TESIS-Caracterización de los Linfocitos T CD4 específicos ...

CARACTERIZACIÓN DE LOS LINFOCITOS T CD4 ESPECÍFICOS DE ROTAVIRUS

MIGUEL HERNANDO PARRA AVILA

TESIS

Presentada como requisito parcial para optar al título de

Doctor en Ciencias Biológicas.

Directores

Juana Ángel Manuel Antonio Franco

Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias

Programa de doctorado en Ciencias Biológicas Bogotá, D.C.

Colombia Julio de 2014.

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NOTA DE ADEVERTENCIA “La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velara porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. Articulo 23 de la resolución No. 13 de Julio de 1946.

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CARACTERIZACIÓN DE LOS LINFOCITOS T CD4 ESPECÍFICOS

DE ROTAVIRUS


APROBADO ___________________________ _____________________________ Juana Ángel, MD. PhD Manuel Antonio Franco, MD. PhD

Directora Director

___________________________ _____________________________ Fernando Esquivel G, Biol. PhD Beatriz Parra Patiño, Bact, PhD

Jurado Jurado

___________________________ _____________________________ Nelly Stella Roa, Odont. PhD Jairo Antonio Rodríguez, MD, PhD

Jurado Jurado

_____________________________

Paula Andrea Velilla H. Bact. PhD Jurado

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CARACTERIZACIÓN DE LOS LINFOCITOS T CD4 ESPECÍFICOS DE ROTAVIRUS


___________________________ _____________________________ Concepción Puerta B. Bact. PhD Manuel Antonio Franco, MD. PhD

Decana Académica Director de Posgrados Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias

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TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................................. 10 MARCO TEÓRICO .......................................................................................................................................... 16 Rotavirus ...................................................................................................................................................... 16 Estructura del virus ............................................................................................................................ 16 Clasificación de los rotavirus .......................................................................................................... 17 Replicación de los rotavirus ............................................................................................................ 18 Epidemiología de la infección por rotavirus ............................................................................ 21 Las vacunas contra rotavirus ......................................................................................................... 22

Poblaciones de los linfocitos T ............................................................................................................ 25 Tejido linfoide asociado al tracto gastrointestinal (GALT, por sus siglas en inglés) ... 26 El tráfico de las células T hacia el intestino .................................................................................. 27 Respuesta inmune al rotavirus ........................................................................................................... 30 Inmunidad Innata contra la infección por rotavirus ............................................................ 35

Métodos para estudiar linfocitos T ................................................................................................... 37 Los tetrámeros ...................................................................................................................................... 37 Los tetrámeros de clase II. ............................................................................................................... 38 Uso de tetrámeros de clase II en la identificación de células T específicas de antígeno en enfermedades infecciosas ...................................................................................... 39

OBJETIVOS ....................................................................................................................................................... 40 Objetivo general ........................................................................................................................................ 40 Objetivos específicos ............................................................................................................................... 40

Artículos ............................................................................................................................................................ 41 Artículo número 1 .................................................................................................................................... 41 Introducción .......................................................................................................................................... 41 Materiales y Métodos ......................................................................................................................... 41 Resultados .............................................................................................................................................. 42 Conclusiones .......................................................................................................................................... 43 Limitaciones ........................................................................................................................................... 43 Texto del artículo 1 ............................................................................................................................. 44 Figuras y tablas adicionales del artículo 1 ................................................................................ 58 Ensayos no incluidos en el artículo número 1 ........................................................................ 62 Coloración para identificar los perfiles de regulación en CMSP ................................ 62 Estimulación y fenotipificación de las células CD4 extraídas de muestras de intestino humano ............................................................................................................................ 69

Artículo número 2 .................................................................................................................................... 78 Introducción .......................................................................................................................................... 78 Materiales y Métodos ......................................................................................................................... 79 Resultados .............................................................................................................................................. 79 Conclusiones .......................................................................................................................................... 79 Limitaciones ........................................................................................................................................... 80 Texto del artículo 2 ............................................................................................................................. 81

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Figura adicional del artículo 2 .................................................................................................... 133 Discusión General ...................................................................................................................................... 134 Perspectivas ................................................................................................................................................. 145 Anexos ............................................................................................................................................................. 146

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RESUMEN

En la infección por rotavirus los linfocitos T CD4 son importantes porque estimulan a los LB a que produzcan anticuerpos IgA protectores. El objetivo principal del estudio fue caracterizar los linfocitos T CD4 humanos específicos de rotavirus. Por métodos bioinformáticos se seleccionaron 39 péptidos de rotavirus predichos de ser presentados por moléculas DRB1*0101. Se evaluó la producción de citocinas de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de adultos sanos genotipificados para el HLA estimuladas con los péptidos organizados en grupos. Se realizó la deconvolución de los grupos positivos para identificar los péptidos individuales. Los péptidos seleccionados fueron acoplados con moléculas solubles de HLA DRB1*0101 para formar tetrámeros. CMSP de adultos y niños DR1 fueron teñidas con los tetrámeros, y anticuerpos contra marcadores de migración y diferenciación. Además, se aislaron CMSP, y células mononucleares de intestino humano de adultos para evaluar la producción de citocinas por los linfocitos T, generar líneas de linfocitos T y teñir con los tetrámeros a los linfocitos T. Tres de los péptidos identificados por bioinformática fueron reconocidos por los linfocitos T de adultos en contexto de moléculas DRB1*0101. Dichos péptidos hacen parte de tres proteínas del virus, dos estructurales y una no estructural. Las líneas de linfocitos T generadas a partir de estos voluntarios mostraron ser específicas al re-estimularlas con los péptidos específicos. Se observó que en CMSP de adultos sanos y niños vacunados, las células específicas de rotavirus están enriquecidas en células de memoria y que éstas expresan marcadores de migración intestinal. Al comparar la producción de citocinas de CMSP estimuladas con rotavirus, tétanos o virus de la influenza se observó que la respuesta de las células T CD4 contra rotavirus está enriquecida en células productoras de sólo IFN-γ, mientras que las de tétanos e influenza están enriquecidas en células multifuncionales.

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ABSTRACT

In rotavirus infection, T CD4 lymphocytes are important because they stimulate B-lymphocytes to produce protective IgA antibodies. The principal aim of this work was to characterize human rotavirus specific T CD4 cells. Using bioinformatics, 39 rotavirus peptides predicted to be restricted by HLA DRB1*0101 were selected. Cytokine production by PBMC obtained from healthy adults, previously HLA genotyped, were evaluated after stimulation with pools of peptides. To identify individual rotavirus specific peptides, pools were deconvoluted. Selected peptides were assembled with soluble HLA DRB1*0101 molecules to form tetramers. PBMC obtained from DR1 healthy adults and children were stained with tetramers, and antibodies against migration and differentiation markers. Moreover, PBMC and human intestinal mononuclear cells from adults were isolated to evaluate cytokine production by T cells, produce T cell lines and stain the T cells with the tetramers. Three of the peptides identified by bioinformatics, were recognized by CD4 T cells in the context of DRB1*0101. The peptides are derived from two structural and one non-structural rotavirus proteins. Cell lines generated after stimulation with these peptides specifically responded after re-stimulation with the specific peptides. Results also showed that rotavirus specific T cells were enriched in antigen-experienced cells that expressed intestinal migration markers. Comparison of cytokine production by rotavirus specific T cells with those specific for influenza and tetanus toxoid showed that rotavirus specific T cells are enriched in cells producing only IFN-γ, whereas tetanus toxoid and influenza specific cells are enriched in multifunctional cells.

