TESIS: Interacciones in vivo de proteínas del sistema de ...
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Interacciones in vivo de proteínas del sistema de secreción tipo III de Escherichia coli enteropatógena QUE PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE : T E S I S MAESTRO EN CIENCIAS (BIOQUÍMICAS) P R E S E N T A: O N A S I S V I C E N T E F E R M Í N TUTOR: Dra. Bertha González Pedrajo - IFC México, D.F. Enero, 2014 Noviembre, 2013 FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
Interacciones in vivo de proteínas del sistema de secreción tipo III de Escherichia coli enteropatógena
QUE PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE:
T E S I S
MAESTRO EN CIENCIAS (BIOQUÍMICAS)
P R E S E N T A:
O N A S I S V I C E N T E F E R M Í N
TUTOR: Dra. Bertha González Pedrajo - IFC
México, D.F. Enero, 2014 Noviembre, 2013
FACULTAD DE QUÍMICA
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS
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AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo se realizó bajo la dirección de la Dra. Bertha González Pedrajo
y el apoyo técnico de la Dra. Norma Espinosa Sánchez, en el laboratorio 325 del
Departamento de Genética Molecular del Instituto de Fisiología Celular de la
Universidad Nacional Autónoma de México.
Para la realización del presente proyecto de investigación se contó con el apoyo
de los donativos IN212911 de la Dirección General de Asuntos del Personal
Académico, UNAM; 81847 y 180460 del CONACyT y un apoyo complementario de
la Fundación Miguel Alemán, A.C.
Durante la realización del proyecto se recibió una beca del Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnología (CONACyT) con número de registro 235099.
El comité tutor que asesoró el desarrollo de esta tesis estuvo conformado por
las doctoras: Bertha González Pedrajo, Soledad Funes Argüello y Marina
Gavilanes Ruíz.
El jurado que examinó el presente trabajo estuvo conformado por los doctores:
Herminia Loza Tavera, Francisco Ruiz Terán, Ángel Manjarrez Hernández, María
del Carmen Wacher Rodarte y Gonzalo Castillo Rojas.
El trabajo se desarrolló con el apoyo técnico de los miembros de la Unidad de
Biología Molecular: Dra. Laura Ongay Larios, Biól. Guadalupe Códiz Huerta y M. en
C. Minerva Mora Cabrera; de la Unidad de Cómputo: Biól. Gerardo Coello Coutiño,
Ing. Juan Barbosa Castillo e Ing. Ivette Rosas Arciniega así como del Taller de
Mantenimiento: Ing. Aurey Galván Lobato e Ing. Manuel Ortínez Benavides.
Al Dr. Javier de la Mora Bravo cuyo apoyo técnico y asesoría fue muy importante
para lograr los objetivos principales del presente trabajo.
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A la Mtra. Sandra Moncada Hernández, jefa de la biblioteca, por las facilidades
proporcionadas durante el período de realización del presente trabajo.
A todos los miembros del laboratorio 325 del IFC por el apoyo brindado durante
la realización de este trabajo.
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_____________________________________________________________________ i
ÍNDICE GENERAL
Página
I. RESUMEN………………………………………………………………………………………….. 1
II. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………. 2
2.1 Escherichia coli……………………………………………………………………………. 2
2.2 E. coli diarreagénicas……………………………………………………………………. 3
2.3 Escherichia coli enteropatógena (EPEC)……………………………………………… 8
2.4 Modelo de infección por EPEC………………………………………………………. 9
2.5 Locus de esfacelamiento enterocítico de EPEC……………………………… 12
2.6 Producción de diarrea…………………………………………………………………… 13
2.7 Sistema de secreción tipo 3 (SST3)……………………………………………….. 14
2.8 Sistema de secreción tipo 3 de EPEC……………………………………………. 16
2.9 Interruptores moleculares en el ensamblaje del SST3 de EPEC……… 19
2.9.1 Primer interruptor molecular: control de la secreción de
sustratos tempranos, de la longitud de la aguja, formación del
filamento y secreción de efectores……………………………………………… 21
2.9.2 Segundo interruptor molecular: facilita la secreción de
translocadores y bloquea la secreción de sustratos tardíos
(efectores)…………………………………………………………………………………. 23
III. ANTECEDENTES……………………………………………………………………………….. 25
IV. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………………………. 30
V. HIPÓTESIS………………………………………………………………………………………… 31
VI. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………….. 32
VII. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………………… 33
7.1 Cepas bacterianas y medios de cultivo………………………………………….. 33
7.2 Técnicas de biología molecular……………………………………………………… 33
7.2.1 Amplificación por PCR……………………………………………………….. 33
7.2.2 Purificación de DNA…………………………………………………………… 35
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________ ii
7.2.3 Clonación y subclonación de genes en los vectores pGADT7 y
pGBKT7……………………………………………………………………………………… 35
7.2.4 Obtención de DNA plasmídico……………………………………………. 39
7.2.5 Análisis de restricción………………………………………………………… 39
7.2.6 Secuenciación…………………………………………………………………… 39
7.3 Preparación de células competentes Top-10 con CaCl2 y
transformación del DNA plasmídico……………………………………………………. 40
7.4 Sistema del doble híbrido en levadura…………………………………………… 41
7.4.1 Ensayos de interacción proteína-proteína por doble híbrido
en levadura………………………………………………………………………………… 43
7.5 Análisis de la actividad hemolítica de EPECΔescP………………………… 46
VIII. RESULTADOS………………………………………………………………………………….. 47
8.1 Construcción de plásmidos para doble híbrido en levadura……………. 47
8.2 Análisis de interacción proteína-proteína por doble híbrido…………….. 49
8.2.1 Interacción de la proteína SepD con SepL…………………………… 49
8.2.2 Interacción de la proteína SepL con SepD…………………………… 51
8.2.3 Interacción de la proteína EscP con EscUC…………………………. 53
8.2.4 Interacción de la proteína EscUC con EscP.………………………… 54
8.2.5 Interacción de la proteína EscP con EscUCC………………………… 55
8.2.6 Interacción de la proteína EscUCC con EscP………………………… 56
8.2.7 Interacción de la proteína EscP con SepD………………………….. 58
8.2.8 Interacción de la proteína SepD con EscP………………………….. 59
8.2.9 Interacción de la proteína EscP con SepL…………………………… 60
8.2.10 Interacción de la proteína EscP con Tir…………………………….. 61
8.2.11 Interacción de la proteína Tir con EscP…………………………….. 62
8.2.12 Interacción de la proteína EscP con CesT…………………………. 63
8.2.13 Interacción de la proteína CesT con EscP…………………………. 64
8.2.14 Interacción de la proteína Tir con CesT…………………………….. 65
8.2.15 Interacción de la proteína CesT con Tir…………………………….. 66
8.2.16 Interacción de la proteína EscP con EscF…………………………. 67
8.2.17 Interacción de la proteína EscF con EscP…………………………. 68
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
iii
8.3 Actividad hemolítica de la mutante EPECΔescP.................................... 69
IX. DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………. 71
X. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………… 80
XI. PERSPECTIVAS…………………………………………………………………………………. 81
XII. ANEXOS………………………………………………………………………………………….. 82
XIII. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………….. 86
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
1. Esquema representativo de Escherichia coli………………………………………. 2
2. Mecanismo de patogénesis de los seis patovares diarreagénicos de
E. coli……………………………………………………………………………………………………. 6
3. Modelo de infección por EPEC……………………………………………………………. 10
4. Locus de esfacelamiento enterocítico (LEE) de EPEC………………………….. 13
5. Esquema representativo del inyectisoma de EPEC……………………………… 18
6. Los residuos 309-342 de Spa40, Spa40cc, son la región de
interacción con Spa32……………………………………………………………………………. 27
7. Alineamiento múltiple de EscU de EPEC, Spa40 de Shigella flexneri,
SpaS de Salmonella enterica, YscU de Yersinia enterocolitica, BscU de
Bordetella bronchiseptica, HrcU de Xanthomonas campestris y FlhB del
sistema flagelar de Salmonella enterica………………………………………………… 28
8. Alineamiento múltiple de EscP de EPEC, Orf16 de EHEC y Orf16 de CR.. 29
9. Mapa de restricción y sitio de multiclonación del plásmido pGBKT7……. 37
10. Mapa de restricción y sitio de multiclonación del plásmido pGADT7….. 38
11. Sistema del doble híbrido en levadura……………………………………………… 42
12. Ensayo de interacción de SepD y SepL…………………………………………….. 51
13. Ensayo de interacción de SepL y SepD……………………………………………… 52
14. Ensayo de interacción de EscP y EscUC…………………………………………….. 53
15. Ensayo de interacción de EscUC y EscP…………………………………………….. 54
16. Ensayo de interacción de EscP y EscUCC…………………………………………… 55
17. Ensayo de interacción de EscUCC y EscP………………………………............... 56
18. Ensayo de interacción de EscUCC y EscP…………………………………………… 57
19. Ensayo de interacción de EscP y SepD…………………………………………….. 58
20. Ensayo de interacción de SepD y EscP……………………………………………… 59
21. Ensayo de interacción de EscP y SepL…………………………………………….. 60
22. Ensayo de interacción de EscP y Tir…………………………………………………. 61
23. Ensayo de interacción de Tir y EscP…………………………………………………. 62
24. Ensayo de interacción de EscP y CesT...................................................... 63
25. Ensayo de interacción de CesT y EscP……………………………………………… 64
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________ v
26. Ensayo de interacción de Tir y CesT………………………………………………….. 65
27. Ensayo de interacción de CesT y Tir………………………………………………….. 66
28. Ensayo de interacción de EscP y EscF………………………………………………. 67
29. Ensayo de interacción de EscF y EscP………………………………………………. 68
30. Actividad hemolítica de la mutante EPEC ΔescP……………………………….. 69
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vi
ÍNDICE DE TABLAS
Página
1. Cepas bacterianas utilizadas en este estudio……………………………………… 33
2. Oligonucléotidos utilizados para la amplificación del dominio escUCC…… 34
3. Relación estándar para la reacción de PCR………………………………………… 34
4. Relación de componentes para la transformación en levadura……………. 43
5. Tubos con agua estéril para diluciones………………………………………………. 44
6. Diluciones progresivas de levadura para doble híbrido……………………….. 45
7. Construcciones de DNA realizadas/utilizadas en el presente estudio….. 47
8. Controles para analizar interacciones por doble híbrido………………………. 49
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vii
ABREVIATURAS
A/E Lesión de adherencia y esfacelamiento (del inglés Attaching and
Effacing).
AAF Fimbrias de adherencia agregativa (del inglés Aggregative
Adherence Fimbriae).
AD Dominio de activación de GAL4 (del inglés Activating Domain).
BD Dominio de unión a DNA de GAL4 (del inglés Binding Domain).
BFP Fimbria tipo IV (del inglés Bundle Forming Pilus).
CFA Antígeno factor de colonización (del inglés Colonization Factor
Antigen).
CR Rojo congo (del inglés Congo Red).
DAEC E. coli de adherencia difusa (del inglés Diffusely Adherent
Escherichia coli).
EAEC E. coli enteroagregativa (del inglés Enteroaggregative Escherichia
coli).
EAF Plásmido de virulencia EAF (del inglés EPEC Adherence Factor).
EAST1 Enterotoxina termoestable 1 de EAEC (del inglés Enteroaggregative
E. coli ST).
EHEC E. coli enterohemorrágica (del inglés Enterohemorrhagic
Escherichia coli).
EIEC E. coli enteroinvasiva (del inglés Enteroinvasive Escherichia coli).
EPEC E. coli enteropatógena (del inglés Enteropathogenic Escherichia
coli).
ETEC E. coli enterotoxigénica (del inglés Enterotoxigenic Escherichia coli).
HUS Síndrome urémico hemolítico (del inglés Haemolytic Uremic
Syndrome).
LEE Locus de esfacelamiento enterocítico (del inglés Locus of
Enterocyte Effacement).
PAI Isla de patogenicidad (del inglés Pathogenicity Island).
PCR Reacción en cadena de la polimerasa (del inglés Polymerase Chain
Reaction).
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viii
REPEC EPEC de conejo (del inglés Rabbit Enteropathogenic Escherichia
coli).
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida (del inglés Sodium Dodecyl
Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis).
TEM Microscopía electrónica de transmisión (del inglés Transmission
Electron Microscopy).
Tir Proteína Tir (del inglés Translocated Intimin Receptor).
UAS Secuencia regulatoria UAS (del inglés Upstream Activating
Sequence).
YPDA Medio de cultivo YPDA (del inglés Yeast Peptone Dextrose Adenine).
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1
RESUMEN
Escherichia coli enteropatógena (EPEC) es una bacteria gram negativa y la
principal responsable de brotes de diarrea infantil en países en vías de desarrollo.
La transmisión de EPEC es por vía fecal-oral y generalmente a través de manos,
alimentos u objetos contaminados. EPEC es un patógeno extracelular que induce
una alteración histopatológica denominada lesión A/E que se caracteriza por la
eliminación de las microvellosidades intestinales y la adherencia íntima de la
bacteria a la membrana de las células epiteliales. La habilidad de EPEC para
inducir la histopatología A/E está codificada en una isla de patogenicidad llamada
locus de esfacelamiento enterocítico (LEE). En el LEE están codificados los
componentes estructurales que forman el sistema de secreción tipo III (SST3) a
través del cual EPEC inyecta proteínas de virulencia al interior de la célula
hospedera una vez que ha ocurrido la adherencia íntima de la bacteria. El SST3
de EPEC es una estructura que forma una nanomáquina denominada
inyectisoma, la cual se compone de un cuerpo basal y una aguja extracelular
rígida y hueca de 23 nm de longitud, sobre la que se ensambla un filamento de
hasta 800 nm que permite el contacto entre la bacteria y el enterocito. Se
propone que una vez que EPEC hace contacto con la célula hospedera las
proteínas translocadoras EspB y EspD son secretadas para formar el poro de
translocación a través del cual se translocan los efectores hacia el citoplasma del
hospedero. EPEC requiere algunos mecanismos para asegurar un control
jerárquico y temporal de la secreción de proteínas a través del inyectisoma. Dicha
regulación se lleva a cabo a nivel transcripcional, post-transcripcional,
traduccional y post-traduccional; en esta última participan complejos
denominados interruptores moleculares y componentes estructurales del
inyectisoma. Se propone que dos interruptores moleculares regulan la biogénesis
y secreción vía el SST3, uno que controla la secreción de sustratos tempranos, la
longitud de la aguja y la formación del filamento (interruptor molecular 1) y otro
que promueve la secreción de translocadores y bloquea la secreción de proteínas
efectoras hasta que el SST3 hace contacto con el enterocito (interruptor
molecular 2). En el presente trabajo se caracterizaron interacciones proteína-
proteína a través del sistema del doble híbrido entre los componentes que
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2
regulan la especificidad de secreción de sustratos en el inyectisoma de E. coli
enteropatógena.
II. INTRODUCCIÓN
2.1 Escherichia coli.
Escherichia coli es una bacteria Gram negativa en forma de bacilo con un
diámetro de 0.3 – 1.5 micras. Es la bacteria anaerobia facultativa más común de
la microbiota intestinal de animales, colonizando de forma natural la capa
mucosa del colon. La colonización del intestino por la bacteria se inicia en las
primeras horas de vida, estableciéndose una relación benéfica tanto para la
bacteria como para el hospedero. En mamíferos, E. coli está involucrada en
procesos biológicos como por ejemplo la absorción de alimentos no digeribles por
el intestino, la síntesis de la vitamina K, así como de algunos precursores del
complejo B y utilización del gluconato (Kaper JB, et al., 2004). En condiciones
naturales, las cepas de E. coli (fig. 1) que conforman la microbiota no producen
ningún daño; sin embargo, en situaciones que favorecen la salida de su hábitat
natural o en individuos con trastornos inmunes, la bacteria puede causar
enfermedad. Infecciones debidas a E. coli se pueden limitar únicamente a la
mucosa intestinal o, en el peor de los casos, pueden diseminarse en todo el
cuerpo (Kaper JB, et al., 2004).
Fig. 1. Esquema representativo de Escherichia coli. Tomada de http://www.doctortipster.com
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3
E. coli se consideró por mucho tiempo el principal comensal no patógeno en el
humano. Sin embargo, a principios del siglo XX se descubrió que es capaz de
causar una gran variedad de enfermedades en el hombre, como por ejemplo
diarrea, colitis hemorrágica, disentería, síndrome urémico hemolítico, infecciones
en vías urinarias, entre otras patologías (Sandner L, et al., 2001).
Existen por lo menos ocho patovares de E. coli, cada uno con sus respectivos
atributos específicos de virulencia que causan un síndrome clínico característico.
Dicha variedad es el resultado de la evolución y dispersión de genes de virulencia
entre las diferentes especies; a través de la transferencia horizontal de
elementos genéticos como plásmidos, bacteriófagos e islas de patogenicidad
(Puente JL y Finlay BB, 2001). Sólo las combinaciones de factores de virulencia
exitosas han persistido y llegado a ser patovares específicos de E. coli capaces de
causar enfermedad en individuos sanos (Kaper JB, et al., 2004).
Debido al fácil acceso de estos patógenos que se ingieren con los alimentos, el
tracto gastrointestinal es susceptible a las infecciones de E. coli diarreagénicas.
Las enfermedades diarreicas en las que están implicadas estas cepas son un
gran problema de salud pública a nivel mundial, provocando cerca de dos
millones de muertes anualmente (Chen HD y Frankel G, 2005).
2.2 E. coli diarreagénicas.
Los patógenos intestinales de E. coli se clasifican en ocho patovares de los
cuales seis son diarreagénicos y son los siguientes: (1) E. coli enteropatógena
(EPEC, por sus siglas en inglés, enteropathogenic Escherichia coli), (2) E. coli
enterohemorrágica (EHEC, por sus siglas en inglés, enterohemorrhagic
Escherichia coli), (3) E. coli enterotoxigénica (ETEC, por sus siglas en inglés,
enterotoxigenic Escherichia coli), (4) E. coli enteroagregativa (EAEC, por sus siglas
en inglés, enteroaggregative Escherichia coli), (5) E. coli enteroinvasiva (EIEC, por
sus siglas en inglés, enteroinvasive Escherichia coli), y (6) E. coli de adherencia
difusa (DAEC, por sus siglas en inglés, diffusely adherent Escherichia coli) (Kaper
JB, et al., 2004).
