción con la materia mediante fenómenos

físicos como la dispersión Compton, la cual corresponde también aproximadamente al 0.16% del total de

radiación incidida sobre el cristal, dicho efecto deposita cantidades mínimas de energía comparado con

el efecto fotoeléctrico, el cual corresponde aproximadamente al 1.68% del total de rayos X incididos, en

dicho efecto la energía incidente es absorbida totalmente y un electrón de capa externa es liberado

(efecto de fotoionización), los porcentajes presentados son considerando un fotón incidente con energía

de 12.4 keV (0.9998 Å) (Carugo & Carugo, 2005).

1.4 Daño por radiación

El efecto fotoeléctrico es la interacción dominante en las energías de interés para la cristalografía de

rayos X, la energía de este fotoelectrón liberado es dependiente de la energía del fotón incidente, la cual

es disipada totalmente en el cristal, contribuyendo de esta forma en ocasiones a uno o varios de los

siguientes eventos: ruptura mecánica de la matriz del cristal, calentamiento, eventos de ionización de

residuos y escisión de enlaces, dañando a los cristales, especialmente cuando fuentes de radiación de

alta intensidad son utilizadas (Carugo & Carugo, 2005 y Murray et al. 2004).

Este proceso de daño por radiación debido principalmente al efecto fotoeléctrico es un componente en

ocasiones indeseable pero inherente a la colecta de datos en cristalografía de rayos X, el cual resulta en

ocasiones en detalles estructurales erróneos, impactando de manera negativa en el modelo final tanto

de manera específica como general (Owen et al. 2006). Así la estructura 3D generada en los

23

experimentos podría diferir de la estructura de la molécula de la proteína nativa (Carugo & Carugo,

2005).

Figura 5. Fenómenos físicos involucrados en la exposición de un cristal a los rayos X. Dispersión elástica o de

Thomson, inelástica o de Compton, efecto fotoeléctrico y generación de especies radiolíticas.

En términos generales el daño por radiación puede ser separado en daño primario y secundario. El daño

primario resulta de la absorción directa de los rayos X, es decir de la dispersión inelástica, la cual produce

un flujo de electrones secundarios propagados desde sus sitios de creación principalmente por

transferencias tipo túnel (Messer et al. 2000), así como una cascada de reacciones radioquímicas las

cuales ocurren en una escala de tiempo de femtosegundos (Teng & Moffat, 2000), donde la energía

absorbida no es distribuida de forma uniforme y por tanto es depositada en cantidades de 20-100 eV, en

áreas que inicialmente pueden ser de 50Å de diámetro; estas regiones se denominan “spurs” o espuelas

(Ravelli & McSweeney, 2000). El daño secundario involucra principalmente el movimiento por difusión

en el solvente de radicales y electrones de baja energía, los cuales afectan a cadenas laterales,

estructuras secundarias e incluso a moléculas completas (Warkentin & Thorne, 2010). A pesar de que no

se conozca con certeza la probabilidad relativa de que ocurran estos eventos, se ha estimado que cada

fotón absorbido puede producir aproximadamente 500 eventos de ionización a partir de fotones a 12

keV (O´Neill et al. 2002). El aumento de la energía térmica le permite a los productos reactivos la

difusión a través del cristal causando daños, esta difusión es además altamente dependiente del tiempo

(Garman, 1999). La interacción entre la radiación ionizante y el alto contenido de solvente en cristales de

24

proteínas (20-80% v/v) desarrolla un papel significativo en la liberación de radicales libres a partir del

solvente (radiólisis), dicho fenómeno es responsable de la generación de distintas especies radiolíticas

(Figura 6), entre las que destacan radicales OH• (radicales hidroxilo), H• (radicales hidrógeno), electrones

hidratados, así como protones, dichos productos generados en el medio de la proteína reaccionan con

distintas estructuras de esta, generando daño en su estructura (Burmeister, 2000). Sin embargo, las

primeras especies formadas por eventos de foto-absorción en el agua son los electrones hidratados así

como los radicales hidroxilo (Ravelli & McSweeney, 2000).

H2O H2O+• + e- (ionización)

H2O H2O* (ionización electrónica)

H2O+• + H2O H3O+ + •OH

e- +nH2O e-aq

H2O* H• + •OH

e-aq + H+ H•

Figura 6. Especies radiolíticas producidas por el daño primario al agua. Especies dependientes de la temperatura,

pH y otros factores (Modificado a partir de Ward, 1988).

Este daño generado por la radiación X incidente, el movimiento por difusión, las transferencias

electrónicas tipo túnel y especies radiolíticas está asociado con la ruptura de enlaces y modificaciones

estructurales. Estas modificaciones varían dependiendo del ambiente donde se encuentre el residuo

involucrado, pero ocurren preferentemente y por orden de facilidad de escisión sobre centros metálicos,

ruptura de puentes disulfuro (Figura 7), descarboxilación de ácidos aspárticos y glutámicos, pérdida de

hidroxilos en tirosinas y desmetilación de metioninas (De la Mora et al. 2011).

La interacción de las distintas especies generadas producto de la radiación depende del flujo de fotones

y el tiempo de vida individual de cada uno de los radicales generados en la proteína, así las reacciones de

recombinación tienden a ocurrir especialmente con flujos de fotones altos, los cuales deben de ser

similares o superiores a la tasa de radicales que se pierden (O´Neill et al. 2002).

Radiación ionizante

Radiación ionizante

25

Figura 7. Pérdida de las ocupaciones afinadas de las cisteínas libres y las cisteínas formando puentes disulfuro en

cristales de la proteína mirosinasa. Se muestra una notable disminución en el porcentaje de las cisteínas formando

puentes disulfuro al aumentar la dosis depositada (Modificado a partir de Burmeister, 2000).

El daño por radiación a una molécula también puede ser clasificado en base a la generación de especies

involucradas como: A, Daño directo: es el daño a una molécula debido a la dispersión inelástica de los

rayos X y/o la interacción directa con los electrones primarios y/o secundarios y B, daño indirecto, el cual

genera modificaciones al cristal de la proteína como consecuencia de la interacción con otras moléculas

dañadas, sus productos radiolíticos, el alto contenido de solvente en los cristales y los radicales

generados a partir de este (Kmetko et al. 2011 y De la Mora et al. 2011).

En proteínas que contienen centros metálicos, los iones metálicos son más susceptibles a la dosis

absorbida de radiación por rayos X que cualquier otro residuo de aminoácido presente, incluso con bajas

dosis de radiación depositada (Owen et al. 2006). Esta dosis de radiación depositada en el cristal de

proteína propicia la generación de dos efectos principales sobre los centros metálicos uno de ellos es la

reducción en el estado de oxidación de los mismos, debido a su capacidad de aceptar electrones por

parte de los metales, mientras que el otro impacta como una reducción en la ocupación de los centros

metálicos (De la Mora et al. 2011 y Carugo & Carugo, 2005). De la Mora y colaboradores (2012),

observaron que en el caso de las MCOs azules, la geometría de los centros metálicos, así como la

distancia entre los iones metálicos y sus ligandos varía dependiendo del estado de oxidación de los

átomos de cobre, sugiriendo que estas alteraciones son catalíticamente relevantes en la unión,

activación y reducción del O2. En el caso de la MCO-Tth los iones cobre que presenta aparecen

Átomos de S en cisteínas libres

Átomos de S en puentes disulfuro

Ocu

pac

ión

Afluencia de 1015 fotones/mm2

26

principalmente reducidos, si estos metales forman parte de centros redox, se puede generar incluso la

escisión parcial o total del metal, lo que se manifiesta como una reducción en la ocupación de estos

átomos metálicos y, como resultado de esto, en potenciales modificaciones estructurales producto de

esta escisión (Figura 8).

Figura 8. Pérdida de la ocupación del CuT2 coordinado por dos histidinas en la MCO-Tth, se observa en la imagen A,

dicho cobre con una ocupación de 0.16 esto después una dosis de radiación acumulada de 0.7 MGy. Al aumentar la

dosis de radiación hasta 1.4 MGy, imagen B, se observa la escisión total del CuT2 (ocupación 0). (Cálculos

considerando un flujo de 4.2x1010 fotones/segundo (Serrano-Posada, H., Tesis Doctorado, pág. 65).

Adicional al daño especifico descrito en párrafos anteriores, el cual impacta en el modelado final de la

estructura, existen otro tipo de efectos negativos que impactan sobre la calidad del cristal, y por tanto

sobre las estructuras tridimensionales generadas, a este tipo de daño se le denomina de manera

genérica como daño inespecífico o daño terciario, y es resultado inevitable de la colecta de datos y de la

exposición del cristal a los rayos X. Este tipo de daño se manifiesta esencialmente como una disminución

de la calidad global de los datos obtenidos, reducción del poder de difracción del cristal, resolución,

mosaicismo, así como aumento de los valores B, factores de temperatura o parámetros de

desplazamiento atómico (PDA) tanto globales como individuales (Figura 9) así como incremento de los

parámetros y volumen de la celda unitaria. El aumento en el volumen de la celda unitaria debido a la

absorción de los rayos X, se ha planteado que es debida a las repulsiones electroestáticas entre las

cargas que se generan por efecto de los electrones durante la exposición (Ravelli et al. 2002). Sin

embargo, el movimiento propio de las moléculas por el incremento en la temperatura, la generación de

gases y la radiólisis del solvente también podrían estar involucrados.

A B

27

Figura 9. Histograma del incremento relativo (%) de los PDAs para las cadenas laterales de distintos residuos en la

acetilcolinesterasa de Torpedo califórnica (TcAChE) como consecuencia de la irradiación en un sincrotrón. La línea

horizontal indica el aumento medio de los PDAs de las cadenas laterales. Los números a lo largo del eje x indican el

número de veces que se repite el residuo en la proteína. Las barras individuales muestran el incremento promedio

de cada residuo comparando un segundo dataset con un dataset de referencia (Modificado a partir de Weik, et al.

2000).

Como parte del estudio sobre el efecto de la dosis de radiación depositada en cristales de proteína, así

como sobre el impacto de la misma en la calidad y vida del cristal, Henderson (1990), mediante

observaciones en experimentos de microscopia electrónica, y asumiendo que los electrones y los rayos X

eran similares en su capacidades dañando el orden interno de las proteínas criopreservadas, propuso un

límite de dosis para los experimentos de cristalografía de proteínas criopreservadas a 77K, definido como

la dosis de radiación absorbida en la cual el cristal de una proteína pierde la intensidad de sus reflexiones

a la mitad de su valor original y el cual equivale a 2x107Gy. Años más tarde Owen y colaboradores, (2006)

recalcularon este límite de radiación tolerado utilizando cristales de ferritina en su forma apo y holo y

rayos X, considerando que el límite de dosis experimental no puede ser calculado solo en términos de la

disminución del poder de difracción, cambios en parámetros estadísticos como Rmeas, valor B de la gráfica

de Wilson, así como la calidad de la densidad electrónica de los residuos dañados fueron considerados,

obteniendo un número estimado de 3x107Gy y definido genéricamente como “límite de Garman”.

Incr

emen

to r

elat

ivo

de

los

PD

As

(%)

28

1.5 Preservación de los datos cristalográficos

Paralelo a la evolución de la cristalografía se han desarrollado distintas técnicas para lograr contender

contra los daños generados por los rayos X. El primero de estos acercamientos denominado

criopreservación se desarrolló bajo la premisa de que la difusión de especies radiolíticas producidas a

partir del solvente que rodea a los átomos de la proteína, disminuye significativamente al disminuir la

temperatura, evitando así la difusión y reacción de estos radicales y especies radiolíticas con los distintos

aminoácidos presentes en la proteína. Hoy en día es sabido que la disminución de temperatura en

cristales de proteína hasta 100 K genera un aumento, en algunos de los casos estudiados, de hasta el

70% en la tolerancia de la dosis de radiación, comparado con cristales de proteína irradiados a

temperatura ambiente (298 K), si bien la efectividad depende de la proteína, la fuente y sobre todo el

flujo de rayos X empleados, el contenido de solvente en el cristal, etc. (Nave & Garman, 2005). Se han

analizado en varias publicaciones las especies formadas por exposición a los rayos X, así como la

movilidad de las mismas en distintas condiciones para poder así explicar la efectividad de la

criopreservación. Se ha descrito la presencia de protones móviles en la forma de hielo amorfo a

aproximadamente 115K (Fisher & Devlin, 1995) y a pesar de que radicales OH• son atrapados en cristales

de hielo (Symons, 1999), se ha reportado su movilidad a 77K en cristales de ADN (Lange et al. 1995). De

la misma forma Jones y colaboradores (1987), así como Rao y colaboradores (1983), mostraron la

presencia de electrones móviles interactuando con estructuras de la proteína, principalmente puentes

disulfuro a temperaturas de hasta 77K.

Debido a la gran aceptación de las técnicas de criopreservación y su adopción en la colecta de datos en

cristalografía de rayos X, se siguieron desarrollando técnicas que permitieran aumenta la calidad de los

datos obtenidos. Lo anterior debido a que el simple uso de técnicas de criopreservación y la disminución

en la difusión de las especies radiolíticas por la reducción de temperatura, en muchos casos no fue

suficiente para mitigar el daño producido por la radiación en los cristales de proteína, esto considerando

además que las fuentes sincrotrónicas de rayos X generan flujos cada vez más intensos con la idea de

emplear cristales más pequeños, pero aumentando al mismo tiempo los daños causados por la dosis

depositada. Así se llegó al uso de compuestos que introducidos en el medio de la proteína, es decir el

líquido madre donde crecen los cristales, interaccionan más eficientemente que los átomos de las

proteínas con las especies radiolíticas, salvaguardando de esta manera a los átomos proteicos.

29

1.6 Agentes radioprotectores o scavengers

De esta manera se empezó a probar el uso de compuestos radioprotectores también denominados

scavengers como potenciales agentes protectores compatibles con el medio de la proteína, los cuales

pueden reducir el daño por radiación al menos en dos formas: 1) de manera competitiva, es decir

compitiendo con la proteína por los radicales libres y productos radiolíticos formados en el solvente y 2)

de manera regenerativa o restitutiva, reparando daños químicos generados en residuos específicos de la

proteína (p.ej. transferencia de H+ desde grupos sulfihidrilos a radicales biológicos formados) (Kmetko, et

al. 2011).

En la presencia o ausencia de compuestos radioprotectores, los centros producidos por los efectos

directos de la radiación, ya sea ganancia o pérdida de electrones pueden sufrir eventos de

recombinación generando un estado excitado el cual puede o no generar daño. Estos procesos de

recombinación compiten de forma activa con los eventos de migración. La migración de estos centros

reactivos puede ocurrir mediante efecto túnel (temperatura independiente) o mediante saltos o hopping

(temperatura dependiente) a sitios específicos dentro de la proteína donde los radicales tienden a

localizarse. Es preciso considerar que debido a estos eventos de recombinación se debe de proceder con

cautela en el uso de ciertos agentes radioprotectores ya que estos pueden ser radiolisados generando

radicales dentro de la proteína, los cuales a su vez pueden reaccionar con la proteína, aunque en un nivel

de varios órdenes de magnitud menor que los radicales primarios generados (O´Neill et al. 2002).

Con el fin de mitigar el daño por radiación en cristales de proteínas a temperatura ambiente, el primer

acercamiento al uso de agentes radioprotectores fue realizado por Zaloga y Sarma (1974) remojando

cristales de inmunoglobulina en una solución 1.2, 2 y 30mM de estireno y monitoreando su efecto en

dos reflexiones distintas a temperatura ambiente, encontrando que la concentración de 2mM generó

una mejora en la resolución pasando de 5.5 Å a 4 Å, además de propiciar un aumento de diez veces el

tiempo de vida del cristal. Sin embargo, en otros estudios se observó que usando concentraciones más

altas de estireno y a temperaturas de 100 K, la calidad de la difracción se vio deteriorada debido a la

polimerización del mismo (Murray & Garman, 2002). Cascio et al. (1984) encontraron que al sustituir el

agua en la solución madre con 10 a 20% (v/v) de polietilenglicol (PEG) con peso molecular de 4000 a

20,000 en los cristales de α-amilasa de páncreas de cerdo, canavalina y fructosa 1,6 difosfatasa, se

generaba una reducción en el daño por radiación evaluado como un aumento de 20 a 90 horas en el

tiempo de vida del cristal difractado en un generador de rayos X de ánodo rotatorio a 8 keV. Betts (2004)

remojó cristales de neuraminidasa N9 de virus de influenza con 0.5 M de ascorbato y al analizar los

30

mapas de densidad electrónica se encontró que solo existió una protección en los residuos exteriores de

la proteína, pero no existió protección para aquellos residuos que se localizan en el interior de la misma,

lo que sugirió para los autores una falta de penetración de las moléculas de ascorbato en el interior de la

proteína. De la misma forma se evaluó el efecto de la glucosa en concentraciones 0.5 M por 30 minutos y

12 horas en los mismos cristales de neuraminidasa N9, sin embargo en esta ocasión no se observó un

efecto favorable, solo se exacerbó el daño generado a los cristales. Murray y Garman, (2002) evaluaron

de nueva cuenta el efecto radioprotector del ascorbato, esta vez usando a la lisozima, a una

concentración de 1.0 M y mediante cocristalización, en esta ocasión se observó la protección de puentes

disulfuro así como una disminución en el incremento de los PDAs, tanto globales como específicos de los

residuos de cisteína, además de la disminución en el aumento del valor de B de Wilson comparándolos

contra el cristal nativo. De la misma forma con cristales de lisozima cocristalizados con ascorbato y

mediante el uso de un microespectrofotómetro, Murray & Garman (2002) observaron el efecto de

disminución de la señal a 400nm atribuible en el cristal nativo a la formación de radicales anión

disulfuro, mismo efecto que observaron McGeehan y colaboradores (2009), encontraron la misma

disminución en la señal a 400nm evaluada en los sistemas disulfuro usando 0.3 M y 1.0 M de ascorbato.

Sin embargo, al evaluar el compuesto TEMP (2,2,6,6-tetrametil-4-4piperidona) no se observó un efecto

de protección en los puentes disulfuro estudiados. Más tarde Barker y colaboradores (2009), estudiaron

el efecto diferencial de los scavengers de electrones solvatados (es-) y de radicales OH•, 1,4

benzoquinona y ascorbato respectivamente, ambos en la concentración de 0.5 M donde se observó en

ambos casos un aumento de la tolerancia a la dosis de radiación absorbida, una disminución en el

incremento de los valores de B de Wilson, así como en los ADPs globales y específicos de las cisteínas

involucradas en la formación de puentes disulfuro. De la Mora y colaboradores (2011), investigaron el

efecto de 0.1 M ascorbato mediante cocristalización y de 0.5 M de nitrato de sodio (ion nitrato)

remojado durante 4 y 8 minutos en cristales de lisozima, evaluando mediante microespectrofotometría

la aparición de señales a 580 nm atribuible a los electrones solvatados, así como la aparición de una

señal a 400 nm la cual corresponde a la formación del radical anion disulfuro RS-SR•´-, encontrando que

ambos compuestos aumentaban la tolerancia a la dosis de radiación absorbida de manera global y de

forma específica protegiendo a puentes disulfuro y residuos ácidos. Entre otros de los compuestos que

se han propuesto y evaluado como posibles agentes radioprotectores están el ácido nicotínico, ácido

5,5´ditiobis-2-nitro-benzoico, etanol, tiourea, metilmetacrilato, clorostireno, cisteína, glutatión, 2,3-

dicloro-1,4-naftoquinona, t-butanol, (N-2-hidroxi-etilpiperazina-N´-2-acido etenosulfonico (HEPES),

tris(hidroxi-metil)aminoetano (Tris), etilenglicol entre otros, con resultados variables dependiendo de la

proteína y las condiciones donde se evalúen (Macedo et al 2009). En la Tabla 1 se presentan algunos de

31

los agentes radioprotectores evaluados en la literatura, así como algunas observaciones de su efecto

protector en cristales de proteínas.

Tabla 1. Algunos de los agentes radioprotectores evaluados en la literatura y su efecto de protección en cristales de

proteínas.

PROTEÍNA RADIOPROTECTOR CONDICIÓN OBSERVACIÓN REFERENCIA

Neuraminidasa N9 (Virus Influenza)

0.5 M Ascorbato 12 hrs soaking o remojado

1.9M K3PO

4 pH 6.8 /

40%v/v glicerol

Protección solo de los residuos exteriores de la proteína.

Betts, 2003.

Neuraminidasa N9 (Virus Influenza)

0.5 M Glucosa soaking 1.9M K3PO

4 pH 6.8 /

40%v/v glicerol

Incremento en el daño generado en la proteína.

Betts, 2003.

Inmunoglobulina 2mM Estireno soaking --- Aumento de la resolución de 5.5 a 4Å así como aumento del tiempo de vida del cristal por un factor de diez.

Zaloga, et al. 1974

Lisozima (HEWL) Solución saturada de Estireno mediante Cocristalización

Acetato de sodio y NaCl pH 4.5 / Glicerol

Bajo estas condiciones no se observó un efecto detectable

Murray & Garman, 2002.

Lisozima (HEWL) 1.0 M Ascorbato mediante cocritalización


Protección de puentes disulfuro, mantenimiento de los PDAs y B-Wilson comparados con el cristal nativo.

Murray & Garman, 2002.

Lisosima (HEWL) 1.0 M 1,4 benzoquinona mediante cocritalizacion


Menor daño en las estructuras, protección específica en puentes disulfuro evitando su ruptura.

Barker, et al. 2009.

Lisosima (HEWL) 0.5M Ascorbato mediante cocritalizacion


Menor aumento en los valores B-Wilson comparado con cristales nativos así como de los PDAs de las Cisteinas.

Barker, et al. 2009.