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LISTA DE ABREVIATURAS

ARN. Ácido ribonucleico. VLPs. Partículas virales vacías. DNA. Ácido desoxiribonucleico. LT. Linfocitos T. CMSP. Células mononucleares de sangre periférica. GALT. Tejido linfoide asociado al tracto gastrointestinal. CMV. Citomegalovirus. ICS. Tinción intracelular de citocinas. TCM. Células T de memoria central. TEM. Células T de memoria efectora. TTE. Células T de memoria efectora terminal. DLPs. Partículas virales de doble capa. TLPs. Partículas virales de triple capa. HA. Hemaglutinina. RER. Retículo endoplasmático rugoso. VIH. Virus de inmunodeficiencia humana. TRM. Células T residentes en los tejidos. PP. Placas de Peyer. ILF. Folículo linfoide aislado. NLM. Nódulo linfático mesentérico. CD. Células dendríticas. TREG. Células T reguladoras. VEA. Vénulas endoteliales altas. MHC. Complejo mayor de histocompatibilidad. TCR. Receptor de las células T. Dpi. Días post-infección. EBV. Virus Epstein Barr. ISGs. Genes estimulados por interferón. PCR. Reacción en cadena de la polimerasa. TRF. Receptor de transferrina. CMIH. Células mononucleares intestinales humanas. GE. Gastroenteritis. VHC. Virus de hepatitis C. SEB. Enterotoxina estafilococcica B. DTT. Ditiotreitol. HBSS. Solución salina balaceada de Hanks

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INTRODUCCIÓN Rotavirus es un virus perteneciente a la familia Reoviridae, cuyo genoma está constituido por 11 segmentos de ARN de doble cadena que sintetizan 12 proteínas, de las cuales 6 son proteínas estructurales y 6 no estructurales 1. Antes de la introducción de las vacunas en el 2008, la diarrea causada por rotavirus era la principal causa de hospitalizaciones en el mundo en niños menores de 5 años 2, 3. Además, de acuerdo con un estudio retrospectivo en el que se evaluaron 72 publicaciones realizadas en diferentes países, se determinó que la infección por este virus está asociada con una alta mortalidad en niños menores de 5 años; se estimó entonces que la infección por rotavirus cobraba la vida de cerca de 527.000 (475.000-580.000) niños anualmente, esto se traduce en aproximadamente 1.440 muertes por rotavirus diariamente 2, 3. Un estudio más reciente mostró que para el año 2008 la mortalidad mundial se estimó en 453.000 muertes mundialmente (95% IC 420.000-494.000) en niños menores de 5 años, datos que corresponden con el 37% de las muertes debidas a diarrea y 5% de las muertes totales en niños menores de 5 años 4. Antes de la inclusión de las vacunas, en Colombia se estimó que el número de visitas a urgencias y muertes relacionadas con infecciones por rotavirus en niños menores de 2 años era de 105.378 y 470, respectivamente 5. La infección por rotavirus se encuentra distribuida en todo el mundo y los datos recolectados indican que las tasas de infección son similares en los países desarrollados y en vías de desarrollo. Sin embargo, la mortalidad es diferente; India concentra la mayor cantidad de muertes relacionadas con la infección por rotavirus con cerca de un 25% de todos los casos a nivel mundial; seis países (China, Nigeria, Pakistán, Congo, Etiopia e India) suman más del 50% de los casos fatales a nivel mundial 2. El desarrollo de vacunas contra este patógeno es una necesidad teniendo en cuenta los datos epidemiológicos. En 1998 la FDA aprobó para su uso la vacuna Rotashield®, un año después la vacunación fue suspendida debido a un elevado número de casos de invaginación intestinal relacionados con el uso de la vacuna 6. Actualmente hay dos vacunas en el mercado que tiene la aprobación de Organización Mundial de la Salud (OMS) 7: Rotarix®® (GlaxoSmithKline Biologicals) y RotaTeq® (Merk and Co. Inc.). Sin embargo, los estudios post-licencia de las dos vacunas, que se han realizado en diferentes países, han mostrado que en países con bajos niveles socioeconómicos (África Subsahariana y Asia) las dos vacunas son menos eficaces 8, 9, en comparación con los informes obtenidos de la vacunación realizada en países europeos o latinoamericanos 2. Las razones que llevan a ese comportamiento de las vacunas en los países de bajo índice socioeconómico aún no se conocen. Teniendo en cuenta la experiencia con otras vacunas orales, como la de polio, que también ha mostrado esta tendencia, se puede sospechar que esa disminución en la protección luego de la vacunación

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contra rotavirus puede deberse a que: la infección en países de África Subsahariana y Asia ocurre durante todo el año y no es estacional como sucede en países desarrollados; a una alta dosis de infección e incluso a una coinfección con varias cepas virales; la circulación de cepas poco comunes que escapan a la protección ofrecida por las vacunas; además, la flora intestinal y la presencia de parásitos intestinales en los niños vacunados pueden también ejercer un papel negativo en la efectividad de la vacuna 10. Debido a estos factores y al alto costo de las vacunas para los países con menores ingresos per cápita, se ha hecho necesario el desarrollo de nuevas vacunas contra rotavirus 11, 12 o implementar otro tipo de estrategias, como el uso de virus inactivados, partículas virales vacías (VLPs), vacunas de DNA o subunidades de VP6, las cuales se encuentran actualmente en estudios en animales 10. Sin embargo, el uso de estrategias diferentes a las vacunas vivas-orales o el mejoramiento de las vacunas actuales implica tener un amplio conocimiento de la patogénesis y la respuesta inmunológica frente al virus. Los rotavirus se replican preferencialmente en las células absortivas del intestino delgado, por lo que la inmunidad mucosa local es esencial en el desarrollo de la inmunidad contra el rotavirus 10. Sin embargo, este virus induce una respuesta inmune intestinal y sistémica, esta última relacionada con la antigenemia que ha sido detectada en infecciones agudas de animales y niños 13, 14. Tanto en humanos como animales se ha observado que la IgA intestinal específica de rotavirus es esencial en la respuesta inmune contra rotavirus 15. La IgA es importante para al aclaramiento viral y la protección contra la infección por rotavirus 15. Actualmente, la medición de IgA sérica específica de rotavirus poco después de una infección natural o de la vacunación es el mejor correlato de protección contra la gastroenteritis por rotavirus en humanos 16. La respuesta de células T específicas de rotavirus no ha sido caracterizada a profundidad, no obstante, en los modelos de ratones se ha observado que la respuesta de los linfocitos T CD4 es importante para la generación de la IgA protectora y la de los LT CD8 tiene un rol importante en el aclaramiento viral 17. En ratones, se ha observado que la respuesta de los LT CD4 es importante para la generación de cerca del 90% de la IgA protectora 18, sin embargo, estos hallazgos no se han podido comprobar en humanos 19. A pesar de esto, estudios realizados en niños con inmunodeficiencias severas de células T y/o B –en los que se evidenció que las infecciones por rotavirus son crónicas y no se limitan únicamente al intestino, sino que también pueden infectar el hígado y el riñón– muestran que la respuesta inmune de los linfocitos T es importante para controlar la infección 20. Por lo anterior, caracterizar la población de linfocitos específicos de rotavirus se vuelve necesario para poder aportar al entendimiento de la inmunología contra el rotavirus e identificar qué tipo de antígenos reconocen estas poblaciones celulares.