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EPEC (cepa E2348/69 O127:H7), que coloniza el intestino delgado, fue el
primer patovar de E. coli en ser descrito. Importantes brotes de diarrea infantil en
Reino Unido durante las décadas de 1940 y 1950 relacionaron a EPEC como la
causa principal de esta epidemia, dado que este patovar se aisló de niños con
diarrea pero no en niños sanos. EPEC infecta principalmente a niños menores de
dos años en países en vías de desarrollo mientras que ha desaparecido en países
industrializados. Desde 1979 se ha avanzado de manera importante en el
entendimiento de la patogénesis de EPEC, tal que ahora se sabe que esta
bacteria se adhiere al intestino por medio de una fimbria tipo IV llamada BFP
(BFP, por sus siglas en inglés, bundle forming pilus), e induce una lesión
histopatológica característica denominada lesión de adherencia y
esfacelamiento, lesión A/E, que consiste en la eliminación de las
microvellosidades del epitelio intestinal, la adherencia íntima de la bacteria al
enterocito, así como la generación de una estructura tipo pedestal rica en actina
que se forma debajo del sitio de adhesión de la bacteria (fig. 2) (Kaper JB, et al.,
2004). En la primera etapa de infección por EPEC, ésta se adhiere de manera no
íntima a las células del epitelio intestinal en un patrón conocido como adherencia
localizada, que consiste en la formación de agregados o microcolonias
bacterianas. Dicho fenotipo es mediado parcial o totalmente por el pilus Bfp,
fimbria que tiende a agregarse en forma de cordones permitiendo así el
reclutamiento de bacterias en el ambiente de la célula hospedero. Se ha
identificado que el pilus Bfp se une al compuesto de membrana N-acetil-
lactosamina en el enterocito (Clarke SC, et al., 2003; Girón JA, et al., 2002;
Humphries RM, et al., 2010).
EHEC (cepa O157:H7) fue reconocido como agente patógeno de humanos en
1982. EHEC es la bacteria responsable de la colitis hemorrágica y del síndrome
urémico hemolítico (HUS, por sus siglas en inglés, haemolytic uremic syndrome)
principalmente en niños. El principal reservorio de EHEC es el tracto intestinal de
bovino y los primeros brotes de enfermedad se asociaron con el consumo de
hamburguesas con carne de res media cruda, por lo que al padecimiento se le
denominó “enfermedad de la hamburguesa”. Subsecuentemente una amplia
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variedad de alimentos han sido asociados con EHEC por causar estas
enfermedades incluyendo salchichas, leche sin pasteurizar, lechugas, jugo de
manzana, entre otros. Al igual que EPEC, EHEC contiene la isla de patogenicidad
LEE e induce la formación de la lesión A/E, sin embargo, la infección por EHEC se
caracteriza por la expresión de las toxinas Shiga (Stx) y la hemolisina (fig. 2)
(Kaper JB, et al., 2004).
ETEC coloniza el intestino delgado proximal y es la principal causa de la llamada
“diarrea del viajero” en adultos de países industrializados, afectando también a
niños en países en vías de desarrollo. Patologías por ETEC se adquieren a través
del consumo de agua y alimentos contaminados. La infección se caracteriza por
la producción de enterotoxinas termolábiles (LT) y termoestables (ST), y está
mediada por factores fimbriales o fibrilares denominados factores de
colonización (CFA, por sus siglas en inglés, colonization factor antigen) (fig. 2)
(Kaper JB, et al., 2004). GM1 y GD1b, y la enzima guanilato ciclasa, son los
receptores en el hospedero de las enterotoxinas LT y ST, respectivamente, que al
activarse conllevan a una deficiente absorción de electrolitos e inhibición en la
expresión de péptidos antimicrobianos (Croxen MA y Finlay BB, 2010).
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Fig. 2. Mecanismo de patogénesis de los seis patovares diarreagénicos de E. coli. (a) EPEC se adhiere a los enterocitos del epitelio intestinal en el intestino delgado y destruye la arquitectura normal de las microvellosidades, induciendo la lesión de adherencia y esfacelamiento. 1. Adhesión inicial, 2. translocación de proteínas vía SST3, 3. formación del pedestal. (b) EHEC también induce la lesión A/E pero en el colon. La característica distintiva de EHEC es la producción de la toxina Shiga. (c) ETEC también se adhiere a los enterocitos del intestino delgado e induce diarrea acuosa mediante la secreción de las enterotoxinas LT y ST. (d) EAEC se adhiere al epitelio del intestino delgado y grueso mediante una biopelícula densa y lleva a cabo su mecanismo de infección mediante la secreción de enterotoxinas y citotoxinas. (e) EIEC invade las células epiteliales del colon, lisa la vacuola y difunde a través de la célula gracias a la nucleación de microfilamentos de actina. La bacteria puede moverse lateralmente a través del epitelio. (f) DAEC provoca un mecanismo característico de transducción de señales en enterocitos del epitelio intestinal que se manifiesta con el crecimiento de proyecciones celulares en forma de dedos que rodean la bacteria (Tomada de Kaper JB, et al., 2004). EAEC es reconocida por ser la causante de diarrea persistente en niños y
adultos en países en vías de desarrollo, produciendo diarrea acuosa que a
menudo es acompañada de moco. EAEC se adhiere a las células epiteliales en un
patrón conocido como autoagregativo en el que las bacterias se adhieren una a
otra en forma de “ladrillos apilados”. Es probable que esta definición acompañe
tanto a bacterias patógenas como a las no patógenas, lo cual mantiene en
controversia si EAEC tiene algún factor común que contribuya a su fenotipo de
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adherencia compartida. La estrategia básica de infección por EAEC parece
comprender la colonización de la mucosa intestinal, predominantemente del
colon, seguida de la secreción de enterotoxinas y citotoxinas. Estudios en
humano indican que EAEC induce un leve pero significativo daño en la mucosa
intestinal principalmente en el colon. Algunos de los factores de virulencia de
EAEC son las fimbrias de adherencia agregativa (AAF, por sus siglas en inglés,
aggregative adherence fimbriae), las proteasas involucradas en la colonización
intestinal denominadas Pic y Pet, y la enterotoxina termoestable 1 de EAEC
(EAST1, por sus siglas en inglés, enteroaggregative E. coli ST), una proteína de 38
aminoácidos similar a la toxina ST en ETEC y que contribuye en gran manera a la
diarrea acuosa (fig. 2) (Kaper JB, et al., 2004).
EIEC se caracteriza por causar colitis inflamatoria invasiva, y ocasionalmente
disentería, pero en la mayoría de los casos provoca diarrea acuosa indistinguible
de aquella causada por infección de otras bacterias. La primera fase de la
patogénesis de EIEC comprende la invasión y penetración de las células
epiteliales, seguida de la lisis de la vacuola endocítica, multiplicación intracelular,
movimiento direccional a través del citoplasma y extensión hacia células
epiteliales adyacentes (fig. 2) (Kaper JB, et al., 2004).
DAEC tiene un patrón de adherencia difusa en células epiteliales y es el agente
causante de diarrea en niños menores de 1 año de edad, sin embargo se
desconocen los detalles de su mecanismo de patogénesis. Esta bacteria
desencadena la activación de diferentes cascadas de transducción de señales en
los eritrocitos del intestino delgado, lo cual conduce al desarrollo de proyecciones
celulares largas similares a dedos que envuelven la bacteria (fig. 2) (Kaper JB, et
al., 2004). En el mecanismo de infección de DAEC todas las adhesinas Afa-Dr
interaccionan con el receptor DAF (del inglés, decay-accelerating factor) el cual se
encuentra en la superficie de células epiteliales y urinarias. La unión a DAF
resulta en la agregación de moléculas DAF debajo del sitio de adhesión de la
bacteria. Esto activa una cascada de señalización dependiente de Ca2+, la cual
resulta en la elongación y daño de las microvellosidades del hospedero a través
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de la desorganización de componentes esenciales del citoesqueleto (Croxen MA y
Finlay BB, 2010).
2.3 Escherichia coli enteropatógena (EPEC).
En la actualidad, la infección por EPEC es una de las causas principales de
diarrea infantil en países en vías de desarrollo (Levine MM, et al., 1978). La
infección ocasionada por EPEC desencadena diarrea de tipo acuoso que puede
ocurrir en diversos grados de intensidad y es común que los niños infectados
además presenten vómito y fiebre (Cravioto A y Vázquez V, 1988). Se han
encontrado serotipos característicos de EPEC en aire, agua, comida y excremento
de animales, que pueden servir como reservorios de estas bacterias (Nataro JP y
Kaper JB, 1998).
EPEC es un patógeno extracelular que induce una alteración histopatológica
característica denominada lesión de adherencia y esfacelamiento, “lesión A/E”
(A/E, por sus siglas en inglés, attaching and effacing), la cual se observa en
biopsias de pacientes o animales infectados y puede reproducirse en cultivos
celulares. El fenotipo A/E se caracteriza por la eliminación de las
microvellosidades y la adherencia íntima de la bacteria a la membrana de la
célula epitelial. Bajo el sitio de adhesión de la bacteria se observan marcados
cambios del citoesqueleto del enterocito, que incluyen principalmente la
acumulación de actina polimerizada, originándose una estructura tipo “pedestal”
que puede extenderse hasta 10 μm fuera de la célula intestinal (Moon HW, et al.,
1983). La habilidad de EPEC para inducir esta histopatología está codificada en
una isla de patogenicidad de 35 kb (PAI, por sus siglas en inglés, pathogenicity
island) llamada locus de esfacelamiento enterocítico (LEE, por sus siglas en
inglés, locus of enterocyte effacement). El locus LEE se encuentra también en
otros patógenos de humanos y animales que producen la histopatología A/E,
incluyendo EHEC, EPEC en conejo (REPEC, por sus siglas en inglés, rabbit
enteropathogenic Escherichia coli) y Citrobacter rodentium, la cual induce
hiperplasia colónica en ratones (Kaper JB, et al., 2004).
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2.4 Modelo de infección por EPEC.
El modelo de patogénesis de EPEC se divide en tres etapas: (1) adherencia inicial,
(2) transducción de señales y (3) adherencia íntima (Chen HD y Frankel G, 2005).
La adherencia inicial de EPEC a las células enterocíticas es un proceso
fundamental en el que está directamente involucrada una fimbria o pili tipo IV,
denominada BFP. La biogénesis del pili BFP requiere 14 genes codificados en el
plásmido de virulencia EAF (EAF, por sus siglas en inglés, EPEC adherence factor)
(Stone KD, et al., 1996). El pili BFP permite que las bacterias se agrupen entre
ellas y formen microcolonias, de esta manera se promueve el patrón de
adherencia localizada típico de EPEC (Cravioto A, et al., 1979). Además del pili
BFP, otros factores como el flagelo, la adhesina intimina y el filamento EspA son
importantes durante la etapa de adherencia inicial de EPEC (fig. 3) (Giron JA, et
al., 2002).
La etapa de transducción de señales ocurre después de que EPEC se adhiere al
enterocito, entonces inyecta a la célula hospedera una serie de proteínas
denominadas “efectores” mediante el SST3. Estos efectores de virulencia alteran
diferentes vías de señalización de la célula eucarionte, afectan la integridad de
las uniones estrechas, degradan la red de microtúbulos, modulan la estructura
del citoesqueleto de actina, inducen la formación de filopodios y alteran la
función mitocondrial (Kenny B, 2002). Un efector de gran importancia en la
patogénesis de EPEC es la proteína Tir (Tir, por sus siglas en inglés, translocated
intimin receptor). Después de que Tir es translocado a la célula hospedera vía el
SST3, se inserta en la membrana plasmática del enterocito en donde adopta una
topología de asa en la que los extremos amino y carboxilo se mantienen
citosólicos (Campellone KG y Leong JM, 2003), mientras que su región central
permanece extracelular y actúa como un receptor para una adhesina de
membrana externa de EPEC llamada intimina (Kenny B, et al., 1997). Éste es el
único ejemplo conocido en el que la bacteria transloca su propio receptor para
unirse a las células eucariontes. Además, se han reportado otras proteínas
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eucarióticas adicionales que también pueden actuar como receptores para la
intimina (fig. 3) (Kaper JB, et al., 2004).
Fig. 3. Modelo de infección por EPEC. El modelo de patogénesis de EPEC se divide en tres etapas: (1) adherencia inicial, (2) transducción de señales y (3) adherencia íntima. Tomada de http://www.fernness.com/science-15.htm
Una vez que ocurre la interacción entre Tir y la intimina se da la adherencia
íntima de EPEC a la superficie del enterocito. Además de su papel como receptor,
Tir tiene funciones importantes de señalización que al ser fosforilado en la
tirosina 474, por al menos dos cinasas del hospedero, Fyn y Abl. La fosforilación
de Tir genera un sitio de reclutamiento para las proteínas adaptadoras Nck1 y
Nck2, llamadas conjuntamente Nck. El dominio SH3 de Nck recluta y activa a la
proteína N-WASP, lo que conlleva a la activación del complejo remodelador de
actina, Arp2/3, y a la acumulación de filamentos de actina por debajo del sitio de
adhesión de la bacteria, dando lugar a la formación del pedestal característico de
la lesión A/E (Kalman D, et al., 1999). Otras proteínas del citoesqueleto como
vinculina, cortactina, talina y α-actinina también son reclutadas al pedestal (fig. 3)
(Vallance BA y Finlay BB, 2000).
Por otro lado, en el LEE están codificadas 7 proteínas efectoras, Tir, Map, EspB,
EspF, EspG, EspH y EspZ que son translocadas vía SST3 directamente a la célula
hospedera para inducir cambios en la misma e inducir la formación de la lesión
Adherencia íntima Transducción de señales Adherencia inicial
EPEC EPEC
EPEC eae
eae BFP bfp
per
LEE Intimina
Ca2+, IP3, PKC
Intimina
CesT
EspD
EspA
EspB
Actina, α-actinina, Talina, Ezrina, VASP, Arp 2/3, MLC-P, Vilina
Tir
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A/E. El efector Map interfiere con la estabilidad de la membrana mitocondrial
produciendo la deformación, el crecimiento y daño total de este organelo con la
consecuente inducción de la apoptosis celular. EspB, además de su papel en la
formación del poro de translocación actúa como efector que impide la fagocitosis
de la bacteria (Croxen MA y Finlay BB, 2010). EspF participa en la destrucción de
la barrera intestinal, provocando la pérdida de resistencia transepitelial y
aumentando la permeabilidad paracelular, lo que causa diarrea en el individuo
infectado por EPEC. EspG activa la formación de fibras de estrés de actina y la
destrucción de los microtúbulos interaccionando con las tubulinas por debajo del
sitio de adherencia bacteriana. EspH se encarga de modular la estructura del
citoesqueleto, especialmente de la actina, influyendo así en la formación del
pedestal (Vallance BA y Finlay BB, 2000). Por otra parte, se ha identificado que
EspZ inhibe la translocación de proteínas efectoras vía SST3, por lo que se
propone que EspZ mide la duración del proceso de translocación de proteínas
efectoras asegurando la colonización e infección de EPEC (Berger CN, et al.,
2012). Por otro lado, las proteínas de virulencia Nle (codificadas fuera del LEE)
también participan en el proceso de infección por EPEC. Entre los efectores no
codificados en el LEE, NleA (denominado EspI), NleB y Cif son esenciales para la
virulencia de EPEC, llevando a cabo diversas alteraciones en el enterocito las
cuales incluyen actividades apoptóticas, alterando la respuesta inmune a través
de la inhibición de la vía NF-kB, incrementando la permeabilidad celular,
inhibiendo la división celular, promoviendo la destrucción de microtúbulos del
citoesqueleto, inhibiendo la opsonofagocitosis, entre otras alteraciones (García-
Angúlo VA, et al., 2012).
A pesar de los avances en el entendimiento de los mecanismos moleculares
que inducen la lesión A/E y la formación de los pedestales de actina, todavía no
se ha esclarecido el mecanismo global que involucra a EPEC en la diarrea. Se
cree que la unión de la bacteria al pedestal provee una fuerte adherencia de
EPEC a la superficie celular, previniendo que EPEC sea eliminada al sobrevenir la
diarrea.
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2.5 Locus de esfacelamiento enterocítico de EPEC.
Los genes necesarios para inducir la lesión A/E están codificados en una región
cromosomal llamada locus de esfacelamiento enterocítico, LEE, la cual es una
isla de patogenicidad de 35.6 kb que contiene 41 marcos de lectura abiertos,
agrupados principalmente en 5 operones policistrónicos (LEE1 a LEE5) (Jarvis KG,
et al., 1995).
En el LEE están codificados los componentes estructurales que forman el SST3,
reguladores transcripcionales, proteínas efectoras, las proteínas involucradas en
la adherencia íntima, chaperonas y otras proteínas cuya función es desconocida
(Jarvis KG, et al., 1995). Los operones LEE1, LEE2 y LEE3 contienen
principalmente los genes que codifican a los componentes estructurales del
SST3, el LEE4 codifica a las proteínas translocadoras, y el LEE5 contiene los
genes involucrados en la adherencia íntima. Los genes presentes en la isla LEE
de EPEC son suficientes para inducir la lesión A/E, ya que si se transfieren a una
cepa comensal de E. coli ésta es capaz de generar dicho fenotipo (fig. 4)
(McDaniel TK y Kaper JB, 1997).
El LEE además contiene el gen eae que codifica para la intimina, una proteína
de la membrana externa bacteriana de 94 kDa. Además de mediar la adherencia
íntima de EPEC a las células del epitelio intestinal, la intimina también estimula
diferentes respuestas inmunes, así como también la hiperplasia intestinal críptica
(Kaper JB, et al., 2004).
La regulación de la transcripción de los genes del LEE depende de condiciones
ambientales, detección del quorum y diversos reguladores transcripcionales tales
como Ler, GrlA y GrlR, mismos que forman parte de la isla LEE. Ler, codificado en
el primer gen del operón LEE1, regula positivamente la transcripción de los
operones LEE2 a LEE5 y funciona como un desrepresor que contrarresta el efecto
negativo que ejerce H-NS sobre la expresión de dichos operones. Por otro lado,
GrlA es esencial para la activación eficiente de los genes de la isla ya que activa
directamente al gen que codifica para Ler, con quien establece un ciclo de
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regulación positiva ya que Ler también activa la expresión del operón grlRA,
favoreciendo ambos la expresión de los genes del LEE. Por otra parte, GrlR actúa
como un regulador negativo de la transcripción de la isla LEE al interactuar y, por
lo tanto, inhibir dicha transcripción mediante su interacción con GrlA (Barba J, et
al., 2005).
Fig. 4. Locus de esfacelamiento enterocítico (LEE) de EPEC (Dean P, et al., 2005; modificada por García E).
Por otro lado, el operón per del plásmido EAF codifica para las proteínas PerA,
PerB y PerC. PerA regula la producción de la fimbria BFP mediante la activación
de los genes bfpA y perA. Por su parte, PerC activa la expresión del gen ler, dando
lugar a una cascada reguladora dependiente de PerA, ya que éste autorregula la
expresión del operón per (Barba J, et al., 2005).