Para fines de este proyecto se evalúo el uso de distintos compuestos radioprotectores principalmente

aquellos asociados con mecanismos de reacción de captura de electrones, electrones hidratados y

grupos hidroxilo. Entre los compuestos que se evaluaron se encuentran ejemplos clásicos de

radioprotectores como:

Nitrato de sodio: Se ha observado que en solución acuosa a temperatura ambiente, esta

pequeña molécula es un excelente captador del exceso de electrones (Anbar et al. 1967). Este

compuesto reacciona de forma exotérmica con los electrones solvatados (eaq-) presentes en el

medio con una constante de afinidad de k(eaq-)= 9.7 x 109 M-1 s-1 (Buxton et al. 1988), de acuerdo

a la Ecuación 1. De forma significativa y en altas concentraciones también se ha observado que

el nitrato intercepta a electrones pre-solvatados de forma eficiente con una afinidad de k= 1013

M-1 s-1 (Hiroki et al. 2002). De la Mora y colaboradores (2011) observaron la reducción dosis

dependiente del nitrato de sodio correlacionado con la protección generada sobre un puente

disulfuro vecino. Se presume que esta molécula interacciona con el ambiente propiciado por la

cascada de electrones generada después de los eventos de difracción e ionización, captando el

32

exceso de electrones, dicho compuesto se ha observado se ve reducido por acción de las

cascadas electrónicas, evitando así la reducción de residuos y centros metálicos dentro de la

proteína (Figura 10).

NO3- + eaq

- → NO32- + H2O → NO2 + 2OH-

Ecuación 1. Mecanismo de reacción del nitrato frente a los electrones solvatados (De la Mora et al. 2011).

Figura 10. A-D Reducción dependiente de la dosis absorbida de una molécula de nitrato. La densidad

electrónica de los aniones nitrato disminuye conforme aumenta la dosis de radiación depositada. Durante

la reducción del anión nitrato se observa la conservación de la densidad electrónica alrededor del puente

disulfuro; E-F, a dosis más altas (23.3 MGy) el NO3 reducido desaparece y de manera concomitante con

esto aparece el daño en el puente disulfuro (De la Mora et al. 2011).

Acido ascorbico/Ascorbato: molécula radioprotectora, la cual funciona en solución como un

poderoso antioxidante removiendo del medio radicales OH• de manera efectiva (kOH•= 8 x 109 M-1

s-1) (Schuler et al. 1974). Estas especies OH•, son radicales altamente oxidantes limitados solo

por la difusión, los cuales remueven electrones al interactuar con ellos, por ejemplo generando

eventos de descarboxilación en algunos residuos (Hug et al. 2000 y Wisniowski et al. 2002).

A B C

D

A.

E F

Cys 6

Cys 27

Cys 6

Cys 27

Cys 6

Cys 27

Cys 6 Cys 6 Cys 6

Cys 27 Cys 27 Cys 27

NO3

33

Cuando se trata de soluciones acuosas la primera especie formada es H2O•+, la cual rápidamente

se convierte en un radical hidroxilo, •OH, a través de la reacción indicada en la ecuación 2A. La

especie •OH ahora reacciona con el ascorbato de acuerdo a la ecuación 2B.

A H2O•+ + H2O → H3O+ + •OH

B AH- + •OH → AH• + OH- → A•- + H2O

Ecuación 2. A Mecanismo de formación del radical hidroxilo y B, reacción del ascorbato/ácido ascórbico

frente a los radicales hidroxilo (De la Mora et al. 2011).

Así mismo se considera que a altas concentraciones este radioprotector podría donar sus

electrones a sitios inicialmente dañados (De la Mora et al. 2011). Este efecto reparador se ha

observado sobre radicales triptófano formados, frente a los cuales en solución acuosa y a

temperatura ambiente el ácido ascórbico ha intervenido como un donador de electrones,

generando de nueva cuenta la especie neutra triptófano (Wardman, 1989)

Figura 11. Intensidades relativas sumadas de datasets sucesivos graficados contra la dosis absorbida. El

decaimiento en la intensidad es exponencial con la dosis, comportamiento de un cristal nativo de lisozima

comparado con un cristal co-cristalizado con 0.5M de ascorbato (Modificado a partir de Barker et al.

2009).

Inte

nsi

dad

re

lati

va I/

I 0

Dosis Absorbida (MGy)

nativo nativo 0.5M ascorbato

34

Conglomerados o “clúster” de tantalio: Tetradecabromuro de hexatantalio, Ta6Br2+12: Este grupo

de moléculas fue diseñado originalmente para realizar experimentos de reemplazo isomórfico

sobre ASP y ASN, para resolver el problema de fases. Dichos compuestos han demostrado

experimentalmente ser altamente afectados por la dosis absorbida, se ha observado que en

cristales remojados con conglomerados grandes de Ta6Br2+12, existe una absorción mayor que en

cristales derivatizados con otros metales como platino o SeMet en varios rangos de energía. El

clúster es un octaedro regular que consiste de seis átomos metálicos y 12 átomos de bromo a lo

largo de las doce esquinas del octaedro (Figura 12). El clúster es compacto, de forma casi

esférica con un radio aproximado de 4.3 Å. Una molécula de Ta6Br2+12 agrega 856 electrones a la

proteína, lo que aumenta de manera considerable el poder de difracción (Knäblein et al. 1997).

Jones et al. 1984 evaluaron el efecto del FeCN3-6, el cual actúa como un aceptor de electrones

móviles, observando que los electrones del medio son preferentemente transferidos al átomo

de Fe, el cual se reducirá, previniendo la transferencia de electrones hacia otras estructuras de la

proteína. Halliwell & Gutteridge (1999) observaron que compuestos y complejos que presentan

como parte de su estructura metales de transición actúan como aceptores de electrones libres y

por esta razón podrían ser utilizados para interaccionar con el ambiente propiciado por la

cascada de electrones generada después de los eventos de difracción e ionización, captando el

exceso de electrones, protegiendo de esta forma a residuos y centros metálicos. Sin embargo, se

advierte que la presencia de estos iones metálicos generan un aumento en la dosis de radiación

absorbida hasta niveles de radiación acumulada potencialmente dañinos para la proteína

cristalizada.

Figura 12. Tetradecabromuro de hexatantalio, Ta6Br2+12. El clúster es compacto, de forma casi esférica con

un radio aproximado de 4.3 Å.

35

Ciclofanos binucleares de cobre: De la misma forma que los clúster de tantalio, se evaluaran

nuevos compuestos producto de una colaboración con el Departamento de Investigación en

Polímeros y Materiales de la Universidad de Sonora y con el Centro de Investigación en

Alimentación y Desarrollo del mismo estado. Mediante la evaluación de estos compuestos de

estructura macrocíclica con dos iones cobre coordinados (Figura 13), se combinaran dos de las

estrategias planteadas para mitigar el daño por radicación una que involucra la presencia de los

metales presentes en su estructura, los cuales como se ha planteado anteriormente funcionan

como captadores de electrones y electrones solvatados, por otro lado se han evaluado las

capacidades antioxidantes (captura de radicales OH•) las cuales son similares a las que exhibe el

acido ascórbico (Sugich-Miranda et al. 2010).

Figura 13. Ciclofanos binucleares de cobre (Modificado a partir de Sugich-Miranda et al. 2010).

En soluciones alcalinas (pH por encima de 7), los compuestos presentan un cambio en su

geometría de coordinación pasando de una estructura octaédrica a una geometría plana

cuadrada, la cual presenta una mayor solubilidad además de una mayor actividad como

superoxido dismutasa. Sin embargo, para fines de este trabajo esta capacidad de dismutación

del anión superóxido no es relevante, ya que no es una de las especies involucradas en el daño

por radiación a cristales de proteína. Por otro lado, con respecto a sus capacidades antioxidantes

se demostró en el ensayo de capacidad de equivalentes antioxidantes TROLOX (TEAC por sus

siglas en inglés), que el compuesto Cu2PO (0.10g eq TROLOX mol-1) presenta una capacidad

antioxidante en el rango del ácido ascórbico (0.15g eq TROLOX mol-1), mientras que esta

capacidad antioxidante en el compuesto Cu2PC es menor (Figura 14). Se propone que las

diferencias entre las capacidades antioxidantes del Cu2PO y el Cu2PC pueden estar relacionadas

con su rigidez estructural, así como por la capacidad de estabilizar la conformación de

36

coordinación plana-cuadrada, la cual esta favorecida en pH´s alcalinos (Sugich-Miranda et al.

2010 & Medina-Salazar et al. 2013).

Figura 14. Capacidad antioxidante de los complejos ciclofanos de cobre Cu2PO y Cu2PC por el método TEAC

(Modificado a partir de Sugich-Miranda et al. 2010).

Si bien el uso de CuSO4 como radioprotector no se ha reportado en la literatura, se consideró entre los

compuestos a probar en este trabajo debido a su capacidad de captura de electrones dada por sus iones

metalicos, asi como su posible efecto restaurador de iones cobre en el sistema de la MCO-Tth.

1.7 Uso de datasets compuestos

Con el fin de minimizar los daños generados por la radiación de los rayos X en los datasets, Berglund y

colaboradores (2002) desarrollaron una metodología novedosa para estudiar el mecanismo de reacción

en metaloenzimas, en la cual mediante colectas distribuidas de manera sistemática de distintos datasets

procedentes de cristales individuales de peroxidasa de rábano, bajo las mismas condiciones y haciendo

uso de cristales de características similares en cuanto a sus medidas, se genera una titulación de los

cristales con las distintas dosis de radiación depositadas en cada uno de ellos (Figura 15), lo que permitió

generar una descripción molecular de los intermediarios que participan en el mecanismo catalítico de

esta enzima.

Cu2PO Cu2PC Acido ascórbico

37

Figura 15. A Estrategia de colecta de datos en múltiples cristales, se muestra la distribución de la dosis absorbida

de radiación por rayos X en función del ángulo de rotación en cristales individuales de peroxidasa de rábano. B,

construcción de datasets compuestos a partir de la información procedente de los datos individuales. Los datasets

compuestos representan las estructuras que recibieron distinta dosis de radiación depositada (Modificado a partir

de Berglund et al. 2002).

Esta técnica de obtención de información en cristalografía es una herramienta valiosa que permite

integrar los distintos datos obtenidos de manera individual e integrarlos de acuerdo a la dosis de

radiación recibida generando así un conjunto de datos representativo de la dosis depositada, sin

embargo se trata de un método de obtención de datos muy complejo que demanda mucho tiempo, así

como el uso varios cristales de características y tamaños similares, lo que en ocasiones es complicado de

obtener.

Sin embargo, los resultados de esta técnica al evaluar la depleción del CuT2 en la MCO-Tth, muestran

que incluso a las dosis más bajas de radiación probadas, equivalente a 0.7 MGy y 1.4 MGy se observa la

pérdida de la ocupación de este metal en la proteína en un 84 % y 100% respectivamente, en

comparación con la misma dosis depositada (0.7 MGy) en donde los CuT1 y los dos CuT3 (CuT3 y CuT3´)

solo han perdido 0%, 57% y 0% respectivamente (Serrano-Posada & Rudiño-Piñera, en preparación).

Do

sis

reci

bid

a d

e ra

yos

X (

%)

Do

sis

reci

bid

a d

e ra

yos

X (

%)

Intervalo de ángulos

A. Data sets individuales B. Data sets compuestos

Intervalo de ángulos

38

1.8 Uso de líneas de alta y baja energía

Otro posible mecanismo que se ha explorado para disminuir el daño por radiación es el uso de líneas de

alta energía (20 a 40 keV) con cristales de proteína (Paithankar et al. 2009). Esto bajo el fenómeno físico

de que el daño por radiación es dependiente de la longitud de onda, del flujo de los rayos X y de que el

daño por radiación es independiente de la energía incidida, pero dependiente de la energía depositada

en el cristal.

El uso de radiación sincrotrónica, haciendo uso de intensidades muy altas, solo ha sido posible gracias al

desarrollo de anillos de almacenamiento para electrones de alta energía. Experimentos haciendo uso de

estos fotones de alta energía han demostrado que la difracción de alta energía (Hastings et al. 1989),

dispersión de Compton o dispersión de muestras amorfas (Poulsen et al. 1994), así como experimentos

de espectroscopía en el nivel k haciendo uso de materiales con número atómico alto (Z) así como

dispersión magnética no resonante, genera beneficios gracias al aumento de la energía primaria de los

fotones (Tschentscher et al. 1998).

Uno de estos estudios realizado a 100 K utilizando cristales de lisozima de huevo de tamaño conocido y

constante (0.4mm) haciendo uso de dos distintas longitudes de onda; energía alta (55.6 keV) así como

energías utilizadas de manera típica en cristalografía de rayos X (12 keV), permitió observar una

disminución en la tasa de daño debida a la radiación cuando se hizo uso de energías altas, debido a la

menor dosis de radiación depositada en los cristales de proteína. Lo anterior a pesar de que cuando se

hace uso de longitudes de onda más cortas se incrementan los tiempos de colecta de datos

comparándolos con los tiempos utilizados en los experimentos realizados en las líneas de energía

usuales (Jakoncic et al. 2006).

En otra serie de experimentos Shimizu y colaboradores (2007), monitorearon el daño por radiación en

cristales de lisozima de huevo en nueve distintas longitudes de onda de rayos X pasando desde baja

energía hasta energías altas (6.5, 7.1, 8.3, 9.9, 12.4, 16.5, 20, 24.8 y 33 keV), observando que la

degradación de las estadísticas cristalográficas es independiente de la energía incidente, pero el daño es

proporcional a la dosis absorbida por el cristal. Es importante considerar que la intensidad de las

difracciones generadas por los fotones incidentes disminuye, en tanto la energía de este aumenta. Estos

resultados que fueron satisfactorios en el uso de líneas de alta energía dejan en manifiesto la

importancia de conocer los fenómenos físicos que se llevan a cabo en la proteína como producto de la

interacción de la materia con los fotones incidentes producto de los rayos X (Figura 16). Los cuales

39

cuando se usan líneas de alta energía se ven modificados, un claro ejemplo de esto es el aumento del

efecto Compton; a medida que la energía del fotón incidente aumenta (longitudes de onda cortas), la

probabilidad de que este interactúe con los átomos de la proteína como un todo disminuye,

aumentando así la probabilidad de interactuar con los electrones individuales, disminuyendo de manera

adicional los coeficientes de absorción y atenuación por parte de la muestra, lo que se traduce como una

potencial disminución de la dosis de radiación absorbida. De forma contrastante con el aumento de

probabilidad de ocurrencia de este fenómeno, la dispersión de Rayleigh que es la responsable de la

formación del patrón de difracción pierde probabilidad de ocurrencia disminuyendo así la intensidad de

las difracciones generadas (Paithankar & Garman, 2010).

Figura 16. Contribución relativa (%) al efecto fotoeléctrico, efecto Compton (dispersión inelástica) y efecto

Thomson (dispersión elástica) explorando distintas energías (keV) en un cristal de lisozima de dimensiones 0.1 x 0.1

x 0.1mm, usando un haz de tamaño constante. (Modificado a partir de Paithankar & Garman, 2010).

De manera complementaria con el uso de líneas de alta energía, también se ha considerado evaluar el

daño por radiación haciendo uso de energías bajas (longitudes de onda altas), en donde la intensidad de

las difracciones por fotón incidente es mayor que la que se genera haciendo uso de altas energías

(Lehmann et al. 1993; Stuhrmann et al. 1995 y 1997; Behrens et al. 1998; Weiss et al. 2005). Además de

que la absorción es mayor para cristales gruesos es aun pequeña para cristales delgados (Blundell &

Johnson, 1976 y Nave, 1995). Otra posible ventaja de la radiación de baja energía es su posible

utilización en las difracciones anómalas cerca de los límites de absorción de elementos ligeros como el

40

azufre (2.47 keV) y el fósforo (2.14 keV), esto en aquellos cristales donde dichos elementos se

encuentran presentes en las macromoléculas (Boesecke et al. 2009).

De esta forma y por consiguiente se evaluará el perfil de daño generado en los cristales de la MCO-Tth

utilizando líneas de alta y baja energía explorando las ventajas y desventajas del uso de estas energías en

fuentes sincrotrónicas para la obtención de datos estructurales que nos permitan preservar la ocupación

de los iones metálicos en el sitio catalítico.

1.9 Atenuación de la intensidad del flujo

Durante la colecta de datos cuando el flujo de rayos X es muy grande, especialmente cuando se trabaja

en sincrotrones de tercera generación, y el flujo impacta de forma negativa en las muestras debido al

daño por radiación, se hace uso de otra estrategia de colecta denominada atenuación (Weik et al. 2000).

En términos generales consiste en colocar materiales con alta absorción o deflexión (dispersión) de rayos

X (por ejemplo laminas de aluminio o foils), los cuales mediante su interacción con la materia reducen el

flujo de fotones/segundo que interactúan finalmente con la muestra, reduciendo de esta forma la dosis

de radiación absorbida por la misma. En la Figura 17 se muestra el efecto de los atenuadores y su

impacto en la disminución del flujo de rayos X que interaccionan con la muestra.

Figura 17. Disminución del flujo de los rayos X por efecto de los atenuadores. Se observa una reducción del 20% del

valor de flujo en cada ocasión que los rayos X atraviesan a los atenuadores en su camino desde la fuente hasta la

muestra y el detector, resultando de esta forma en una reducción del 80% del flujo después de la colocación de 4

atenuadores, lo que impacta en la dosis de radiación que recibe el cristal.

41

2. Hipótesis

Es posible preservar la ocupación de los sitios metálicos en la MCO de Thermus thermophilus (MCO-Tth)

manipulando los daños por radiación al utilizar distintos métodos de preservación estructural.

Si consideramos que los rayos X son responsables del 85% de la información 3D que conocemos y que

aproximadamente una tercera parte de las proteínas conocidas contienen metales, el encontrar las

condiciones en que la información 3D de rayos X puede preservarse en estas proteínas tiene una

importante aplicabilidad en estudios catalítico/estructurales.

3. Objetivo General

Evaluar el efecto de la dosis absorbida sobre los cristales de la MCO-Tth a energías de 8 keV y a energías

de 12 keV con y sin atenuación del flujo. Así como, evaluar el efecto de scavengers de electrones y

radicales OH• a las energías en que comúnmente se difractan cristales proteicos (12 keV). Por último

explorar la reducción del efecto fotoeléctrico utilizando fuentes de rayos X a más de 30 keV.

3.1 Objetivos Particulares

Determinar el daño generado a la MCO-Tth por efecto de dosis de radiación acumulada y evaluar

el impacto de dicho daño en los cobres presentes en la proteína, residuos, estructura general,

calidad de los datos y modelos generados.

Evaluar el efecto de la intensidad de los rayos X en cristales de la MCO-Tth asociados a la escisión

de iones cobre, particularmente del CuT2, utilizando fuentes sincrotrónicas de energía estándar

(12keV) y ánodo rotatorio de cobre (8keV).

Determinar el impacto de la atenuación en líneas sincrotrónicas evaluado en la preservación de

los sitios metálicos en la MCO-Tth, contrastándolo con los datos de flujo no atenuado.

Evaluar el efecto de líneas de la alta energía (<30 keV) en la reducción del efecto fotoeléctrico y

la disminución en la depleción de iones cobre.

Describir el efecto de compuestos radioprotectores de distinto tipo y a diferentes

concentraciones para disminuir la escisión de iones cobre en cristales de la MCO-Tth

evaluándolos bajo distintas condiciones de irradiación de rayos X (fuentes sincrotrón).

42

4. Sección experimental

4.1 Sobreexpresión y purificación de la MCO-Tth recombinante

El proceso de biología molecular fue realizado durante la tesis de Maestría en Ciencias Bioquímicas de

José David Ruiz Aguilar, estudiante de la Dra. Brenda Valderrama Blanco (IBT-UNAM). Ellos clonaron el

gen de la MCO-Tth en el plásmido pET-32a siguiendo el protocolo descrito por Miyazaki (2005) y

transformando a las células competentes de Escherichia coli BL21 con el plásmido pET-32a.

Posteriormente la Tec. María Guadalupe Paredes Váldez transformó y creció a las células competentes

en una caja petri con agar utilizando medio LB con 200 μg mL-1 de ampicilina y 20 μg mL-1 de tetraciclina

a 37°C.

Para realizar el proceso de sobreexpresión (Serrano-Posada et al. 2011) se tomó una colonia y se incubó

en 30 mL de medio LB con una concentración final de 200 μg/mL de ampicilina y 20 μg/mL de tetraciclina

durante 12 horas con agitación constante a 30°C. Se inocularon 2L de medio LB con 10 mL del pre-

inóculo y se adicionaron 200 μg/mL ampicilina y 20 μg/mL de tetraciclina bajo agitación constante a 30°C

hasta que la densidad óptica a 600nm alcanzara un valor de 0.5. Tres horas después de la adición del

pre-inóculo se realizó la inducción de los 2 L del LB adicionando 0.1mM de IPTG y se incubaron a 30°C

con agitación constante durante 24 h.

Las células obtenidas se separaron por centrifugación (7,000 rpm, 30 min, 4°C). El precipitado celular

obtenido se resuspendió en 50 mL de 20mM Tris pH 8.0 a 4°C al que previamente se le habían

adicionado una tableta del inhibidor de proteasas “Complete libre de EDTA” y desoxirribonucleasa

(1µg/mL). La mezcla obtenida fue “sonicada” en hielo bajo pulsos intermitentes (3 ciclos de 2 minutos

c/u) con 1 minuto de reposo entre cada ciclo. La mezcla obtenida de células lisadas y extracto crudo fue

calentada utilizando un baño maría a 65°C, durante 20 minutos para precipitar así las proteínas

termolábiles de E. coli. Se centrifugó la mezcla obtenida a 10,000 rpm durante 45 minutos a 4°C y se

desechó el precipitado celular. El sobrenadante se dializó contra cinco volúmenes del amortiguador

20mM Tris pH 8.0 y 0.1mM CuSO4, con cambio cada 12 horas c/u, utilizando una membrana de diálisis de

30 kDa de corte molecular para obtener la forma holo de la MCO-Tth.