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Con el desarrollo del presente trabajo buscamos aportar al conocimiento de la respuesta de las células T específicas de rotavirus desde varios aspectos: 1. Identificación de nuevos epítopes de células T CD4 humanas de rotavirus. Los

primeros epítopes restringidos a clase I derivados de la proteína VP7 de rotavirus se identificaron en un modelo de ratón infectado con la cepa bovina RF 21. A partir de ese punto, el número de epítopes derivados de las proteínas VP7 y VP6 de clase I y II murinos se ha incrementado 22-24, incluyendo epítopes derivados de la proteínas NSP1 25 y epítopes de la proteína VP6 restringidos a clase II en modelos de monos Rhesus 26. En humanos se han identificado muy pocos péptidos específicos de rotavirus, además, los descritos en la literatura están ligados a la presentación por moléculas de clase I y son derivados de las proteínas VP6 y VP7 del virus 27, 28. Para el desarrollo de este trabajo se eligieron las secuencias de aminoácidos de las proteínas de una cepa de rotavirus humano y se identificaron los posibles péptidos presentados por las moléculas de clase II DR β1:0101, usando una combinación de dos algoritmos bioinformáticos, P9 y SYFPHEITI. Los péptidos reconocidos por el algoritmo se organizaron en grupos de 5 péptidos cada grupo y se evaluó la producción de IL-2 e IFN-γ en CMSP derivadas de adultos sanos. Finalmente, se realizó la deconvolución de los grupos con resultados positivos para identificar los péptidos individuales específicos de rotavirus que eran reconocidos por las células T CD4 de los voluntarios.

2. Usando marcación con tetrámeros de clase II caracterizamos las células T CD4 circulantes específicas de rotavirus, determinando sus perfiles de diferenciación y de migración. El uso de los tetrámeros de clase II ha surgido como una importante herramienta para evaluar la especificidad y determinar el fenotipo de las células CD4 en las respuesta inmune de diferentes enfermedades y en los estudios post-vacunación 29, 30. El uso de las marcaciones con los tetrámeros solubles de clase II se ha transformado en una tecnología robusta usada en numerosos contextos clínicos 30. Determinar los perfiles de migración y diferenciación de las células individuales específicas de rotavirus nos ayuda a entender en qué lugar anatómico se estimularon inicialmente las células de memoria y a determinar la funcionalidad de las mismas. Esto debido a que las células T son funcionalmente heterogéneas y median su actividad a través de diferentes mecanismos. Para identificar mejor las células con perfiles de migración intestinal es necesario combinar la expresión de la integrina α4β7 y del receptor CCR9, que permite diferenciar si las células migran hacia colon o intestino delgado ya que el receptor CCR9 que es un marcador de migración de intestino delgado exclusivamente, mientras que α4β7 es de intestino delgado y colon. La expresión de los receptores de marcadores de migración definen los lugares anatómicos hacia los cuales los linfocitos T de memoria migran, principalmente

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hacia la piel o la mucosa gastrointestinal 31, 32. Estos receptores son impuestos por las células dendríticas durante el desarrollo de las células T y promueven el tráfico de estas células hacia los tejidos donde se expresan sus ligandos 33. Las células dendríticas ligadas al GALT metabolizan la vitamina A transformándola en ácido retinóico, que induce a las células T vírgenes a expresar los marcadores α4β7 y CCR9, marcadores que predisponen a las células recientemente activadas a migrar desde el torrente sanguíneo hacia el tejido del tracto gastrointestinal 34. El ligando natural de la moléculas α4β7 es la adresina MadCAM-1 35, que se encuentra expresada en las células endoteliales de la lámina propia a lo largo de todo el recorrido del intestino, mientras que el ligando natural de CCR9 es la molécula CCL25 que solamente se encuentra expresada en las vénulas del intestino delgado 36; por lo tanto, una células que expresa ambos marcadores está condicionada a migrar desde el torrente sanguíneo al intestino delgado. El rotavirus tiene como sitio de replicación principal a los enterocitos maduros del intestino delgado, sin embargo, se ha observado en animales y en niños una diseminación sistémica 13, 14, 37, consecuentemente, se generan células T específicas de rotavirus en los dos compartimientos (el intestinal y el sistémico). La evaluación de poblaciones de células T CD4 circulantes específicas de rotavirus han mostrado que éstas expresan preferencialmente el marcador de migración intestinal α4β7 38, 39. No obstante, la metodología usada en estos trabajos implicaba la separación de todas las células α4β7, para posteriormente evaluar únicamente la proliferación frente al antígeno de rotavirus. Esta metodología no permitía la evaluación de los estadios de diferenciación de las células circulantes y además, tampoco se podía saber si las células específicas de rotavirus migraban hacia el intestino delgado y/o el colon, porque no se incluyó la determinación del receptor CCR9.

3. Comparamos la respuesta T específica de rotavirus con la de toxoide tetánico e influenza en los mismos individuos adultos y niños sanos. Resultados previos han mostrado que la respuesta contra rotavirus en los niños es menos eficiente que la observada en adultos 38, 40, 41. Entonces, se ha hecho necesario determinar qué diferencias existen entre la respuesta de niños y adultos mediante estudios comparativos. Adicionalmente, se ha determinado que la respuesta contra rotavirus es similar a la observada en otras infecciones virales de mucosas 40. En contraste, al comparar la respuesta de rotavirus frente a infecciones virales sistémicas, como la de citomegalovirus (CMV), se observó que la frecuencia de células T específicas de CMV es 20 veces mayor que la de las células específicas de rotavirus 41. Este hecho soporta la necesidad de comparar la respuesta de las células T específicas de rotavirus contra otros antígenos de origen mucoso (influenza) y de origen sistémico (toxoide tetánico).