2.6 Producción de diarrea.
El principal efecto que conlleva la infección por EPEC es la diarrea acuosa, que
puede contener moco pero no sangre. Otros síntomas asociados pueden incluir
fiebre, malestares, vómito, intolerancia a la comida, deshidratación y pérdida de
peso. La diarrea puede durar de 5-15 días, pero puede convertirse en crónica
(Blank TE, et al., 2002). La pérdida de las microvellosidades y en consecuencia, la
mala absorción en esta región contribuyen a la diarrea (Chen HD y Frankel G,
2005). Las causas de la aparición de diarrea en individuos infectados con EPEC
son multifactoriales. Varias investigaciones han involucrado la alteración del
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transporte de electrolitos y la apertura de canales durante la infección. La
alteración de la permeabilidad epitelial puede también contribuir.
La secreción de efectores por EPEC es capaz de inducir una cascada de
señalización dentro de la célula hospedera, resultando en la fosforilación de las
cadenas ligeras de la miosina (MLC), ocasionando un incremento en la
permeabilidad de las uniones estrechas, afectándose el proceso de transporte y
absorción pasiva de agua como consecuencia de la disipación del gradiente
electroquímico (Chen HD y Frankel G, 2005). Estas alteraciones, junto con el
esfacelamiento de las microvellosidades del epitelio, que impide la correcta
función de absorción, son también responsables de la aparición de la diarrea
intensa (Nataro JP y Kaper JB, 1998). Además, como consecuencia de la
translocación de proteínas efectoras, se genera un aumento en los flujos
intracelulares de calcio (Ca2+), inducido por el inositol-1,4,5-trifosfato (IP3), lo que
resulta en cambios importantes del citoesqueleto del enterocito debido al
rompimiento y polimerización de la actina. El IP3 resulta de la hidrólisis del
fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) por la fosfolipasa C (PLC), la cual parece ser
activada como resultado del proceso de patogénesis de EPEC (Kaper JB, et al.,
2004).
Recientemente, empleando modelos de infección in vivo con Citrobacter
rodentium, se descubrió que las acuaporinas (canales de agua) juegan también
un papel importante durante la producción de diarrea por patógenos A/E,
alterándose la distribución de las mismas durante la enfermedad (Guttman JA, et
al., 2007).
2.7 Sistema de secreción tipo 3 (SST3).
Las bacterias secretan un gran número de proteínas al medio extracelular como
toxinas, adhesinas y enzimas hidrolíticas requeridos en procesos tales como la
biogénesis de estructuras como el inyectisoma y flagelo, la adquisición de
nutrientes y la expresión de factores de virulencia. A pesar del número, la
diversidad y la amplia variedad de funciones que desempeñan las proteínas
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secretadas (proteólisis, hemólisis, citotoxicidad, etc.) éstas son translocadas
utilizando un número limitado de mecanismos. Las vías de secreción en las
bacterias gram negativas han sido clasificadas en cinco grupos principales:
secreción tipo I, II, III, IV y los autotransportadores. Dicha clasificación se basa en
la naturaleza molecular de las maquinarias de transporte y las reacciones que
éstas catalizan. Sin embargo, estos grupos se pueden subdividir en dos grandes
clases dependiendo del mecanismo que se utilice para el transporte a través de
la membrana plasmática. Las vías Sec dependientes, que utilizan el sistema de
secreción denominado Sec, en el que las proteínas a secretarse presentan una
secuencia señal o péptido líder en el extremo amino-terminal; y las Sec
independientes en las que los sustratos se pueden translocar directamente
desde el citosol hasta el exterior celular sin que exista un intermediario
periplásmico, ni una secuencia señal en el extremo amino terminal (González
Pedrajo B y Dreyfus G, 2003). En el presente trabajo se describe brevemente el
SST3 poniendo especial énfasis en el SST3 de EPEC.
El SST3 es una vía Sec independiente en la que la secreción ocurre en un sólo
paso desde el citosol hasta el exterior celular, que desempeña un papel central
en la patogenicidad de muchas bacterias gram negativas. El SST3 ha sido
identificado en una gran variedad de patógenos de humanos, animales y plantas,
incluyendo especies de Bordetella, Yersinia, entre otros. Mediante este sistema
los efectores de virulencia se pueden translocar hasta el citosol de la célula
eucarionte. La maquinaria está conservada entre los diferentes patógenos, sin
embargo, las proteínas secretadas difieren completamente, por lo que el mismo
mecanismo de transporte puede generar una amplia gama de enfermedades.
Además de su papel en la patogénesis, el SST3 se requiere para la biogénesis
flagelar. Los sustratos a translocarse por el SST3 carecen de una señal de
secreción definida, sin embargo, para algunas proteínas tanto del sistema
flagelar como del de virulencia se ha demostrado que la señal se localiza en el
dominio amino terminal. Por otro lado, en todos los SST3 estudiados existen
proteínas chaperonas que comparten características comunes como el tamaño
pequeño y punto isoeléctrico ácido. La exportación de algunos sustratos es
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facilitada por dichas chaperonas, las que se propone mantienen a las proteínas
en una conformación adecuada para la secreción, previniendo además la
agregación prematura en el citosol. Sin embargo, el papel directo de las
chaperonas como posible señal de reconocimiento en la secreción, así como su
papel en la organización de la jerarquía de translocación de los efectores aún no
ha sido demostrado (González Pedrajo B y Dreyfus G, 2003).
2.8 Sistema de secreción tipo 3 de EPEC.
El SST3 es una estructura compleja de más de 20 proteínas que forma una
nanomáquina denominada inyectisoma, la cual funciona como una jeringa
molecular para inyectar proteínas de virulencia al citosol de la célula hospedero.
La patogénesis de EPEC se vincula estrechamente al SST3 o inyectisoma (Elliot
SJ, et al., 1998).
El inyectisoma de EPEC se compone principalmente de dos regiones; (1) un
cuerpo basal cilíndrico y (2) una aguja-filamento. El cuerpo basal le permite al
inyectisoma atravesar ambas membranas celulares así como el espacio
periplásmico. Se compone de un anillo en la membrana externa, dos anillos en la
membrana interna, uno formado por la lipoproteína EscJ y otro formado por la
proteína EscD, y un eje central que conecta ambos anillos dando lugar a un canal
continuo (Marlovits TC, et al., 2004; Ogino T, et al., 2006). En EPEC la proteína
EscC forma el anillo de la membrana externa. Este segundo anillo puede
representar el sitio de anclaje de las proteínas membranales del aparato de
exportación, EscR, EscS, EscT, EscU y EscV (Crepin VF, et al., 2005).
La proteína EscQ en EPEC forma un anillo citoplásmico que al parecer favorece
la localización del complejo de la ATPasa (EscN) y su regulador negativo (EscL), en
la base del sistema (Pallen MJ, et al., 2005). Además, se ha sugerido que EscQ,
EscN y EscL forman un complejo ternario en el cual EscL estabiliza la interacción
de EscQ con EscN, interacción de gran importancia que asegura la secreción en el
SST3 (Biemans-Oldehinkel E, et al., 2011). Adicionalmente, se propone que la
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proteína EscI conforma el eje periplásmico que comunica los anillos de las
membranas interna y externa (Sal-Man N, et al., 2012).
En la región extracelular del inyectisoma, la proteína EscF polimeriza para
formar la aguja, estructura rígida y hueca de una longitud aproximada de 23 nm
(Monjarás FJ, et al., 2012). Una característica distintiva del SST3 de EPEC, así
como de otros patógenos causantes de la lesión A/E, es la polimerización de la
proteína translocadora EspA, en la punta o región distal de la aguja. La proteína
EspA polimeriza un filamento que se extiende formando un puente físico, de
hasta 800 nm, que permite el contacto entre la bacteria y la membrana de la
célula (Ghosh P, 2004). Se piensa que una vez que EPEC hace contacto con la
célula hospedera las proteínas translocadoras EspB y EspD son secretadas.
Ambas proteínas se ubican en la punta del filamento EspA y se insertan en la
membrana plasmática del hospedero para formar un poro que permitirá la
translocación de las proteínas efectoras al citoplasma de la célula hospedero (fig.
5) (Ide T, et al., 2001).
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Fig. 5. Esquema representativo del inyectisoma de EPEC. El SST3 de EPEC se compone principalmente de dos regiones (1) un cuerpo basal cilíndrico y (2) una aguja-filamento. El cuerpo basal se compone de un anillo en la membrana externa compuesto por subunidades de la proteína EscC. Por otro lado, en la membrana interna se ensamblan dos anillos, uno en la cara periplásmica de la membrana interna formado por subunidades de la lipoproteína EscJ, mientras que el segundo anillo, asociado con la cara citoplásmica, está formado por subunidades de la proteína EscD. Además, subunidades de la proteína EscI forman un eje periplásmico que comunica los anillos de la membrana externa e interna. La región extracelular del inyectisoma está formada por la aguja y el filamento. En el citoplasma de EPEC, el complejo chaperona-efector es dirigido hacia el aparato de exportación donde se seleccionan las proteínas que serán secretadas a través del sistema.
EspA
EspB/D
EscF EscC
EscI EscJ
EscD
EscL EscQ
EscV,T,R,U,S EscN
ME
MI
PC
Hospedero
M Sustratos tardíos Tir, EspZ, EspF, EspH, EspG, Map
Sustratos intermedios EspA, EspB, EspD
Sustratos tempranos EscI, EscF
Segundo interruptor SepD/SepL
Primer interruptor EscP/EscU
Anillo en membrana externa EscC
Anillos en membrana interna EscD, EscJ
Eje periplásmico EscI
Aparato de exportación EscR, EscS, EscT, EscU, EscV
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2.9 Interruptores moleculares en el ensamblaje del SST3 de EPEC.
El ensamblaje del inyectisoma es un proceso secuencial y cuidadosamente
orquestado que requiere la coordinación de muchas proteínas localizadas en el
citosol, en las membranas interna y externa bacteriana y en la superficie celular.
Durante la biogénesis del inyectisoma, los componentes de los anillos
membranales y las proteínas del aparato de exportación son secretados vía la
maquinaria Sec, que es la vía general de secreción que media la translocación de
proteínas a través de la membrana interna y la inserción de proteínas
membranales; mientras que los subsecuentes componentes son exportados vía
el SST3 (He SY, et al., 2004; Nijeholt JA y Driessen AJ, 2012).
El ensamblaje de los componentes Sec dependientes del SST3 de EPEC
comienza con la formación del anillo de la membrana externa, el cual se extiende
al periplasma y está formado por la secretina EscC y de los dos anillos de la
membrana interna, formados por la proteína EscD y la lipoproteína EscJ. Con el
ensamblaje de los anillos membranales queda constituido un canal que sirve de
base para el ensamblaje de los componentes restantes del inyectisoma.
Adicionalmente, se forma un complejo citosólico formado por las proteínas EscL,
EscN y EscQ, que se ensambla en un solo paso y no requiere de las proteínas
membranales que forman el aparato de exportación. EscN es la ATPasa necesaria
para la secreción de sustratos vía SST3; EscL es el regulador negativo de la
actividad de la ATPasa y EscQ forma un anillo citoplásmico, el anillo C, cuyo
homólogo en Salmonella podría funcionar como una plataforma de secreción
selectiva de translocadores y efectores, asegurando la jerarquía de secreción vía
el SST3 (Biemans-Oldehinkel E, 2011; Dewoody RS, et al., 2013; Diepold A, et al.,
2010; Lara-Tejero M, et al., 2011; Monjarás FJ, et al., 2012).
El aparato de exportación está compuesto de las proteínas integrales de
membrana EscR, S, T, U y V, y se ensambla en la cavidad de los anillos de la
membrana interna. Aunque se conoce poco sobre la función de las proteínas que
forman el aparato de exportación en el proceso de ensamblaje del inyectisoma,
se cree que dichas proteínas actúan como receptores que reconocen las señales
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de secreción de los sustratos y forman un canal de secreción en la membrana
interna. YscV de Yersinia, y EscV en EPEC, al parecer interaccionan con sustratos
del SST3, chaperonas y proteínas solubles del aparato de exportación. YscU, en
EPEC EscU, controla el cambio en la especificidad de secreción de subunidades
de la aguja a proteínas translocadoras y efectoras. Sobre YscR, S y T se sabe que
son importantes para promover la polimerización de YscV. En conjunto, los anillos
membranales, la ATPasa, el anillo C y el aparato de exportación, forman un
cuerpo basal completo y funcional para la secreción de sustratos (Dewoody RS, et
al., 2013; Diepold A, et al., 2010; Diepold A, et al., 2011; Ghosh P, 2004; He SY,
et al., 2004).
Una vez que se ha completado la formación del cuerpo basal comienza la
secreción de sustratos vía SST3. Existe una jerarquía en la secreción de dichos
sustratos, misma que depende tanto de la etapa del ensamblaje del inyectisoma
como de la funcionalidad de dicha estructura. Los primeros sustratos en ser
secretados vía SST3 son los sustratos tempranos, que en EPEC son EscI,
componente principal del eje periplásmico, y EscF, la aguja. Posteriormente, se
secretan los sustratos intermedios, EspA, EspB y EspD, que forman el filamento y
el poro de translocación, finalmente se secretan los sustratos tardíos, que son las
proteínas efectoras o de virulencia Tir, EspZ, EspF, EspH, EspG y Map (Deane JE,
et al., 2010; Pallen MJ, et al., 2005).
Los mecanismos para asegurar un control jerárquico y temporal del ensamblaje
de los componentes del SST3 están en proceso de estudio. Sin embargo, se ha
propuesto la existencia de dos interruptores moleculares conservados en los
SST3 de bacterias gram negativas. El primer interruptor molecular controla la
longitud de la aguja, el cambio en la especificidad de secreción de sustratos
tempranos a intermedios, la formación del filamento EspA y la secreción de
efectores. El segundo interruptor molecular controla el cambio en la especificidad
de secreción de sustratos intermedios a tardíos, bloqueando la secreción de
proteínas efectoras durante la morfogénesis del filamento en EPEC (Deane JE, et
al., 2010; O’Connell CB, et al., 2004).
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2.9.1 Primer interruptor molecular: control de la secreción de sustratos
tempranos, de la longitud de la aguja, formación del filamento y secreción de
efectores.
El cambio en la especificidad de secreción de sustratos tempranos a intermedios
se lleva a cabo una vez que se ha ensamblado la aguja, alcanzando una longitud
de ~23 nm en EPEC, entonces se activa el primer interruptor molecular. Este
proceso implica dos mecanismos: (1) la medición de la longitud de la aguja y (2)
la interacción de ‘la regla molecular’ con proteínas de la familia EscU/YscU/FlhB
de la membrana interna (Dewoody RS, et al., 2013; Thomassin JL, et al., 2011;
Wagner S, et al., 2010).
El control de la longitud de la aguja es un proceso altamente regulado en el que
se ha implicado en Y. enterocolitica a la proteína YscP, miembro de la familia de
proteínas T3S4 (del inglés, Type III Secretion Substrate Specificity Switch), que
también incluye a Spa32 en Shigella, InvJ en Salmonella y recientemente a EscP
en EPEC. En ausencia de la proteína YscP, las mutantes sobresecretan YscF (EscF
en EPEC) y forman inyectisomas con agujas extremadamente largas pero
defectuosas en la secreción de proteínas efectoras. Además, deleciones e
inserciones en la secuencia de yscP conllevan al ensamblaje de agujas cortas y
largas, respectivamente; por lo que existe una correlación linear entre el número
de residuos de aminoácidos de YscP y la longitud de la aguja, sugiriendo que
YscP en su conformación extendida funciona como ‘regla molecular’ (Dewoody
RS, et al., 2013; Journet L, et al., 2003; Monjarás FJ, et al., 2012; Wagner S, et
al., 2010).
En el modelo de ‘regla molecular’ de Journet y colaboradores, se propone que
YscP se secreta vía SST3 y funciona como un polipéptido anclado al extremo
distal de la aguja en crecimiento, así como, a la base de la misma. Al mismo
tiempo se secretan subunidades de la aguja hasta que ésta alcanza la longitud
de la proteína YscP extendida; en este punto, YscP interacciona con YscU,
proteína transmembranal del aparato de exportación, y provoca un cambio en la
especificidad de secreción de sustratos lo cual finaliza la secreción de
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subunidades de la aguja (sustratos tempranos) permitiendo la secreción de los
sustratos intermedios (primer interruptor molecular). Recientemente, Wagner y
colaboradores, demostraron que se requiere sólo una molécula de YscP por
inyectisoma para controlar la longitud de la aguja. Además se observó que YscP
no es totalmente indispensable para el cambio en la especificidad de sustratos
(puesto que éste puede ocurrir de forma espontánea aunque ineficiente) pero sí
favorece que éste ocurra; lo mismo sucede con EscP en EPEC según datos
publicados por nuestro laboratorio (Journet L, et al., 2003; Monjarás FJ, et al.,
2012; Wagner S, et al., 2010).
Por otro lado, los miembros de la familia de proteínas YscU/FlhB/Spa40 poseen
un dominio carboxilo citoplásmico (C) que sufre un procesamiento autocatalítico
produciendo un subdominio C-terminal (CC), el cual permanece estrechamente
asociado con el subdominio N-terminal de la región carboxilo (CN) asociado a la
membrana. Dicha autoproteólisis ocurre entre los residuos de aminoácidos
asparagina (Asn) y prolina (Pro) en el motivo altamente conservado NPTH.
Mutaciones que modifican o eliminan la Asn o Pro del NPTH evitan la
autoproteólisis e interfieren con la función de interruptor molecular. El fenotipo de
dichas mutantes consiste en la no secreción de sustratos intermedios, como
EspA, EspB y EspD en EPEC. Por tanto, Sorg y colaboradores propusieron que la
autoproteólisis de YscU se requiere para que ésta adopte la conformación
adecuada que permita el reconocimiento de las proteínas translocadoras y su
secreción (Deane JE, et al., 2010; Edqvist PJ, et al., 2003; Sorg I, et al., 2007;
Zarivach R, et al., 2008).
Finalmente, en EPEC los homólogos de YscP y YscU son las proteínas EscP y
EscU, y recientemente se demostró que éstas regulan en EPEC la longitud de la
aguja y el cambio en la especificidad de secreción de sustratos tempranos a
intermedios y tardíos (Monjarás FJ, et al., 2012; Zarivach R, et al., 2008).
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2.9.2 Segundo interruptor molecular: facilita la secreción de translocadores y
bloquea la secreción de sustratos tardíos (efectores).