El sobrenadante obtenido después de la diálisis se aplicó a una columna de intercambio catiónico (SP

Sepharose Fast Flow, GE Healthcare), la cual fue pre-equilibrada con 20mM Tris pH 8.0 y lavada con

varios volúmenes del mismo amortiguador. Posteriormente la muestra se eluyó con un gradiente lineal

43

de NaCl de 0-1 M en la misma solución amortiguadora de equilibrio con un flujo de 2 mL/min. El pico

correspondiente a la MCO-Tth se colectó y posteriormente se concentró por ultrafiltración (Amicon

Ultra-15, Millipore) con una membrana de corte molecular de 30 kDa, posteriormente se inyectó en una

columna de exclusión molecular (SuperDex 75, GE Healthcare) pre-equilibrada con 20mM Tris pH 8.0,

50mM NaCl. La MCO-Tth se eluyó con un flujo de 1 mL/min.

Después de cada purificación se realizaron electroforesis desnaturalizantes (SDS-PAGE) al 12 % para

detectar el pico correspondiente a la MCO-Tth. En todos los casos los geles fueron teñidos con azul de

Coomassie. La proteína pura obtenida se cuantificó mediante el método de Bradford (Bradford, 1976).

4.2 Cristalización

Las pruebas de cristalización se realizaron con el método de difusión en fase vapor bajo la modalidad de

gota colgante y gota sedente. Los cristales de la MCO-Th se obtuvieron bajo la metodología desarrollada

por el ahora Dr. Hugo Serrano Posada, en la condición de cristalización 35 del Crystal Screen II (Hampton

Research) la cual está compuesta de 0.1 M Hepes pH 7.5 y 70 % v/v (+/-)-2-metil-2,4-pentanodiol (MPD)

y una concentración de proteína de 19.5 mg/ml en 20mM Tris pH 8.0. Sin embargo estas condiciones se

optimizaron al diseñar diferentes matrices variando la concentración de MPD: 60, 65 y 70%, la

concentración de proteína: 20 y 30 mg/ml, el volumen de proteína/agente precipitante utilizado 1μL/1μL

y 2μL/2μL. El volumen dentro del reservorio en la modalidad de gota colgante fue de 1 mL y en la

modalidad de gota sedente fue de 0.5 mL. Una vez colocadas las muestras de proteína/agente

precipitante se procedió a utilizar la técnica de microseeding. En dicha técnica una gran cantidad de

núcleos cristalinos se transfirieren a partir de cristales previamente obtenidos a gotas frescas de solución

de proteína/agente precipitante haciendo uso de una fibra natural (seeding tool de Hampton Research).

Se observaron cristales pequeños después de un par de semanas, sin embargo se necesitaron entre 1-2

meses para conseguir las dimensiones adecuadas para poder ser útiles en experimentos de difracción de

rayos X. Todas las gotas tuvieron un volumen final de 2 μL, con proporciones iguales de solución de

proteína y solución del reservorio (agente precipitante) (1 + 1 μL). Las condiciones de cristalización se

realizaron a 4°C y se utilizó agua tetradestilada. Los ensayos de soaking o remojado, utilizando nitrato de

sodio, ascorbato de sodio, clústeres de tantalio, sulfato de cobre y paraciclofanos binucleares de cobre y

fierro se realizaron con distintos tiempos de “remojado” en cristales con las dimensiones adecuadas para

44

ser difractados, a la misma temperatura y tamaños similares a los cristales nativos, asegurando la

concentración final de scavenger o radioprotector.

En términos generales la preparación de todas las soluciones de soaking, no presentaron mayores

contratiempos. Sin embargo, con respecto a la preparación de las soluciones de los cristales remojados

en el paraciclofano binuclear Cu2PO se presentaron problemas de solubilidad en el rango de pH del

amortiguador utilizado para el soaking (0.1 M Hepes pH 7.5). Este compuesto fue solubilizado de manera

distinta utilizando la cantidad molar equivalente de NaOH para lograr neutralizar cada uno de los grupos

carboxilato presentes en esta molécula con su contra ión Na+, de esta manera se logró formar el

carboxilato de sodio el cual presenta propiedades de solubilidad y geometría óptimas. Lo anterior

permitió la solubilización total del compuesto, manteniendo al compuesto en su forma soluble en el pH

requerido.

4.3 Colecta de datos

Los primeros datos de difracción se obtuvieron en Diciembre de 2011 en la línea X6A del National

Synchrotron Light Source, NSLS (Upton, New York). Los datos fueron colectados utilizando un detector

ADSC Quantum-270 (CCD) y el criopreservador empleado contenía 0.1 M Hepes pH 7.5 y 65% MPD. Se

colectaron 4 datasets procedentes de cristales nativos con límites de resolución entre 1.60 y 2.25 Å para

la MCO-Tth, sin embargo solo uno de los datasets permitió ser integrado y afinado con una estadística

aceptable, el cual fue dividido en ocho datasets individuales, mismos que permitieron realizar un estudio

comparativo del aumento de dosis de radiación en un cristal. En Diciembre de 2011 se realizó otra

colecta de datos en esta ocasión en la línea ID15A del European Synchrotron Radiation Facility, ESRF

(Grenoble, Francia), línea de alta energía no acondicionada para cristalografía de proteínas, utilizando un

detector MAR345 (Image plate) en esta ocasión se colectaron 4 datasets correspondientes a 3 cristales

nativos, donde uno de dichos cristales ya había sido difractado con anterioridad (1.60Å) en la línea X6A

del NSLS, pero en distinta zona del cristal. De nueva cuenta en las mismas instalaciones del NSLS (Upton,

New York) pero en Marzo del 2012, en las líneas X4A y X4C se obtuvieron nuevos datos de difracción

utilizando el detector ADSC Quantum-4R (CCD) y MARCCD 165 respectivamente. Se utilizó el mismo

criopreservador así como diversos agentes radioprotectores, con distintos tiempos de soaking, donde se

colectaron siete datasets, de los cuales cuatro fueron integrados resultando en estructuras con

estadísticas aceptable con límites de resolución máxima entre 1.50-1.90 Å.

45

En Junio del 2012 se realizó una cuarta colecta de datos de nueva cuenta en la línea X6A del NSLS,

haciendo uso de un detector ADSC Quantum-270 (CCD), en esta ocasión se colectaron datos a partir de

diecinueve cristales, haciendo uso del mismo criopreservador así como diversos agentes

radioprotectores con distintos tiempos de soaking, de los cuales cinco de estos generaron datasets,

mismos que fueron integrados y afinados resultando con estadísticas aceptables y límites de resolución

máxima entre 1.55-1.82 Å.

Adicionalmente se obtuvo una quinta colecta de datos en Octubre del 2012 en el Laboratorio Nacional

de Estructura de Macromoléculas en el Instituto de Química de la U.N.A.M, haciendo uso de un equipo

ánodo rotatorio modelo Rigaku micromax-007 HF acoplado con un detector R-AXIS IV++. La información

procedente de los datos de colecta de cuatro cristales nativos con distintos tiempos de exposición por

imagen, donde solo tres de los cristales presentaron una estadística aceptable después de su integración

y afinamiento, con límites de resolución máxima entre 1.6 y 2.0 Å.

En Febrero del 2013 se realizó una sexta colecta de datos de nueva cuenta en la línea X6A del NSLS,

haciendo uso de un detector ADSC Quantum-270 (CCD) y atenuación mediante foils de aluminio. Sin

embargo, en esta ocasión solo se colectaron los datos de un cristal, el cual generó dos estructuras

representativas de la misma zona del cristal, pero con distinta dosis depositada. Los datos obtenidos

fueron integrados de manera satisfactoria resultando en estructuras con estadísticas aceptables y

resoluciones máximas entre 2.3 y 2.5 Å. Cabe señalar que todas las colectas de datos se realizaron

utilizando un flujo de nitrógeno continuo a 100 K.

4.4 Procesamiento de la información

Se determinaron las estructuras tridimensionales por difracción de rayos X de la MCO-Tth utilizando

distintas aproximaciones para evaluar y mitigar el daño por radiación sufrido principalmente en sus

centros metálicos, residuos y cadenas principales, así como el daño inespecífico generado.

La primera aproximación realizada para la integración de los datos procedentes de la difracción de los

cristales se realizó mediante el programa Mosflm y el escalamiento de los mismos se realizó mediante el

programa Scala (CCP4). Sin embargo, con fines de mejorar la estadística, la determinación final de las

medidas de la matriz del cristal (autoindexado), la estimación del mosaicismo, la multiplicidad y la misma

integración de los datos se realizó con el programa XDS (Kabsch, 2010). El ordenamiento, escalamiento

de los datos y la generación de la estadística de la colecta se realizó en XSCALE (Kabsch, 2010). La

46

resolución de fases para la estructura se generó mediante un remplazo molecular haciendo uso del

programa PHASER (CCP4) (McCoy et al. 2007), a partir del modelo de la MCO de Thermus thermophilus

HB27 (PDB 2XU9), el cual había sido previamente editado borrándole las coordenada de moléculas de

agua, ligandos y iones cobre. El afinamiento de cuerpos rígidos y restricción geométrica se realizó en el

programa Refmac5 (CCP4) (Murshudov, 1997). La adición de ligandos y iones cobre se realizó de manera

manual en el programa Coot (Emsley & Cowtan, 2004), mientras que la adición de moléculas de agua, así

como los ciclos de afinamiento para la construcción de los modelos finales se realizaron en el programa

PHENIX mediante varias iteraciones (Adams, 2010) (Figura 18).

Es notable considerar que las ocupaciones de los iones cobre en el CTC fueron ajustadas de forma

manual para que sus valores PDA fueran similares a los de su ambiente de coordinación, ya que la

asignación de ocupaciones no fraccionales dio lugar a PDAs significativamente mayores a los del

ambiente de coordinación, los cuales generaban errores sustanciales en los mapas de diferencias (Bento

et al. 2005 y De la Mora et al. 2012)

Figura 18. Algoritmo de integración (XDS), escalamiento (XSCALE), conversión de formato (XDSCONV) modelado

(Coot) y afinamiento (Phenix/Refmac5) de los datos de colecta hasta la generación de una estructura afinada.

47

Es preciso considerar que en cada uno de los programas utilizados para la integración, escalamiento,

modelado y afinamiento de los datos se cuidaron todos los parámetros estadísticos que dan validez

experimental a los datos, lo cual asegura la calidad de la estructura cristalográfica generada.

4.5 Dosis de radiación absorbida

Con el fin de poder establecer una relación entre el cambio y daños generados entre estructuras se hace

uso de un parámetro de comparación que está íntimamente relacionado con el daño generado a las

estructuras cristalinas y a la información procedente de ellas. Este parámetro es la dosis de radiación

absorbida (D), la cual describe la cantidad de energía depositada en la superficie de una muestra (Gy ≡ J

kg-1), la cual es el producto del coeficiente de absorción de la muestra, µ/ρ (cm2 g-1), la energía del fotón,

E (eV), el número de fotones/segundo, n, y la duración de la irradiación, t (s), sobre el área incidida, A

(µm2) (O´Neill et al. 2002).

Para conocer la dosis de radiación absorbida en un cristal de proteína, es preciso conocer algunos datos

básicos como el tamaño del cristal, las dimensiones de la celda unitaria, el número de monómeros

presentes en la unidad asimétrica, el número de residuos presentes en la proteína, la cantidad milimolar

de átomos pesados presentes en la proteína y el solvente, así como otros parámetros referentes a la

colecta de los datos y al haz utilizado como son su tamaño, la apertura de los slits utilizados, la energía

de los fotones incidentes (keV), la densidad de flujo de los rayos X, el tiempo de exposición por imagen y

el número de imágenes colectadas en cada dataset (Paithankar & Garman, 2010).

Es preciso conocer la presencia de cualquier átomo pesado que se encuentre unido a la proteína (por

ejemplo clústers de tantalio), ya que la presencia de estos aumenta de manera considerable el

coeficiente de absorción de los rayos X por parte de la proteína (Paithankar & Garman, 2010), lo que

incrementa por consiguiente la dosis de radiación absorbida. De la misma forma las moléculas de

solvente, ya sea en el líquido madre o en el criopreservador, juegan un papel importante en la dosis

absorbida total, en particular si el cristal fue remojado en soluciones que contienen átomos pesados

(Murray et al. 2005).

Con los datos obtenidos anteriormente y haciendo uso del programa para cálculo de dosis RADDOSE

versión 2.0 (Paithankar & Garman, 2010) se realiza el cálculo de la misma a partir de un archivo de

entrada (input), obteniéndose un archivo de salida (output), el cual presenta datos importantes como

son la dosis absorbida para un determinado número de exposiciones de determinada duración, el

48

tiempo necesario para alcanzar la dosis limite acumulada en el cristal de 30 MGy (Owen et al. 2006) o

alguna dosis predeterminada por el usuario, el coeficiente de atenuación compuesto por el efecto

fotoeléctrico, así como la proporción de energía relacionada con las dispersiones elásticas e inelásticas,

el aumento de temperatura en el cristal, el número de fotones absorbidos por celda unitaria por dataset

y la fracción del haz que impacta al cristal (Figura 19) (Paithankar & Garman, 2010).

El programa RADDOSE considera todos los eventos físicos que ocurren en un cristal con la excepción del

escape fotoeléctrico (el cual solo es significativo en el caso de cristales muy pequeños y en flujos de

rayos X de alta energía). RADDOSE asume que el cristal es estacionario durante la irradiación. Para

cristales más pequeños o iguales al tamaño del haz no se genera error en el cálculo, sin embargo para

cristales más grandes que el haz esta suposición causa que la dosis quede sobreestimada, ya que

conforme el cristal es rotado nuevas partes de este son irradiadas por el mismo. Con el fin de tomar en

consideración este parámetro, las dimensiones del cristal así como la orientación de este con respecto al

eje de rotación deben de ser conocidas (Murray et al. 2005).

Sin embargo es preciso señalar que los parámetros indispensables para conocer la dosis absorbida son el

tamaño, energía e intensidad del flujo de fotones. Dichos parámetros implicados en la medición de

fotones incididos/unidad de área son independientes en algunas líneas o equipos del flujo de la corriente

del anillo de almacenamiento de electrones. Sin embargo, en algunas otras es dependiente de la

corriente del anillo y como resultado de esto, el flujo disminuye a lo largo del día y de la colecta,

pudiendo así sobreestimar el valor de este dato, lo que genera un cálculo de dosis de radiación mayor

que la dosis real depositada. Con el fin de conocer de manera más precisa el flujo que presenta la línea

de rayos X en el momento de la colecta, se realizaron calibraciones de las líneas haciendo uso de un PIN

fotodiodo, el cual permite conocer mediante una conversión el número de fotones/unidad de área que

se irradian a determinada corriente del anillo de almacenamiento. Detalles referentes al PIN fotodiodo

asi como el cálculo del flujo se encuentran en el Apendice de este trabajo.

49

Figura 19. A Archivo de entrada (input) y B, archivo de salida (output). En ambos casos se muestran los parámetros

que deben de ser utilizados para el cálculo final de la dosis de radiación depositada, haciendo uso del programa

RADDOSE y usando como ejemplo los datos de una fosfofructocinasa de Thermotoga maritima (PPK) (Paithankar &

Garman, 2010).

5. Resultados y Discusión

5.1 Sobreexpresión y purificación de la MCO-Tth recombinante

La metodología que se utilizó para la sobreexpresión y purificación de la MCO-Tth consistió en algunas

modificaciones del protocolo descrito por José David Ruiz Aguilar y el ahora Dr. Hugo Serrano Posada

(Serrano-Posada et al. 2011) con el objetivo de obtener una proteína de alta pureza. El rendimiento

obtenido fue de 7.5 mg de MCO-Tth por litro de cultivo. En el primer análisis electroforético que se

realizó después de la cromatografía de intercambio catiónico (SP Sepharose Fast Flow, GE Healthcare)

(Figura 20 A) se observan algunos contaminantes en la MCO-Tth (Figura 20 B). Estos contaminantes se

eliminaron completamente con una cromatografía de exclusión molecular (SuperDex 75, GE Healthcare)

(Figura 21 A), lo cual se puede observar en el análisis electroforético realizado después de dicha

cromatografía (Figura 21 B).

50

Figura 20. A Cromatograma de la muestra obtenida después de dializar al extracto bacteriano conteniendo a la

MCO-Tth, usando una columna de intercambio catiónico (SP Sepharose Fast Flow, GE Healthcare) y B,

electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE 12%. Carril 1 marcador de peso molecular Fermentas, carriles 2-4 las

fracciones obtenidas a partir de la purificación.

Figura 21. A Cromatograma de la MCO-Tth después de la cromatografía de intercambio catiónico usando una

columna de exclusión molecular (SuperDex 75, GE Healthcare) y B, electroforesis desnaturalizante 12 % SDS-PAGE.

Carril 1 y 2 (distintas concentraciones) banda única de ~ 50 kDa que corresponde al peso molecular aproximado de

la MCO-Tth. La proteína purificada exhibió el color azul característico de las MCOs, carril 3 marcador de peso

molecular Fermentas.

A B

A B

1 2 3 4

1 2 3

51

5.2 Determinación cualitativa de los cobres T1 y T3

Se determinó cualitativamente la presencia de los cobres T1 y T3 por medio de un espectro de UV-

Visible. Se observó el pico característico de absorción a aproximadamente 600-610 nm correspondiente

al CuT1 y un pequeño hombro a aproximadamente 330 nm correspondiente a los dos CuT3 acoplados

por un grupo hidroxilo (Figura 22).

Figura 22. A Espectro UV-Visible de la MCO-Tth en 20 mM Tris pH 8.0. Se muestra la presencia de los cobres T1 y

T3, mediante sus picos característicos de absorción a 610 (CuT1) y 330 nm (CuT3). B, espectro de la MCO-Tth en su

forma apo (Serrano-Posada, H., Tesis Doctorado, pág. 34).

5.3 Cristalización

Se observaron los primeros cristales de la MCO-Tth en la prueba de cristalización 0.1 M Hepes pH 7.5 y

60, 65 y 70 % MPD, bajo la modalidad de gota colgante y gota sedente. Sin embargo los cristales crecidos

bajo las concentraciones de 65% y 70% MPD en la modalidad de gota colgante y gota sedente (Figura

23), son los que presentaron un tamaño mayor así como hábito cristalino adecuado y fueron totalmente

azules (lo que indica la presencia del CuT1 y correlaciona con los datos obtenidos del espectro UV-visible

presentado anteriormente). Se obtuvieron cristales pequeños después de 1 a 2 semanas, sin embargo se

necesitaron entre 1 y 2 meses para crecer y tener las dimensiones adecuadas (mayores a 50µm) para

poder ser utilizados en experimentos de difracción de rayos X.

A B

52

La proteína no cristalizó en concentraciones distintas de 20 mg/ml en ningún porcentaje de MPD,

tampoco se lograron resultados satisfactorios al variar las cantidades de proteína/agente precipitante

colocadas en la gota de cristalización por encima de 1 + 1 μL.

Figura 23. Cristales de MCO-Tth crecidos a 4°C y una concentración de proteína de 20 mg/ml. Se presentan los

cristales crecidos en 0.1 M Hepes pH 7.5 y 60, 65 y 70% (v/v) de MPD, mediante el método de gota colgante

utilizando microseeding.

5.4 Impacto de la dosis de radiación absorbida en la MCO-Tth

Como se mencionó anteriormente, la primer colecta de datos se realizó en el NSLS, específicamente en

la línea X6A, la cual es considerada una línea de energía estándar (12.7 keV) que opera con una longitud

de onda de 0.979Å, esta línea presenta las siguientes características: Efecto fotoeléctrico: 2.6 cm2/g,

efecto Compton: 0.21 cm2/g, efecto Rayleigh: 0.2 cm2/g (Valores determinados utilizando RADDOSE). En

esta serie de experimentos se colectaron datos de 4 cristales, sin embargo con fines de análisis solo se

consideraron los datos obtenidos de uno de ellos.

Los datos analizados representan 2690 imágenes de difracción, sin embargo, para asegurar que la

superficie expuesta a los rayos X fuera idéntica y aditiva, se determinó cada una de las 8 estructuras

utilizando los mismo 110 grados en cada caso. De esta manera la primera estructura se determinó con

las imágenes 1 a 110, mientras que la segunda se determinó usando las imágenes 361 a 471 y la octava

estructura se generó usando las imágenes 2521 a 2631. Es importante mencionar que entre las imágenes

utilizadas se mantuvo la colecta, por lo que entre la primera y segunda estructura, por ejemplo, el cristal

fue expuesto por 360 segundos, y así consecutivamente. Con estos data sets se determinaron ocho

estructuras tridimensionales por difracción de rayos X de la MCO-Tth, cuya estadística se integra en las

Tablas 2 y 3.

53

Tabla 2. Parámetros estadísticos de la colecta de datos, integración y escalamiento de 8 estructuras de la MCO-Tth

procedentes de un cristal nativo con diferentes dosis de radiación.