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La característica fundamental para evaluar la respuesta de las células T es la magnitud, entendida como la frecuencia de las células específicas contra un patógeno o la medición de una función efectora, como la producción de IFN-γ; mientras que la calidad de la respuesta representa mejor las características de una células T eficiente: habilidades para proliferar, inducir la proliferación de otras células, organizar la respuesta inmune y llevar a cabo funciones efectoras a través de mecanismos citolíticos o la secreción de citocinas 42. La respuesta de las células T contra rotavirus ha sido caracterizada mediante la técnica de linfoproliferación 43-46; los resultados han mostrado que la mayoría de los adultos sanos y niños en la etapa convaleciente tienen células específicas de rotavirus que proliferan en respuesta al antígeno. Por medio de las técnicas de ELISPOT y la tinción intracelular de citocinas (ICS) se ha observado que en los adultos sanos la mayoría de las células T tanto CD4 y como CD8 producen únicamente IFN-γ, mientras que las células doble positivas (IFN-γ/IL-2) o las que producen solamente IL-2 se observan en muy bajos porcentajes 38, 40, 41, 47. Pese a esto, las frecuencias detectadas son comparables con las células específicas de los virus de mucosas respiratorias 40. Las características de estas células sugieren entonces que las células T específicas de rotavirus son probablemente células de memoria terminales, incapaces de generar una respuesta inmune eficiente. La respuesta de células T en niños con infección natural por rotavirus ha mostrado que la frecuencia de células CD4 que secretan IFN-γ es más baja que en los adultos, mientras que la respuesta de citocinas en niños sanos no ha sido estudiada 38, 40, 41, 47.

El modelo de diferenciación lineal funcional para las células T CD4 TH1 propone que las células CD4 multifuncionales –que producen TNF-α/IL-2/IFN-γ–, doble productoras – que producen TNF-α /IL2– o que solamente producen TNF-α o IL-2 y que no han perdido su capacidad proliferativa corresponden con las poblaciones de células de memoria central (TCM), mientras que las células doble productoras (IFN-γ/IL-2 o IFN-γ/TNF-α) se correlacionan mejor con las poblaciones de células de memoria efectora (TEM). Finalmente, las células productoras de IFN-γ solamente y con baja capacidad de proliferación son las células que se encuentran en estado de efectoras terminales (TTE) 42, 48. Estudios previos han mostrado que las células T CD4 y CD8 específicas de rotavirus obtenidas de adultos sanos e infectados producen IFN-γ, mientras que en niños esas frecuencias son más bajas e incluso indetectables 38, 40, 41, 47. Aunque otras citocinas también han sido analizadas (IL-2, IL-4, IL10, IL-13, IL-17), se han observado frecuencias muy bajas e incluso indetectables. Se ha propuesto que la multifuncionalidad de las células es la mejor forma de evaluar la calidad de la respuesta frente a un antígeno, en rotavirus esta multifuncionalidad ha sido parcialmente evaluada en estudios previos. La mejor combinación de producción de citocinas para evaluar la multifuncionalidad de

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las células específicas de un antígeno es IL-2, IFN-γ y TNF-α. De acuerdo al modelo de diferenciación lineal 42 la combinación del análisis de estas tres citocinas nos permite relacionar la funcionalidad de las células con las poblaciones de células vírgenes, de memoria central, de memoria efectora y efectora terminal.

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MARCO TEÓRICO

Rotavirus

Estructura del virus

Los rotavirus son virus no envueltos que pertenecen a la familia Reoviridae, se caracterizan porque la partícula viral infecciosa tiene morfología icosaédrica, semejante a una rueda, al observarla por microscopía electrónica, de la cual se deriva su nombre. Está compuesto por tres capas proteicas concéntricas que rodean un genoma conformado por 11 segmentos de ácido ribonucleico (ARN) de doble cadena 1, 49 (figura 1). Cada uno de los segmentos de ARN codifica para una proteína, excepto el segmento 11 que codifica para 2 proteínas (NSP5 y NSP6, en algunas cepas virales) 1. De las 12 proteínas del virus, 6 corresponden a proteínas estructurales y 6 a proteínas no estructurales 1.

Figura 1. Estructura del virión de rotavirus. El virión de rotavirus se caracteriza por estar formado por tres capas concéntricas de proteínas, la capa más internas está conformada por las proteínas VP1, VP2 y VP3 (color verde), mientras que la capa intermedia está constituida por la proteína mayoritaria VP6 (color azul), y finalmente la capa más externa está formada por las proteínas VP7 (color amarillo) y VP4 (color rojo). Figura obtenida de 1.

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El virión infectivo tiene cerca de 100 nm de diámetro, la capa más interna está conformada por 120 copias de la proteína VP2, que se encuentra asociada con VP1 (ARN polimerasa dependiente de ARN) y VP3 (Guaniltransferasa y metilasa) protegiendo el genoma del virus e implicadas en la replicación del virus. La capa intermedia rodea el core del virus y está compuesta por 260 trímeros de VP6 organizados en pentámeros y hexámeros. VP6 es la proteína estructural más abundante del virus y conforma las partículas de doble capa (DLPs), que no son infecciosas pero si son replicativamente activas 50. Finalmente, la capa externa está compuesta por los 260 trímeros de la glicoproteína de unión a calcio VP7 y por 60 espículas triméricas de la proteína sensible a proteasas VP4 49; la combinación de las tres capas forma las estructuras infecciosas de tres capas denominadas TLPs 51. Por último, la morfología del virus tiene 132 canales que se agrupan en 3 tipos, dependiendo de la posición que ocupan dentro de la arquitectura del virus, que juegan un papel muy importante en la entrada del virus y la liberación de los ARN mensajeros recién formados 51, 52.

Clasificación de los rotavirus Las cepas de rotavirus poseen una alta diversidad genética y antigénica y son clasificadas en tres diferentes especificidades, grupo, subgrupo y serotipo 19. Los grupos de rotavirus se identifican basados en la antigenicidad de la proteína estructural más abundante, VP6. Actualmente son reconocidos 7 grupos designados con las letras A hasta G; los rotavirus del grupo A, B y C son la causa más común de infección en los seres humanos y animales, mientras que los grupos D a G sólo han sido identificados en huéspedes animales 53. El grupo A es el grupo más común encontrado en las infecciones en humanos, los cuales se subdividen en tres diferentes genogrupos, basados en características comunes que comparten con tres cepas prototipo humanas Wa, DS-1 y AU-1. Los epítopes de reacción cruzada presentes en la proteína VP6 confieren la clasificación de subgrupo y se organizan en los subgrupos I, II, I/II y no I/no II. Los rotavirus humanos G2 y G8 pertenecen al subgrupo I, mientras que la mayoría de los G1, G3, G4 y G9 humanos pertenecen al subgrupo II, sin embargo, esta clasificación ha caído en desuso 53, 54. Además, los rotavirus pueden ser clasificados en serotipos teniendo en cuenta las proteínas de la capa externa VP7 y VP4. Debido a que los genes que producen estás proteínas se segregan de forma independiente se ha establecido un sistema dual para determinar los serotipos del virus. Los serotipos G (por glicoproteína) están relacionados con los epítopes neutralizantes de VP7, mientras que los serotipos P (por sensibilidad a las proteasas) se correlacionan con el antígeno VP4. Se han descrito hasta el momento 27 serotipos G y 14 serotipos P 54. Los serotipos