Las proteínas translocadoras no son necesarias para que se lleve a cabo la
secreción tipo III en ensayos in vitro en los sistemas bacterianos, pero sí se
requieren para la translocación de efectores debido a que ensamblan el conducto
de translocación y el poro en la membrana del hospedero. Cada bacteria tiene
sus propios efectores de acuerdo a sus propias estrategias de patogénesis, sin
embargo, los translocadores están generalmente conservados entre los
patógenos. Debido a que los translocadores se requieren para la inyección de
efectores al interior del hospedero, se propone que los patógenos han
desarrollado mecanismos que aseguran que los translocadores sean secretados
previo a los efectores (Deng W, et al., 2005).
El segundo interruptor molecular regula la transición en la secreción de
translocadores (sustratos intermedios) a efectores (sustratos tardíos). Se ha
identificado una familia de proteínas que regulan la secreción de sustratos a este
nivel, MxiC en Shigella, SsaL e InvE en Salmonella, YopN en Yersinia y SepL y
SepD en EPEC. Todos los miembros de esta familia de proteínas evitan la
secreción de efectores ya que su deleción causa la hipersecreción de éstos.
Además, mutantes en sepL o sepD presentan un fenotipo adicional, que es la
anulación de la secreción de las proteínas translocadoras EspA, EspB y EspD y,
por tanto, no hay formación del filamento EspA ni translocación de proteínas
efectoras al interior de la célula hospedero. Estas observaciones muestran la
habilidad del SST3 de EPEC para discriminar entre la secreción de las proteínas
translocadoras y de las efectoras. Con base en esto se ha propuesto que esta
familia de proteínas juega un papel directo en la secreción vía SST3 facilitando la
secreción de translocadores y reprimiendo la de efectores hasta que el
inyectisoma hace contacto con la célula eucarionte (Kresse AU, et al., 2000;
O’Connell CB, et al., 2004; Pallen MJ, et al., 2005).
SepL es una proteína de 351 aminoácidos cuya masa molecular es de 39.9
kDa, es una proteína soluble citoplásmica aunque se ha encontrado además en
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fracciones de membrana interna y externa. SepL se considera un componente no
estructural del sistema de secreción pero es esencial para la secreción de
translocadores y, por tanto, es requerido para desarrollar la lesión A/E. SepL
interacciona físicamente con SepD, una proteína que se ha encontrado asociada
a membrana a pesar de carecer de dominios transmembranales y de su
predicción citosólica. Se cree que SepD se requiere para la localización de SepL
en la membrana interna bacteriana. La deleción del gen sepD tiene el mismo
fenotipo que una mutante en sepL, abate la secreción de translocadores e
hipersecreta efectores, como por ejemplo Tir. Debido a su fenotipo se propuso, y
ahora está demostrado, que SepL y SepD interaccionan y forman un complejo
que regula el cambio en la especificidad de secreción de sustratos intermedios a
tardíos (Deng W, et al., 2005; O’Connell CB, et al., 2004; Wang D, et al., 2008).
Aunque no se conoce a detalle el mecanismo de funcionamiento del segundo
interruptor molecular, una reciente hipótesis propone que el complejo SepL-SepD
bloquea la secreción de efectores mientras se ensambla el translocón. Se ha
reportado que la interacción de SepL-Tir es importante para retener la secreción
de los efectores debido a que la secreción de Tir se requiere para la secreción de
los demás efectores. Una vez formado el poro de translocación en el hospedero la
bacteria detecta una disminución en la concentración de calcio, señal que se
transmite mediante un mecanismo desconocido al complejo SepL-SepD
causando su disociación o cambio conformacional, permitiendo así la salida de
los efectores directamente al citoplasma de la célula hospedero. Se ha reportado
que la quelación de calcio en el medio reduce la secreción de proteínas
translocadoras e incrementa la del efector Tir en EPEC y DAEC, fenómeno que
también ocurre en Yersinia spp., donde bajas concentraciones de calcio
favorecen la secreción del efector YopE y otros factores de virulencia (Ide TS, et
al., 2001; Kenny BA, et al., 1997; Lee VT, et al., 2001; Thomas NA, et al., 2007;
Wang D, et al., 2008).
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III. ANTECEDENTES
Existen varios estudios en diferentes especies bacterianas que sugieren la
interacción entre las proteínas EscP y EscU, componentes del primer interruptor
molecular en EPEC. El concepto de interruptor molecular o switch para el cambio
en la especificidad de sustratos del SST3 se acuñó primero en el sistema flagelar.
El flagelo bacteriano consiste de tres partes: el cuerpo basal, el cual está
embebido en la pared celular y en las membranas de la bacteria; el gancho, el
cual está localizado en la superficie celular; y un largo filamento flagelar, el cual
se ensambla después del gancho y sirve para impulsar a la bacteria (Moore SA y
Jia Y, 2010; Mizuno S, et al. 2011; Anderson JK, et al., 2009).
Cepas mutantes en el gen flagelar fliK de Salmonella typhimurium exhiben un
fenotipo denominado ‘poligancho’ caracterizado por la presencia de un gancho
extremadamente largo y carente del filamento, siendo la longitud normal del
gancho de 55 nm (Williams AW, et al., 1996; Minamino T, et al., 1999). Sin
embargo, el fenotipo de mutantes en fliK puede ser suprimido por mutaciones en
el gen que codifica la proteína FlhB, proteína que forma parte del aparato de
exportación del sistema flagelar de Salmonella (Williams AW, et al., 1996; Hirano
T, et al., 1994). Un fenómeno similar ocurre en el sistema de virulencia de
Xanthomonas, donde mutaciones en la proteína HrcU (FlhB) suprimen el fenotipo
de mutantes en la proteína HpaC (FliK), restaurándose así la secreción de las
proteínas del translocón (Lorenz C y Büttner D, 2011). En relación con estos
datos se ha demostrado que FliK interacciona con el dominio citoplásmico de
FlhB, miembro de la familia Spa40/YscU a la que también pertenece la proteína
EscU de EPEC. De esta forma, después del ensamblaje del gancho y una vez que
éste ha alcanzado su longitud correcta, FliK regula un cambio en la especificidad
de reconocimiento de sustratos al modificar la conformación topológica de FlhB,
deteniendo así la exportación de subunidades del gancho y promoviendo la
secreción de la flagelina, cuyas subunidades forman el filamento (Ryan KA, et al.,
2005; Evans LD, et al., 2006).
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Una regulación de la secreción similar se ha reportado en el sistema de
virulencia de varias especies bacterianas tales como Salmonella, Shigella,
Yersinia y Xanthomonas, por mencionar algunos ejemplos (Rüssmann H, et al.,
2002; Tamano K, et al., 2002; Magdalena J, et al., 2002; Lorenz C y Büttner D,
2011). En Salmonella, una cepa mutante en el gen invJ ensambla inyectisomas
con agujas extremadamente largas y no es capaz de secretar proteínas efectoras,
lo cual sugiere que en esta mutante no funciona el primer interruptor molecular
(Rüssmann H, et al., 2002). Por otro lado, un trabajo reciente en Shigella muestra
que la proteína Spa32 participa en el control de la longitud de la aguja, y que la
proteína es funcionalmente equivalente e intercambiable con su homólogo InvJ
de Salmonella y que se secreta vía SST3 (Tamano K, et al., 2002). Se demostró
por TEM (por sus siglas en inglés, Transmission Electron Microscopy) que al
deletar el gen que codifica para Spa32, los SST3 de Shigella poseen agujas de
varias longitudes, en el rango de entre 40 y 1,150 nm siendo entre 40 y 50 nm la
longitud normal. Al complementar la cepa Δspa32 con la proteína Spa32 se
restauró el rango normal de longitud de la aguja. Además, en este mismo estudio
se demostró que la proteína Spa32 es esencial para la funcionalidad del SST3 ya
que es crucial para el ensamblaje de SST3 funcionales que permitan a la bacteria
infectar al hospedero. Este estudio representa la primera evidencia estructural y
funcional de que Spa32 es una proteína secretada vía SST3 y responsable de
controlar la longitud de la aguja del mismo (Tamano K, et al., 2002). El conjunto
de datos obtenidos en el sistema flagelar, así como, en los sistemas de virulencia
bacterianos apoyan fuertemente la hipótesis de un interruptor molecular general
formado por los miembros de la familia de proteínas FliK/InvJ/Spa32 y los
miembros de la familia FlhB/YscU/Spa40.
Una vez observada la interrelación que existe entre miembros de ambas
familias de proteínas se han llevado a cabo estudios para caracterizar este
interruptor molecular. Por ejemplo, se ha reportado en Shigella que en ensayos
de copurificación tipo pull down la proteína Spa32, interacciona con el extremo
carboxilo de Spa40 (Botteaux A, et al., 2008). En Xanthomonas también se
demostró por ensayos de copurificación tipo pull down que la proteína HpaC,
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interacciona con el extremo carboxilo terminal de HrcU, y que dicha interacción se
lleva a cabo sólo después de la autoproteólisis del C-terminal de HrcU con la
consecuente formación de los subdominios HrcUCN y HrcUCC. Gracias a estos
hallazgos se reconoció la importancia del motivo NPTH localizado en el extremo
carboxilo terminal de los miembros de la familia FlhB/YscU/Spa40, por ser éste el
sitio donde ocurre dicha proteólisis. Además de los estudios de interacción in
vitro de estas proteínas también se han reportado ensayos de interacción in vivo
mediante la técnica del doble híbrido. Por ejemplo, en S. flexneri se reportó que
Spa32 interacciona con el extremo carboxilo terminal de Spa40 pero
específicamente con el subdominio Spa40CC, localizado entre los aminoácidos
309-342 (fig. 6) (Botteaux A, et al., 2010).
Fig. 6. Los residuos 309-342 de Spa40, Spa40cc, son la región de interacción con Spa32. (a) Esquema topológico de la proteína Spa40 entera. (b) Alineamiento de la secuencia de Spa40CT con YscUC y FlhBC. Los residuos de aminoácidos encerrados en un margen representan el dominio de interacción de Spa40 con Spa32 (Botteaux A, et al., 2010).
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En el laboratorio se realizó un análisis bioinformático de EscU y EscP, previo a
éste trabajo, para conocer las propiedades fisicoquímicas de estas proteínas y ver
si existían características compartidas con las proteínas de la familia
FlhB/YscU/Spa40 con EscU y de miembros de la familia FliK/InvJ/Spa32 con
EscP (Monjarás Feria J, 2013). El análisis bioinformático indica que EscU
comparte ≈ 40% de identidad con las proteínas de la familia FlhB/YscU/Spa40, y
al igual que todas las proteínas de esta familia presenta cuatro dominios
transmembranales y un dominio carboxilo terminal citoplásmico que se
autoproteoliza entre la asparagina 262 y la prolina 263 del motivo NPTH (Fig. 7).
Fig. 7. Alineamiento múltiple de EscU de EPEC, Spa40 de Shigella flexneri, SpaS de Salmonella enterica, YscU de Yersinia enterocolitica, BscU de Bordetella bronchiseptica, HrcU de Xanthomonas campestris y FlhB del sistema flagelar de Salmonella enterica (Tomado de Monjarás Feria J, 2013).
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Por otro lado, se realizó una búsqueda para encontrar proteínas con similitud
de secuencia a EscP, usando la herramienta BLAST, donde las únicas proteínas
relacionadas con el SST3 que se mostraron fueron las proteínas homólogas a
EscP de los patógenos A/E Citrobacter rodentium (CR) y Escherichia coli
enterohemorrágica (EHEC). EscP de EPEC comparte 97% de identidad con la
proteína Orf16 de EHEC y 78% con Orf16 de CR (Fig. 8).
Fig. 8. Alineamiento múltiple de EscP de EPEC, Orf16 de EHEC y Orf16 de CR. En negro se marcan los aminoácidos idénticos, en gris los aminoácidos similares y se subraya con verde los primeros 35 aminoácidos de Orf16 de CR que no se reportaron cuando se secuenció el LEE de CR (Monjarás Feria J, 2013).
Ahora bien, este conjunto de datos sugiere la existencia de un interruptor
molecular también en EPEC el cual estaría constituido principalmente por la
proteína EscU, miembro de la familia FlhB/YscU/Spa40, y EscP, miembro de la
familia de proteínas T3S4. En este trabajo se evaluó dicha interacción en un
sistema in vivo.
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IV. JUSTIFICACIÓN
El ensamblaje del inyectisoma es un proceso ordenado y altamente regulado que
permite la correcta biogénesis de esta estructura. Las interacciones proteína-
proteína tienen un papel central en este proceso ya que permiten la formación de
complejos que participan en el reconocimiento diferencial de las proteínas de
secreción por los componentes del sistema secretor. Ahora bien, en nuestro
grupo de investigación estamos interesados en entender el mecanismo a través
del cual se lleva a cabo la regulación de la secreción ordenada de proteínas a
través del SST3 de Escherichia coli enteropatógena. El entendimiento de los
mecanismos moleculares que regulan el proceso de secreción es crucial para la
búsqueda de blancos terapéuticos que contrarresten la patogenicidad de esta
bacteria.
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V. HIPÓTESIS
La proteína EscP interacciona con componentes del sistema de secreción tipo III
para la regulación de la secreción jerárquica de sustratos.
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VI. OBJETIVOS
General
Caracterizar las interacciones proteína-proteína entre los componentes que
regulan la especificidad de la secreción en el inyectisoma de Escherichia coli
enteropatógena.
Específicos
1. Subclonación y clonación de los genes escP, escUC, escUCC, escN, sepL,
sepD, tir, cesT y escF en los vectores de expresión pGADT7 y pGBKT7.
2. Evaluación de las interacciones proteína-proteína usando el sistema del
doble híbrido en levadura.
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VII. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1 Cepas bacterianas y medios de cultivo.
Todas las cepas bacterianas utilizadas en el presente trabajo se cultivaron a
37°C, en medio Luria Bertani (LB, 10 g peptona, 5 g extracto de levadura, 10 g
de NaCl) o en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, de Gibco).
Cuando se requirió, el medio se suplementó con ampicilina [100 μg/ml],
kanamicina [50 μg/ml], estreptomicina [50 μg/ml] y/o tetraciclina [25 μg/ml]
(tabla 1).
Tabla 1. Cepas bacterianas utilizadas en este estudio
Cepa Descripción Fuente/Referencia
Top-10
Cepa con una eliminación parcial del gen lacZ que permite la α-complementación. Tiene una alta eficiencia de transformación. Resistente a estreptomicina.
Invitrogen
XL1-Blue Cepa derivada de K12. Mutante en la endonucleasa I. Resistente a tetraciclina.
Stratagene
Cepas de EPEC
E2348/69 EPEC silvestre O127:H26. Resistente a estreptomicina.
Donada por el Dr. J. L. Puente
ΔescN E2348/69 conteniendo una eliminación en fase del gene escN. Resistente a estreptomicina.
Donada por el Dr. J. L. Puente
ΔescP E2348/69 conteniendo una eliminación en fase del gene escP e inserción de un casete de kanamicina. Resistente a estreptomicina y kanamicina.
Monjarás Feria, J. 2012
7.2 Técnicas de biología molecular.
7.2.1 Amplificación por PCR.
A partir de la secuencia del DNA cromosomal de EPEC se diseñaron cebadores
específicos para amplificar el dominio escUCC del gen escU por PCR (PCR, por sus
siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction), utilizando la enzima Taq DNA
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polimerasa (Invitrogen) y los oligonucleótidos enlistados en la siguiente tabla
(tabla 2).
El fragmento amplificado escUCC se visualizó mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1% en TAE 1X, mismo que se tiñó en una solución de bromuro de
etidio y se observó en una lámpara de luz ultravioleta.
Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación del dominio escUcc
Cebador Secuencia 5’ → 3’ Sitio de restricción
escUccNdeIFw GTTATTGTTCATATGCCGACTCAC NdeI
escUccBamHIRv TGAGCAAGGATCCGATTAATAATC BamHI
Los parámetros para llevar a cabo la amplificación mediante la técnica de la
PCR dependen de factores tales como el tamaño del gen a amplificar, la
polimerasa y los valores de las temperaturas medias de desnaturalización (Tm)
de los oligonucleótidos utilizados. Los componentes moleculares para la PCR se
añadieron siguiendo la relación que se muestra a continuación:
Tabla 3. Relación estándar para la reacción de PCR
Componente Volumen
DNA cromosomal EPEC 3 μl
Amortiguador de enzima [10X] 10 μl
Mezcla de DNTP’s [2 mM] 10 μl
Cebador Rv [250 pmol μl-1] 2 μl
Cebador Fw [250 pmol μl-1] 2 μl
Enzima Taq DNA polimerasa 1 μl
Agua 72 μl
Volumen final 100 μl
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7.2.2 Purificación de DNA.
Cuando el producto de PCR se amplificó de forma específica, es decir, no se
amplificaron otros productos más que el correspondiente al tamaño esperado, se
procedió a la purificación utilizando el sistema (PCR Purification Kit, Qiagen). En
caso de que además del producto deseado se hayan amplificado productos
inespecíficos, el producto de PCR se corrió en un gel de agarosa 1%, se cortó la
banda correspondiente al gen de interés y se purificó con el sistema (Gel
Extraction, Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. El objetivo
central de la purificación del producto de PCR es remover todos los
oligonucleótidos, enzimas y nucleótidos no incorporados.
7.2.3 Clonación y subclonación de genes en los vectores pGADT7 y pGBKT7.
El fragmento escUCC, amplificado por PCR, se digirió con enzimas de restricción
NdeI⁄BamHI al igual que los vectores de clonación de levadura pGADT7 y pGBKT7.
Una vez digeridos y purificados el inserto y los vectores (Gel Extraction, Qiagen),
se procedió a clonar a escUCC en los vectores ya mencionados, ligando con la
enzima T4 DNA ligasa (New England Biolabs), y la reacción de ligación se incubó
16 horas a 16°C. En cuanto a todas las subclonaciones realizadas en el presente
trabajo el procedimiento fue el mismo, con la excepción de que los genes de
interés se extrajeron de plásmidos previamente construidos y digeridos en su
mayoría con enzimas de restricción (New England Biolabs) de los sitios
NdeI⁄BamHI. Finalmente, cada una de las reacciones de ligación se transformó en
células competentes Top-10. Las colonias de células transformadas con la nueva
construcción se seleccionaron por la resistencia al respectivo antibiótico que les
confiere el plásmido en cuestión, siendo la ampicilina para el plásmido pGADT7 y
la kanamicina para el plásmido pGBKT7.