Estructura 1 Estructura 2 Estructura 3 Estructura 4 Estructura 5 Estructura 6 Estructura 7 Estructura 8

Fuente BNL NSLS beamline X6A

BNLNSLS beamline X6A

BNL NSLS beamline X6A






Detector ADSC Q270 ADSC Q270 ADSC Q270 ADSC Q270 ADSC Q270 ADSC Q270 ADSC Q270 ADSC Q270

Longitud de onda (Å)

0.979 0.979 0.979 0.979 0.979 0.979 0.979 0.979

Grupo espacial C2221 C2221 C2221 C2221 C2221 C2221 C2221 C2221

Parámetros de celda unitaria (Å)

a=93.46, b=110.13, c=96.21

a=93.47, b=110.14, c=96.23

a=93.52, b=110.18, c=96.28

a=93.56, b=110.21, c=96.32

a=93.58, b=110.24, c=96.36

a=93.61, b=110.26, c=96.36

a=93.63, b=110.28, c=96.41

a=93.65, b=110.3, c=96.43

Volumen celda

(Å3

)

990265.46 990667.24 992072.36 993179.37 994074.74 994883.47 995483.04 996082.85

Expansión de volumen (relativo a la Estructura 1)

1.00000 1.00040 1.00182 1.00294 1.00384 1.00466 1.00526 1.00587

Intervalo de resolución (Å)

20.0 - 1.60 (1.80 - 1.60)

20.0 - 1.62 (1.8-1.62)

20.0 - 1.68 (1.8 - 1.68)

20.0 - 1.76 (1.90 - 1.76)

20.0 - 1.80 (1.90 - 1.80)

20.0 - 1-84 (2.0 - 1.84)

20.0 - 1.86 (2.0 - 1.86)

20.0 - 1.92 (2.0 - 1.92)

Reflexiones únicas

62893 60621 54433 47312 44189 41468 40008 36326

Multiplicidad 4.68 (4.61) 4.69 (4.62) 4.70 (4.62) 4.76 (4.67) 4.72 (4.63) 4.73 (4.66) 4.74 (4.66) 4.75 (4.68) Integridad (%) 95.9 (97.3) 95.9 (97.4) 95.7 (97.4) 95.5 (97.5) 95.3 (97.5) 95.2 (97.3) 95.1 (97.2) 94.9 (97.2)

I/σ(I) 15.58 (4.15) 14.87 (3.63) 15.36 (3.58) 16.31 (4.29) 16.27 (3.95) 16.02 (4.29) 15.44 (3.79) 15.34 (3.55) R

merge (%) 8.3 (41.8) 8.7 (48.2) 8.5 (49.1) 8.1 (39.6) 8.2 (42.8) 8.4 (38.9) 8.8 (44.2) 8.9 (47.2)

Valor B de Wilson

(Å2

)

9.28 11.30 11.87 12.49 13.42 14.32 15.44 16.49

Mosaicismo 0.18 0.18 0.17 0.17 0.17 0.16 0.18 0.15 Tiempo de

exposición / por imagen

13 s / 1° 13 s/ 1° 13 s/ 1° 13 s/ 1° 13 s/ 1° 13 s/ 1° 13 s/ 1° 13 s/ 1°

* Los valores en paréntesis corresponden a la última faja de resolución.

54

Tabla 3. Parámetros estadísticos del afinamiento de 8 estructuras de la MCO-Tth procedentes de un cristal nativo

con diferentes dosis de radiación.

Estructura 1 Estructura 2 Estructura 3 Estructura 4 Estructura 5 Estructura 6 Estructura 7 Estructura 8

Rwork/Rfree 16.92/20.77 17.69/20.58 17.25/21.27 16.91/21.27 17.01/20.99 16.90/20.83 17.01/21.32 16.91/22.30 Contenido de la unidad

asimétrica

Todos los átomos 4653 4742 4746 4691 4685 4643 4653 4617

Átomos de proteína 4012 4259 4269 4259 4269 4259 4269 4259

Iones de cobre 3 3 3 3 3 3 3 3

Moléculas de agua 510 352 346 301 285 253 253 227

Moléculas de MPD 16 16 16 16 16 16 16 16

R.m.s.d. del ideal

Longitud de enlaces (Å) 0.008 0.009 0.010 0.010 0.008 0.009 0.009 0.009

Ángulos de enlace (°) 1.26 1.31 1.34 1.31 1.31 1.30 1.33 1.31

Valor B global promedio

(Å2

)

14.12 14.73 15.78 16.61 17.55 18.51 19.55 21.48

Proteína 11.76 13.24 14.30 15.18 16.09 17.13 18.19 20.12

Solvente H2O 27.56 24.66 26.10 25.94 27.25 27.66 28.86 29.83

Solvente MPD 34.45 37.15 37.35 42.26 44.58 46.21 46.44 51.99

Iones cobre 12.98 14.69 15.30 17.10 20.40 22.52 24.35 21.63 Residuos en el diag. de

Ramachandran

Regiones más favorecidas

(%)

94.35 94.72 95.47 95.53 95.06 95.53 95.88 95.53

Regiones adicionales

permitidas (%)

3.53 3.25 2.88 2.44 3.29 2.03 2.47 2.44

Fuera de rango (%) 2.12 2.03 1.65 2.03 1.65 2.44 1.65 2.03 Dosis absorbida máxima

(MGy)

0.40 1.63 2.76 3.80 4.78 5.68 6.51 7.28

Error en la coordinación

(probabilidad máxima) Å)

0.20 0.22 0.20 0.22 0.23 0.23 0.22 0.24

Al analizar los datos obtenidos se observa un aumento de varios de los parámetros estadísticos, lo

anterior como producto del incremento de la dosis de radiación acumulada en el cristal, entre los que

destacan los parámetros de celda, el volumen de la celda unitaria, los valores B (B de Wilson y PDAs

globales, de las moléculas de agua, MPD y de los cobres presentes en la proteína), así como una

disminución en la resolución de las estructuras. Sin embargo varios de los parámetros estadísticos

relacionados con la calidad de la información como Rmeas y I/σ(I) se mantuvieron en términos generales

constantes a lo largo de las ocho estructuras generadas y otros más como el valor de mosaicismo

decrecieron, aunque de una manera que parece ser explicada por errores en el cálculo de este valor, al

aumentar la dosis de radiación acumulada.

Se ha observado que los cristales de proteínas presentan un aumento lineal del volumen de su celda

unitaria dependiente de la dosis absorbida de radiación, esta expansión puede ser debida a un aumento

en el volumen de la proteína, del solvente o de ambos, sin embargo es notable considerar que esta

variación en la expansión del volumen de celda es altamente variable para distintos cristales a pesar de

55

presentar la misma dosis depositada (Murray & Garman, 2002). En un estudio desarrollado en cristales

de holoferritina los cuales son ricos en iones fierro, se ha observado una gran expansión en el volumen

de la celda unitaria producto de la exposición de los cristales debido al gran contenido de estos iones en

la proteína (Figura 24), aumentando de manera considerable la absorción primaria y por tanto

exacerbando la expansión en la celda hasta en un 5% (Ravelli et al. 2002). Sin embargo los valores más

típicos que reflejan esta expansión están cerca del 1% en el volumen de la celda (Murray & Garman,

2002). Una posible razón para dicha expansión en el solvente puede ser la pérdida de puentes de

hidrógeno, debido a la transformación de moléculas de agua en especies radicales como hidroxilos,

gases como H2 y CO2 en los espacios de la matriz cristalina (Burmeister, 2000). Sin embargo, el

mecanismo especifico por el que la expansión en la celda unitaria ocurre no está comprendido en su

totalidad (Murray & Garman, 2002).

Figura 24. Incremento del volumen de celda unitaria en cristales de ferritina dependiente de la dosis de radiación

absorbida. Cada cruz representa el volumen calculado de la celda unitaria a partir de imágenes de 1°. El cristal es

regresado a su posición original cada 5°. La línea sólida representa un ajuste de mínimos cuadrados. Modificado a

partir de Ravelli et al. 2002.

Al analizar el comportamiento de aumento en los parámetros de celda y de volumen de la misma en la

MCO-Tth, y compararlos con estudios reportados en la literatura con otras proteínas, especialmente con

ferritina se observa que a pesar de que en el caso de la proteína MCO-Tth la dosis de radiación es 10

veces mayor, el incremento en el volumen de la celda unitaria es mucho menor. Esta comparación entre

Dosis absorbida (MGy)

Vo

lum

en d

e la

cel

da

un

itar

ia (

10

6 Å

3)

56

ambos comportamientos se logró normalizando los datos obtenidos de expansión de volumen de la

celda unitaria de la estructura 1, considerando a esta como referencia y a partir de esta se calculó el

incremento subsecuente en el volumen de las celdas en las demás estructuras, observándose una

dependencia casi lineal en el fenómeno (Figura 25).

Figura 25. Expansión del volumen normalizado a partir de la estructura 1 (1001) de la celda unitaria como producto

del aumento de la radiación en la MCO-Tth, se observa la dependencia casi lineal de dicho fenómeno.

Se ha considerado por algunos autores que una explicación para este incremento en el volumen de la

celda unitaria es la expansión térmica del cristal. El cristal sufre un incremento indudable de

temperatura por exposición a los rayos X. Adicionalmente se ha planteado que de manera paralela al

incremento en el volumen de la celda producto de le expansión térmica, los procesos de ionización

causados por el efecto fotoeléctrico en los residuos de aminoácidos generan repulsiones electrostáticas

entre las cargas que se generan por la exposición (Ravelli et al. 2002).

De forma paralela a la expansión en el volumen de la celda unitaria, en el curso de la colecta de datos, el

poder de difracción el cristal se ve reducido, esto es debido a la pérdida eventual de las reflexiones

(Ravelli et al. 2002 y Burmeister, 2000), dichos eventos coinciden con los datos obtenidos

experimentalmente en la MCO-Tth (Figura 26). La pérdida del poder de difracción es directamente

proporcional a la energía depositada en el cristal y no toma en consideración ninguno de los efectos

químicos específicos como el daño estructural especifico en los aminoácidos involucrados en los

contactos del cristal (Murray et al. 2005).

1.000

1.001

1.002

1.003

1.004

1.005

1.006

0 1 2 3 4 5 6 7 8 Vo

lum

en n

orm

aliz

ado

de

ce

lda

(%)


Expansión del volumen de celda

57

Figura 26. Pérdida de reflexiones únicas en un cristal de MCO-Tth, producto del daño por la radiación absorbida a

través de las 8 estructuras generadas.

Como se mencionó con anterioridad uno de los parámetros que comúnmente se ven afectados como

producto de la exposición de los cristales de proteína a la radiación es el aumento progresivo en los

parámetros de desplazamiento atómico (PDAs) o valores B, los cuales determinan la incertidumbre en la

posición de un átomo o residuo en la proteína. En el caso específico de la MCO-Tth se observó un

aumento en los PDAs a lo largo de las 8 estructuras generadas (PDAs globales, de las moléculas de agua

así como del MPD y de los cobres presentes en la proteína) (Figuras 27 A) así como en los valores B de

Wilson (Figura 27 B). Estos resultados se observan de manera cotidiana en cristales de proteína

expuestos a radiación, en donde la acumulación de radiación genera un progresivo desorden dentro del

cristal y en algunos casos inclusive cambios químicos en las moléculas de proteína.

1.60Å 1.62Å

1.68Å

1.76Å 1.80Å

1.84Å 1.86Å

1.92Å 35000

40000

45000

50000

55000

60000

65000

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Re

fle

xio

ne

s u

nic

as


Reflexiones únicas

58

Figura 27. A Incremento de los Parámetros de Desplazamiento Atómico (PDA) y B, incremento del valor B de

Wilson producto de la dosis absorbida de radiación. Se observa una dependencia casi lineal de los valores con el

incremento en la dosis de radiación.

Con respecto a la preservación de la ocupación en el CTC por parte de los iones cobre, se puede apreciar

en los mapas que no se observa densidad electrónica en el sitio del CuT2, incluso desde la dosis más baja

(Estructura 1 o 0.40 MGy), hasta la dosis más alta (Estructura 8 o 7.28 MGy) en la cual no se observan

cambios adicionales en este sitio (Figuras 28 y 29). De forma similar De la Mora y colaboradores (2012),

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

0 1 2 3 4 5 6 7 8

PD

A (

Å2 )

Dosis Absorbida (MGy)

A PDAs

Proteína

Solvente agua

Solvente MPD

Iones cobre

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Val

or

B d

e W

ilso

n (

Å2 )


Valor B de Wilson (Å2)

59

observaron en la MCO de C. gallica a pH 7.0, la radiólisis temprana de su ion CuT2, relatando de esta

manera que dicha escisión ocurre a dosis de radiación absorbida menores a 4 MGy, pero mayores a

0.62MGy cuando se colecta en equipos caseros. A pesar de que los resultados no concuerdan con

respecto a las dosis de radiación depositada en ambos cristales, los resultados en ambos casos indican

como se ha considerado de manera previa, que el CuT2 es el más lábil de los iones presentes en esta

metaloproteína y que esta escisión ocurre de manera temprana es decir, con bajas dosis de radiación.

Con respecto a los otros iones cobre presentes en la MCO-Tth se observó de manera adicional que el

CuT3´ presenta de igual forma que el CuT2 susceptibilidad al efecto de la dosis de radiación absorbida,

perdiendo desde la dosis más baja (Estructura 1 o 0.40 MGy), la coordinación con la His137, lo que se

mantiene constante hasta la dosis más alta (Estructura 8 o 7.28 MGy). No se observan otros cambios en

este sitio metálico como se observa en las Figuras 30 y 31, así como tampoco en los otros dos iones

cobre (T1 y T3) presentes en el CTC, los cuales no presentan modificaciones evidentes en sus mapas de

densidad electrónica a las dosis de radiación absorbida estudiadas.

60



sigma representados en azul.

0.40 MGy

1.60Å

1.63 MGy

1.62Å

2.76 MGy

1.68Å

3.80 MGy

1.76Å

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

61


correspondientes a las estructuras 5 a 8 del cristal nativo (4.78-7.28 MGy) para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 sigma

representados en azul.

4.78 MGy

1.80Å

5.68 MGy

1.84Å

6.51 MGy

1.86Å

7.28 MGy

1.92Å

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

62




0.40 MGy

1.60Å

1.63 MGy

1.62Å

2.76 MGy

1.68Å

3.80 MGy

1.76Å

His 137

CuT3´ His 398

His 444

His 137

CuT3´ His 398

His 444

His 137

CuT3´ His 398

His 444

His 137

CuT3´ His 398

His 444

63




Al encontrar indicios de daño específico en los sitios metálicos de la proteína, específicamente en los

CuT2 y CuT3´ desde la dosis más baja y observar que a pesar de que la dosis de radiación aumenta

sucesivamente en las estructuras generadas, ya no se observan más cambios específicos evidentes que

los presentados anteriormente, se procedió a analizar otras regiones específicas de la proteína. La

primera aproximación de este análisis se realizó evaluando los cambios generados por la dosis de

radiación absorbida en la tapa-antena o loop (residuos 294 a 307) (Figura 32), así como en otros residuos

4.78 MGy

1.80Å

5.68 MGy

1.84Å

7.28 MGy

1.92Å

6.51 MGy

1.86Å

His 137

CuT3´ His 398

His 444

His 137

CuT3´ His 398

His 444

His 137

CuT3´ His 398

His 444

His 137

CuT3´ His 398

His 444

64

normalmente reportados como vulnerables en la literatura (Figura 33). Al analizar las diferencias entre

los mapas de densidad electrónica 2fo-fc de la dosis baja (0.40 MGy) y dosis alta (7.28 MGy), se puede

observar que existen diferencias sutiles, las cuales indican un aumento en el movimiento de los residuos

de aminoácidos, lo que se traduce estrucutralmente como una pérdida en la densidad electrónica. Sin

embargo no se observan cambios debidos a descarboxilaciones, desaminaciones o pérdidas en la

continuidad de las cadenas principales ni laterales. Estos datos indican que el daño generado por la

radiación no es específico, por tanto debe de estar afectando a la proteína en su totalidad de manera

inespecífica, dicho fenómeno se puede observar de manera definida en el aumento de los valores B

globales, de la proteína así como la expansión de la celda unitaria, aunque también podrían ser

atribuidos al cambio de la resolución entre ambas estructuras (1.60Å y 1.92Å).

Figura 32. Comparación de la densidad electrónica en un mapa 2fo-fc de la tapa-antena o “loop” de la MCO-Tth

(residuos 294 a 307). Mapas 2fo-fc a 1 sigma.

0.40 MGy

1.60Å

7.28 MGy

1.92Å

65

Figura 33. Superposición de los mapas de densidad electrónica 2fo-fc de la primera estructura con 0.40 MGy

(densidad electrónica azul) de dosis de radiación acumulada y la última estructura generada con 7.28 MGy

(densidad electrónica rosa). Mapas 2fo-fc a 1 sigma.

Arg 410 Glu 85

Glu 157

Arg 347

Met 293

Glu 270

Met 355

Glu 278

66

Otro de los posibles factores considerados como implicados en el daño por radiación es la accesibilidad

del solvente al CTC y su posible radiólisis con la futura formación de especies reactivas. Este fenómeno

se evaluó determinando la presencia y posición de las moléculas de agua que se encuentran vecinas al

CTC en las 8 estructuras generadas. Sin embargo, no se observaron cambios evidentes en estas

moléculas de agua evaluadas a lo largo de las 8 estructuras con distinta dosis de radiación absorbida, lo

que hace considerar que la radiólisis de estas moléculas no sucede, y por lo tanto no está directamente

relacionado con la escisión de los centros metálicos.

Con fines comparativos de la dosis de radiación absorbida por los cristales nativos de la MCO-Tth, así

como del daño generado sobre los mismos, se consideró en esta ocasión uno de los cristales

procedentes de la tercera colecta de datos, la cual como se mencionó con anterioridad se llevó a cabo en

las instalaciones del NSLS, haciendo uso de energía estándar (12.7 keV), longitud de onda 0.979Å. Los

datos analizados pertenecen a un cristal nativo, las estadísticas de la integración, escalamiento y

afinamiento de los datos se encuentran en la Tabla 4.

Tabla 4. Parámetros estadísticos de la colecta de datos, integración, escalamiento y afinamiento de un cristal

nativo colectado en la línea X4A.

Nativo Nativo

Fuente BNL NSLS beamline X4A Rwork/Rfree 19.65/23.28 Detector ADSC Quantum-4R Contenido de la unidad

asimétrica

Longitud de onda (Å) 0.9791 Todos los átomos 4607 Grupo espacial C2221 Átomos de proteína 4259

Parámetros de celda unitaria (Å) a=93.4. b=109.79. c=96.42 Iones de cobre 4

Volumen celda (Å3) 988727.90 Moléculas de agua 216

Intervalo de resolución (Å) 20 - 1.90 (1.95-1.90) Moléculas de MPD 16 Reflexiones únicas 38869 R.m.s.d. from ideal

Multiplicidad 4.50 (4.54) Longitud de enlaces (Å) 0.007 Integridad (%) 98.8 (100.0) Ángulos de enlace (°) 1.230

I/σ(I) 12.71 (3.68) Valor B global promedio (Å

2)

22.00

Rmerge (%) 9.1 (44.0) Proteína 21.09 Valor B de Wilson (Å

2) 18.15 Solvente H2O 27.81

Mosaicismo 0.33 Solvente MPD 45.1

Tiempo de exposición / por imagen 20 s / 1° Iones cobre 19.06

Residuos en el diag. de Ramachandran

Regiones más favorecidas (%)

94.26

Regiones adicionales permitidas (%)

4.51

Fuera de rango (%) 1.23 Dosis absorbida máxima

(MGy) 0.29

Error en la coordinación (probabilidad máxima) Å)

0.29


67

Al observar las estructuras generadas y evaluar de manera general la densidad electrónica del CTC, se

aprecia de manera contrastante con respecto a las 8 estructuras anteriormente presentadas, la

presencia del CuT2 así como la del CuT3´, en este caso no se observa pérdida de la densidad electrónica

por parte de los residuos responsables de las coordinaciones de estos iones (Figura 34). Es preciso

considerar que la dosis de radiación absorbida por el cristal es 0.29 MGy, siendo esta considerablemente

inferior a la dosis de radiación absorbida más baja en las estructuras consideradas anteriormente

(Estructura 1 o 0.40 MGy). Con respecto a los datos estadísticos obtenidos en esta estructura no pueden

ser comparados con los de las estructuras anteriormente determinadas, ya que se trata de dos cristales

distintos.

Figura 34. Estructura del CuT2 y CuT3´ asi como de los aminoácidos que los coordinan correspondientes a los datos

procedentes del cristal nativo colectado en la línea X4A (0.29 MGy) para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 sigma


5.5 Evaluación en la ocupación del CuT2 modificando el flujo de los rayos X en cristales de la

MCO-Tth

Al evaluar de forma general los datos obtenidos anteriormente y siguiendo con las observaciones de que

aparentemente la dosis absorbida de radiación por el cristal es la única responsable de los cambios

observados en los cobres de las estructuras analizadas. En esta ocasión se presentan los datos de cuatro

cristales de la MCO-Tth para así poder evaluar el impacto de la disminución del flujo mediante

atenuación en la temprana escisión del CuT2, así como mediante la exploración del uso de fuentes

His 95 His 396

CuT2

His 137

His 398

His 444

CuT3´

68

generadoras de rayos X de baja intensidad (ánodo rotatorio). En las Tablas 5 y 6 se presentan los datos

procedentes de la colecta, integración, escalamiento y afinamiento de dos estructuras generadas a partir

de un cristal difractado en la misma región en dos ocasiones (Estructura 1: imágenes 1 a 110 y Estructura

2: imágenes 361 a 470). Por lo tanto, los datos corresponden a dos distintas dosis de radiación

acumuladas, una baja y otra alta. Es notable considerar que para esta colecta de datos se utilizó la línea

X6A, la cual se había utilizado anteriormente para la determinación de las 8 estructuras provenientes del

cristal individual. Sin embargo, en este experimento el haz de rayos X fue atenuado mediante el uso de

foils de aluminio, lo que permitió la disminución del flujo hasta dos órdenes de magnitud comparándola

con la línea X6A no atenuada. De forma paralela en un equipo de “difracción casera” (ánodo rotatorio)

se determinaron las estructuras de 3 cristales de MCO-Tth bajo distintos tiempos de colecta de

imágenes: 240, 120 y 60 segundos generando de esta forma tres estructuras denominadas como

AR240s, AR120s y AR60s respectivamente, es preciso considerar que de igual forma que en la fuente

sincrotrónica atenuada el flujo de fotones/segundo esta dos órdenes de magnitud por debajo de la línea

X6A no atenuada, las estadísticas pertenecientes a estos cristales se integran de igual forma en las

Tablas 5 y 6.

Tabla 5. Parámetros estadísticos de la colecta, integración y escalamiento de los datos un cristal nativo de MCO-Tth

(Estructura 1: imágenes 1 a 110 y Estructura 2: imágenes 361 a 470), colectado dos veces en la misma zona del

cristal en la línea X6A atenuada y de tres cristales nativos de MCO-Tth (AR240, AR120 y AR60) en el equipo casero

ánodo rotatorio bajo distintos regímenes de tiempo de colecta de imágenes.