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G1, G2, G3, G4 y G9 y están relacionados con cerca del 90% de las infecciones en humanos, mientras que el serotipo P1 representa alrededor del 91% de las cepas circulantes humanas 10, 19. Pero no solo la clasificación actual de los rotavirus se centra en reacciones serológicas, también se han descrito genotipos basados en la secuencia de los segmentos del genoma del virus. Los serotipos G y su correspondiente genotipo son generalmente equivalentes, mientras que existen al menos 35 genotipos P que no son siempre equivalentes con los serotipos P; para hacer la clasificación completa se deben reportar los dos, por lo tanto, los genotipos se designan entre corchetes; por ejemplo, la cepa Wa se identifica como P1A[8]G1 53. A pesar de esto, la diversidad de las cepas humanas es limitada: cerca del 90% de los aislamientos humanos realizados antes de la introducción de las vacunas corresponden a los tipos G1, G2, G3, G4 y G9 que se combinan preferencialmente con los tipos P1A[8] (G1, G3, G4, G9) o con P1B[4] (G2) 10. En conclusión, el grupo de trabajo de la clasificación de rotavirus recomienda la siguiente nomenclatura: primero, el serotipo/genotipo G, “X” si es desconocido, seguido del serotipo P, y finalmente el genotipo P enmarcado en corchetes 54. Las asociaciones más comunes en humanos son G1P1A[8], G2P1B[4], G3P1A[8], G4P1A[8] y G9P1A[8] 10, 19.

Replicación de los rotavirus Los rotavirus tienen un tropismo natural por los enterocitos maduros localizados en las extremos de la vellosidades intestinales, lo que sugiere que este tipo de células son las que poseen los receptores específicos del virus. Sin embargo, con el descubrimiento de que el virus se puede diseminar extraintestinalmente, se sospecha que el rango de células huésped es mucho más amplio del que se consideraba inicialmente 53(Figura 2). El primer paso en la infección del rotavirus comienza con la unión de virus a las células blanco. Esta función está a cargo de la proteína VP4 o de la proteína producida después del clivaje de la misma, VP5 55. Se ha observado que algunas cepas del virus aglutinan eritrocitos y que el tratamiento con neuraminidasa disminuye la unión del virus, indicando que el ácido siálico tiene un papel importante en este paso de la replicación. La proteína VP4 tiene actividad de hemaglutinina (HA) y juega un papel importante en la adhesión del virus a la células blanco, sin embargo, las cepas de rotavirus humanas inician la adhesión de forma HA-independiente; en su lugar los receptores celulares de estas cepas son los gangliósidos GM1, GM3 y la integrina α2β1 56. Luego de la unión a los receptores principales, las proteínas del virus reconocen otro tipo de proteínas accesorias; algunas de las interacciones secundarias reconocidas son entre VP7 o VP5 con la proteína de choque térmico 70 (HSP70) y las integrinas αvβ3, αxβ2 y

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α4β1 57. Los pasos de reconocimiento inicial ocurren dentro de microdominios de las membranas enriquecidos en colesterol y esfingolípidos llamados raft lipídicos. La penetración del virus es un proceso complejo que aún no se ha entendido completamente, puede ser mediado por la penetración directa de membrana o por endocitosis, además está constituido por varios pasos que envuelven una serie de cambios a nivel de las proteínas de la cápside. Los resultados muestran que las bajas concentraciones de Ca++ en los endosomas son los principales responsables del desnudamiento del virus, que ocurre por desacoplamiento de las proteínas de la capa externa, permitiendo que las partículas virales de doble capa (DLPs) entren al citoplasma. Para que la capa externa se desacople más rápidamente, los viriones debe haber sido activados con tripsina, que fracciona la proteína VP4 en dos, generando las proteínas VP5 y VP8; los estudios han mostrado que los virus no activados con tripsina tardan entre 30-50 minutos para penetrar la células, mientras que los virus activados lo hacen en tan solo 4-5 minutos. El proceso de transcripción es mediado por una ARN polimerasa dependiente de ARN que hace parte de un complejo de transcripción formado por las proteínas VP1 y VP3 localizado al interior de la capa de VP2, por lo tanto, el proceso de transcripción ocurre dentro de las DLPs intactas estructuralmente. Los nuevos ARNs transcritos salen de las DLPs a través de los canales de tipo I formados en la estructura de la capa de VP2. Las proteínas virales son traducidas por la maquinaria celular a partir de los mARN liberados desde las DLPs, esos mARNs tienen estructuras cap pero no son poliadenilados. Las proteínas no estructurales ejercen diferentes funciones en el ensamblaje y liberación de los nuevos viriones. NSP3 está involucrada en la inhibición de la síntesis de proteínas celulares, mientras que NSP2 y NSP5 se acumulan en el citoplasma formando zonas electrodensas conocidas como viroplasmas, cuya función es la de permitir el ensamblaje de las DLPs y ayudar en el empaquetamiento de las cadenas de ARNs de doble cadena. NSP4 se asocia con la membrana del retículo endoplásmatico rugoso (RER) capturando a VP6 para permitirle la gemación hacia el espacio intraluminal de RER. VP7 y VP4 se acoplan en este mismo lugar con el resto de las DLPs en un proceso que no está suficientemente claro. Los nuevos viriones son liberados desde el RER hacia el exterior de la célula durante una lisis celular 53.

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Figura 2. Replicación de rotavirus. El virión de rotavirus reconoce su receptor en la superficie del enterocito maduro, fenómeno no esclarecido totalmente: posteriormente el virus es endocitado en vesículas libres de clatrina que posteriormente forman el endosoma temprano: después el virus pierde su capa externa (desnudamiento) y las partículas virales de doble capa (DLPs) penetran el citoplasma. Una vez las DLPs se localizan en el citoplasma el complejo de replicación (VP1 y VP3) se activan y se comienzan a sintetizar moléculas de RNA(+) y RNA(-). Las proteínas no estructurales recién sintetizadas NSP2 y NSP5 forman los viroplasmas que secuestran todos los componentes necesarios para formar los nuevos viriones, procedimiento que comienza con el ensamblaje de las nuevas secuencias de RNA con las proteínas de la capa interna, seguidas por el acoplamiento de VP6 para formar la capa intermedia y finalmente también se forma la capa externa en la capa citoplasmática del Retículo Endoplasmático (RE), un proceso que aún no está claro. Finalmente ocurre la liberación del virus que debe ser activado por acción de la tripsina para que se formen VP5 y VP8 a partir de la transformación de la proteína VP4. Figura obtenida de 49.