El plásmido pGBKT7 es un vector de expresión en levadura de 7.3 kb, el cual
funciona para la expresión de proteínas fusionadas a los aminoácios 1 a 147 del
dominio de unión a DNA de GAL4 (DNA-BD). Dentro de la levadura las proteínas
fusionadas se expresan de forma constitutiva en alto número de copias gracias al
promotor constitutivo ADH1 (PADH1). Este plásmido contiene el promotor T7, una
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etiqueta c-Myc y un sitio de multiclonación (MCS) para la clonación de los genes
de interés. La etiqueta c-Myc permite identificar las proteínas de interés con
anticuerpos comerciales específicos. Además, la transcripción del inserto clonado
en pGBKT7 se finaliza en la levadura gracias a la señal de terminación de la
transcripción TADH1. El plásmido pGBKT7 se replica de manera autónoma tanto en
E. coli, como en S. cerevisiae a partir de las regiones pUC y 2 μ ori,
respectivamente. Contiene el gen de resistencia a kanamicina para su selección
en E. coli y el marcador nutricional TRP1 para su selección en levadura. Además,
presenta una alta eficiencia de transformación en levadura a pesar del gran
tamaño del vector (fig. 9).
El plásmido pGADT7 es un vector de expresión en levadura de 8 kb el cual
funciona para la expresión de proteínas fusionadas a los aminoácidos 768 a 881
del dominio de activación de GAL4 (AD) en el extremo 5’ del gen clonado. Este
plásmido se expresa de forma constitutiva y en alto número de copias gracias al
promotor constitutivo ADH1 (PADH1). También contiene el promotor T7, una
etiqueta HA y un sitio de multiclonación (MCS) para la clonación de los genes de
interés. La transcripción del inserto clonado en pGADT7 se finaliza gracias a la
señal de término de la transcripción TADH1. Contiene además una señal de
localización nuclear (SV40 NLS) en el extremo amino que dirige a la proteína
recombinante al núcleo. El plásmido pGADT7 se replica de manera autónoma
tanto en E. coli como en S. cerevisiae a partir de las regiones pUC y 2 μ ori,
respectivamente. Además, contiene el gen de resistencia a ampicilina para su
selección en E. coli y el marcador nutricional LEU2 para su selección en levadura
(fig. 10).
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Fig. 9. Mapa de restricción y sitio de multiclonación del plásmido pGBKT7.
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Fig. 10. Mapa de restricción y sitio de multiclonación del plásmido pGADT7.
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7.2.4 Obtención de DNA plasmídico.
Para extraer el DNA plasmídico de células transformadas se procede a tomar una
colonia de éstas, se inocula en 5 ml de medio LB, adicionado con el respectivo
antibiótico, y se incuba toda la noche a 37°C en agitación a 250 rpm. Al día
siguiente se lleva a cabo el rompimiento de las células de dicho cultivo mediante
lisis alcalina de modo que sólo permee selectivamente su DNA plasmídico. La
miniprep (Kit QIAprep Spin Miniprep Qiagen) es la técnica más utilizada para la
purificación y concentración de DNA plasmídico para cualquiera de sus posibles
fines, entre los que destaca la clonación. Finalmente, el DNA plasmídico obtenido
se analizó digiriéndolo con enzimas de restricción verificando la presencia del
inserto a través del patrón de restricción de dicha muestra.
7.2.5 Análisis de restricción.
El análisis de restricción usando enzimas de restricción específicas es importante
porque permite obtener patrones de migración en un gel de agarosa que indican
si el gen de interés se clonó en el plásmido. Para ello, se procedió a extraer el
DNA plasmídico (QIAprep Spin Miniprep Qiagen) de algunas colonias de células
transformantes. El DNA plasmídico se examinó incubando 3 µl de DNA con 1 μl
total de las enzimas de restricción específicas para dicha muestra, 5 μl agua y 1
μl del amortiguador de las enzimas utilizadas en un volumen final de 10 µl. La
reacción de restricción se realizó a 37°C durante un período de 5 horas
aproximadamente. Una vez transcurrido el tiempo de digestión del DNA la
muestra se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1% en TAE 1X y se
corroboró que en el patrón de migración los fragmentos generados
correspondieran a los fragmentos esperados para cada caso. Finalmente, y
siendo positivo el resultado obtenido, el plásmido se transformó en células XL1-
Blue, se purificó y se procedió a realizar la secuenciación del mismo.
7.2.6 Secuenciación.
La secuenciación es la determinación del orden preciso en el que se encuentran
los nucleótidos, adenina, timina, citosina y guanina, en una muestra de ADN
determinada. La secuenciación de DNA se realiza por el método de terminadores
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marcados con BigDye, y electroforesis capilar, empleando el Kit BigDye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Life Technologies) y un
secuenciador ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). La
secuenciación de todos los plásmidos construidos para el presente trabajo se
llevó a cabo usando el oligonucleótido PT7 [0.1 µg/µl]. El objetivo de secuenciar
los plásmidos es corroborar, respecto a la secuencia reportada, que no hayan
ocurrido mutaciones en los insertos clonados y que éstos se encuentren en el
marco de lectura correcto. De esta manera se puede confiar en que se producirá
la proteína esperada y el resultado obtenido para efectos de la presente
investigación. La secuenciación automática de los plásmidos se realizó en la
Unidad de Biología Molecular del Instituto de Fisiología Celular, UNAM.
7.3 Preparación de células competentes Top-10 con CaCl2 y transformación del
DNA plasmídico.
De un cultivo de bacterias Top-10 se toma una colonia aislada y se inocula en 2
ml de medio LB, adicionado con el respectivo antibiótico, y dicho precultivo se
crece a 37°C durante un período de 12 horas en agitación a 250 rpm. Al día
siguiente, se toman 300 µl del precultivo y se inoculan en 30 ml (dilución 1:100)
de medio LB fresco, adicionado con el respectivo antibiótico, mismas que se
crecen a 37°C en agitación a 250 rpm, hasta alcanzar una DO650 = 0.3 – 0.5.
Dichas células se cosechan centrifugándolas a 8,000 rpm por 5 min a 4°C. La
pastilla obtenida se resuspende cuidadosamente en 30 ml de CaCl2 [100 mM]
frío. Posteriormente, las células se incuban en hielo por 40 min y se centrifugan
nuevamente a 8,000 rpm por 5 min a 4°C. Finalmente, la pastilla obtenida se
resuspende cuidadosamente en 3 ml de CaCl2 [100 mM] frío.
Por otro lado, la transformación de las células competentes con la reacción de
ligación consiste en mezclar el volumen total de la reacción de ligación (50 µl
aproximadamente) con 200 µl de células competentes e incubar dicha mezcla
durante 1 hora a 4°C. Después de pasado el tiempo mencionado las células se
sometieron a un choque de calor a 42°C durante 2 min para después incubarlas
a 4°C por 3 min. Una vez hecho esto, las células se siembran en cajas con medio
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LB sólido, adicionado con el respectivo antibiótico, y se dejan toda la noche a
37°C. Las colonias transformadas se obtienen al día siguiente, mismas que se
cultivan para proceder a la extracción del plásmido de interés.
7.4 Sistema del doble híbrido en levadura.
El sistema del doble híbrido en levadura es una metodología de Biología
Molecular que permite encontrar proteínas que interaccionan mutuamente. La
técnica consiste en la activación de genes reporteros por la acción de un factor
de transcripción que se une a la secuencia regulatoria UAS (UAS, por sus siglas
en inglés, Upstream Activating Sequence), misma que se localiza río arriba del
promotor. En el sistema del doble híbrido el factor de transcripción es separado
en dos fragmentos, uno que reconoce el UAS, dominio de unión a DNA, BD, (BD,
por sus siglas en inglés, Binding Domain), y el otro que promueve la activación de
la maquinaria de transcripción, dominio de activación, AD, (AD, por sus siglas en
inglés, Activating Domain). Entonces, dos proteínas de interés que se piense que
interaccionan entre sí se fusionan por separado al dominio de unión a DNA y al
dominio de activación de la transcripción. Si la interacción se lleva a cabo
entonces se reconstituye el factor transcripcional, usualmente es GAL4, mismo
que promueve la expresión de genes reporteros cuya proteína producto puede ser
detectada fácilmente (fig. 11) (Chien CT, et al., 1991; Criekinge WV, Beyaert R,
1999).
La técnica del doble híbrido se basa en el hecho de que la mayoría de factores
de transcripción eucarióticos tienen una organización modular, es decir, poseen
un dominio de activación y otro de unión de DNA separados, que pueden
funcionar si se encuentran próximos el uno con el otro, pero sin necesidad de
estar unidos directamente. Esto quiere decir que incluso aunque el factor de
transcripción sea separado en dos fragmentos, es capaz de activar la
transcripción cuando los dos fragmentos son conectados indirectamente (Traven
A, et al., 2006).
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42
Este sistema suele servirse de una cepa de levadura modificada
genéticamente para que sea defectiva en la biosíntesis de ciertos nutrientes,
comúnmente aminoácidos o ácidos nucleicos. Cuando estas cepas se cultivan en
medio que carecen de estos nutrientes no son capaces de sobrevivir. Además,
esta cepa mutante es capaz de incorporar DNA plasmídico foráneo. En el sistema
del doble híbrido de levadura, dos plásmidos independientes conteniendo el cebo
y el anzuelo son simultáneamente introducidos en la cepa mutante de levadura.
Los plásmidos son diseñados para producir un producto proteico en el cual el
dominio de unión al DNA es fusionado con una de las proteínas mientras que el
otro plásmido es diseñado para producir un producto proteico en el que el
dominio de activación es fusionado con la otra proteína. La proteína fusionada
con el BD se suele denominar proteína anzuelo o cebo. La proteína fusionada con
el AD se conoce como proteína presa y puede tratarse de una única proteína
conocida o de una librería de proteínas conocidas o desconocidas (Criekinge WV,
Beyaert R, 1999).
El sistema del doble híbrido ofrece un número de ventajas sobre otros
procedimientos bioquímicos usados en el análisis de interacciones proteína-
proteína. Por ejemplo, este sistema evita la producción de anticuerpos y
purificación de las proteínas de interés, es mucho más sensible que muchos
sistemas in vitro y permite la detección de interacciones transitorias entre
proteínas, por mencionar algunos ejemplos.
Fig. 11. Sistema del doble híbrido en levadura.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
43
7.4.1 Ensayos de interacción proteína-proteína por doble híbrido en levadura.
La transformación de Saccharomyces cerevisiae AH109 inicia inoculando una
colonia de esta cepa en 5 ml de medio líquido YPDA (Yeast Peptone Dextrose
Adenina) el cual se incuba a 30°C, 260 rpm, por 12 horas. Al día siguiente, se
agregan 800 µl del inóculo en 25 ml de medio líquido YPDA y se incuba a 30°C,
260 rpm, por 5 horas aproximadamente hasta alcanzar una DO600 = 0.7 – 1. Una
vez alcanzada la densidad deseada se toman 1.5 ml del cultivo para cada
transformación a realizar y se centrifugan 2 min a 10,000 rpm, eliminando el
sobrenadante. Enseguida se resuspende la pastilla de células en 1 ml de agua
estéril y se vortexea. Se centrifuga la muestra 2 min a 10,000 rpm y se elimina el
sobrenadante. Se resuspende la pastilla en 1 ml de LiAc 0.1 M y dicha mezcla se
incuba por 10 min a temperatura ambiente. Mientras tanto, se procede a calentar
el DNA de esperma de salmón a 96°C por 10 min, mismo que funciona como
acarreador de los plásmidos de interés y facilita su ingreso al interior celular.
Transcurrido el tiempo de incubación, se centrifugan las muestras 2 min a
10,000 rpm eliminando el sobrenadante. Se agregaron los siguientes
componentes a las pastillas celulares en el orden siguiente:
Tabla 4. Relación de componentes para la transformación en levadura
Componente Volumen
PEG 3500 50% w⁄v 240 μl
LiAc [1M] 36 μl
DNA esperma de salmón 10 μl
Plásmido pGADT7
(presa, sin inserto o con el gen de interés clonado) 1 μl
Plásmido pGBKT7
(carnada, con el gen de interés clonado) 1 μl
Agua estéril 72 μl
Volumen final 360 μl
Las levaduras, junto con la mezcla para transformar, se agitaron fuertemente
en el vortex hasta obtener una mezcla lo más homogénea posible. Las muestras
se incubaron por 45 min a 42°C agitando éstas con el vortex cada 10 min.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
44
Enseguida las muestras se centrifugaron 2 min a 10,000 rpm, se eliminó el
sobrenadante y la pastilla celular se resuspendió en 500 μl de agua estéril y se
plaquearon 100 μl de dicha mezcla en cajas de medio mínimo SD –Trp –Leu para
seleccionar colonias de levaduras cotransformadas con la ‘carnada’ y la ‘presa’
para examinar su posible interacción. Las colonias de levaduras cotransformadas
aparecieron entre los 3-5 días posteriores siendo las cajas incubadas a 30°C
durante todo este período de tiempo.
Una vez obtenidas colonias transformantes, se hacen parches de al menos
ocho colonias diferentes para permitir el crecimiento de las colonias de
levaduras. Dichos parches se cultivan igualmente a 30°C durante un período de
3-4 días aproximadamente.
El análisis de interacciones proteína-proteína se examina diluyendo de manera
progresiva un cultivo de levaduras cotransformadas para obtener resultados que
sean diferenciables de los falsos positivos. Las diluciones de levaduras se inician
tomando una pequeña muestra del parche de levaduras y cultivando ésta 12
horas, 260 rpm, a 30°C en 5 ml de medio mínimo SD –Trp –Leu. Durante este
período de tiempo las levaduras tienen que alcanzar un crecimiento deseable que
sea de una D.O.600nm= 1-1.5. Enseguida hay que preparar 6 tubos de 1.6 ml
estériles por cada muestra a diluir, y agregarles agua estéril en el siguiente orden:
Tabla 5. Tubos con agua estéril para diluciones
Tubo Volumen
1 -
2 50 μl
3 90 μl
4 90 μl
5 90 μl
6 90 μl
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
45
Después hay que calcular el volumen de cada una de las muestras cuya
D.O.600nm = 1. Centrifugar cada una de las muestras 2 min a 10,000 rpm, y
eliminar el sobrenadante. Resuspender la pastilla en 1 ml de agua estéril, agitar
la muestra fuertemente en el vortex y centrifugar 2 min a 10,000 rpm eliminando
el sobrenadante. Resuspender la pastilla en 1 ml de agua estéril para todas las
muestras y agitar fuertemente en el vortex. Finalmente, las diluciones progresivas
se hacen siguiendo las siguientes instrucciones:
Tabla 6. Diluciones progresivas de levadura para doble híbrido
Tubo Dilución Especificaciones
1 - Contiene volumen de muestra D.O.600nm =1. Tomar 50 μl y agregar
en tubo 2.
2 1:2 Resuspender, tomar 10 μl y agregar en tubo 3.
3 1:10 Resuspender, tomar 10 μl y agregar en tubo 4.
4 1:100 Resuspender, tomar 10 μl y agregar en tubo 5.
5 1:1,000 Resuspender, tomar 10 μl y agregar en tubo 6.
6 1:10,000 Dilución final
Finalmente, las diluciones se plaquean en medio mínimo sólido SD –Leu –Trp y
SD –Leu –Trp –His y las cajas se incuban a 30°C durante un período de 3-5 días.
El medio SD –Leu –Trp –His es el determinante para saber si las dos proteínas de
interés interaccionan entre sí ya que sólo si esto ocurre se activará la expresión
del gen reportero HIS3 y crecerán colonias de levaduras en este medio.
El sistema de doble híbrido empleado en el presente estudio (Clontech)
proporciona un control positivo de interacción y uno negativo. En el control
positivo, la proteína murina p53 está fusionada al dominio de unión a DNA
(pGBKT7-53) y el antígeno T de SV40 está fusionado al dominio de activación
(pGADT7-T). Está demostrado que ambas proteínas interaccionan entre sí por lo
que en conjunto son un control positivo confiable. En el control negativo, la
proteína de la lámina C está fusionada al dominio de unión a DNA (pGBKT7-Lam),
la carnada, y como presa se usa nuevamente el plásmido pGADT7-T. Está
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_____________________________________________________________________
46
demostrado que ambas proteínas no interaccionan por lo que son un control
negativo confiable. Además, en todos los experimentos se emplearon como
controles negativos de interacción los genes fusionados al dominio de unión a
DNA cotransformados con el plásmido pGADT7 sin inserto, que contiene el
dominio de activación de GAL4, para corroborar que las proteínas de interés no
activaran por sí mismas la actividad transcripcional de los genes reporteros HIS3,
ADE2, lacZ y MEL1.
7.5 Análisis de la actividad hemolítica de EPECΔescP.
Con el objetivo de analizar si la mutante EPECΔescP es capaz de ensamblar el
mismo número de inyectisomas respecto a la cepa silvestre se realizaron ensayos
para medir la actividad hemolítica de la mutante, lo cual es un indicador de si se
ha llevado a cabo el ensamblaje del filamento y del poro de translocación y si la
proteína EscP es esencial en dicho proceso.
En primer lugar se procedió a obtener una muestra de 5 ml aproximadamente
de sangre humana fresca para, a partir de ésta, aislar los eritrocitos. Para obtener
los eritrocitos humanos se agregó la muestra de sangre en un tubo Falcon con
EDTA para evitar su coagulación. Se lavan los eritrocitos con una solución salina
de NaCl 0.9% para eliminar el suero y leucocitos y quedarse únicamente con los
eritrocitos. Una vez aislados los eritrocitos se comienza el ensayo de hemólisis el
cual inicia inoculando medio DMEM 1% LB con un precultivo bacteriano (dilución
1:50), el cual se deja crecer hasta una D.O.650nm = 0.6-0.7. Se ajustan todas las
muestras a la misma D.O. en un volumen de 5 ml. Enseguida se agregan 500 μl
del cultivo bacteriano a 500 μl de DMEM 4% eritrocitos. Se centrifugan las
muestras a 2,500 X g para favorecer el contacto de EPEC con los eritrocitos. Se
incuban las muestras 4 horas, 37°C, 5% CO2. Transcurridas las 4 horas de
incubación se procede a agitar cada muestra fuertemente en el vortex para
facilitar la liberación de hemoglobina. Finalmente, en el espectrofotómetro se
analiza la liberación de hemoglobina de cada muestra a una D.O.450nm.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
47
VIII. RESULTADOS
8.1 Construcción de plásmidos para doble híbrido en levadura.
Para llevar a cabo los ensayos de interacción proteína-proteína por doble híbrido
en levadura se generaron las construcciones de DNA mostradas en la siguiente
tabla, mismas que en su mayoría fueron producto de subclonaciones a partir de
otros plásmidos a los cuales también se hace referencia a continuación:
Tabla 7. Construcciones de DNA realizadas/utilizadas en el presente estudio
Nombre Descripción Fuente/Referencia
pOGADeF Gen escF subclonado en pGADT7 En este trabajo.
No publicado.
pOGADeUc Gen escUc subclonado en pGADT7 En este trabajo.