Estructura 1 nativo: haz atenuado con 40 foils (imágenes 1 a

110)

Estructura 2 nativo: haz atenuado con 40 foils (imágenes 360 a

470)

Ánodo rotatorio AR240





LANEM, Instituto de Química, UNAM



Detector ADSC Q270 ADSC Q270 R-Axis IV++ Rigaku R-Axis IV++ Rigaku R-Axis IV++ Rigaku Longitud de onda (Å) 0.977 0.977 1.541 1.541 1.541

Grupo espacial C2221 C2221 C2221 C2221 C2221 Parámetros de celda unitaria

(Å) a=93.63, b=110.37,

c=96.20 a=93.62, b=110.37,

c=96.19 a=93.66, b=110.33,

c=96.18 a=93.64, b=110.22,

c=96.24 a=93.72, b=110.29,

c=96.20 Volumen celda (Å

3) 994125.32 993915.82 993505.26 993293.11 994359.64

Intervalo de resolución (Å) 20.0 - 2.30 (2.40 – 2.30)

20.0 - 2.55 (2.60 – 2.55)

20.0 - 1.70 (1.80 – 1.70)

20.0 - 1.60 (1.70 - 1.60)

20.0 - 2.0 (2.20 – 2.0)

Reflexiones únicas 22384 16502 54560 65415 33559 Multiplicidad 4.49 (4.53) 4.47 (4.49) 4.31 (4.18) 4.31 (4.01) 4.38 (4.35) Integridad (%) 99.4 (99.6) 99.4 (99.6) 99.2 (99.0) 99.4 (99.8) 98.7 (99.7)

I/σ(I) 10.94 (3.69) 10.52 (3.87) 14.67 (2.92) 17.65 (3.20) 8.51 (3.24) Rmerge (%) 14.8 (46.6) 15.2 (44.9) 7.3 (47.30) 6.01 (45.6) 18.3 (49.6)

Valor B de Wilson (Å2

) 15.50 15.81 13.13 13.26 13.30

Mosaicismo 0.30 0.30 0.20 0.13 0.11

Tiempo de exposición / por imagen

90s/1.0° 90s/1.0° 240s/0.5° 120s/0.5° 60s/0.5°


69

Tabla 6. Parámetros estadísticos del afinamiento de datos un cristal nativo de MCO-Tth (Estructura 1: imágenes 1 a

110 y Estructura 2: imágenes 361 a 470), colectado dos veces en la misma zona del cristal en la línea X6A atenuada

y de tres cristales nativos de MCO-Tth (AR240, AR120 y AR60) en el equipo casero ánodo rotatorio bajo distintos

regímenes de tiempo de colecta de imágenes.

Nativo: haz atenuado con 40 foils (imágenes

1 a 110)

Nativo: haz atenuado con 40 foils (imágenes

360 a 470)




Rwork/Rfree 17.57/23.86 18.02/23.31 16.71/19.38 16.93/19.70 17.88/23.25 Contenido de la unidad

asimétrica

Todos los átomos 4208 4177 4440 4495 4421 Átomos de proteína 3869 3881 3916 3935 3953

Iones de cobre 3 3 3 3 3 Moléculas de agua 208 165 392 429 337 Moléculas de MPD 16 16 16 16 16 R.m.s.d. from ideal

Longitud de enlaces (Å) 0.007 0.007 0.007 0.008 0.007 Ángulos de enlace (°) 1.241 1.227 1.271 1.212 1.218

Mean overall B value (Å2) 15.58 14.27 18.39 17.47 16.19

Proteína 13.91 12.69 16.44 15.47 14.25 Solvente H2O 25.03 22.32 30.82 29.98 28.61 Solvente MPD 50.25 50.98 39.54 36.98 42.68

Iones cobre 44.06 42.35 24.43 11.17 42.17 Residuos en el diagrama de

Ramachandran

Regiones más favorecidas (%)

94.65 95.08 96.05 96.43 96.89

Regiones adicionales permitidas (%)

3.77 2.87 2.96 2.27 1.38

Fuera de intervalo (%) 1.57 2.05 0.99 1.30 1.73 Dosis absorbida máxima

(MGy) 0.02 0.08 0.51 0.26 0.13

Error en la coordinación

(Probabilidad máxima. Å) 0.31 0.39 0.27 0.21 0.27

Al analizar las estructuras obtenidas a partir de los experimentos de difracción realizados, es notable

considerar que en ninguno de los casos estudiados la densidad perteneciente al CuT2 está presente, lo

que indica la escisión total de este ión metálico. Con respecto a la coordinación por parte de la His137 y

el CuT3´, se aprecia en la densidad electrónica la pérdida en la coordinación de este ión metálico. Es

importante considerar que la dosis de radiación absorbida por las estructuras nativas con haz atenuado y

las de ánodo rotatorio con 120 y 60 segundos de exposición por imagen, son considerablemente

menores a la dosis depositada en el cristal nativo presentado anteriormente el cual muestra la presencia

del CuT2 y de la continuidad de la coordinación de la His137 con el CuT3´ (Figuras 33 y 34).

70




MGy) a 2.0Å; D, cristal nativo AR120 colectado en un ánodo rotatorio (0.26 MGy) 1.60Å; E, cristal nativo colectado

en un equipo ánodo rotatorio AR240 (0.51 MGy) 1.70Å para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 sigma representados en

azul.

A

B

C

D

E

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

71




MGy) a 2.0Å; D, cristal nativo AR120 colectado en un ánodo rotatorio (0.26 MGy) a 1.60Å; E, cristal nativo

colectado en un equipo ánodo rotatorio AR240 (0.51 MGy) a 1.70Å para la MCO-Tth. Mapas 2fo-fc a 1 sigma


A B

D C

E

His 137

His 398

His 444

His 137

His 398

His 444

His 137

His 398

His 444

His 137

His 398

His 444

His 137

His 398

His 444

CuT3´ CuT3´

CuT3´ CuT3´

CuT3´

72

Con respecto a la estadística generada por los cristales nativos colectados utilizando la atenuación, se

observa de nueva cuenta la presencia de daño inespecífico el cual se ve reflejado principalmente en la

pérdida de la capacidad de difracción, perdíendose un número importante de reflexiones únicas, lo que

impacta finalmente en la diferencia entre las resoluciones de las estructuras generadas. Los otros

parámetros estadísticos indicativos de daño inespecífico como el volumen de la celda, el valor de Rmerge,

mosaicismo y aumento de los valores B globales y específicos no presentan un comportamiento que

sustente este fenómeno de daño. En referencia a los demás residuos en la estructura, la tapa antena o

loop, así como los otros iones cobre presentes no se observan cambios que ameriten un análisis más

profundo.

5.6 Impacto del uso de altas energía y disminución del efecto fotoeléctrico en la MCO-Tth

A partir de la colecta de datos realizada en el ESRF, línea ID15-A, una línea de alta energía (38.47 keV)

que opera con una longitud de onda fija de 0.323Å. Esta línea presenta las siguientes características:

Efecto fotoeléctrico: 0.077cm2/g. Efecto Compton: 0.24 cm2/g. Efecto Rayleigh: 0.035 cm2/g (Valores

determinados utilizando RADDOSE). Al comparar las características de esta línea con las de las líneas de

energía estándar como X6A, X4A o X4C (~12 keV), se observa que el efecto fotoeléctrico en ID15-A es 34

veces menor que en las líneas X6A, X4A y X4C, el efecto Compton es similar en ambas líneas. Sin

embargo, el poder de difracción es 6 veces menor en alta energía. En adición a lo anterior, en cristales

similares el tiempo de exposición debe ser 1.5 veces mayor en ESRF. La eficiencia del detector durante la

colecta de datos fue del 65%, este dato del detector es crucial para la integración de los datos y se

abordará más a fondo en los párrafos siguientes. En esta serie de experimentos se colectaron datos de 3

cristales, donde uno de los cuales corresponde al mismo cristal difractado en la línea X6A, el cual generó

las 8 estructuras anteriormente evaluadas y descritas, por lo tanto se conocía que la capacidad de

difracción del cristal era de 1.60Å en una línea operando a ~12 keV.

En esta serie de experimentos de difracción en alta energía se hizo uso de un detector Image Plate

Mar345, el cual presentaba incompatibilidades y problemas con la detección de las señales provenientes

de los rayos X de baja longitud de onda. Al analizar las imágenes generadas se observan “rayas”

aleatorias provenientes del ruido del detector (Figura 37), las cuales afectaron la medición de las

intensidades. Debido a estos problemas el análisis estadístico generó datos fuera de los valores

convencionales, pero absolutamente falsos debido a las limitantes técnicas mencionadas, por lo tanto

no se presentan tablas con las estadísticas de la colecta, integración, escalamiento y afinamiento.

73

Figura 37. Efecto del ruido del detector utilizado se observa este como círculos concéntricos aleatorios a lo largo

de los patrones de difracción generados en el detector ImagePlate-Mar345, se puede observar la distribución

aleatoria de estas líneas a lo largo de las imágenes A y B, lo que impacta en la eficiencia del detector disminuyendo

este valor hasta 65%. Las imágenes C y D, corresponden a patrones de difracción de un detector ADSC Quantum 4R

utilizado en líneas de energía estándar (específicamente X4A) en las cuales no se observan rayas aleatorias y el cual

opera al 100% de eficiencia.

Es preciso considerar tal como indican Garman & Owen (2006) que a longitudes de onda muy cortas

existen retos experimentales: los cuales van desde la sensibilidad del detector, se requiere de un flujo

mayor, parte de los rayos X incidentes y difractados son absorbidos por el aire así como la necesidad de

espejos especialmente diseñados, si bien esta última variable ya fue considerada por el personal de la

línea ID15B.

Hablando específicamente de los detectores, se ha observado que estos de manera cotidiana son

utilizados para la detección de señales en energías medias, por lo tanto no se encuentran optimizados

para lecturas en alta energía. Los detectores de tipo IP como el MAR345 usado en este experimento de

alta energía, utilizan una película de fósforo para detectar los rayos X, la cual es excitada por los rayos X.

La lectura de los mismos en el detector es realizada mediante un láser, la eficiencia de lectura por parte

del láser se reduce de manera significativa en altas energías y es dependiente de esta (Jakoncic et al.

2006 y Guía de Usuario del detector Mar165) (Figura 38). De manera general un detector tipo CCD no

presentaría estas limitantes, sin embargo no se contaba con uno de ellos al momento del experimento.

74

La pérdida en la eficiencia de la lectura impacta de esta forma y según Sarin y colaboradores (2009), en

dos características muy importantes en la lectura de un detector: la linealidad y uniformidad en la

respuesta del detector. La linealidad es la capacidad de un detector de rayos X para responder de

manera proporcional al flujo de fotones incidentes, mientras que la uniformidad es la capacidad de

producir respuestas idénticas ante variaciones mínimas en cada pixel para la misma exposición de un

flujo de fotones, es precisamente esta falta en la linealidad y uniformidad en la respuesta la responsable

de la variabilidad en las intensidades detectadas, así como la aparición de rayas concéntricas en los

patrones de difracción generados, y por último, la dificultad en la integración de los datos.

Figura 38. Eficiencia en la absorción de los fotones incidentes por parte de la película de fósforo del detector Image

Plate MAR345 y el detector MAR CCD en el rango de energías de 1-100 keV (Jakoncic et al. 2006).

Los datos analizados en esta sección representan 4 data sets provenientes de 3 cristales, donde los datos

generados como A1 y A2 corresponden al mismo cristal, el cual como se ha indicado con anterioridad

había sido colectado anteriormente en la línea X6A del NSLS, difractando a 1.6 Å de resolución máxima.

Sin embargo, la colecta de datos se realizó en distintas zonas del mismo cristal asegurando la exposición

de nuevas zonas del mismo. Los tiempos de exposición por imagen en todos los casos fueron de 5

segundos, excepto para el cristal denominado como C, el cual presentó un tiempo de exposición de 10

segundos. Los datos de colecta de dichos cristales se integran para su análisis en la Tabla 7.

Efic

ien

cia

en la

ab

sorc

ión

Energía [keV]

75

Tabla 7. Parámetros estadísticos de la colecta e integración de los datos de cuatro estructuras a partir de tres

cristales nativos de MCO-Tth colectados en alta energía, con distintos tiempos de exposición por imagen.

Cristal A1 Cristal A2 Cristal B Cristal C

Fuente ESRF beamline ID15A ESRF beamline ID15A ESRF beamline ID15A ESRF beamline ID15A Detector Image Plate MAR345 Image Plate MAR345 Image Plate MAR345 Image Plate MAR345

Longitud de onda (Å) 0.323 0.323 0.323 0.323 Grupo espacial C2221 C2221 C2221 C2221

Parámetros de celda unitaria (Å) a=94.2, b=111.3, c=96.90 a=93.61, b=110.32, c=96.33 a=93.74, b=110.33, c=96.48 a=93.88, b=110.55, c=96.47 Volumen celda (Å

3) 1015944.17 994805.22 997828.40 1001207.53

Intervalo de resolución (Å) 18.00 – 1.60 (1.80 – 1.60) 18.00 – 1.60 (1.80 – 1.60) 18.00 – 1.60 (1.80 – 1.60) 18.00 – 1.60 (1.80 – 1.60) Reflexiones únicas 64294 62073 63800 65829

Multiplicidad 6.93 (6.88) 5.48 (5.42) 6.98 (6.93) 5.73 (5.30) Integridad (%) 95.5 (91.2) 92.2 (87.3) 96.3 (94.2) 97.8 (93.7)

Mosaicismo 0.09 0.12 0.08 0.35

Tiempo de exposición / por imagen

5s/1.0° 5s/1.0° 5s/0.5° 10s/0.5°


Con respecto a la estadística de integración, escalamiento y afinamiento de los datos obtenidos a partir

de las 4 estructuras generadas, esta no se incluye de manera completa, debido a los problemas antes

mencionados referentes a la sensibilidad de detección de fotones por parte del detector. Sin embargo,

es preciso considerar que a pesar de las dificultades encontradas, los datos pudieron ser integrados y

escalados de manera satisfactoria, generando así mapas de densidad electrónica de toda la proteína y

específicamente del CTC de alta resolución en todos los casos (1.6 Å). Con respecto a la prevalencia de la

densidad electrónica en la zona del CuT2, así como a la densidad que sustenta la coordinación existente

entre la His137 y el CuT3´, estas están ausentes, de igual forma que en las demás estructuras

presentadas excepto el cristal nativo colectado con baja dosis absorbida en la línea X4A. Es importante

considerar que la dosis de radiación depositada es superior a la de la mayoría de los cristales

presentados en este trabajo. Las estructuras obtenidas a partir de los tres cristales nativos colectados en

alta energía después del afinamiento de los datos se presentan en las Figuras 39 y 40.

76

Figura 39. Estructuras del CuT2 y de los aminoácidos que lo coordinan de la MCO-Tth en alta energía con diferente






A1

A2

B

C

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

77

Figura 40. Estructuras del CuT3´ y de los aminoácidos que lo coordinan de la MCO-Tth en alta energía con diferente






5.7 Evaluación en la ocupación del CuT2 utilizando agentes radioprotectores en la MCO-Tth

A partir de dos colectas distintas en las líneas X4A y X4C se presentan los datos de 4 cristales de la MCO-

Tth, sometidos a la técnica de soaking, empleando como agente radioprotector NaNO3 en distintas

A1 A2

C B

0.43 MGy 0.76 MGy

His 137

CuT3´ His 398

His 444

His 137

CuT3´ His 398

His 444

His 137

CuT3´ His 398

His 444

His 137

CuT3´ His 398

His 444

78

concentraciones (100 y 500mM) y tiempos de remojado (1, 1.5 y 7 minutos). Los datos obtenidos de la

colecta, así como los parámetros estadísticos determinados después de la integración, escalamiento y

afinamiento de las estructuras mencionadas se presentan en las Tablas 8 y 9.

Tabla 8. Parámetros estadísticos de la colecta, integración y escalamiento de los datos de tres cristales de MCO-Tth

con NaNO3 como radioprotector en distintas concentraciones (100 y 500mM) y tiempos de remojado (1, 1.5 y 7

minutos) en las líneas X4A y X4C.

100mM NaNO3 1.5min 500mM NaNO

3 1 minuto 100mM NaNO3 7 minutos

Fuente BNL NSLS beamline X4A BNL NSLS beamline X4C BNL NSLS beamline X4C Detector ADSC Q4R MarCCD 165 MarCCD 165

Longitud de onda (Å) 0.9791 0.9791 0.9791 Grupo espacial C2221 C2221 C2221

Parámetros de celda unitaria (Å) a=93.69. b=110.31. c=96.15 a=93.63. b=110.02. c=96.06 a=93.48. b=109.91. c=96.10 Volumen celda (Å

3) 993704.76 989530.58 987368.49

Intervalo de resolución (Å) 20.0 - 1.50 (1.60 - 1.50) 20.0 - 1.60 (1.80 – 1.60) 20.0 - 1.80 (2.0 - 1.80) Reflexiones únicas 79277 65307 43772

Multiplicidad 4.50 (4.39) 4.55 (4.52) 4.47(4.34) Integridad (%) 97.3 (86.7) 99.7 (99.8) 95.0 (94.0)

I/σ(I) 15.76 (3.49) 14.31 (4.02) 11.09 (4.37) Rmerge (%) 7.7 (46.6) 7.8 (38.7) 20.1 (44.7)

Valor B de Wilson (Å2) 8.66 10.20 10.28

Mosaicismo 0.119 0.163 0.263

Tiempo de exposición / por imagen 20s/1° 20s/1° 20s/1°


** A pesar de la mala estadística de la estructura 100mM NaNO3, se decidió presentarla ya que los resultados obtenidos a partir

de ella confirman los resultados observados cuando se utiliza NaNO3 como radioprotector.

Tabla 9. Parámetros estadísticos del afinamiento de los datos de tres cristales de MCO-Tth con NaNO3 como

radioprotector en distintas concentraciones (100 y 500mM) y tiempos de remojado (1, 1.5 y 7 minutos) en las

líneas X4A y X4C.

100mM NaNO3 1.5min 500mM NaNO3 1 minuto 100mM NaNO3 7 minutos

Rwork

/Rfree

17.45 / 19.66 17.82 / 21.26 18.92 / 23.74

Contenido de la unidad asimétrica Todos los átomos 4916 4853 4713 Átomos de proteína 4259 4249 4249 Iones de cobre 3 3 3 Moléculas de agua 526 473 333 Moléculas de MPD 16 16 16 R.m.s.d. from ideal 0.049 0.043 0.07 Longitud de enlaces (Å) 2.265 2.116 1.213 Ángulos de enlace (°)

Mean overall B value (Å2

) 14.90 15.81 14.79

Proteína 12.11 13.29 13.55 Solvente H

2O 32.54 32.04 23.18

Solvente MPD 35.25 39.65 33.87 Iones cobre 10.26 10.83 25.81 Residuos en el diagrama de Ramachandran Regiones más favorecidas (%) 94.72 94.74 95.14 Regiones adicionales permitidas (%) 4.07 4.05 3.64 Fuera de intervalo (%) 1.22 1.21 1.21 Dosis absorbida máxima (MGy) 0.32 0.41 0.36 Error en la coordinación

(Probabilidad máxima. Å) 0.29 0.32 0.30

79

En una cuarta colecta de datos realizada en NSLS línea X6A, utilizando energía estándar (12.47 keV),

longitud de onda de 0.979Å, se colectaron datos de 19 cristales sometidos a la técnica de soaking,

haciendo uso de distintos agentes radioprotectores con distintas concentraciones y bajo distintos

tiempos de remojado. El número de imágenes colectadas entre los distintos cristales variaron, sin

embargo los tiempos de exposición permanecieron constantes en 10 segundos por frame en todos los

casos. Los datos analizados y presentados en las Tablas 10 y 11, representan solo 5 de los 19 cristales, los

cuales presentaron parámetros estadísticos aceptables después de la colecta, integración, escalamiento

y afinación de los datos.

Tabla 10. Parámetros estadísticos de la colecta, integración y escalamiento de datos en la línea X6A de 5 cristales

sometidos a la técnica de soaking, haciendo uso de distintos agentes radioprotectores con distintas

concentraciones y bajo distintos tiempos de remojado.

5mM Cu2PC 3 min 5mM Cu2PC 5 min 5mM Cu2PO 8 min 100mM ascorbato 10 min 100mM CuSO4 20min




BNL NSLS beamline X6A BNL NSLS beamline X6A

Detector ADSC Q270 ADSC Q270 ADSC Q270 ADSC Q270 ADSC Q270

Longitud de onda (Å) 0.9184 0.9184 0.9184 0.9184 0.9184 Grupo espacial C2221 C2221 C2221 C2221 C2221

Parámetros de celda unitaria (Å)

a=93.47, b=110.14, c=96.18

a=93.35, b=110.11, c=96.05

a=93.41, b=109.89, c=96.05

a=93.57, b=109.83, c=96.34 a=93.65, b=110.36, c=95.95

Volumen celda (Å3

) 990152.42 987275.66 985936.34 990066.23 991663.78

Intervalo de resolución (Å)

20 - 1.82 (2.0-1.82) 20.0 - 1.60 (1.80 - 1.60)

20 - 1.55 (1.70-1.55) 20 - 1.80 (1.90-1.80) 20 - 1.70 (1.80-1.70)

Reflexiones únicas 44643 65184 70218 42015 54745 Multiplicidad 4.55 (4.58) 4.53 (4.53) 4.37 (4.32) 2.45 (2.39) 4.54 (4.56) Integridad (%) 99.7 (99.9) 99.8 (99.9) 97.8 (99.4) 91.2 (94.0) 99.5 (99.4) I/σ(I) 15.74 (5.05) 19.11 (5.24) 13.74 (2.68) 10.83 (2.02) 16.95 (3.32) Rmerge (%) 8.6 (32.4) 6.4 (31.3) 8.3 (52.0) 8.2 (52.1) 7.7 (48.8) Valor B de Wilson (Å

2) 12.27 10.30 10.37 13.63 11.15

Tiempo de exposición

/ por imagen

10 s / 0.5° 10 s / 0.5° 10 s / 0.5° 10 s / 0.5° 10 s / 0.5°

*Los valores en paréntesis corresponden a la última faja de resolución

80

Tabla 11. Parámetros estadísticos del afinamiento de datos en la línea X6A de 5 cristales sometidos a la técnica de

soaking, haciendo uso de distintos agentes radioprotectores con distintas concentraciones y bajo distintos tiempos

de remojado.