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Epidemiología de la infección por rotavirus Antes de la introducción de las vacunas contra rotavirus a nivel mundial, los informes mostraban que la diarrea causada por rotavirus era la principal causa de hospitalizaciones en el mundo en niños menores de 5 años 2, 3. Se determinó entonces que la infección por este virus estaba asociada con una alta mortalidad en niños menores de 5 años, además, se estimó que la infección por rotavirus cobraba la vida de cerca de 527.000 (475.000-580.000) niños anualmente, esto se traducía en aproximadamente 1.440 muertes por rotavirus diariamente 2, 3. La infección por rotavirus se encuentra distribuida en todo el mundo y los datos recolectados indican que las tasas de infección son similares en los países desarrollados y en vías de desarrollo, sin embargo, la mortalidad es diferente. India concentra la mayor cantidad de muertes relacionadas con la infección por rotavirus con cerca de un 25% de todos los casos a nivel mundial; seis países (China, Nigeria, Pakistán, Congo, Etiopia e India) suman más del 50% de los casos fatales a nivel mundial 2. En los Estados Unidos, norovirus ha superado a rotavirus como la mayor causa de gastroenteritis luego de la implementación de los programas de vacunación 58. Sin embargo, rotavirus sigue siendo el agente etiológico más importante de la gastroenteritis severa en países en vías de desarrollo que no tienen implementado el programa de vacunación contra rotavirus 59. En Colombia, aproximadamente 1.300 niños menores de un año mueren anualmente debido a gastroenteritis agudas, representando el 10% de las muertes totales en este grupo de edad 5. En Colombia un estudio de 2004 mostró que en las ciudades de Bogotá, Barranquilla y Cali las infecciones por rotavirus causaban el 50% de las diarreas y que eran el motivo de 16 hospitalizaciones por cada 1.000 niños y de 1 muerte por cada 2.000 niños. Los genotipos asociados con las infecciones fueron G3P8 (32,7%), G2P4 (21,1%), G1P8 (19,1%) y mixtos (8,5%) 60. En Bogotá, los genotipos más frecuentemente encontrados fueron G1P8 (36,9%), G3P8 (29,2%) y G2P4 (16,9%) 60. Recientemente, se estimó que sin vacunación el número anual de visitas médicas y muertes relacionadas con la infección por rotavirus en niños colombianos menores de 2 años fue de 105.378 y 470 (IC 95% 295-560), respectivamente 5. La transmisión del virus depende de la zona geográfica en consideración. En zonas tropicales hay un patrón de infección constante, sin embargo, se ven ligeros aumentos de casos en los meses más fríos. En zonas con estaciones las tasas de infección son más altas en el otoño y el invierno; en Estados unidos la dinámica espaciotemporal del la infección por rotavirus se inicia en el sureste al final del otoño y termina en el noreste tres meses después, es de anotar que la implementación de la vacunación ha cambiado estos patrones impactando la dinámica de las epidemias de rotavirus 61, 62. La distribución de las cepas de rotavirus varia con el tiempo, la época del año y la

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localización. De acuerdo con los estudios, las cepas más frecuentes a nivel mundial son G1P1A[8], G2P1B[4], G3P1A[8], G4P1A[8] y G9P1A[8], que representan más del 90% de los aislamientos 63. En algunas regiones geográficas de India, Brasil y África las cepas G9P[6], G5 y G8, respectivamente, son más prevalentes que en otras regiones del mundo 64. En África existe una gran variabilidad de cepas circulantes con combinaciones poco comunes de genes G y P, se sospecha que algunas cepas son de origen zoonótico 65. La transmisión del rotavirus ocurre principalmente por la vía oro-fecal o por el tracto respiratorio, por contacto persona a persona o la manipulación de objetos o superficies contaminadas. En las heces de los pacientes infectados se excreta el virus infecciosos en altas concentraciones incluso dos días antes del inicio de la diarrea y hasta 10 días después del inicio de la misma. El inoculo para producir una infección en un huésped homologo es muy bajo de 10 o menos partículas virales. A pesar de que la infección sucede en otros animales, es muy baja la probabilidad de una transmisión animal-humano, debido a la restricción de especie, por lo tanto los animales no son considerados reservorios de las cepas de rotavirus humanas 50.

Las vacunas contra rotavirus En 1998 la FDA aprobó para su uso en Estados Unidos la vacuna Rotashield®, en octubre de ese mismo año se inició la aplicación de esta vacuna con algunas advertencias relacionadas con el desarrollo de invaginación intestinal 6. Un año después del inicio del programa, la vacunación fue suspendida debido a un elevado número de casos de invaginación intestinal relacionados con el uso del biológico 6. El retiro de Rotashield® del mercado condujo a la industria farmacéutica a trabajar en el desarrollo de nuevas vacunas más seguras contra rotavirus 10. Después de la experiencia de Rotashield®, en el año 2006 se dio inicio a una nueva etapa de las vacunas contra rotavirus con la aprobación de la vacuna Rotarix® (GlaxoSmithKline®) (Figura 3) inicialmente en México, seguida por su introducción en otros países latinoamericanos y europeos 10. Dos años después fue introducida en el mercado la vacuna RotaTeq® (Merck) 10, 66(Figura 3). Rotarix® es una vacuna monovalente obtenida a partir de la atenuación por pases consecutivos de la cepa humana 89-12 67, mientras que RotaTeq® es una vacuna pentavalente construida teniendo como base la cepa bovina WC3 combinada con genes que codifican para las proteínas VP4 y VP7 humanas 68, 69. Las dos vacunas contra rotavirus demostraron ser seguras y ofrecer una muy buena protección contra los casos de enfermedad severa en países europeos y latinoamericanos (85%-98%), donde se realizaron los estudios piloto 67, 70. Las dos vacunas han sido licenciadas en más de 100 países e incluso se han incluido en los programas de vacunación en casi 30 países, que incluyan países

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con alto y mediano nivel socioeconómico de América, Europa y Australia 66. Sin embargo, el uso de vacunas orales como las vacunas contra polio, cólera y fiebre tifoidea en países con bajo nivel socioeconómico no han mostrado resultados comparables a los observados en países con alto y mediano nivel socioeconómico, por eso la OMS recomendó que fueran llevados a cabo estudios en países con bajo nivel socioeconómico para poder hacer la recomendación de uso universal de estas vacunas 66. Los resultados de los estudios realizados en países con un nivel económico mediano, como Brasil y México, mostraron impactos destacables al usar las vacunas. En México, los índices de mortalidad por diarreas severas han disminuido en un 39% 71, 72, mientras que en Brasil los reportes señalan una disminución de 22% y 28% 73. En países con bajo nivel económico los reportes son menos alentadores, para Rotarix® los estudios realizados en Suráfrica y Malawi mostraron eficacia de 76% y 49%, respectivamente 74. En el caso de RotaTeq® estudios realizados en 5 países de África y Asia mostraron en promedio una eficacia de 64%75, 76. A pesar de esto, se determinó que hubo un beneficio importante porque se protegieron las vidas de los niños, por lo tanto la OMS recomendó la inmunización de los niños de forma universal 66. Para 2008, una serie de estudios llevados a cabo por hospitales a nivel individual alrededor de los Estados Unidos documentaron una marcada disminución de los casos de diarrea, hospitalizaciones y visitas a las salas de urgencia ocasionadas por la infección por rotavirus en niños menores de 2 y 3 años en la temporada de rotavirus 66, 77, 78. Incluso, reportes más recientes hablan de una disminución de los casos de rotavirus tan dramática que norovirus se proyecta como la causa más común de gastroenteritis viral aguda en niños norteamericanos menores de 5 años 58, 79. Aún más, los programas de vacunación sugirieron que la vacunación estaba fomentando un efecto rebaño que también estaba protegiendo a los niños no vacunados y a los adultos 66, 80