No publicado.
pOGADeUcc Gen escUcc subclonado en pGADT7 En este trabajo.
No publicado.
pOGADo16 Gen escP subclonado en pGADT7
En este trabajo.
Monjarás Feria, J.,
2012.
pOGADpD Gen sepD subclonado en pGADT7 En este trabajo.
No publicado.
pOGADtir Gen tir subclonado en pGADT7 En este trabajo.
No publicado.
pOGBKeF Gen escF subclonado en pGBKT7
En este trabajo.
Monjarás Feria, J.,
2012.
pOGBKeN Gen escN subclonado en pGBKT7 En este trabajo.
No publicado.
pOGBKeNΔ102 Gen escNΔ102 subclonado en pGBKT7 En este trabajo.
No publicado.
pOGBKeUc Gen escUc subclonado en pGBKT7
En este trabajo.
Monjarás Feria, J.,
2012.
pOGBKeUcc Gen escUcc subclonado en pGBKT7 En este trabajo.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
48
Monjarás Feria, J.,
2012.
pOGBKo16 Gen escP subclonado en pGBKT7 En este trabajo.
No publicado.
pOGBKpD Gen sepD subclonado en pGBKT7 En este trabajo.
No publicado.
pOGBKpL Gen sepL subclonado en pGBKT7 En este trabajo.
No publicado.
pOGBKtir Gen tir subclonado en pGBKT7 En este trabajo.
No publicado.
pOMeUcc Gen escUcc clonado en pGEM-T easy En este trabajo.
No publicado.
pEUeF Gen escF clonado en pUC18 Delgado, E.
No publicado.
pJEeUc Gen escUc subclonado en pET19b Monjarás Feria, J.,
2012.
pJRo16 Gen escP clonado en PCR-Blunt II TOPO Monjarás Feria, J.,
2012.
pAEpD Gen sepD subclonado en pET19b Castañeda, A.
No publicado.
pMRtir Gen tir clonado en PCR-Blunt II TOPO Díaz, M.
No publicado.
pMEpL Gen sepL subclonado en pET19b Gaytán, M.
No publicado.
pAUescN Gen escN clonado en pUC18 Andrade, A.
No publicado.
pAEeNΔ1-102 Gen escNΔ1-102 subclonado en pET19b Andrade, A.
No publicado.
pMGADcT Gen cesT subclonado en pGADT7 Gaytán, M.
No publicado.
pMGBKcT Gen cesT subclonado en pGBKT7 Gaytán, M.
No publicado.
pMGADpL Gen sepL subclonado en pGADT7 Gaytán, M.
No publicado.
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_____________________________________________________________________
49
8.2 Análisis de interacción proteína-proteína por doble híbrido.
En el presente trabajo se estableció la técnica de interacción proteica a través del
sistema de doble híbrido en levadura. Los resultados que se presentan son
preliminares y algunos han sido ya posteriormente corroborados en el laboratorio
de la Dra. González. Los ensayos que se han verificado posteriormente se
señalan con un asterisco.
8.2.1 Interacción de la proteína SepD con SepL.
La primera interacción analizada en el presente trabajo fue entre las proteínas
SepD y SepL, componentes del segundo interruptor molecular del inyectisoma de
EPEC. Dicha interacción se realizó con el objetivo de corroborar la confiabilidad
del sistema de doble híbrido usado en este trabajo, ya que ésta se reportó en
2004 por el grupo de Michael S. Donnenberg (O’Connell et al., 2004). Asimismo,
dicha interacción se detectó en el laboratorio a través de ensayos de
copurificación tipo pull down. Todos los experimentos de interacción que se
presentan se realizaron por triplicado. Para analizar la interacción de SepD con
SepL se cotransformaron los siguientes plásmidos:
Tabla 8. Controles para analizar interacciones por doble híbrido
Carnada Presa Tipo de control
pGBKT7-53 pGADT7-T Control positivo
pGBKT7-Lam pGADT7-T Control negativo
pOGBKpD pNGADpL Análisis de interacción
pOGBKpD pGADT7 Control negativo
Las colonias cotransformantes se seleccionaron en placas de agar con medio
mínimo SD sin leucina y triptófano (SD -LT). A partir de las colonias
cotransformantes se hicieron parches en placas de agar con medio mínimo SD –
LT para permitir el crecimiento de cada una de las colonias seleccionadas. Una
vez crecidas las colonias se inocularon cultivos líquidos a partir de éstas en
medio SD –LT y se cultivaron por 12 horas en agitación constante a 30°C.
Enseguida se realizaron las diluciones de cada muestra como se describió en la
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
50
sección de materiales y métodos. Las diluciones se plaquearon en cajas de agar
con medio mínimo SD –LT como control de crecimiento y en medio SD sin
leucina, triptófano e histidina (SD –LTH) para seleccionar las interacciones
positivas.
Como control positivo se cotransformaron los plásmidos pGBKT7-53 y pGBKT7-
T los cuales codifican fusiones del DNA-BD y AD de GAL4 a la proteína murina
p53 y el antígeno T del virus SV-40, respectivamente. Estas proteínas
interaccionan en un ensayo de doble híbrido en levadura, crecen en medio
mínimo SD –LTH y por lo tanto funcionan como un control positivo de interacción.
Como control negativo de interacción se cotransformaron los plásmidos pGBKT7-
Lam, que codifica para la proteína humana lámina C fusionada al dominio BD de
GAL4, y pGBKT7-T, cuyas productos génicos no interaccionan en un ensayo de
doble híbrido. Otro control negativo utilizado fue el de cotransformar el plásmido
pOGBKpD, que codifica para la proteína SepD fusionada al BD de GAL4, con el
pGADT7 sin inserto, que codifica solo el dominio de activación de GAL4. Este
control es de principal importancia ya que el crecimiento de colonias de levaduras
cotransformadas con ambos plásmidos en medio mínimo SD –LTH indicaría dos
cosas: (1) que la proteína BD-SepD interacciona con el dominio de activación de
GAL4 aún en ausencia de la presa o, (2) que la proteína de fusión BD-SepD por sí
misma es capaz de activar la expresión de los genes reporteros HIS3 ó ADE2, por
mencionar dos ejemplos. Este control permite corroborar que la interacción
analizada sea real y no se deba a autoactivación de la expresión por la proteína
fusionada al dominio de unión al DNA. Tal como se muestra a continuación, no se
observa crecimiento de colonias de levaduras transformadas con estos plásmidos
en medio SD –LTH. El resultado obtenido de doble híbrido fue el siguiente:
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
51
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 12. Ensayo de interacción de SepD y SepL. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKpD y pNGADpL, y (d) pOGBKpD y pGADT7. Días de incubación: 7.
Se puede observar que no crecen colonias de levaduras cotransformadas con
los plásmidos pOGBKpD y pNGADpL, figura 12, línea c, en medio selectivo SD –
LTH. Esto indica que dichas proteínas no interaccionan en el sistema de doble
híbrido usado en el presente trabajo.
8.2.2 Interacción de la proteína SepL con SepD.
Dado que la interacción de la proteína SepD con SepL no se observó en el
sistema de doble híbrido estandarizado en el laboratorio se decidió clonar ambos
genes en el vector de clonación opuesto, es decir, el gen sepL se subclonó en el
plásmido pGBKT7, sirviendo ahora SepL como carnada, y el gen sepD se
subclonó en el plásmido pGADT7, ejerciendo ahora SepD la función de presa. Al
cotransformar los plásmidos y realizar el ensayo de doble híbrido se obtuvo el
siguiente resultado:
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
52
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 13. Ensayo de interacción de SepL y SepD. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKpL y pOGADpD, y (d) pOGBKpL y pGADT7. Días de incubación: 5.
Como se puede observar en la figura 13, colonias de levaduras
cotransformadas con los plásmidos pOGBKpL y pOGADpD crecen en medio SD –
LTH; sin embargo, el control negativo de interacción pOGBKpL y pGADT7 también
crece en la misma magnitud por lo que, dado que la proteína SepL fusionada al
BD es capaz de autoactivar la expresión, no es posible validar la interacción de la
proteína SepL con SepD. El resultado obtenido en este trabajo no corresponde
con lo previamente reportado; sin embargo, otras interacciones conocidas sí
funcionaron en otros proyectos del laboratorio con el mismo sistema, por lo que
se decidió continuar analizando otras posibles interacciones proteicas de interés
esperando obtener resultados positivos y, que el resultado negativo obtenido de
la interacción de las proteínas SepD con SepL sea cuestión de diferencias
metodológicas de cada sistema de doble híbrido utilizado (ver discusión).
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
53
8.2.3 Interacción de la proteína EscP con EscUC.
Para analizar la interacción de las proteínas EscP y EscUC, extremo carboxilo de la
proteína EscU in vivo, se cotransformaron en S. cerevisiae los plásmidos
pOGBKo16 y pOGADeUc, usando a la proteína EscP como carnada y a la proteína
EscUC como presa. Al cotransformar los plásmidos y realizar el ensayo de doble
híbrido se obtuvo el siguiente resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 14. Ensayo de interacción de EscP y EscUC. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKo16 y pOGADeUc, y (d) pOGBKo16 y pGADT7. Días de incubación: 8.
No se observó crecimiento de colonias de levaduras en placas con medio SD –
LTH, incluso después de incubar a 30°C las placas Petri por períodos superiores
a los 8 días. Resultados que muestran que por doble híbrido, y en esta
orientación de presa y carnada, la proteína EscP no interacciona con EscUC,
extremo carboxilo de la proteína EscU.
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
54
8.2.4 Interacción de la proteína EscUC con EscP*.
Dado que no se obtuvo el resultado esperado de la interacción de la proteína
EscP con EscUC, usando la primera como carnada, se decidió clonar cada gen en
el plásmido contrario, es decir, usar esta vez a la proteína EscUC como carnada y
a EscP como presa. Se cotransformaron los plásmidos pOGBKeUc y pOGADo16,
se hicieron las diluciones y éstas se plaquearon en medio SD –LT y SD –LTH
obteniendo el siguiente resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 15. Ensayo de interacción de EscUC y EscP. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKeUc y pOGADo16, y (d) pOGBKeUc y pGADT7. Días de incubación: 7.
Se puede observar el crecimiento de colonias de levaduras en medio SD –LTH
que coexpresan a las proteínas EscUC y EscP, tal como se observa en la figura 15,
línea c. Sin embargo, también se observa crecimiento de colonias de levaduras
que coexpresan tanto a la proteína EscUC como al dominio de activación de GAL4.
Las propiedades autoactivantes de la proteína BD-EscUC son de tal magnitud que
no se puede validar la interacción de la proteína EscUC con EscP.
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
55
8.2.5 Interacción de la proteína EscP con EscUCC.
Debido a que no se obtuvo el resultado esperado de la interacción entre las
proteínas EscP y EscUC, se decidió amplificar por PCR y clonar en pGBKT7 y
pGADT7 el dominio carboxilo del extremo carboxilo de la proteína EscU, EscUCC,
debido a que en 2010 se demostró que la proteína Spa32 de Shigella,
equivalente a EscP en EPEC, interacciona con los últimos 33 aminoácidos del
extremo carboxilo terminal de Spa40, homólogo de EscU en EPEC. Dichos
aminoácidos se denominan región carboxilo del carboxilo una vez que EscUC se
autoproteoliza en dos fragmentos, el amino (EscUCN) y el carboxilo (EscUCC). Se
cotransformaron los plásmidos pOGBKo16 y pOGADeUcc, se plaquearon las
diluciones en medio SD –LT y SD –LTH obteniendo el siguiente resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 16. Ensayo de interacción de EscP y EscUCC. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKo16 y pOGADeUcc, y (d) pOGBKo16 y pGADT7. Días de incubación: 5.
El resultado obtenido muestra que las proteínas EscP y EscUCC no interaccionan
por doble híbrido en este sentido de expresión de carnada y presa, al no haber
crecimiento de colonias de levaduras en medio SD –LTH, como se muestra en la
figura 16, línea c. Las cajas se dejaron incubando a 30°C incluso por más tiempo
pero no hubo ningún indicio de interacción entre estas dos proteínas.
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
56
8.2.6 Interacción de la proteína EscUCC con EscP*.
Debido a que no se obtuvo el resultado esperado de la interacción entre las
proteínas EscP y EscUCC, usando a la proteína EscP como carnada, se decidió
clonar el gen de la proteína EscUCC en el dominio de unión a DNA de GAL4 y
analizar si EscUCC funcionando como carnada era capaz de interaccionar con la
proteína EscP. Para llevar a cabo este experimento se cotransformaron los
plásmidos pOGBKeUcc y pOGADo16, se plaquearon las diluciones en medio SD –
LT y SD –LTH obteniendo el siguiente resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 17. Ensayo de interacción de EscUCC y EscP. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKeUcc y pOGADo16, y (d) pOGBKeUcc y pGADT7. Días de incubación: 5. Tal como se muestra en la figura 17, línea c, colonias de levaduras
cotransformadas con los plásmidos pOGBKeUcc y pOGADo16 crecen en placas
de agar SD –LTH, lo cual es un indicador de que la proteína EscUCC, usada como
carnada, interacciona con la proteína EscP lo cual permite la expresión del gen
reportero HIS3 y, por lo tanto, el crecimiento de colonias de levaduras en este
medio de cultivo. Con este experimento se demuestra la interacción de EscU y
EscP lo cual apoya la hipótesis de que ambas proteínas funcionan en complejo
como un interruptor molecular en el SST3 de EPEC.
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
57
Una vez determinada la interacción de la proteína EscUCC con EscP se analizó si
colonias de levaduras cotransformadas con los plásmidos pOGBKeUcc crecían en
un medio de cultivo altamente astringente, lo cual es un indicador de la
especificidad y fortaleza de la interacción de dichas proteínas. Para llevar a cabo
dicho experimento se cotransformaron los plásmidos pOGBKeUcc y pOGADo16,
se plaquearon las diluciones en medio SD –LT y SD –LTHA obteniendo el
siguiente resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTHA
Fig. 18. Ensayo de interacción de EscUCC y EscP. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTHA. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKeUcc y pOGADo16, y (d) pOGBKeUcc y pGADT7. Días de incubación: 16. Tal cual se aprecia en la figura 18, línea c, colonias de levaduras
cotransformadas con los plásmidos pOGBKeUcc y pOGADo16 crecen en placas
SD –LTHA. Se puede observar que colonias de levaduras cotransformadas con
dichos plásmidos crecen bien en las diluciones 1:2 y 1:10 e incluso se observa
crecimiento de levaduras en la dilución 1:100. Este resultado demuestra que la
proteína EscUCC interacciona con la proteína EscP y que dicha interacción es
específica y suficientemente fuerte. Este resultado corrobora los datos previos
obtenidos en el laboratorio en los que dicha interacción se identificó a través de
ensayos de copurificación tipo pull down.
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
58
8.2.7 Interacción de la proteína EscP con SepD.
Para analizar la interacción de las proteínas EscP y SepD, componentes del
primer y segundo interruptor molecular en EPEC, respectivamente, se
cotransformaron en S. cerevisiae los plásmidos pOGBKo16 y pOGADpD, usando
la proteína EscP como carnada y la proteína SepD como presa. Al cotransformar
los plásmidos y realizar el ensayo de doble híbrido se obtuvo el siguiente
resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 19. Ensayo de interacción de EscP y SepD. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKo16 y pOGADpD, y (d) pOGBKo16 y pGADT7. Días de incubación: 9.
Tal como se observa en el presente resultado, no hay una interacción, al menos
no por doble híbrido, entre EscP (componente del primer interruptor molecular) y
SepD (componente del segundo interruptor). De existir dicha interacción habría
que analizarla con base en otro método como coinmunoprecipitación y/o ensayos
de copurificación tipo pull down.
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
59
8.2.8 Interacción de la proteína SepD con EscP.
Dado que no se obtuvo un resultado positivo al analizar la interacción de la
proteína EscP con SepD, usando la proteína EscP como carnada, se decidió
clonar el gen codificante para la proteína SepD en el dominio de unión a DNA de
GAL4 y analizar si SepD funcionando como carnada interacciona con la proteína
EscP. Para analizar dicha interacción se cotransformaron los plásmidos pOGBKpD
y pOGADo16, se plaquearon las diluciones en medio SD –LT y SD –LTH
obteniendo el siguiente resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 20. Ensayo de interacción de SepD y EscP. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKpD y pOGADo16, y (d) pOGBKpD y pGADT7. Días de incubación: 9.
Tal como se puede apreciar en la figura 20, panel derecho, colonias de
levaduras cotransformadas con las proteínas SepD y EscP no crecen en medio SD
–LTH, lo cual significa que dichas proteínas no interaccionan por doble híbrido.
De momento, se descarta la hipótesis de que las proteínas SepD y EscP podrían
interaccionar físicamente y que dicha interacción podría ser importante para
regular la jerarquía de secreción de sustratos del SST3 de EPEC.
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
60
8.2.9 Interacción de la proteína EscP con SepL.
De acuerdo con nuestra hipótesis de que la proteína EscP podría interaccionar
con algún componente del segundo interruptor molecular se analizó su posible
interacción con la proteína SepL. Para llevar a cabo dicho análisis se
cotransformaron en levadura los plásmidos pOGBKo16 y pNGADpL, se
plaquearon las diluciones en medio SD –LT y SD –LTH obteniendo el siguiente
resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 21. Ensayo de interacción de EscP y SepL. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKo16 y pNGADpL, y (d) pOGBKpD y pGADT7. Días de incubación: 8.
Tal como se observa en la figura 21, panel derecho, línea c, no se observa
crecimiento de colonias de levaduras cotransformadas con las proteínas EscP y
SepL en medio SD –LTH, lo cual significa que por doble híbrido dichas proteínas
no interaccionan entre sí. Si dicha interacción realmente ocurre tendrá que ser
analizada mediante una técnica alterna. Finalmente, no se analizó por doble
híbrido la interacción de estas proteínas usando a SepL como carnada dado que,
como se mostró anteriormente, dicha proteína autoactiva la expresión del gen
reportero HIS3. En cuanto a la posible interacción entre los interruptores
moleculares, faltaría analizar la interacción entre EscP y Orf12.
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
61
8.2.10 Interacción de la proteína EscP con Tir.
Resultados de nuestro laboratorio y otros grupos demuestran que cepas de EPEC
en cuyo genoma está deletado el gen codificante para SepL hipersecretan la
proteína Tir (Wang D, et al., 2008), sin embargo, al sobreexpresar a EscP dicha
secreción disminuye. Esta estrecha relación entre ambas proteínas sugiere que
éstas podrían estar relacionadas desde el punto de vista funcional, por tanto,
podrían interaccionar entre sí. Con base en estos antecedentes se hizo el análisis
de interacción cotransformando los plásmidos pOGBKo16 y pOGADtir en
levadura, se plaquearon las diluciones en medio SD –LT y SD –LTH obteniendo el
siguiente resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 22. Ensayo de interacción de EscP y Tir. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKo16 y pOGADtir, y (d) pOGBKo16 y pGADT7. Días de incubación: 8. Tal como se muestra en la figura 22, panel derecho, línea c, no se observa
crecimiento de colonias de levaduras cotransformadas con las proteínas EscP y
Tir en medio SD –LTH. Esto significa que dichas proteínas no interaccionan (en
este sentido de expresión como carnada y presa) por doble híbrido en levadura.