5mM Cu2PC 3 min 5mM Cu2PC 5 min 5mM Cu2PO 8 min 100mM Ascorbato 10 min 100mM CuSO4 20min

Rwork/Rfree 16.71 / 19.39 15.84 / 18.92 19.77 / 24.12 18.51 / 22.38 16.88 / 22.20 Contenido de la unidad asimétrica

Todos los átomos 4723 4803 4831 4695 4764 Átomos de proteína 4260 4259 4259 4259 4259 Iones de cobre 3 3 3 3 3 Moléculas de agua 356 421 441 305 374 Moléculas de MPD 13 15 16 16 16 R.m.s.d. from ideal

Longitud de enlaces (Å) 0.010 0.010 0.010 0.008 0.007 Ángulos de enlace (°) 2.007 1.993 1.978 1.287 1.280

Mean overall B value (Å2

) 15.10 15.52 15.26 20.66 16.11

Proteína 13.47 13.44 12.99 18.78 14.03 Solvente H

2O 27.91 30.49 29.70 33.96 29.75

Solvente MPD 37.83 36.84 40.96 51.53 45.38 Iones cobre 11.50 13.07 26.65 23.71 18.06 Residuos en el diagrama de Ramachandran

Regiones más favorecidas (%) 94.74 95.49 95.90 94.31 95.12 Regiones adicionales permitidas (%)

3.64 3.28 2.46 4.07 2.85

Fuera de intervalo (%) 1.62 1.23 1.64 1.63 2.03 Dosis absorbida máxima (MGy) 0.52 0.57 0.49 0.53 0.42 Error en la coordinación (Probabilidad máxima. Å)

0.20 0.22 0.26 0.19 0.22

Los datos obtenidos en ambas tablas representan de manera general parámetros estadísticos similares a

los de los cristales nativos colectados con dosis equivalentes de radiación. Con respecto al daño

específico que se observa en el CTC de la proteína, específicamente en los iones CuT2 y CuT3´. El CuT2

presenta depleción total mientras que el CuT3´ muestra la pérdida de coordinación con la His137. No se

observa la capacidad protectora esperada contra el efecto reductor de los electrones y electrones

hidratados, ya que estos sitios metálicos se encuentran dañados de igual manera a las estructuras en

ausencia de radioprotectores. Las estructuras generadas a partir de los 8 cristales previamente

presentados con distintos agentes radioprotectores se presentan en las Figuras 41 a 44.

81



100mM NaNO3 7 minutos (0.36MGy) 1.80Å; C, 500mM NaNO3 1 minuto (0.40MGy) 1.60Å. Mapas 2fo-fc a 1 sigma


A

B

C

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

82


procedentes de cristales sometidos a la técnica de soaking. D, 100mM ascorbato 10 minutos (0.62MGy) 1.80Å; E,

100mM CuSO4 20 minutos (0.43MGy) 1.70Å; F, 5mM Cu2PC 3 minutos (0.58MGy) 1.82Å; G, 5mM Cu2PC 5 minutos

(0.64MGy) 1.80Å y H, 5mM Cu2PO 8 minutos (0.55MGy) 1.55Å. Mapas 2fo-fc a 1 sigma representados en azul.

D

E

F

G

H

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

His 95 His 396

83



100mM NaNO3 7 minutos (0.36MGy) 1.80Å; C, 500mM NaNO3 1 minuto (0.40MGy) 1.60Å; D, 100mM CuSO4 20

minutos (0.43MGy) 1.70Å. Mapas 2fo-fc a 1 sigma representados en azul.

A B

C D

84


procedentes de cristales sometidos a la técnica de soaking. E, 100mM ascorbato 10 minutos (0.62MGy) 1.80Å; F,

5mM Cu2PC 3 minutos (0.58MGy) 1.82Å; G, 5mM Cu2PC 5 minutos (0.64MGy) 1.80Å y H, 5mM Cu2PO 8 minutos

(0.55MGy) 1.55Å. Mapas 2fo-fc a 1 sigma representados en azul.

6. Análisis y discusión de los resultados

Con respecto a los resultados obtenidos a partir de las estructuras analizadas se confirma nuevamente, y

de manera contundente, el daño por radiación que presentan los cristales de MCO-Tth por exposición a

E F

G H

85

los rayos X. Este daño ya había sido observado previamente (Serrano-Posada, H., Tesis Doctorado). Sin

embargo, no había sido evaluado con profundidad, ni había tratado de ser mitigado.

Con el fin de facilitar el análisis de los datos presentados en el apartado de Resultados ahora se presenta

en la Tabla 12 los datos más relevantes de los cristales, los cuales permitirán el desarrollo de esta

sección.

Tabla 12. Parámetros comparativos de los cristales analizados durante el desarrollo de este trabajo.

Cristal / Fuente de rayos X Energía (keV) / λ(Å) Flujo (fotones/segundo)

Tiempo de exposición (segundos) por imagen

Imágenes/Δφ

Dosis de radiación absorbida (MGy)

A1 (datos a 1.6Å) ESRF-ID15A

38.42/ 0.323 30.0 x 1010

5 160/1.0° 0.43

A2 (datos a 1.6Å) ESRF-ID15A

38.42/ 0.323 30.0 x 1010

5 283/1.0° 0.76

B (datos a 1.6Å) ESRF-ID15A

38.42 / 0.323 30.0 x 1010

5 160/1.0° 0.43

C (datos a 1.6Å) ESRF-ID15A

38.42/ 0.323 30.0 x 1010

10 142/1.0° 0.76

Nativo Estructura 1 (1.6Å) NSLS X6a

12.65 / 0.979 3.67 x 1010

13 110/1.0° 0.40


12.65 / 0.979 3.36 x 1010

13 110/1.0° 1.63


12.65 / 0.979 3.12 x 1010

13 110/1.0° 2.76

Nativo Estructura 4 (1.76Å) NSLS X6A

12.65 / 0.979 2.88 x 1010

13 110/1.0° 3.80


12.65 / 0.979 2.65 x 1010

13 110/1.0° 4.78


12.65 / 0.979 2.49 x 1010

13 110/1.0° 5.68


12.65 / 0.979 2.33 x 1010

13 110/1.0° 6.51


12.65 / 0.979 2.10 x 1010

13 110/1.0° 7.28

Nativo (1.9Å) NSLS X4A

12.66 /0.979 1.21 x 1010

20 110/1.0° 0.29

Nativo atenuado 40 foils (imágenes 1 a 110) (2.3Å)

NSLS X6A

12.69/0.977 1.73 x 108 90 110/1.0° 0.02

Nativo atenuado 40 foils (imágenes 360 a 470) (2.5Å)

NSLS X6A

12.69/0.977 1.73 x 108 90 110/1.0° 0.08

Nativo ánodo rotatorio AR240 (1.7Å) LANEM IQ UNAM

8.041 / 1.541 8.0 x 108 240 220/0.5° 0.51


8.041 / 1.541 8.0 x 108 120 220/0.5° 0.26


8.041 / 1.541 8.0 x 108 60 220/0.5° 0.13

5mM Cu2PC verde 3 min (1.82Å) NSLS X6A

13.50/0.918 2.49 x 1010

10 220/0.5° 0.52

5mM Cu2PC verde 5 min (1.80Å) NSLS X6A

13.50/0.918 2.75 x 1010

10 220/0.5° 0.58

5mM Cu2PO azul 8 min (1.55Å) NSLS X6A

13.50/0.918 2.36 x 1010

10 220/0.5° 0.49

100mM A. asc 10 min (1.80Å) NSLS X6A

13.50/0.918 2.61 x 1010

10 220/0.5° 0.53

100mM CuSO4 (1.70Å) NSLS X6A

13.50/0.918 1.75 x 1010

10 220/0.5° 0.42

100mM NaNO3 1.5 min (1.5Å) NSLS X4A

12.66/0.979 1.35 x 1010

20 110/1.0° 0.32

500mM NaNO3 1 min (1.6Å) NSLS X4C

12.66/0.979 3.52 x 1010

10 110/1.0º 0.41

86

A pesar de explorar distintas estrategias de colecta y preservación de la información específicamente

orientada para evitar la escisión de los sitios metálicos del CTC, como son el uso de agentes

radioprotectores, colecta de datos en alta y baja energía, uso de atenuadores y flujos de radiación

reducidos en ánodo rotatorio, este daño de tipo específico a centros metálicos fue persistente. El

principal parámetro que permitió de una forma más precisa determinar la cantidad de radiación

depositada en cada uno de los cristales fue la dosis absorbida de radiación, la cual gracias al programa

RADDOSE, así como a las calibraciones realizadas en las distintas líneas de difracción y colecta permitió

conocer un aproximado de la cantidad de MGy depositados en cada muestra.

Con respecto a los datos presentados a partir del cristal nativo irradiado de manera continua, el cual

permitió la obtención de 8 estructuras distintas con dosis de radiación acumulativa (0.40 a 7.28 MGy), se

observa, un aumento en los parámetros indicativos de daño inespecífico, los cuales impactan de manera

global el orden interior de los cristales, ocasionando un decremento en la calidad de los datos

estadísticos obtenidos. Sin embargo, a pesar de que los tiempos de colecta necesarios para obtener las 8

estructuras, y por tanto la cantidad total de fotones depositada en este cristal es considerablemente alta

(~1015 fotones depositados al final de la colecta de la estructura 8), no se observaron otros indicadores

de daño específico adicionales a los ya considerados en el sitio CuT2 y CuT3´.

Mediante el análisis de un cristal nativo difractado en esta ocasión en la línea X4A el cual presentaba una

dosis de radiación absorbida de 0.29 MGy (~0.1 MGy por debajo de la dosis de radiación absorbida por la

Estructura 1 anteriormente presentada), y de forma contrastante presentaba a los CuT2 y CuT3´con

menor daño con relación a las estructuras obtenidas del cristal irradiado de manera continua. Este

resultado permitió considerar que efectivamente la dosis de radiación absorbida por un cristal es el

parámetro más importante implicado en la preservación de estos los CuT2 y T3´, y que específicamente

en la MCO-Tth la colecta de datos por debajo de ~0.3 MGy permite preservar a estos sitios metálicos.

De acuerdo a los resultados anteriormente presentados se procedió a analizar datos procedentes de

experimentos que permitieran la colecta de cristales utilizando flujos de fotones bajos, para así asegurar

que la dosis de radiación absorbida por el cristal se encontrara por debajo de este valor de ~0.3 MGy y

así confirmar lo anteriormente observado. De esta forma se planearon colectas haciendo uso de un haz

atenuado (X6A atenuada con 40 foils de aluminio), así como de un ánodo rotatorio donde en ambos

casos la colecta de datos se realizó con flujos de rayos X como se ha mencionado con anterioridad, dos

órdenes de magnitud por debajo del flujo de una línea sincrotrónica de energía estándar como X6A, X4A

o X4C, asegurando de esta forma que la dosis de radiación absorbida en los cristales (específicamente

87

AR60, AR120 y atenuados) sea inferior a la de todas las estructuras presentadas en este trabajo. Sin

embargo, sorprendentemente el daño por radiación observado fue específico, afectando únicamente a

los CuT2 y T3´, de la misma forma que en los cristales que fueron colectados con un perfil de flujo de

rayos X mayor y por tanto con mayor dosis absorbida.

Estos datos generan una nueva pregunta con respecto a la dosis de radiación depositada en un cristal, la

cual es: ¿existe algún otro factor distinto a la dosis de radiación depositada en los cristales nativos de

MCO-Tth que juegue un papel trascendental en el daño a sitios metálicos?, la respuesta es sí, este factor

es la dosis relativa al tiempo, es decir el flujo de fotones por unidad de tiempo que absorbe un cristal.

Leiros y colaboradores, (2006) concluyeron que de forma general el impacto de la dosis absorbida de

radiación por un cristal presenta dos componentes: un comportamiento dependiente de la dosis

absorbida, relacionado estrechamente con el daño primario, el cual impacta de forma negativa en

algunos parámetros macroscópicos del cristal como son el poder de difracción del cristal, la resolución

máxima, la expansión de la celda unitaria así como el mosaicismo, y otro componente independiente de

la dosis absorbida relacionado con el daño secundario y la distribución del flujo de fotones y radicales

generados en el cristal a través del tiempo. Se ha observado que la dosis relacionada al tiempo impacta

de forma negativa y de manera específica a los átomos más sensibles en las estructuras de proteínas

(Leiros et al. 2006) y que este está relacionado con el daño secundario.

El daño secundario, el cual como se ha planteado en este trabajo, es altamente dependiente del tiempo,

así como de la temperatura; es decir al aumentar el tiempo en el cual el cristal se encuentra expuesto a

los rayos X, las probabilidades de que los radicales formados se difundan y reduzcan o dañen el sistema

aumentan. O´Neill y colaboradores (2002), consideran importante a la dosis relacionada al flujo, ya que

las interacciones de las especies producidas en el interior del cristal son dependientes del flujo de

fotones, así como del tiempo de vida media de los radicales en la proteína. Ellos consideraron que a

flujos de radiación altos se permite mantener un equilibrio entre las reacciones de formación y

desaparición de radicales libres, es decir las reacciones de recombinación mantienen en concentración

baja a los radicales generados en el sistema. Esto adquiere mayor fuerza si se considera que solo se

requieren alrededor de 10 fotones absorbidos por celda unitaria con energía de 12 keV (1.0 Å) para

generar un daño severo en esta, el cual se traduciría en la ruptura de 10 enlaces dentro de la misma, sin

embargo esta absorción se cree es dependiente del tamaño de la proteína (Sliz et al. 2003).

De esta forma, la formación, recombinación y difusión de radicales libres contribuye a la población total

de radicales libres formados en el sistema, de esta manera cuando los valores de dosis relacionada al

88

flujo son altos, los tiempos de irradiación son muy prolongados, o las reacciones de recombinación de

radicales no son lo suficientemente veloces para disminuir la población de radicales libres, se facilita la

difusión de radicales en el interior del cristal ya que se aumenta su tiempo de estancia, aumentando así

la probabilidad de daño debido a la reducción de las partes más sensibles del cristal, como es el caso de

los centros metálicos, específicamente en este caso de los cobres T2 y T3´.

Considerando el daño secundario y el impacto de los radicales generados en el medio de la proteína con

el fin de preservar a los iones cobre presentes en el CTC y así poder observar de manera completa el sitio

catalítico por el que la MCO-Tth opera se hizo uso de agentes radioprotectores. Se analizaron los datos

obtenidos a partir de las 8 estructuras generadas utilizando distintos agentes radioprotectores, a

distintas concentraciones y tiempos de soaking. Algunos de los compuestos evaluados, ya había sido

utilizados con éxito anteriormente tanto en nuestro grupo de trabajo como en varios trabajos

bibliográficos. Estos resultados indicaban aumentos en la tolerancia a la dosis de radiación absorbida por

los cristales y por tanto brindaban al sistema cristalino de protección contra radicales hidroxilo,

electrones y electrones hidratados. Al comparar las estructuras generadas utilizando radioprotectores

con aquellas procedentes de cristales nativos, se puede observar que el daño temprano generado por los

rayos X en los CuT2 y T3´ es común en las 8 estructuras, si bien es cierto que la dosis de radiación

absorbida en casi todos los casos se encuentra por encima de 0.30 MGy (dosis aproximada en la cual se

observó una disminución en el daño a los sitios metálicos CuT2 y CuT3´). Si bien existe un cristal con un

perfil de colecta en la línea X4A del NSLS muy similar a aquella que permitió la obtención de la estructura

con menor daño en estos iones cobre, cabe aclarar que la dosis depositada en este cristal es ~0.3 MGy

mayor.

Es realmente notable como a pesar del uso de agentes radioprotectores en cristales de la MCO-Tth no se

observen modificaciones en algunos de los parámetros estadísticos. Indicando de esta forma que no

existe un efecto protector sobre el daño inespecífico ni especifico, ya que los valores estadísticos

observados muestran un comportamiento similar al de un cristal nativo. Si bien estos datos no son

directamente comparables al proceder de cristales distintos, el efecto de los agentes radioprotectores

bajo las concentraciones y tiempos mencionados, se podría decir que no es observable en los cristales

analizados por tanto su efecto protector es nulo.

Otro de los factores planteados en el trabajo como implicado en el daño por radiación fue el efecto

fotoeléctrico el cual disminuye de manera abrupta (siendo 34 veces menor que a ~12 keV) cuando se

trabaja con longitudes de onda cortas o rayos X de alta energía. El análisis de los datos generados a partir

89

de los cristales colectados en la línea ID15A del ESRF: A1, A2, B y C, permitió conocer el efecto de la

disminución del efecto fotoeléctrico. La colecta de los datos presenta dosis de radiación acumulada

considerablemente más altas que las de cristales colectados en líneas de energía estándar, a pesar de

que los tiempos de colecta sean cortos, esto está dado por la alta densidad de fotones dada por el flujo

de rayos X. Los datos analizados no permiten correlacionar el impacto del efecto fotoeléctrico con el

daño en sitios metálicos ya que estos se encuentran afectados como sucede con las estructuras

colectadas en líneas donde el efecto fotoeléctrico es mayor. De esta forma se podría considerar que la

disminución del impacto del efecto fotoeléctrico es nulo o su papel en el daño generado en los sitios

metálicos de la MCO-Tth es compensado por la dosis alta de fotones que son irradiados en el cristal,

generando otro tipo de eventos radiolíticos, considerando de esta forma que el daño por radiación es un

proceso multifactorial.

Adicionalmente a estos resultados cabe destacar que una comparación más precisa de las estructuras

generadas en alta energía no fue posible debido a los problemas presentados en la sensibilidad de

detección de fotones por parte del detector Image Plate Mar165. Estas limitaciones experimentales se

verán subsanadas con el desarrollo de líneas de difracción de alta energía especializadas para el

desarrollo de experimentos de cristalografía de proteínas, ya que específicamente la línea donde se

desarrollaron los experimentos es utilizada de manera convencional para experimentos de ingeniería de

materiales debido a esto y a las características propias del detector las cuales han sido consideradas con

más detalle en la sección de Resultados “Impacto del uso de altas energías y disminución del efecto

fotoeléctrico en la MCO-Tth” no se incluye un análisis más abundante de los resultados obtenidos.

Una de las posibles explicaciones encontradas ante los resultados previamente presentados es el hecho

de que el sistema cristalino de la MCO-Tth se encontrara protegido contra las especies generadoras de

daño primario, secundario, específico e inespecífico. Esta protección seria debida a la presencia del MPD

en altas concentraciones, dicho alcohol se encuentra como parte de la solución de cristalización (60 a

70%), así como parte de la solución criopreservadora (45%), es decir un poco más de la mitad del

volumen del cristal de la MCO-Tth está ocupado por moléculas de MPD.

Con el fin de analizar el posible efecto radioprotector que genera el MPD (2-metil-2,4 pentanodiol) sobre

el sistema de la MCO-Tth, se evaluó la presencia de este agente precipitante en la base de datos del PDB

comparando la totalidad de estructuras presentes en esta base de datos (1492) y el promedio de

resolución en la cual se han publicado dichas estructuras, siendo este número 1.98 Å comparado con el

número total de estructuras reportadas de 76,227 con un promedio de resolución de 2.19 Å. Si bien

90

estos datos no son contundentes y solo indican una posible mejora en la resolución de la estructuras en

los rangos de resolución de 0.5 a 2.5 Å, la cual puede ser debida a varios factores (Figura 45). El valor de

ADPs promedio del MPD reportado en el PDB a partir de las estructuras reportadas hasta la fecha es de

36 ±1.9Å2.

Figura 45. Impacto del agente precipitante MPD en la resolución máxima de las estructuras que lo contienen

reportadas en el PDB. Se compara la totalidad de estructuras presentes con MPD en esta base de datos (1,492) y el

promedio de la resolución en la cual se han publicado dichas estructuras, siendo este número 1.98Å (barras azules),

comparado con el número total de estructuras reportadas de 76,227 con un promedio de resolución de 2.19 Å

(barras rojas).

De esta forma y con base en algunos de los datos antes mencionados se podría hipotetizar que el

sistema cristalino de la MCO-Tth, se encuentra protegido por sí mismo con un radioprotector con base

en los argumentos previamente mencionados y de acuerdo a las siguientes consideraciones:

a) O´Neill y colaboradores (2002), observaron que cuando las concentraciones de radioprotectores

presentes en el cristal son altas, muchos de los radicales generados en el cristal son interceptados antes

de su interacción con la proteína. El MPD se encuentra en altas concentraciones en cristales de

proteínas; el cual si bien es cierto que hasta ahora, no se ha probado como agente radioprotector, se

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0-0,5 0,5-1,0 1-1,5 1,5-2,0 2,0-2,5 2,5-3,0 3,0-3,5 3,5-4,0 4,0-4,5 4,5-5,0

Po

rcen

taje

de

PD

B´s

Resolución (Å)

Sin MPD

Con MPD

91

sabe actúa como agente deshidratante de forma penetrativa, modificando por desplazamiento el

entorno de moléculas de agua, principalmente en surcos y cavidades (en algunas ocasiones sitios activos

de unión a ligandos) así como en la superficie de proteínas. Esta propiedad resulta en una reducción del

área accesible para el solvente, lo que puede tener importantes implicaciones en la estabilidad y

movilidad de las proteínas (Anand et al. 2002).

b) Al existir una disminución en el número de moléculas de agua por sustitución de estas por MPD en el

entorno de la proteína, se reduciría la radiólisis de las mismas, lo que impactaría en la cantidad de

radicales generados a partir del mismo.

c) Se ha observado que el MPD promueve la estabilización de las proteínas por hidratación preferencial

facilitado esto por la unión de moléculas de MPD a la superficie hidrófoba, además de su gran capacidad

de formación de enlaces de hidrógeno, de esta forma la unión del MPD a la proteína podría tener

grandes implicaciones en la estabilidad termodinámica de las proteínas (Anand et al. 2002).

d) Anand y colaboradores (2002), observaron que el MPD disminuía la constante dieléctrica de la

solución en donde se encuentra, lo que podría estar implicado en una reducción en el flujo de electrones

circulantes en el medio.