Figura 3. Esquema de las cepas componentes de las vacunas Rotarix® y RotaTeq® . Rotarix es una vacuna monovalente derivada de una cepa humana P1A[8]G1 atenuada, mientras que RotaTeq es una vacuna pentavalente formada por 5 cepas bovinas (WC3) recombinadas que expresan diferentes serotipos de las proteínas VP7 y VP4 derivas de cepas humanas. Figura obtenida de 10.

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Enfermedad causada por los rotavirus La infección por rotavirus se adquiere por contacto persona a persona por transmisión oro-fecal. Luego que el virus es ingerido las partículas virales infecciosas se dirigen hacia el intestino delgado donde infecta los enterocitos maduros. Posteriormente, las nuevas partículas virales se dirigen hacia regiones más lejanas del intestino o terminan siendo excretadas en las heces 81. Durante la infección se ha estimado que los niños excretan entre 1010 y 1011 partículas virales. Las infecciones por rotavirus en los niños tienen manifestaciones clínicas claramente definidas: la mayoría de los casos de primoinfección se presentan entre las edades de 6 meses a 24 meses y los síntomas son fiebre y vómito durante 2 a 3 días, seguidos de diarrea sin sangre pero abundante y profusa, lo que conduce a los pacientes a sufrir deshidratación grave con riesgo de muerte en muchos de los casos 81. Las manifestaciones clínicas de las reinfecciones suelen ser menos graves en estos pacientes. A diferencia de lo que sucede en niños, los adultos presentan síntomas más difíciles de identificar, por lo que es muy difícil establecer un patrón de síntomas tras la infección por el virus, pero suelen presentar diarrea, vómito, dolor de cabeza y cólicos 81. La deshidratación severa y la alteración de los niveles de electrolitos son las consecuencias más serias que ocurren durante la infección por rotavirus y los infantes son los que las sufren de forma más frecuente 82. Estas manifestaciones clínicas son responsables de la mayoría de los casos mortales especialmente en condiciones donde el acceso al tratamiento médico es deficiente. Los hallazgos histopatológicos relacionados con la infección por rotavirus están restringidos al intestino delgado y se caracterizan por acortamiento y atrofia de las vellosidades, aumento de la profundidad de las criptas, aplastamiento de las células epiteliales e incremento del número de células inflamatorias en la lámina propia 82. Los mecanismos que inducen la diarrea en la infección por rotavirus aún no se han comprendido completamente. Múltiples mecanismos se han propuesto para explicar el origen de la diarrea: 1. La muerte de los enterocitos como consecuencia de la infección provoca una diarrea osmótica. 2. La replicación del virus afecta las funciones metabólicas de las proteínas de membrana del enterocito provocando la diarrea de mala absorción. 3. El virus incrementa las concentraciones de Ca++

alterando la estructura del citoesqueleto y la uniones intercelulares, lo que incrementa la permeabilidad intestinal. 4. NSP4 funciona como una enterotoxina que favorece la diarrea secretoria. NSP4 también induce el incremento de la concentración de Ca++ activando las vías de señalización dependientes de Ca++ , movilizando Cl- desde el retículo endoplásmatico y provocando la pérdida de electrolitos y agua. 6. El sistema nervioso entérico es estimulado también por la actividad de NSP4 lo que incrementa la motilidad del intestino 82.

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Poblaciones de los linfocitos T Las células T ejercen su papel en la respuesta inmune a través de varios mecanismos, de hecho, actualmente se estima que el desarrollo de vacunas eficaces contra patógenos como la malaria o el VIH requieren de la generación de una respuesta T potente y durable, por lo tanto, una evaluación adecuada de la complejidad de la respuesta de las células T es necesaria 42. La adquisición de la experiencia antigénica por parte de las células T está marcada por la generación y la persistencia de las células T, que ofrecen protección contra los patógenos de por vida 83. Las células T de memoria se pueden distinguir de forma clásica por medio de la expresión de la isoforma CD45RO y la pérdida de la expresión de la isoforma CD45RA 84, 85. Pero, la definición de las diferentes poblaciones de células T requiere de la determinación de otros marcadores celulares, como la quimiocina CCR7. Mediante la determinación de ambos marcadores se logró establecer que las células vírgenes expresan el CCR7, mostrando su predilección por los órganos linfoides, mientras que las células de memoria pueden ser divididas en dos diferentes poblaciones: CD45RA-CCR7+ que corresponden a las células T de memoria central (TCM) con capacidad de migrar hacia los tejidos linfoides, y las CD45RA-CCR7- que son células de memoria efectora (TEM) que pueden migrar hacia múltiples tejidos 48, 86. La expresión de otros marcadores superficiales como CD95 (FAS) y CD122 (IL-2Rβ), recientemente descritos en el contexto de células T vírgenes, determina la presencia de otra población de células de memoria llamadas células T de memoria “Stem” (TSCM). Tanto en humanos 87 como en ratones 88, este tipo de células tiene una alta capacidad de proliferación, son multipotenciales y se autorenuevan, incluso pueden diferenciarse en otras poblaciones como TCM y TEM 87. Recientemente, estudios realizados en el modelo de ratón han permitido identificar otra clase de linfocitos T de memoria residentes en los lo tejidos (TRM), una forma de células no circulantes que se alojan en los tejidos y que adicionalmente pueden desarrollar una rápida respuesta protectora local. Este tipo de células CD4 TRM pueden ser generadas en los pulmones a partir de la transferencia de células efectoras hacia el tejido 89 o luego de una infección por un virus respiratorio 90. Estas células se diferencian de las células CD4 circulantes por la expresión del marcador CD69, los marcadores específicos de migración pulmonar (CCR6) y su mayor habilidad para mediar la protección contra las infecciones por el virus de influenza, comparadas con sus homologas CD4 circulantes 89. Adicionalmente, se han reconocido poblaciones de células T CD8 TRM localizadas en distintos tejidos que se generan luego de una infección; estas células se han identificado en tejidos como la piel 91, la mucosa vaginal 92, intestino 93, pulmones 90 e incluso cerebro 94.