Será necesario analizar esta posible interacción mediante otra técnica.
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
62
8.2.11 Interacción de la proteína Tir con EscP.
Debido a que no se obtuvo un resultado positivo al analizar la interacción de la
proteína EscP con Tir, usando a EscP como carnada, se decidió clonar el gen
codificante para la proteína Tir en el dominio de unión a DNA de GAL4 y analizar
si Tir funcionando como carnada interacciona con EscP. Para llevar a cabo dicho
experimento se cotransformaron los plásmidos pOGBKtir y pOGADo16, se
plaquearon las diluciones en medio SD –LT y SD –LTH obteniendo el siguiente
resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 23. Ensayo de interacción de Tir y EscP. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKtir y pOGADo16, y (d) pOGBKtir y pGADT7. Días de incubación: 10.
Tal como se puede observar en la figura 23, panel derecho, línea c, colonias de
levaduras que coexpresan las proteínas Tir y EscP crecen en medio SD –LTH, sin
embargo, también se observa crecimiento de colonias de levaduras que
coexpresan tanto la proteína Tir como el dominio de activación de GAL4, línea d.
Esto significa que la proteína BD-Tir puede autoactivar la expresión del gen
reportero HIS3; sin embargo, la interacción es más fuerte que la autoactivación lo
que sugiere que estas proteínas interaccionan.
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
63
8.2.12 Interacción de la proteína EscP con CesT.
Se llevó a cabo el análisis de interacción de la proteína EscP con la proteína CesT,
proteína chaperona de Tir. Este experimento se justifica bajo la premisa de que
probablemente la interacción proteica de EscP con Tir esté mediada por la
proteína CesT, tal como lo sugiere un resultado no publicado con las proteínas
ortólogas en Bordetella. Adicionalmente, la interacción entre las proteínas EscP y
CesT se obtuvo en el laboratorio a través de ensayos de copurificación tipo pull
down. Para corroborar este resultado se cotransformaron los plásmidos
pOGBKo16 y pMGADcT, se plaquearon las diluciones en medio SD –LT y SD –LTH
obteniendo el siguiente resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 24. Ensayo de interacción de EscP y CesT. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKo16 y pMGADcT, y (d) pOGBKo16 y pGADT7. Días de incubación: 9.
Tal como se muestra en la figura 24, panel derecho, línea c, no se observa
crecimiento de colonias de levaduras cotransformadas con las proteínas EscP y
CesT en medio SD –LTH. Esto significa que dichas proteínas no interaccionan en
este sentido de expresión como carnada y presa por el sistema de doble híbrido
en levadura utilizado.
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
64
8.2.13 Interacción de la proteína CesT con EscP*.
Debido a que no se obtuvo un resultado positivo al analizar la interacción de la
proteína EscP con CesT, usando a la proteína EscP como carnada, se decidió
clonar el gen codificante para la proteína CesT en el dominio de unión a DNA de
GAL4 y analizar si CesT funcionando como carnada interacciona con la proteína
EscP. Para llevar a cabo dicho experimento se cotransformaron los plásmidos
pOGBKcT y pOGADo16, se plaquearon las diluciones en medio SD –LT y SD –LTH
obteniendo el siguiente resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 25. Ensayo de interacción de CesT y EscP. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKcT y pOGADo16, y (d) pOGBKcT y pGADT7. Días de incubación: 10. Tal como se observa en la figura 25, panel derecho, línea c, colonias de
levaduras cotransformadas con las proteínas CesT y EscP crecen en medio SD –
LTH. Se puede observar que colonias de levaduras cotransformadas con dichas
proteínas crecen muy bien en las diluciones 1:2 y en mucho menor proporción en
las diluciones 1:10 y 1:100. Este resultado muestra que existe interacción entre
las proteínas CesT y EscP.
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
65
8.2.14 Interacción de la proteína Tir con CesT.
Las proteínas chaperonas son esenciales para la translocación de las proteínas
efectoras del SST3, y se requieren para la estabilización del sustrato, además de
inducir cambios conformacionales que resultan en la estabilización de oligómeros
y complejos proteicos (Cornelis G, 2006). Ahora bien, una vez demostrado que
CesT interacciona con EscP, se analizó por doble híbrido la interacción de Tir con
su proteína chaperona CesT. Para llevar a cabo dicho experimento se
cotransformaron los plásmidos pOGBKTir y pMGADcT, se plaquearon las
diluciones en medio SD –LT y SD –LTH obteniendo el siguiente resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 26. Ensayo de interacción de Tir y CesT. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKtir y pMGADcT, y (d) pOGBKtir y pGADT7. Días de incubación: 12.
Como se observa en la figura 26, panel derecho, línea c, colonias de levaduras
que coexpresan las proteínas Tir y CesT crecen en medio SD –LTH. Sin embargo,
también se observa crecimiento de colonias de levaduras que coexpresan tanto
la proteína Tir como el dominio de activación de GAL4. Un resultado similar de
autoactivación de BD-Tir se había ya observado previamente (ver interacción Tir
con EscP), sin embargo, la interacción Tir-CesT se realizó dado que en ocasiones
(como el caso de la interacción Tir-EscP) sí se logra diferenciar una interacción de
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
66
una autoactivación dado que en la autoactivación las colonias de levaduras
crecen mucho menos que la interacción, lo que no fue el caso en este
experimento.
8.2.15 Interacción de la proteína CesT con Tir.
Dado que no se obtuvo un resultado positivo al analizar la interacción de la
proteína Tir con CesT, usando a la proteína Tir como carnada, se decidió clonar el
gen codificante para CesT en el dominio de unión a DNA de GAL4 y analizar si
CesT funcionando como carnada interacciona con la proteína Tir. Para llevar a
cabo dicho experimento se cotransformaron los plásmidos pMGBKcT y pOGADtir,
se plaquearon las diluciones en medio SD –LT y SD –LTH obteniendo el siguiente
resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 27. Ensayo de interacción de CesT y Tir. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTHA. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pMGBKcT y pOGADtir, y (d) pMGBKcT y pGADT7. Días de incubación: 9.
Tal como se observa en la figura 27, panel derecho, línea c, colonias de
levaduras que coexpresan las proteínas CesT y Tir no crecen en medio SD –LTH.
Esto significa que dichas proteínas no interaccionan por doble híbrido, contrario a
lo que se esperaba, debido a que la chaperona CesT interacciona con la proteína
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
67
efectora Tir favoreciendo su estabilidad y secreción (Ramu T, et al., 2013). No se
pudo corroborar con el sistema de doble híbrido la interacción previamente
reportada y obtenida en el laboratorio con ensayos de copurificación tipo pull
down.
8.2.16 Interacción de la proteína EscP con EscF.
En diversos estudios y modelos biológicos se ha demostrado que proteínas
funcionalmente equivalentes a EscP regulan la longitud de la aguja, estructura
que en EPEC está formada por subunidades de la proteína EscF (Erhardt M, et al.,
2010; Moriya N, et al., 2006; Shen D, et al., 2012). Al ser la proteína EscP quien
funciona como regla molecular que regula la longitud de la aguja se espera que
ambas proteínas, EscP y EscF, interaccionen entre sí. Con base en esta hipótesis
se analizó dicha interacción, por lo que los plásmidos pOGBKo16 y pOGADeF se
cotransformaron en levadura, se plaquearon las diluciones en medio SD –LT y SD
–LTH obteniendo el siguiente resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 28. Ensayo de interacción de EscP y EscF. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKo16 y pOGADeF, y (d) pOGBKo16 y pGADT7. Días de incubación: 5.
Tal como se observa en la figura 28, panel derecho, línea c, colonias de
levaduras que coexpresan las proteínas EscP y EscF no crecen en medio SD –
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
68
LTH. Esto significa, contrario a lo que se esperaba, que dichas proteínas no
interaccionan por doble híbrido cuando la proteína EscP ejerce la función de
carnada.
8.2.17 Interacción de la proteína EscF con EscP*.
Debido a que no se obtuvo un resultado positivo al analizar la interacción de la
proteína EscP con EscF, usando a la proteína EscP como carnada, se decidió
clonar el gen codificante para EscF en el dominio de unión a DNA de GAL4 y
analizar si EscF funcionando como carnada interacciona con la proteína EscP.
Para llevar a cabo dicho experimento se cotransformaron los plásmidos pOGBKeF
y pOGADo16, se plaquearon las diluciones en medio SD –LT y SD –LTH
obteniendo el siguiente resultado:
1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:2 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
SD –LT SD –LTH
Fig. 29. Ensayo de interacción de EscF y EscP. Diluciones de cultivos de S. cerevisiae en medio SD –LT y SD –LTH. S. cerevisiae se cotransformó con (a) pGBKT7-53 y pGADT7-T, (b) pGBKT7-Lam y pGADT7-T, (c) pOGBKeF y pOGADo16, y (d) pOGBKeF y pGADT7. Días de incubación: 10.
Como se puede observar en la figura 29, panel derecho, línea c, colonias de
levaduras que coexpresan las proteínas EscF y EscP crecen en medio SD –LTH.
Por otro lado, también se observa en la ‘línea d’ del mismo panel la
autoactivación de EscF en conjunto con el dominio de activación de GAL4, sin
a
b
c
d
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
69
embargo, se logra ver una diferencia de crecimiento entre el control y la
interacción, por lo que la interacción EscF-EscP se considera como válida. Este
resultado muestra que subunidades de la regla molecular en EPEC interaccionan
con subunidades de la aguja, lo cual concuerda con la trascendencia funcional de
dicha interacción.
8.3 Actividad hemolítica de la mutante EPECΔescP*.
Teniendo como antecedente la interacción in vivo de EscP y EscUCC y proponiendo
que la proteína EscP forma parte del interruptor molecular 1 que regula la
secreción de proteínas translocadoras y efectoras en EPEC, se analizó por
espectrometría la actividad hemolítica de la mutante de EPEC, ΔescP, para
determinar si ésta forma filamento y poro de translocación, por tanto, puede lisar
eritrocitos. El resultado de dicho experimento fue el siguiente:
Fig. 30. Actividad hemolítica de la mutante EPEC ΔescP. Se analizó la capacidad de hemólisis de EPEC silvestre (WT) (considerada como 100%), ΔescP, ΔescP conteniendo el vector pTrc y ΔescP complementada con pTrc- escP. La mutante ΔescN se utilizó como control negativo. Se analizó la hemoglobina liberada al medio a DO450. Los ensayos se realizaron por triplicado.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
70
Tal como se observa en la figura 30, la proteína EscP no es indispensable en el
SST3 para la secreción de proteínas translocadoras que forman el filamento y el
poro de translocación puesto que aún en ausencia de dicha proteína se registra
actividad hemolítica por parte de la mutante de EPEC. Sin embargo, es claro que
EscP favorece la secreción y formación del filamento puesto que mejora
significativamente la actividad hemolítica de EPEC.
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_____________________________________________________________________
71
IX. DISCUSIÓN
El inyectisoma es una estructura de gran trascendencia para que se lleve a cabo
la infección del hospedero por parte de la bacteria patógena. Es por esto que los
SST3 deben tener mecanismos de regulación que resulten en la formación de
inyectisomas maduros y funcionales. Dichos mecanismos de regulación que
coordinan el ensamblaje de esta estructura con la secreción ordenada de
diferentes clases de sustratos se encuentran a diferentes niveles, desde la
regulación de la expresión de genes hasta niveles proteicos que implican cambios
conformacionales, interacciones proteicas, secreción de sustratos e interruptores
moleculares (Riordan KE, et al., 2008; Osborne SE, Coombes BK, 2011; Deane
JE, et al., 2010). Debido a que este mecanismo de virulencia está conservado en
muchos microorganismos patógenos, el inyectisoma es una estructura atractiva
para la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos (Dewoody RS, et al., 2013).
A nivel proteico existen dos interruptores moleculares importantes para el
cambio en la especificidad de secreción a través del SST3 de varias especies
bacterianas como Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri, Xanthomonas
campestris y EPEC, entre otras especies (Edqvist et al. 2003; Botteaux et al.
2010; Lorenz y Büttner, 2010). Se ha documentado que el primer interruptor
molecular regula la secreción entre sustratos tempranos a intermedios y tardíos y
que dicho interruptor está constituido por un componente del aparato de
exportación de la familia de proteínas YscU/FlhB/Spa40 y por una proteína
citoplásmica perteneciente a la familia de proteínas YscP/FliK/Spa32 que
funciona como regla molecular (Erhardt et al., 2010). Además, un análisis
bioinformático reveló que el gen escP es sinténico a genes encontrados en otros
loci bien caracterizados de bacterias patógenas de plantas y animales y al gen
fliK del SST3 flagelar. El análisis de la secuencia de aminoácidos mostró que
EscP de EPEC es 89% similar a su proteína ortóloga en C. rodentium, y en el
laboratorio –y resultados no publicados- se demostró que ambas proteínas tienen
la misma función y son capaces de llevar a cabo la complementación heteróloga
de las respectivas cepas mutantes (Monjarás FJ, et al., 2012). Este conjunto de
datos sugiere la existencia de un mecanismo de regulación común para bacterias
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
72
patógenas de plantas y animales importante durante los procesos de
patogénesis.
En el presente estudio se analizó la interacción in vivo de las proteínas EscU y
EscP. Inicialmente analizamos la interacción del segmento completo C-terminal
de EscU (EscUC) con EscP, ensayo del cual no fue posible obtener un resultado
positivo debido a las propiedades autoactivantes de EscUC; sin embargo, tampoco
se obtuvo el resultado esperado usando a EscP como carnada. Nosotros
pensamos que este ensayo de interacción, usando a EscP como carnada, no
funcionó probablemente debido a que EscUC se proteoliza, y aunque los dominios
EscUCN y EscUCC siguen interaccionando sería difícil pensar que ambos dominios
se translocaran y permanecieran juntos en el interior del núcleo y probablemente
sólo se haya translocado el dominio EscUCN fusionado a GAL4, por lo que
decidimos fusionar unicamente EscUCC a los dominios AD y BD de GAL4. Tal como
se demostró, la proteína EscP interacciona con la proteína EscU, específicamente
con EscUCC, es decir, sólo se requieren los últimos 83 residuos de aminoácidos de
la porción C-terminal de EscU para la interacción, se puede notar que dicha
interacción es fuerte y específica (fig. 18). Esta interacción entre EscUCC y EscP
indica que ambas proteínas forman un interruptor molecular en el inyectisoma de
EPEC y son parte de un mecanismo de regulación que controla el cambio en la
especificidad de secreción de sustratos. Dicho interruptor molecular también se
ha reportado en el sistema flagelar y en patógenos de plantas y animales por lo
que éste constituye un mecanismo de regulación ampliamente conservado
(Botteaux A, et al., 2008; Hirano T, et al., 1994; Lorenz C y Büttner D, 2011).
Ahora bien, la interacción entre las proteínas EscUCC y EscP sólo fue posible
determinarla usando a la proteína EscUCC como carnada; en ningún caso fue
posible observar dicha interacción usando a EscP fusionada al dominio de unión
a DNA de GAL4; ni para esta interacción, ni para ninguna otra llevada a cabo en
este estudio, probablemente debido a que se alteró la conformación de la
proteína EscP o del dominio de unión a DNA en la proteína de fusión. En
ocasiones suele suceder que la fusión de una proteína puede cambiar la
conformación estérica apropiada de la ‘carnada’ o de la ‘presa’,
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
73
consecuentemente, alterar su funcionalidad (Van Criekinge W y Beyaert R, 1999).
Esta conformación alterada puede resultar en una actividad limitada o en una
total inaccesibilidad de los sitios de unión a DNA, de la maquinaria de
transcripción o de la interacción proteica, según sea el caso (Van Criekinge W y
Beyaert R, 1999). Es importante recalcar que las proteínas bacterianas utilizadas
en este estudio deben mantener una conformación adecuada en la levadura y ser
además capaces de translocarse al núcleo. Una de las desventajas del sistema
del doble híbrido utilizado es que éste hace uso de la levadura S. cerevisiae como
hospedero. Esto implica, sin lugar a dudas, que las proteínas de interés,
principalmente de otros organismos, pueden no existir en una conformación
estable dentro de la levadura y/o no translocarse al núcleo (Van Criekinge W y
Beyaert R, 1999).
Antes de realizar cualquier ensayo de interacción se probó el sistema del doble
híbrido estandarizado en nuestro laboratorio analizando una interacción ya
reportada, la de las proteínas SepL y SepD (Creasey EA, et al., 2003; Deng W, et
al., 2005; O’Connell CB, et al., 2004). Sin embargo, no fue posible reproducir
dicha interacción usando a ambas proteínas como carnada o presa. Nosotros
asociamos esta inconsistencia entre nuestros resultados y los ya publicados
(Creasey EA, et al., 2003) a diferencias metodológicas en el sistema del doble
híbrido utilizado en este trabajo. Numerosos factores contribuyen al resultado
obtenido a través de un ensayo de doble híbrido, muchos de los cuales parecen
ser independientes de las propias proteínas analizadas. Entre los factores que
influencian la variación en los resultados están el sitio de fusión (N- ó C-terminal)
de las proteínas de interés a los dominios AD y/o BD de GAL4, variación de las
condiciones experimentales y el sistema de doble híbrido utilizado, en diferentes
cepas de levadura, por mencionar algunos ejemplos (Caufield JH, et al., 2012). En
la gran mayoría de sistemas de doble híbrido se usan proteínas fusionadas al
extremo N-terminal de GAL4; recientes estudios en los que se han fusionado las
mismas proteínas pero en el C-terminal del mismo factor de transcripción han
arrojado resultados diferentes. Por ejemplo, en ensayos de interacción de
proteínas del virus Varicella Zoster se hizo un reanálisis comparativo fusionando
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
74
las proteínas de interés tanto en el C- como en el N-terminal de los dominios AD y
BD (Caufield JH, et al., 2012). Un mayor número de interacciones fueron
reconfirmadas en proteínas fusionadas en el extremo N-terminal en AD y BD
(59%) en comparación a las proteínas fusionadas en el C-terminal (46%) (Braun
P, et al., 2009; Caufield JH, et al., 2012; Chen YC, et al., 2010). Por otro lado, es
bien conocido que diferentes sistemas de doble híbrido arrojan diferentes
resultados aún analizando la interacción de las mismas proteínas. Se han hecho
análisis de interacción basados en GAL4 cuyos resultados no coinciden al usar el
sistema LexA (Fromont-Racine M, et al., 2000). Otro ejemplo, es el recientemente
obtenido en nuestro laboratorio en el que se reconfirmó la interacción de SepL
con SepD usando las cepas de levadura PJ69-4a y PJ69-4alpha (dato no
publicado) mismo que difiere al usar la cepa AH109 a pesar de que ambos
sistemas se basan en la reconstitución de GAL4. Con base en lo ya descrito
podemos notar que el sistema del doble híbrido es una técnica muy importante
más no 100% confiable por lo que es necesario hacer uso de otras técnicas,
como la coinmunoprecipitación y/o pull down, para confirmar los resultados
obtenidos.