Un resultado contrastante con los previamente presentados es el obtenido dentro del proyecto de tesis

de Maestría en desarrollo de la Biol. Nizaá Jiménez. Dicho trabajo se centra en la afinidad de varios

compuestos metálicos en la tapa o loop de la MCO-Tth. En uno de los experimentos realizados, se

remojó un cristal de MCO-Tth en 1mM de CuSO4 y 30mM del agente reductor ditionita de sodio

(hidrosulfito de sodio), en la estructura generada se observa la presencia del CuT2, así como continuidad

en la densidad electrónica de la His137 y el CuT3´ a dosis depositadas de 0.356 MGy. Otro dato

importante es que cuando el cristal fue expuesto a la ditionita de sodio, este perdió su color azul

característico, lo cual implica la reducción del CuT1 (Hakulinen et al. 2006). Es preciso mencionar que

este cristal fue difractado en la línea X6A del NSLS, sin atenuación, la dosis absorbida por este cristal es

aproximadamente 0.06 MGy superior a la del cristal nativo, presentado en esta tesis, en el cual se

observa cierta preservación en los sitios T2 y T3´.

Kau y colaboradores (1987), observaron mediante espectros de fluorescencia que en cristales de la

lacasa de Rhus vernicifera no expuestos a radiación, una señal sencilla a 8999 eV en los espectros (Fig. 46

línea continua), la cual es característica del estado oxidado del Cu+2. Después de la colecta de datos y

alcanzando una dosis estimada de 5.9 MGy, la intensidad de la señal a 8999 eV disminuye, aunado a la

Inte

nsi

dad

no

rmal

izad

a (u

nid

ade

s ar

bit

rari

as)

92

aparición de un hombro a 8987 eV (Fig. 46 línea discontinua). Este hombro es característico del estado

cuproso o reducido del cobre (Cu+1). Posteriormente De la Mora y colaboradores (2012), confirmaron

que los cobres son reducidos en las MCOs debido a los rayos X.

Figura 46. Espectros de absorción de rayos X mostrando la reducción del Cu+2 a Cu+1 después de la irradiación con

rayos X. El espectro correspondiente al cobre oxidado (línea sólida) corresponde al cristal de C. gallica antes de la

colecta de datos por rayos X, mientras el espectro reducido (línea discontinua) muestra la reducción del cobre

durante la colecta de datos (De la Mora et al. 2012).

Así, la presencia de la ditionita de sodio parece haber reducido a los cobres del CTC de la MCO-Tth antes

de la exposición por los rayos X, evitando de esta forma que el ciclo catalítico mediado por el flujo de los

electrones, producto de la irradiación se llevara a cabo. De esta forma por un medio químico esta

estrategia llevo a la enzima MCO-Tth al estado catalítico denominado como estado totalmente reducido

(ETR), en el cual sus iones cobre deben de ser re oxidados o cambiados para poder iniciar un nuevo ciclo

catalítico, sin embargo bajo las condiciones reductoras del flujo de electrones este proceso se bloquea.

Mediante esta estrategia y la observación en la preservación de estos sitios metálicos se puede observar

que existe una relación entre el daño generado y el estado de oxidación de los iones metálicos en esta

metaloenzima, hablando de esta forma de un daño asociado con el ciclo catalítico, el cual es anulado

aparentemente solo mediante la reducción de los iones metálicos presentes, perdiendo estos, al estar

Energía (eV)

_____ oxidado

------ reducido

93

reducidos, su afinidad y por tanto su potencial de captura de electrones, protegiéndolos y preservando

su ocupación.

Como se ha dejado manifiesto en los resultados de este trabajo sobre la susceptibilidad de los sitios

metálicos, así como las observaciones del daño por radiación en otras proteínas reportadas en la

literatura. Se indica de manera general que se deben evaluar con cautela algunas estructuras del PDB

depositadas, especialmente aquellas donde la dosis depositada no es indicada o aquellas estructuras que

presentan puentes disulfuro o sitios metálicos, requiriendo una re-investigación, debido a que podrían

presentar desde ligeras variaciones debidas a los daños por radiación hasta representar proteínas

severamente afectadas por la exposición de los cristales a los rayos X, destacando además que se debe

de tener cuidado especial al interpretar resultados biológicos o bioquímico-catalíticos cuando se parte

de información cristalográfica.

7. Conclusiones

Efecto de la dosis absorbida a energías de 12 keV

El proceso de reducción y escisión del CuT2 ocurre a dosis mayores de 0.29 MGy cuando se

trabajan con tiempos de exposición por imagen cortos (máximo 20 segundos por imagen) y

flujos sincrotrónicos convencionales (flujos de por lo menos 1010 fotones/segundo).

Con una dosis de radiación mayor a 0.3 MGy el daño generado en la estructura de la MCO-Tth se

torna inespecífico y afecta en términos generales a toda la estructura.

El principal impacto por la dosis absorbida se aprecia en los parámetros clásicos indicativos de

daño como el aumento en el volumen de la celda unitaria, la pérdida del poder de difracción, de

las reflexiones de alta resolución del cristal y los PDAs globales y específicos.

Si bien al utilizar flujos atenuados, los flujos de fotones son disminuidos, los tiempos de

exposición deben ser más prolongados para compensar la pérdida en la intensidad de la señal

generada en el detector, lo que podría aumentar el daño secundario generado.

Efecto de la intensidad de los rayos X en ánodo rotatorio

• Si bien el flujo en este equipo es del orden de 108 fotones/segundo, es decir dos órdenes de

magnitud por debajo del flujo de una fuente sincrotrónica, y por tanto la dosis de radiación que

94

acumularía un cristal es menor, los tiempos de exposición prolongados pueden aumentan las

dosis hasta valores similares a los de las fuentes sincrotrónicas.

• Los tiempos de exposición prolongados utilizando este tipo de fuentes generadoras de rayos X,

dan paso a otros eventos dependientes del tiempo, en los cuales los radicales producidos (daño

secundario), podrían estar jugando un papel importante en el daño por radiación.

Reducción del efecto fotoeléctrico a más de 30 keV

• Si bien es cierto que el uso de longitudes de onda más cortas permite la disminución del efecto

fotoeléctrico, el cual es el principal fenómeno físico involucrado en el daño por radiación y en la

reducción del sistema cristalino mediante electrones, el alto flujo de fotones (1011), debe de ser

considerado como parte fundamental de la colecta de datos el flujo de fotones/segundo

utilizados.

• El aumento en el flujo de fotones compensa la disminución del efecto fotoeléctrico, lo que

explica que a altas energías no se observen cambios en el cobre T2 de estas estructuras.

• El uso de un detector eficiente a estas longitudes de onda es crucial para obtener una colecta de

datos que presente una validez estadística.

Efecto de los agentes radioprotectores o scavengers en fuentes sincrotrónicas

• En términos generales no se observa un aparente efecto protector que se genere en las

estructuras de la MCO-Tth con los radioprotectores evaluados en los tiempos y concentraciones

utilizadas.

• El sistema se encuentra aparentemente protegido de forma previa, por el efecto radioprotector

de moléculas que se encuentren en el medio como el MPD (valores B más altos que el resto de

las moléculas del cristal).

• En ninguno de los sistemas proteína-radioprotector evaluados, se encontró dentro de la proteína

en los mapas de densidad electrónica alguna molécula radioprotectora asociada, lo que podría

indicar falta de difusión y estabilización por parte de los radioprotectores.

95

8. Perspectivas

El estudio de las proteínas MCO, específicamente a la MCO-Tth proporciona un ejemplo de un sistema

proteico con alta sensibilidad a los rayos X, dañando estos de forma específica y preferencial a algunos

de los iones metálicos de su sitio activo. El estudio de la MCO-Tth, deja en evidencia que es

indispensable el desarrollo de una estrategia de colecta de datos, orientada de manera específica en el

tipo de información que se desea obtener a partir del cristal difractado, además de hacerla un buen

modelo para el estudio del daño diferencial debido a los rayos X en metaloproteínas

Si bien esta tesis es un estudio sobre varias estrategias presentadas en la literatura, para preservar por

más tiempo y con mayor calidad la información obtenida a partir de experimentos de cristalografía. Abre

la puerta al desarrollo de más preguntas orientadas al efecto de los rayos X en los sitios metálicos, así

como del daño especifico en centros metálicos, el uso de agentes radioprotectores y distintas energías y

flujos durante la colecta. Entre estas preguntas destacan: a) el papel del pH durante la colecta y su

impacto en el ciclo catalítico, en la coordinación y en los centros metálicos, evaluado desde un punto de

vista cristalográfico, b) el papel del MPD en el cristal y su posible efecto radioprotector en cristales de

proteína, c) colecta de datos a distintas temperaturas con el fin de aumentar la difusión de radicales

libres y poder evaluar el impacto del daño secundario, el cual es dependiente en gran medida de la

temperatura y d) evaluar la coordinación y escisión de iones cobres con respecto al estado de oxidación

de los mismos en cristales de la MCO-Tth.

96

9. Bibliografía

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10. Apéndice

10.1 Cálculo del flujo

Como se ha indicado con anterioridad la dosis absorbida por un cristal puede ser calculada a partir de las

interacciones físicas que se dan entre los rayos X y los átomos presentes, pero se considera como un

prerrequisito para este cálculo conocer el tamaño, energía e intensidad del flujo de fotones incidentes,

así mismo es preciso señalar que dicho dato no se encuentra disponible de manera cotidiana en las

líneas de cristalografía macromolecular de rayos X (Owen et al. 2009).

El concepto de medición de flujo de fotones es engañosamente simple: un determinado número de

fotones emergen del colimador cada segundo, dicho número de fotones es cuantificado mediante un

detector (PIN fotodiodo), p. ej. Si 10,000 fotones son contabilizados en 1 segundo, se puede decir que el

flujo de la línea es de 1x105 fotones/segundo, con un error estadístico de ±100 fotones/segundo o 1% de

los fotones contabilizados. Sin embargo, desafortunadamente no existen dispositivos de conteo

apropiados para la medición directa de flujos altos de fotones como lo son los generados por fuentes de

rayos X, esto es debido a que existe un tiempo muerto entre el procesamiento de un fotón y el arribo del

siguiente. A medida que la tecnología avanza el tiempo muerto entre el procesamiento de los datos y la

detección disminuye, lo que genera que una fracción de los fotones que arriban al detector

invariablemente sea omitida, por tanto el valor queda sobreestimado. Aunque mediante factores de

corrección derivados de la distribución de Poisson, se recalcula este valor generando una aproximación

más exacta al flujo de fotones reales incididos (Owen et al. 2009).

De esta forma mediante distintos experimentos, derivaciones y validaciones se ha demostrado que

mediante un modelo simple basado en el depósito de energía sobre una larga superficie de silicio sin

impurezas (PIN fotodiodo), el cual convierte los fotones incididos en corriente o voltaje (Figura 47), es

suficiente para determinar el flujo incidente de fotones en el momento de la colecta de datos (Owen et

al. 2009).

100

Figura 47. Diagrama esquemático de un PIN fotodiodo, donde se muestran las superficies semiconductoras

extrínsecas “P” y “N”, las cuales generan un potencial eléctrico que permiten el movimiento de los fotones a través

de la superficie “Intrínseca”, permitiendo así la contabilización de los mismos como corriente eléctrica (Amperes).

(Modificado a partir de Owen et al. 2009).

De esta forma y con el fin de conocer el flujo de fotones absorbidos por un de cristal de

proteína, se procedieron a realizar distintas mediciones de corriente haciendo uso de PIN

fotodiodos en las líneas X6A, X4A y X4C del NSLS en distintas fechas, a las que se les denominará

de ahora en adelante calibraciones (Tablas 13 a 19). Es importante considerar que para el

cálculo del flujo de fotones se deben de conocer las características propias de los PINES de

silicio a utilizar, las cuales son principalmente la superficie expuesta, la densidad y el grosor. En

dichas calibraciones se consideran como variables la apertura del sistema de slits móviles, la

distancia del PIN fotodiodo al sistema de slits móviles, el tamaño del PIN fotodiodo, así como la

corriente del anillo de almacenamiento en el momento de la determinación del flujo; la cual es

provista por medio de un dispositivo en el magneto doblado (bending magnet), el cual envía los

rayos X procedentes del anillo de almacenamiento hasta la línea de difracción, los rayos X

incididos son reducidos en tamaño por un sistema de slits fijos, pasando después por un

monocromador, el cual permite designar la longitud de onda a utilizar, otro sistema de slits en

este caso móviles, los cuales pueden ser manipulados por el usuario permiten aumentar o

disminuir el tamaño del haz de rayos X y por lo tanto el flujo de los mismos, finalmente se

encuentra la muestra difractada y junto al detector el PIN fotodiodo el cual detecta la corriente

generada por el flujo de fotones que inciden sobre él (Figura 48).

superficie

intrínseca

superficie “P” superficie “N”

101

Figura 48. Esquema de distribución general y posición del PIN fotodiodo como parte de la línea de colecta.

Sin embargo, por sí misma la medición de la corriente detectada (Amperes) por el PIN fotodiodo, no es

suficiente por sí misma para obtener el flujo de rayos X (fotones/segundo). Para obtener este valor es

necesario hacer uso de un factor de conversión, el cual permite relacionar la corriente detectada por el

PIN fotodiodo con el flujo de rayos X. Se sabe que existe una relación directa entre ambos valores. Con

respecto al factor de conversión, este es calculado basándose en los coeficientes de atenuación y

absorción de rayos X en el silicio puro. En la Ecuación 3 se muestra un ejemplo del cálculo de flujo de

fotones haciendo uso del factor de conversión, esto cuando se utiliza un PIN fotodiodo de silicio de

superficie 300 x 300 µm. En este ejemplo el valor detectado de corriente por el PIN fotodiodo es

10.62x10-6 Amperes o 10.62 µA, cuando la longitud de onda del haz incidente es 0.979 Å (12.66 keV) y la

corriente del anillo de almacenamiento es de 308.0 mA. El coeficiente de conversión en este caso es 377,

debido a las características propias del PIN fotodiodo.

Ecuación 3. Cálculo del flujo de rayos X a partir del valor de corriente detectada (amperes) por un PIN fotodiodo de

superficie 300 x 300 µm. Considerando un factor de conversión de 377, derivado de la energía de los fotones

incidentes, así como de los coeficientes de atenuación y absorción de rayos X en el silicio puro.

102


línea X6A (1).

Corriente del anillo

Apertura de slits

Distancia slits a PIN fotodiodo

Atenuación Corriente detectada en el PIN fotodiodo

Flujo de fotones/segundo

308.0 200 x 200 250 Sin atenuar 10.62 x 10-6

28.703 x 109

308.0 110 x 110 250 Sin atenuar 2.3119 x 10-6

6.0717 x 109

308.0 100 x 100 250 Sin atenuar 1.6790 x 10-6

4.4095 x 109

300.0 200 x 200 250 Sin atenuar 10.41 x 10-6

28.00 x 109

300.0 200 x 200 250 Sin atenuar 10.53 x 10-6

27.6548 x 109

300.0 150 x 150 250 Sin atenuar 5.255 x 10-6

13.8011 x 109

296.9 200 x 200 250 2 foils 8.470 x 10-6

22.902 x 109

296.9 150 x 150 250 2 foils 4.1456 x 10-6

11.204 x 109

296.9 110 x 110 250 2 foils 1.7158 x 10-6

4.642 x 109

296.9 100 x 100 250 2 foils 1.2982 x 10-6

3.5086 x 109

292.7 200 x 200 250 4 foils 7.017 x 10-6

18.9648 x 109

292.7 150 x 150 250 4 foils 3.3774 x 10-6

9.1281 x 109

292.7 110 x 110 250 4 foils 1.4625 x 10-6

3.9527 x 109

292.7 100 x 100 250 4 foils 1.0636 x 10-6

2.8745 x 109

300.0 150 x 150 250 8 foils 2.240 x 10-6

6.054 x 109

290.8 200 x 200 250 8 foils 4.795 x 10-6

12.959 x 109

290.8 150 x 150 250 8 foils 2.3655 x 10-6

6.3932 x 109

290.8 110 x 110 250 8 foils 9.7980 x 10-7

2.6432 x 109

290.8 100 x 100 250 8 foils 7.4005 x 10-7

2.0001 x 109

306.0 150 x 150 250 16 foils 1.4556 x 10-6

3.934 x 109

300.0 150 x 150 250 16 foils 1.100 x 10-7

2.97 x 109

286.1 200 x 200 250 16 foils 2.2335 x 10-6

6.0364 x 109

286.1 150 x 150 250 16 foils 1.099 x 10-6

2.9727 x 109***

286.1 110 x 110 250 16 foils 4.8553 x 10

-7 1.3119 x 10

9

286.1 100 x 100 250 16 foils 3.5588 x 10-7

0.9616 x 109

277.5 150 x 150 250 16 foils 1.0965 x 10-6

2.963 x 109**

263.8 150 x 150 250 16 foils 1.0574 x 10

-6 2.857 x 10

9*

265.1 150 x 150 250 16 foils 1.028 x 10-6

2.778 x 109*

250.5 150 x 150 250 16 foils 1.0658 x 10

-6 2.8805 x 10

9**

249.3 150 x 150 250 16 foils 1.0467 x 10-6

2.8289 x 109***

246.5 150 x 150 250 16 foils 9.95 x 10

-7 2.689 x 10

9*

231.9 150 x 150 250 16 foils 9.9975 x 10-7

2.7018 x 109***

230.0 150 x 150 250 16 foils 9.63 x 10

-7 2.603 x 10

9*

228.2 150 x 150 250 16 foils 1.0137 x 10-6

2.739 x 109**

212.1 150 x 150 250 16 foils 9.1927 x 10

-7 2.4845 x 10

9***

207.2 150 x 150 250 16 foils 8.954 x 10-7

2.420 x 109**

206.5 150 x 150 250 16 foils 8.3625 x 10

-7 2.2601 x 10

9*

205.7 150 x 150 250 16 foils 9.2647 x 10-7

2.503 x 109**

204.0 150 x 150 250 16 foils 9.2363 x 10

-7 2.496 x 10

9**

187.0 150 x 150 250 16 foils 8.2206 x 10-7

2.2216 x 109


línea X6A (2).


Apertura de slits

Distancia slits-PIN diodo



291.3 150 x 150 250 Sin atenuar 6.095 x 10-6

16.473 x 109

290.9 110 x 110 250 Sin atenuar 2.670 x 10-6

7.216 x 109

290.7 100 x 100 250 Sin atenuar 1.946 x 10-6

5.259 x 109

285.7 100 x 100 250 Sin atenuar 1.742 x 10-6

4.708 x 109

290.0 100 x 100 250 16 foils 4.981 x 10-7

1.345 x 109

289.7 110 x 110 250 16 foils 6.614 x 10-7

1.786 x 109

289.7 150 x 150 250 16 foils 1.58 x 10-6

4.270 x 109

289.6 200 x 200 250 16 foils 3.176 x 10-6

8.5837 x 109

288.9 200 x 200 250 32 foils 8.147 x 10-7

2.201 x 109

288.6 150 x 150 250 32 foils 3.9906 x 10-7

1.078 x 109

103

288.5 110 x 110 250 32 foils 1.761 x 10-7

0.4756 x 109

288.5 100 x 100 250 32 foils 1.280 x 10-7

0.3459 x 109

286.5 100 x 100 250 40 foils 6.405 x 10-8

0.1729 x 109

286.2 110 x 110 250 40 foils 8.475 x 10-8

0.2270 x 109

286.1 150 x 150 250 40 foils 2.0035 x 10-7

0.5405 x 109

285.9 200 x 200 250 40 foils 4.0045 x 10-7

1.081 x 109


línea X6A (3).