Otro factor que limita la obtención de resultados confiables mediante ensayos
de interacción por doble híbrido es la propiedad autoactivante (falsos positivos)
de algunas proteínas. En este trabajo nosotros encontramos que cuatro
proteínas, cada una fusionada al BD de GAL4, presentan esta propiedad, tal es el
caso de SepL, Tir, EscF y EscUC. En un trabajo previo en el cual analizaron
interacciones por doble híbrido de proteínas codificadas en el LEE de EPEC se
reportó la propiedad autoactivante de SepL, Tir y EscF, siendo SepL la que
presenta mayor magnitud autoactivante (Creasey EA, et al., 2003). De acuerdo
con este reporte previo nosotros encontramos que SepL, y sorpresivamente
también EscUC, no son buenas carnadas debido a que su propiedad
autoactivante es de tal magnitud que no es posible distinguir entre una
interacción real y un falso positivo. Por otro lado, Tir y EscF también presentan
actividad autoactivante, sin embargo, debido a que ésta es menor respecto a la
interacción es posible diferenciar y, por tanto, validar principalmente la
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interacción de EscF con EscP. Según lo reportado, algunos factores, como la
secuencia primaria, determinan la magnitud autoactivante presente en ciertas
proteínas (Zhu J y Kahn R, 1997). Además, las distintas modificaciones
postraduccionales (fosforilación, glicosilación, etc.) son otra de las causas que
pueden generar falsos positivos; este tipo de modificaciones, que en muchos
casos son necesarias para que se lleven a cabo interacciones en estado
fisiológico, pueden ocurrir de manera inadecuada dentro de la levadura
confiriéndole actividad autoactivante a las proteínas (Van Criekinge W y Beyaert
R, 1999). También, se ha documentado que otras causas de la autoactivación de
diversas proteínas son el rearreglo y deleción de fragmentos en plásmidos
codificantes del dominio de unión a DNA, eventos de recombinación entre los
plásmidos codificantes del dominio de unión a DNA y el dominio de activación o
rearreglos genómicos de la cepa hospedero. Otros tipos de falsos positivos
pueden generarse debido a la activación no específica de diferentes sistemas
reporteros, lo cual es causado por proteínas fusionadas al dominio de unión a
DNA que conllevan la activación de diversos activadores de la transcripción (To A
et al., 2011). Aún así, el sistema del doble híbrido es un filtro de selección
realmente útil que ha permitido descubrir importantes interacciones que han
podido ser confirmadas posteriormente por técnicas como la
coinmunoprecipitación, ensayos de copurificación, entre otras (Van Criekinge W y
Beyaert R, 1999; To A, et al., 2011).
Debido a que el sistema del doble híbrido está basado en la reconstitución de
un factor de transcripción, la capacidad de controlar la autoactivación es crucial
para garantizar la confiabilidad de esta técnica. El inicio de la transcripción, dada
alguna actividad autoactivante, está presente en aproximadamente 5% de todas
las proteínas e incluso es mayor en fragmentos generados azarosamente, como
en las bibliotecas de DNA (Van Criekinge W y Beyaert R, 1999). Ahora bien, una
posible solución al fenómeno autoactivante cuando éste es débil (por ejemplo
ante un pequeño fondo en HIS3) es la de incorporar 3-AT (3–amino-1,2,4-triazol)
en el medio sintético. El 3-AT es un inhibidor competitivo del producto del gen
HIS3, la imidazolglicerol-fosfato deshidratasa, enzima que cataliza la producción
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de histidina. Mediante la aplicación de 3-AT a un cultivo de células de levadura
que contiene el gen HIS3, se requiere un mayor nivel de expresión de HIS3 para
que la levadura pueda sobrevivir. Esto ha demostrado ser útil en diversos
sistemas de doble híbrido, donde la interacción entre dos proteínas de alta
afinidad permitirá la sobrevivencia de colonias de levaduras en medios que
contienen altas concentraciones de 3-AT. Crecientes niveles de 3-AT elevan la
cantidad mínima de expresión de HIS3 necesaria para que las colonias de
levadura sobrevivan. A concentraciones de 10 mM de 3-AT, por citar un ejemplo,
sólo las interacciones proteicas más fuertes serán visibles que aquellas
cultivadas a 3 mM (Caufield JH, et al., 2012). La concentración óptima de 3-AT
para cada carnada debe ser determinada de forma independiente. Hay estudios
que reportan concentraciones que van desde 0 hasta 10 mM de 3-AT, al parecer,
la determinación cuidadosa de la concentración de éste es crucial para controlar
los falsos positivos en ensayos de doble híbrido (Caufield JH, et al., 2012; Chen
YC, et al., 2010). Recientemente, se han publicado algunos trabajos en los cuales
se ha logrado reducir el efecto autoactivante de ciertas proteínas usando 3-AT.
Por ejemplo, en un trabajo reciente identificaron alrededor de 70 interacciones
verdaderas y 20 falsos positivos (autoactivantes) en condiciones de baja
astringencia. Pues bien, al incorporar 10 mM de 3-AT se obtuvieron 57
interacciones sin falsos positivos (Chen YC, et al., 2010). Otra solución es deletar
una pequeña región de la proteína que activa la transcripción; removiendo esta
función autoactivante, mientras se retienen otras propiedades de la proteína.
Alternativamente, en vez de fusionar la proteína de interés al dominio de unión a
DNA de GAL4, se puede tratar con una fusión en el dominio de activación, tal cual
se hizo en este trabajo, aunque las probabilidades de que funcione son
reducidas. En 2011 se publicó un estudio en el cual se reporta que de 79
interacciones identificadas por doble híbrido sólo 11 de ellas fueron confirmadas
en ambas orientaciones (To A, et al., 2011). Otro estudio revela que de más de
50 interacciones identificadas solamente una de ellas fue reproducible en ambas
orientaciones (Caufield JH, et al., 2012).
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77
Continuando con los ensayos de interacción, en el presente estudio no se
encontraron interacciones proteicas entre componentes del interruptor 1 y 2. En
ningún caso se demostró interacción entre la proteína EscP, componente del
primer interruptor molecular, y las proteínas SepD o SepL, componentes del
segundo interruptor. Cabe mencionar que la proteína SepD interacciona por doble
híbrido con la proteína Orf12 (componente del segundo interruptor molecular,
recientemente identificado) mediante la eliminación de los últimos 10
aminoácidos de Orf12 se elimina dicha interacción (datos no publicados). Por
tanto, en cuanto a la interacción entre los interruptores moleculares faltaría
analizar la interacción entre EscP y Orf12.
Por otro lado, resultados obtenidos en el laboratorio con mutantes de EPEC en
el gen escP sugerían la interacción de las proteínas Tir y EscP. A pesar de las
propiedades autoactivantes de Tir, el resultado preliminar sugiere la interacción
entre estas proteínas. Debido a esto, se analizó alternativamente si dicha
interacción podría de alguna manera estar mediada por la proteína CesT, proteína
chaperona de Tir. Los resultados preliminares muestran la interacción de CesT
con EscP por lo que este resultado sugiere que EscP podría estar interactuando
con Tir y CesT, interacciones que podrían funcionar para evitar la secreción a
destiempo de proteínas efectoras, favoreciendo así la secreción de proteínas
translocadoras (Monjarás FJ, et al., 2012). Además, se prosiguió el presente
estudio analizando la interacción de las proteínas Tir-CesT, esperando obtener un
resultado positivo. Sin embargo, el efecto autoactivante de Tir fue de tal magnitud
que no es posible apreciar dicha interacción, misma que tampoco fue posible
obtener usando a CesT como carnada en ensayos posteriores.
En el sistema flagelar se ha demostrado que la interacción de la proteína FliK
con la proteína FlgE, que polimeriza y forma el gancho flagelar, es requerida para
un eficiente cambio de especificidad en la exportación de proteínas, sugiriendo
un modelo en el cual FliK mide la longitud del gancho durante la biogénesis de
esta estructura y junto con FlhB, determina el cambio de especificidad en la
secreción (Minamino T, et al., 2009). De acuerdo con estos antecedentes se hizo
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un ensayo de interacción de las proteínas EscP y EscF, proteínas equivalentes a
FliK y FlgE del flagelo. El resultado preliminar muestra que ambas proteínas
interaccionan, lo cual se visualiza a pesar del efecto autoactivante de la proteína
EscF. Este resultado apoya la hipótesis de que en EPEC se lleva a cabo un
mecanismo similar que permite que EscP sea secretado para detectar el progreso
en el ensamblaje de la aguja hasta que ésta alcanza su longitud predeterminada
y se da el cambio de especificidad con la interacción EscP-EscU.
Sobre la función de la proteína EscP los ensayos de lisis de eritrocitos muestran
que aún en ausencia de la proteína EscP sigue habiendo formación de filamento
y poro de translocación, necesarios para lisar los eritrocitos. Este resultado
sugiere que el interruptor molecular formado por EscU-EscP, que regula el cambio
en la especificidad de secreción de sustratos tempranos a intermedios y tardíos,
puede funcionar incluso en ausencia de la proteína EscP, es decir no se trata de
una proteína completamente indispensable para que ocurra el switch; sin
embargo, EscP incrementa de forma notable la eficiencia del interruptor. Además,
la reducida actividad hemolítica en la cepa ΔescP sugiere que un menor número
de inyectisomas son completamente ensamblados, lo cual indica que EscP se
requiere para la completa biogénesis del SST3 (Monjarás FJ, et al., 2012).
Finalmente, en el laboratorio se ha sugerido un modelo de la función de EscP.
Después del ensamblaje de los anillos de la membrana interna y externa y del
aparato de exportación, los sustratos tempranos EscI, EscF y EscP son
reconocidos y secretados. EscP interacciona con EscI y EscF regulando su
secreción. EscUC sufre una autoproteólisis, y los dos subdominios (EscUCC y
EscUCN) permanecen estrechamente asociados uno con otro. La autoproteólisis
de EscUC crea una conformación apropiada esencial para la interacción con otros
componentes del SST3. Además, este evento proteolítico podría disminuir la
secreción de sustratos tempranos, como se ha sugerido en el SST3 flagelar. El
ensamblaje del eje interno permite el anclaje correcto y ensamblaje de la aguja, y
EscP es ocasionalmente secretado mientras que mide la longitud de la aguja.
Cuando la longitud de la aguja está dentro de un cierto rango de su longitud
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preestablecida, todos los subdominios interactuantes de EscP son capaces de
hacer contacto con el canal interno de la aguja, causando un bloqueo que resulta
en una pausa en el proceso de secreción, el cual es necesario para permitir una
interacción productiva entre EscUCC y EscP. Esta interacción promueve un cambio
conformacional en EscUCC que ‘dispara’ el interruptor molecular para permitir el
reconocimiento y secreción de proteínas translocadoras. Mientras el filamento
EspA está siendo ensamblado, EscP unido a CesT-Tir, junto con el complejo SepL-
SepD, evitan la secreción de efectores hasta que el poro de translocación se ha
formado en la membrana de la célula hospedero. Se ha reportado que la
interacción SepL-Tir es crítica en restringir la secreción de proteínas efectoras en
general, debido a que Tir es requerido para la secreción de otros efectores (Wang
D, et al., 2008). Se sugiere por tanto que EscP podría tener un efecto similar vía
su interacción con el complejo chaperona-efector CesT-Tir. Finalmente, después
de que el poro de translocación se ha formado, el complejo SepD-SepL es
alterado, probablemente detectando un cambio en la concentración de calcio y
otras señales ambientales, controlando el interruptor que media la secreción de
translocadoras a efectores (Monjarás FJ, et al., 2012).
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X. CONCLUSIONES
De los resultados del presente trabajo se derivan las siguientes conclusiones:
▪ La proteína EscP interacciona con EscU, siendo el subdominio EscUCC la región
de interacción de ésta. Dicha interacción es fuerte y específica.
▪ La chaperona CesT interacciona con EscP.
▪ La proteína de la aguja EscF interacciona con EscP.
▪ Los resultados de doble híbrido sugieren que el efector Tir interacciona con
EscP.
▪ La proteína EscP es indispensable para la correcta biogénesis del inyectisoma y,
por lo tanto, para la síntesis de un número adecuado de inyectisomas por célula.
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XI. PERSPECTIVAS
Se propone realizar ensayos de interacción por doble híbrido con otros sistemas
comerciales para levadura entre las proteínas SepD-EscP, SepL-EscP y CesT-Tir
para corroborar los resultados presentados en este trabajo debido a que, al
parecer, el sistema del doble híbrido utilizado afecta la interacción de algunos
pares de proteínas, tal es el caso de SepD-SepL.
Debido a que en el presente trabajo no fue posible determinar la interacción
entre componentes de los dos interruptores moleculares de EPEC se sugiere
analizar la interacción de EscP con Orf12, ya que en nuestro laboratorio se ha
demostrado que SepD interacciona por doble híbrido con la proteína Orf12,
componente del segundo interruptor molecular recientemente identificado.
Con el fin de reducir y, en el mejor de los casos, resolver el problema de la
autoactivación de algunas proteínas fusionadas al dominio de unión a DNA de
GAL4 se propone emplear algunas estrategias como el uso de 3-AT (3-amino-
1,2,4-triazol), o la deleción de algunas regiones de las proteínas de interés que
pudieran estar activando la transcripción.
Para evitar los problemas relacionados con la inestabilidad conformacional y
con la translocación nuclear de las proteínas de interés, se propone realizar
ensayos de interacción de proteínas de EPEC en sistemas bacterianos, tales
como el basado en la reconstitución de la adenilato ciclasa en Escherichia coli.
Esto permitirá estudiar dichas interacciones en su contexto nativo favoreciendo
su correcto plegamiento, y al llevarse a cabo las interacciones en el citoplasma
bacteriano se resuelve el problema de la translocación nuclear de los complejos
de proteínas de los sistemas en levadura.
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82
XII. ANEXOS
Antibióticos.
▪ Ampicilina [50 mg/ml]. Disolver en agua y filtrar.
▪ Estreptomicina [10 mg/ml]. Disolver en agua y filtrar.
▪ Kanamicina [20 mg/ml]. Disolver en agua y filtrar.
▪ Tetraciclina [5 mg/ml]. Disolver en etanol.
Medios de cultivo.
▪ Luria Bertani (LB):
- 5 g de extracto de levadura
- 5 g de cloruro de sodio (NaCl)
- 10 g de bactotriptona
- 10 ml de solución timina-tiamina
- 15 g de bactoagar si es medió sólido
- Aforar a 1 litro y esterilizar en autoclave
▪ Eagle modificado por Dulbecco (DMEM):
- Disolver un sobre de DMEM (Gibco) en 800 ml de agua desionizada
- NaHCO3 44 mM
- HEPES 0.1 M
- Ajustar pH a 7.1
- Agregar 100 μl de solución de piridoxal a 40 mg/ml
- Aforar a 1 litro
- Filtrar con membrana de 0.22 μm
▪ Super Optimal Broth (SOB)
- Triptona 2%
- Extracto de levadura 0.5%
- NaCl 10 mM
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- KCl 2.5 mM
- MgCl2 10 mM
- MgSO4 10 mM
- Ajustar pH a 7.4
- Esterilizar en autoclave
▪ Super Optimal Broth with Catabolite repression (SOC)
- Medio SOB + Glucosa [20 mM]
▪ Synthetic Defined (SD):
- 6.7 g de Yeast nitrogen base without aminoacids
- 0.6 g de Dropout supplement (-Leu –Trp ó –Leu –Trp –His –Ade)
- 15 g de agar si es medio sólido
- 800 ml de agua desionizada
- 100 ml de solución de aminoácidos al 10X [L-Adenina 200 mg/ml]
- Ajustar pH a 5.8
- Aforar a 950 ml con agua desionizada y esterilizar en autoclave
- Agregar glucosa a una concentración final del 2% (50 ml de una solución
estéril al 40%)
▪ Yeast Peptone Dextrose Adenine (YPDA):
- 20 g de peptona
- 10 g de extracto de levadura
- 15 ml de adenina hemisulfatada al 0.2%
- 15 g de bactoagar si es medio sólido
- Disolver en 950 ml de agua desionizada.
- Ajustar pH a 6.5
- Esterilizar en autoclave. Agregar glucosa a una concentración final del 2%
(50 ml de una solución estéril al 40%)
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Soluciones.
▪ Acetato de litio [LiAc 1 M]
- Disolver 6.6 g de LiAc en 100 ml de agua desionizada.
- Esterilizar en autoclave
▪ Amortiguador salino de fosfatos (PBS):
- NaCl 137 mM
- KCl 2.7 mM
- Na2HPO4 10 mM
- KH2PO4 2 mM
- Ajustar pH a 7.4
- Esterilizar en autoclave o por filtración.
▪ Amortiguador TAE 1X:
- Tris 40 mM
- Ácido acético glacial al 1.2%
- EDTA 1 mM, pH 8
▪ Azul de Coomassie [0.2%]:
- Disolver 600 mg de Coomassie Brillant Blue R-250 en 150 ml de metanol
[50%], 30 ml de ácido acético [10%] y 120 ml de agua desionizada [40%].
- Se debe disolver el colorante en el metanol antes de agregar agua y al final
el ácido acético.
▪ Bromuro de Etidio:
- Preparar el stock a 10 mg/ml y disolverlo a una concentración final de 0.001
mg/ml en amortiguador TAE 1X.
▪ Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG):
- Disolver 476 mg de IPTG en 20 ml de agua desionizada.
- Esterilizar por filtrado.
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▪ Polietilenglicol (PEG) 3500 50% w/v:
- Disolver 5 g de PEG 3500 en 10 ml de agua desionizada.
- Esterilizar en autoclave.
▪ Solución para desteñir geles:
- Metanol 20%
- Ácido acético 10%
▪ Solución para secar geles:
- Metanol 10%
- Glicerol 4%
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XIII. BIBLIOGRAFÍA
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