Apertura de slits




238.0 50 x 50 250 Sin atenuar 5.97 x 10-8

1.58 x 108

238.1 100 x 100 250 Sin atenuar 5.15 x 10-7

1.37 x 109

238.1 150 x 150 250 Sin atenuar 1.38 x 10-6

3.66 x 109

238.3 200 x 200 250 Sin atenuar 2.59 x 10-6

6.87 x 109

238.3 250 x 250 250 Sin atenuar 4.07 x 10-6

1.08 x 1010

230.0 300 x 300 250 Sin atenuar 5.81 x 10

-6 1.54x 10

10

237.0 50 x 50 250 Sin atenuar 3.34 x 10-8

8.86 x 107

237.0 100 x 100 250 Sin atenuar 2.26 x 10-7

5.99 x 108

237.0 150 x 150 250 Sin atenuar 5.32 x 10-7

1.41 x 109

237.0 200 x 200 250 Sin atenuar 8.75 x 10-7

2.32 x 109

236.4 250 x 250 250 Sin atenuar 1.25 x 10-6

3.32 x 109

236.4 300 x 300 250 Sin atenuar 1.71 x 10-6

4.54 x 109

235.4 50 x 50 250 Sin atenuar 5.21 x 10-9

1.38 x 107

235.8 100 x 100 250 Sin atenuar 5.01 x 10-8

1.33 x 108

235.8 150 x 150 250 Sin atenuar 1.55 x 10-7

4.11 x 108

235.8 200 x 200 250 Sin atenuar 3.40 x 10-7

9.02 x 108

235.8 250 x 250 250 Sin atenuar 6.26 x 10-7

1.66 x 109

236.0 300 x 300 250 Sin atenuar 1.00 x 10-6

2.65 x 109

214.3 50 x 50 250 Sin atenuar 1.26 x 10-8

3.34 x 107

214.3 100 x 100 250 Sin atenuar 1.11 x 10-7

2.94 x 108

214.3 150 x 150 250 Sin atenuar 2.88 x 10-7

7.64 x 108

214.3 200 x 200 250 Sin atenuar 5.55 x 10-7

1.47 x 109

214.0 50 x 50 200 Sin atenuar 1.27 x 10-8

3.37 x 107

214.0 100 x 100 200 Sin atenuar 1.05 x 10-7

2.79 x 108

214.0 150 x 150 200 Sin atenuar 2.85 x 10-7

7.56 x 108

213.5 200 x 200 200 Sin atenuar 5.45 x 10-7

1.45 x 109

212.8 50 x 50 150 Sin atenuar 1.23 x 10-8

3.26 x 107

213.0 100 x 100 150 Sin atenuar 1.09 x 10-7

2.89 x 108

213.0 150 x 150 150 Sin atenuar 3.07 x 10-7

8.14 x 108

213.3 200 x 200 150 Sin atenuar 5.51 x 10-7

1.46 x 109

192.1 100 x 100 150 Sin atenuar 5.96 x 10-8

1.58 x 108

192.3 200 x 200 150 Sin atenuar 3.13 x 10-7

8.30 x 108

279.5 100 x 100 150 Sin atenuar 1.59 x 10-7

4.22 x 108

279.5 200 x 200 150 Sin atenuar 7.72 x 10-7

2.05 x 109

276.1 100 x 100 150 Sin atenuar 3.73 x 10-7

9.89 x 108

276.1 200 x 200 150 Sin atenuar 1.69 x 10-6

4.48 x 109

256.8 100 x 100 110 Sin atenuar 5.14 x 10-7

1.36 x 109

256.8 200 x 200 110 Sin atenuar 2.59 x 10-6

6.87 x 109

256.2 100 x 100 150 Sin atenuar 4.81 x 10-7

1.28 x 109

256.2 200 x 200 150 Sin atenuar 2.43 x 10-6

6.45 x 109

254.0 100 x 100 150 Sin atenuar 2.13 x 10-7

5.65 x 108

254.4 200 x 200 150 Sin atenuar 1.06 x 10-6

2.81 x 109

253.8 100 x 100 250 Sin atenuar 2.01 x 10-7

5.33 x 108

253.5 150 x 150 250 Sin atenuar 5.33 x 10-7

1.41 x 109

253.6 200x200 250 Sin atenuar 9.64 x 10-7

2.56 x 109

248.9 100 x 100 250 Sin atenuar 1.66 x 10-7

4.40 x 108

249.0 150 x 150 250 Sin atenuar 4.58 x 10-7

1.21 x 109

249.1 200x200 250 Sin atenuar 8.18 x 10-7

2.17 x 109

276.8 100 x 100 300 Sin atenuar 1.44 x 10-7

3.82 x 108

277.0 150 x 150 300 Sin atenuar 3.93 x 10-7

1.04 x 109

277.1 200x200 300 Sin atenuar 7.01 x 10-7

1.86 x 109

104

276.5 100 x 100 270 Sin atenuar 1.43 x 10-7

3.79 x 108

276.3 150 x 150 270 Sin atenuar 3.70 x 10-7

9.81 x 108

276.1 200x200 270 Sin atenuar 7.05 x 10-7

1.87 x 109

275.6 100 x 100 250 Sin atenuar 1.45 x 10-7

3.85 x 108

275.7 150 x 150 250 Sin atenuar 3.97 x 10-7

1.05 x 109

275.9 200x200 250 Sin atenuar 1.45 x 10-7

3.85 x 108

212.2 100 x 100 300 Sin atenuar 9.29 x 10-8

2.46 x 108

212.2 150 x 150 300 Sin atenuar 2.61 x 10-7

6.92 x 108

212.2 150 x 200 300 Sin atenuar 4.71 x 10-7

1.25 x 109

212.8 200 x 200 300 Sin atenuar 3.51 x 10-7

9.31 x 108

286.4 100 x 100 300 Sin atenuar 2.07 x 10-7

5.49 x 108

286.7 150 x 150 300 Sin atenuar 5.25 x 10-7

1.39 x 109

286.9 150 x 200 300 Sin atenuar 7.65 x 10-7

2.03 x 109

287.1 200 x 200 300 Sin atenuar 9.23 x 10-7

2.45 x109

267.0 200 x 200 300 Sin atenuar 7.12 x 10-7

1.89 x 109

198.8 50 x 50 100 Sin atenuar 3.35 x 10-8

8.89 x 107

198.8 100 x 100 100 Sin atenuar 2.76 x 10-7

7.32 x 108

198.8 150 x 150 100 Sin atenuar 7.50 x 10-7

1.99 x 109

198.8 200 x 200 100 Sin atenuar 1.43 x 10-6

3.79 x 109

198.8 250 x 250 100 Sin atenuar 2.30 x 10-6

6.10 x 109

198.8 300 x 300 100 Sin atenuar 3.34 x 10-6

8.86 x 109

197.8 50 x 50 150 Sin atenuar 3.31 x 10-8

8.78 x 107

197.8 100 x 100 150 Sin atenuar 2.69 x 10-7

7.14 x 108

197.8 150 x 150 150 Sin atenuar 7.27 x 10-7

1.93 x 109

197.5 200 x 200 150 Sin atenuar 1.39 x 10-6

3.69 x 109

197.4 250 x 250 150 Sin atenuar 2.23 x 10-6

5.92 x 109

197.4 300 x 300 150 Sin atenuar 3.26 x 10-6

8.65 x 109

197.2 50 x 50 200 Sin atenuar 3.25 x 10-8

8.62 x 107

197.2 100 x 100 200 Sin atenuar 2.66 x 10-7

7.06 x 108

196.9 150 x 150 200 Sin atenuar 7.17 x 10-7

1.90 x 109

196.9 200 x 200 200 Sin atenuar 1.37 x 10-6

3.63 x 109

196.8 250 x 250 200 Sin atenuar 2.22 x 10-6

5.89 x 109

196.7 300 x 300 200 Sin atenuar 3.22 x 10-6

8.54 x 109

196.6 50 x 50 210 Sin atenuar 3.25 x 10-8

8.62 x 107

196.5 100 x 100 210 Sin atenuar 2.67 x 10-7

7.08 x 108

196.5 150 x 150 210 Sin atenuar 7.21 x 10-7

1.91 x 109

196.4 200 x 200 210 Sin atenuar 9.37 x 10-6

2.49x1010

196.4 250 x 250 210 Sin atenuar 2.20 x 10

-6 5.84 x 10

9

196.3 300 x 300 210 Sin atenuar 3.20 x 10-6

8.49 x 109

196.2 50 x 50 250 Sin atenuar 3.17 x 10-8

8.41 x 107

196.2 100 x 100 250 Sin atenuar 2.60 x 10-7

6.90 x 108

196.2 150 x 150 250 Sin atenuar 7.01 x 10-7

1.86 x 109

196.1 200 x 200 250 Sin atenuar 1.33 x 10-6

3.53 x 109

196.1 250 x 250 250 Sin atenuar 2.15 x 10-6

5.70 x 109

196.0 300 x 300 250 Sin atenuar 3.13 x 10-6

8.30 x 109

196.0 50 x 50 300 Sin atenuar 3.07 x 10-8

8.14 x 107

195.9 100 x 100 300 Sin atenuar 2.52 x 10-7

6.68 x 108

195.9 150 x 150 300 Sin atenuar 6.76 x 10-7

1.79 x 109

195.7 200 x 200 300 Sin atenuar 1.29 x 10-7

3.42 x 109

195.6 250 x 250 300 Sin atenuar 2.08 x 10-6

5.52 x 109

195.6 300 x 300 300 Sin atenuar 3.03 x 10-6

8.04 x 109

195.6 50 x 50 400 Sin atenuar 2.88 x 10-8

7.64 x 107

195.5 100 x 100 400 Sin atenuar 2.36 x 10-7

6.26 x 108

195.5 150 x 150 400 Sin atenuar 6.39 x 10-7

1.69 x 109

195.3 200 x 200 400 Sin atenuar 1.22 x 10-6

3.24 x 109

195.3 250 x 250 400 Sin atenuar 1.97 x 10-6

5.23 x 109

195.2 300 x 300 400 Sin atenuar 2.89 x 10-6

7.67 x 109

105


línea X6A (4).


Apertura de slits




243.6 300 x 300 142 Sin atenuar 3.07 x 10-6

30.5776 x 109

243.6 200 x 200 142 Sin atenuar 2.30 x 10-6

22.9083 x 109

243.6 150 x 150 142 Sin atenuar 1.60 x 10-6

15.9362 x 109

243.6 110 x 110 142 Sin atenuar 9.40 x 10-7

9.3625 x 109

243.6 100 x 100 142 Sin atenuar 7.90 x 10-7

7.8685 x 109

241.6 300 x 300 314 Sin atenuar 2.87 x 10-6

28.5857 x 109

241.6 200 x 200 314 Sin atenuar 2.14 x 10-6

21.3147 x 109

241.6 150 x 150 314 Sin atenuar 1.49 x 10-6

14.8406 x 109

241.6 110 x 110 314 Sin atenuar 8.60 x 10-7

8.5657 x 109

241.6 100 x 100 314 Sin atenuar 7.30 x 10-7

7.2709 x 109


X6A.


Apertura de slits




303.1 110 x 110 250 Sin atenuar 2.98 x 10-6

2.8653 x 1010

290.4 110 x 110 250 Sin atenuar 2.04 x 10

-6 1.9615 x 10

10

277.4 110 x 110 250 Sin atenuar 1.54 x 10-6

1.4807 x 1010

267.0 110 x 110 250 Sin atenuar 1.42 x 10

-6 1.3653 x 10

10

256.5 110 x 110 250 Sin atenuar 1.35 x 10-6

1.2980 x 1010

254.9 110 x 110 250 Sin atenuar 1.34 x 10

-6 1.2884 x 10

10

250.7 110 x 110 250 Sin atenuar 1.28 x 10-6

1.2307 x 1010

242.3 110 x 110 250 Sin atenuar 1.15 x 10

-6 1.1057 x 10

10

230.6 110 x 110 250 Sin atenuar 1.02 x 10-6

9.078 x 109


X4A.


Apertura de slits




240.0 200 x 200 80 Sin atenuar 2.64 x 10-6

2.631 x 1010

240.0 200 x 200 120 Sin atenuar 2.55 x 10

-6 2.54 x 10

10

240.0 200 x 200 150 Sin atenuar 2.47 x 10-6

2.47 x 1010

Tabla 19. Mediciones de la corriente en un PIN fotodiodo. Calibración de la línea X4C


Apertura de slits


Atenuación Corriente detectada en el pin diodo


300.0 200 x 200 80 Sin atenuar 4.61 x 10-6

4.60 x 1010

300.0 200 x 200 120 Sin atenuar 4.51 x 10

-6 4.49 x 10

10

A partir de algunos de los valores de flujo obtenidos en la Tabla 13, los cuales corresponden a tres

distintos días de calibración (los valores correspondientes al día 1 se presentan con un asterisco (*), los

106

del día dos por dos asteriscos (**), mientras que los del día tres utilizan tres de ellos (***)). Mediante

estos valores se procedió a generar tres gráficas y ecuaciones, las cuales describen el comportamiento

de la línea X6A del NSLS en tres distintos días de calibración, cuando se utiliza un haz atenuado con 16

foils de aluminio, una apertura de slits de 150x150 y distancia cristal-detector de 250mm. Las gráficas y

ecuaciones obtenidas a partir de los valores de tres días de calibración se presentan de manera conjunta

en la Figura 49.

Es preciso mencionar que las variaciones observadas en algunos de los datos presentados en las tablas

anteriores son debidas a errores de medición y de variaciones en las lecturas, sin embargo estos no

fueron considerados para ninguno de los cálculos desarrollados.

Figura 49. Comportamiento del flujo dependiente de la corriente del anillo de almacenamiento. Se presentan de

forma conjunta los datos de tres distintos días de calibración, utilizando un haz atenuado con 16 foils de aluminio,

una apertura de slits de 150x150 y una distancia cristal-detector de 250 mm.

De manera paralela al cálculo del comportamiento de flujo desarrollado con anterioridad, se procedió a

calcular el impacto del uso de atenuadores y del cierre de slits en la misma línea X6A. En esta ocasión se

consideraron para este cálculo algunos los datos de las Tablas 13 y 14, los cuales presentan valores

similares de corriente en el anillo con variaciones en el tamaño de los slits. Por medio de las

comparaciones entre estos valores se determinaron los porcentajes de disminución de flujo referidos al

tamaño de los slits (Figura 50). De forma similar y haciendo uso de los mismos datos, solo que en esta

ocasión utilizando como variable el número de foils de aluminio utilizados durante la calibración, se

determinaron los porcentajes de atenuación de la línea X6A (Figura 51). Los porcentajes de disminución

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3

200 220 240 260 280 300

Flu

jo (f

oto

nes

/seg

un

do

)

Corriente (mA)

Comportamiento de las líneas

Día 1

Día 2

Día 3

107

en el flujo al cambiar el tamaño de slits, así como la atenuación generada referida de igual forma en

porcentaje al utilizar distinto número de foils de aluminio se presentan en las Tablas 20 y 21.

Tabla 20. Porcentajes de disminución del flujo al manipular la apertura de los slits de la línea X6A.

Pasando de slits de a slits de Sin atenuar (%) 2 foils (%) 4 foils (%) 8 foils (%)

200x200 150x150 N/D 51.078 51.869 50.667

150x150 110x110 56.194 58.568 56.694 58.658 110x110 100x100 27.13 24.429 27.270 24.328 200x200 110x110 N/D 79.731 79.156 79.605 200x200 100x100 N/D 84.683 84.841 84.567 150x150 100x100 68.075 68.689 68.503 68.716

* N/D: dato no disponible

Figura 50. Gráfica de disminución del valor de flujo (x 109 fotones/segundo) en la línea X6A cuando se modifica el

tamaño de los slits.

Tabla 21. Porcentaje de disminución del flujo al atenuar la línea X6A utilizando foils de aluminio.

Tamaño de slits Flujo sin atenuar (fotones/segundo x 10

9)

2 foils (%)

4 foils (%)

8 foils (%)

16 foils (%)

32 foils (%)

40 foils (%)

200x200 27.65 17.17 31.41 53.13 68.94 92.03 96.09 150*150 13.801 18.82 33.86 53.67 69.06 92.18 96.08 110x110 6.0717 23.54 34.89 56.47 70.68 92.16 96.26 100x100 4.409 20.43 34.79 54.61 69.49 92.15 96.07

0

5

10

15

20

25

30

35

150 170 190 210 230 250 270 290 310

Flu

jo x

10

9 fo

ton

es p

or

segu

nd

o

mA

Disminución de flujo debido a los slits

Slits 200x200

Slits 150x150

Slits 110x110

Slits 100x100

108

Figura 51. Gráfica de disminución del valor de flujo (x 109 fotones/segundo) en la línea X6A cuando se atenúa

mediante el uso de distinto número de foils de aluminio

Conociendo de manera individual y de forma especifica el comportamiento de flujo en la línea, así como

los porcentajes de disminución de flujo dado por el cierre de slits y el uso de foils de aluminio, se

procedió a calcular los flujos aproximados que se presentan en cada caso específico de las colectas de

datos de los cristales previamente presentados en este trabajo. Con fines meramente explicativos, se

detalla a continuación la forma en la cual se calcularon los flujos (fotones/segundo) aproximados para

cada caso. Es preciso aclarar que se utilizaron como base de este cálculo los valores promedio obtenidos

de las tres ecuaciones y gráficas generadas, las cuales permitieron desarrollar todos los cálculos

posteriores. Se utilizaron como controles algunos de los datos propios de la calibración, los cuales no

fueron considerados para el cálculo de ninguna de las gráficas ni de los comportamientos descritos.

Ejemplo: A partir de los datos utilizando 16 foils de aluminio, distancia cristal-detector de 250 mm y

tamaño de apertura de slits de 150x150µm, se conoce el flujo de 2.78x109 fotones/segundo cuando el

anillo de almacenamiento presenta una corriente de 265.1mA. Se desea saber el valor de flujo la línea

X6a cuando no hay atenuación por parte de los foils de aluminio y la apertura de slits es de 200x200.

0

5

10

15

20

25

30

170 190 210 230 250 270 290 310

Flu

jo x

10

9 f

oto

ne

s p

or

segu

nd

o

mA

Atenuación mediante foils

Sin atenuar

2 foils

4 foils

8 foils

16 foils

32 foils

40 foils

109

Se sabe que cuando se retira la atenuación de la línea, pasando de 16 foils de aluminio a “ninguno”

existe un aumento en el flujo de un 29.42% (100-70.58%), por lo tanto el cálculo queda de la siguiente

forma.

2.78 x109 fotones/segundo x 100 /29.42 = 9.44 fotones/segundo;

De la misma forma, cuando se pasan de slits de 150 a slits de 200 existe un aumento en el flujo de un

48.13% (100-51.87%).

9.44 x109 fotones/segundo x 100 /48.13 = 18.65 fotones/segundo

De la misma forma que en el ejemplo anterior se generaron las gráficas que permitieron calcular los

flujos cuando existen como variables la corriente del anillo, la atenuación dada por distinto número de

foils de aluminio, así como distinta apertura de slits. En la Tabla 22 se muestran de forma breve algunos

de los valores de flujo (fotones/segundo cuando la corriente del anillo de almacenamiento se encuentra

en 300mA con distintas variaciones experimentales (slits y atenuación por foils) tanto para las líneas X6A,

X4A y X4C.

Tabla 22. Valores de flujo (fotones/segundo) bajo distintas variaciones experimentales (slits y atenuación por foils

de aluminio) tanto para las líneas X6A, X4A y X4C.

Corriente mA Línea Apertura de slits Atenuación (foils de aluminio) Flujo promedio (fotones/segundo)

300 X6A 150x150 16 foils 2.97x109

300 X6A 100x100 40 foils 1.8x108

300 X6A 200x200 Sin atenuar 2.8x1010

300 X6A 300x200 Sin atenuar 3.9x1010

300 X4A 200x200 Sin atenuar 2.2x1010

300 X4C 200x200 Sin atenuar 4.6x1010

En el caso particular de la línea ID15A del ESRF, la cual como parte de un sincrotrón de tercera

generación donde no existen variaciones en la corriente del anillo, es decir esta es constante, el flujo de

fotones/segundo permanece constante durante la colecta, dicho flujo equivale a 3.0x1011

fotones/segundo. En el caso específico de las líneas X4A y X4C se procedió a recrear el comportamiento

de cada una de estas líneas, a partir de las calibraciones utilizando las gráficas generadas mediante los

110

datos obtenidos en la línea X6A. Es notable señalar que el comportamiento de decaimiento de la

corriente en el anillo de almacenamiento del NSLS, y por lo tanto en el flujo de las líneas X6A, X4A y X4C

es igual, ya que todas tienen arquitecturas similares. En el caso del ánodo rotatorio se conoce

directamente por medio del proveedor que el flujo es de aproximadamente 8.0 x108 fotones/segundo.

De esta forma mediante el programa RADDOSE y el cálculo de los valores de flujo, obtenidos a partir de

las calibraciones de las líneas del NSLS X6A, X4A y X4C, y mediante los datos determinados para la línea

del ESRF ID15A y el ánodo rotatorio (LANEM I.Q. UNAM), se generó el cálculo final de las dosis de

radiación absorbida de cada uno de los cristales colectados, permitiendo de esta forma generar datos

comparativos entre si y facilitando el establecimiento de una relación entre la dosis absorbida y los

cambios generados en las estructuras presentadas en este trabajo.

10.2 Consideraciones experimentales en una colecta datos

En los siguientes párrafos se plantean de forma breve algunas consideraciones importantes al momento

de la colecta con el fin de aumentar los tiempos de vida útiles tanto de las proteínas como de sus sitios

metálicos y estructuras sensibles.

Es preciso considerar la planeación como parte fundamental de los experimentos de cristalografía, en

especial cuando se trabajan con metaloenzimas, enzimas quelantes de metales o aquellas que hayan

sido sometidas a la técnica de soaking con metales pesados. Como parte de este análisis se integran una

lista de sugerencias orientada a una mejor colecta de estructuras sensibles a los rayos X ya sea debido a

la susceptibilidad de sus residuos o a la facilidad de escisión de sus sitios metálicos.

1) Identificar posibles sitios sensibles al daño en la proteína a estudiar por cristalografía de rayos X,

investigar acerca de proteínas relacionadas que hayan sufrido este tipo de efectos

desfavorables. Los daños por radiación se vuelven importantes cuando existen diferentes

estados redox en la misma proteína.

2) Determinar la presencia de átomos con altos coeficientes de absorción de rayos X en la proteína,

condiciones de cristalización, así como en soluciones de soaking si este fuera el caso a las

longitudes de onda de que se pretende trabajar. Recordar que los átomos de peso molecular

elevado, contribuyen a un incremento considerable en la dosis de radiación absorbida por el

cristal.

111

3) Antes de la colecta de datos, una buena herramienta para la planeación y el diseño de

experimentos de cristalografía cuando la dosis de radiación absorbida por el cristal comprometa

la información obtenida, es el uso del programa RADDOSE.

4) Los daños por radiación ocurren de manera gradual durante la colecta impactando de distintas

maneras la estructura y calidad del cristal, desarrollándose a distintos tiempos e intensidades. La

colecta selección de flujos y tiempos de exposición desarrolla un eje central en la colecta de

datos en el aseguramiento de colectas de datos con dosis bajas de radiación.

5) Si bien el uso de agentes radioprotectores, alta energía y flujos bajos mediante atenuación y

ánodo rotatorio no genero en este trabajo resultados satisfactorios, el uso de estas estrategias

aunadas a otras como la colecta de datasets compuestos podría permitir la obtención de

estructuras con menores daños debidos a la radiación.

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