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Tejido linfoide asociado al tracto gastrointestinal (GALT, por sus siglas en inglés) El sistema inmune intestinal se puede dividir en dos importantes compartimientos: el inductivo y el efector. El compartimiento inductivo incluye todos los tejidos del GALT, en los que encontramos placas de Peyer (PP), los folículos linfoides aislados (ILF) y los nódulos linfoides mesentéricos (NLM), en contraste, los compartimientos efectores están formados por la lámina propia y el epitelio intestinal, que se caracterizan por contener altas cantidades de células T activadas y células plasmáticas secretoras de anticuerpos 95, 96. El tracto gastrointestinal es la mayor puerta de entrada de numerosos patógenos, a pesar de estar protegido por barreras físicas y biológicas 97. Las barreras físicas están formadas principalmente por células epiteliales unidas de forma muy firme por proteínas de unión, las microvellosidades y una capa densa de mucina 97. Adicionalmente, los péptidos antimicrobianos como las defensinas también hacen parte de este sistema de barreras encargadas de evitar la entrada de patógenos al organismo 98. También, el tracto gastrointestinal incluye diferentes tipos de células del sistema inmune, como linfocitos, macrófagos y células dendríticas (CD) que se organizan en estructuras definidas en los tejidos, donde se destacan las PP y los ILF, o que se encuentran dispersas dentro del epitelio y la lámina propia 97. Las PP son los tejidos linfoides asociados al sistema inmune gastrointestinal mejor organizados del tracto gastrointestinal. En los humanos hay cientos localizados en el recorrido del intestino delgado, mientras que en el ratón solamente hay entre 8 y 10 de ellos 99. La organización de las PP es muy similar a la de otros órganos linfoides secundarios, pero, hay características que los distinguen; por ejemplo, no tienen linfáticos aferentes, por lo que las PP están cubiertas por una región epitelial denominada epitelio asociado al folículo, que contiene un grupo de células especializadas llamadas células M, encargadas de transferir antígenos desde el lumen intestinal hacia las PP 100. La región subepitelial es rica en CD, que se encargan de tomar los antígenos transferidos por las células M, para procesarlos y presentarlos a las células T y B localizadas en las mucosas 101. Pero estas CD no sólo están encargadas de presentación de antígenos, ellas expresan la enzima retinaldehído deshidrogenasa, encargada de convertir la vitamina A en ácido retinóico 102, 103. El ácido retinóico induce la expresión de los marcadores α4β7 y CCR9 en las células T y B activadas, promoviendo el retorno de ellas a la lámina propia del intestino delgado 102, 103. Las PP están compuestas por células B en una gran mayoría (75%), mientras que las células T representan cerca de un 20% del total de células de las PP, el mayor porcentaje representadas por células vírgenes, no obstante, también se pueden encontrar células con diferentes fenotipos funcionales como Th1, Th2 y Treg

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productoras de IL-10 y FoxP3+ 97. Los ILF están formados por un folículo único que está compuesto de forma predominante por células B y algunas CD recubiertas por un domo rico en células M 104, pero no contienen células T, indicando que los ILF son sitios de producción de IgA T independiente 105. Existe un número considerable de literatura que evidencia que las PP y los ILF son críticos para el reconocimiento inmune de antígenos derivados de bacterias y virus 96, hecho que refleja la actividad de las células M que transportan activamente material desde el lumen de hacia los compartimientos del GALT, especialmente hacia PP y los ILF 100. De otro lado, se considera que el NLM es el compartimiento crucial en la inducción de la tolerancia oral 96, 106. Las CD locales y migratorias CD103+ son muy importantes en la generación de un ambiente tolerogénico en el NLM. Estas células procesan los antígenos en el lumen del intestino y posteriormente los presentan en el NLM, específicamente, no tienen la capacidad de llegar hasta el torrente sanguíneo ni de migrar hacia otros órganos linfoides 101. Estas CD CD103+ de las lámina propia y de los NLM tiene la capacidad de inducir la expresión de marcadores de migración intestinal CCR9 y α4β7 en las células T 107 y, además, también son fuertes inductoras de la expresión de la moléculas FoxP3 en los T reguladores (Tregs) 108. Estas dos actividades están ligadas a la capacidad de las CD103+ de producir ácido retinóico a partir de la degradación de la vitamina A, la sola presencia de éste induce la expresión de los marcadores de migración intestinal 102, y simultáneamente actúa como cofactor en la conversión de células T vírgenes en Tregs, junto con el TGF-β 109. Las características especiales de estas CD103+ intestinales no son compartidas por las CD103+ de otros tejidos y parecen ser condicionadas directamente por el ambiente intestinal 110.

El tráfico de las células T hacia el intestino

La superficie de la mucosa gastrointestinal es colonizada por un número importante de bacterias, hongos, parásitos y virus. En humanos se estima que cerca de 100 trillones de microorganismos colonizan el tracto gastrointestinal (la mayoría son bacterias), estas poblaciones se conocen como la microbiota 111. La función de la microbiota está relacionada con la digestión y fermentación de los carbohidratos, la producción de vitaminas, el desarrollo del GALT y la prevención de la colonización por organismos patógenos. Consecuentemente, en el intestino el sistema inmune debe aprender a diferenciar entre los antígenos de la dieta, los patógenos y las bacterias comensales con las que se establecen relaciones simbióticas 111, 112. Distintos estudios han mostrado que los NLM son la clave en la inducción de la tolerancia. La presentación de los antígenos dietarios ocurre principalmente en el NLM y no en PP 113, es más, la tolerancia oral no se logró inducir en modelos de ratones sin NLM, pero no se vio afectada en ratones sin PP 114. Incluso, se ha observado que existe un tráfico permanente de las CD desde el epitelio intestinal y

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las PP hacia los NLM, de esta forma los antígenos tomados en el epitelio intestinal son transportados hacia el NLM, donde ocurre la tolerización 115. De otro lado, las PP son claves en la respuesta inmune, translocando los antígenos bacterianos y alimentarios desde el lumen intestinal hacia la lámina propia, pero, no es claro su papel en el desarrollo de la tolerancia oral, aunque si juegan un papel importante en la translocación y la respuesta contra los agentes patógenos que aprovechan las fisiología de las PP para invadir el organismo gracias a sus factores de virulencia 116. Cuando la relación entre la microbiota y la respuesta inmune se afecta o en presencia de agentes patógenos se ocasiona un desequilibrio que conduce al desarrollo de una respuesta inmune que causa una enfermedad. Las moléculas de adhesión, en combinación con compuestos quimioatrayentes de leucocitos, dirigen el tráfico de las células del sistema inmune y regulan las interacciones entre las células durante los procesos de inflamación e inmunidad. Combinaciones específicas de receptores dirigen los linfocitos a sitios anatómicos particulares como la piel, el intestino delgado, nódulos linfáticos periféricos, los tejidos linfoides asociados al tracto respiratorio e intestinal, incluidas las PP 31, 33. Los estudios han mostrado que la inducción de las características de migración hacia el intestino delgado de los linfocitos está regulada por la presencia de ácido retinoico que es procesado y presentado a partir de la vitamina A por las CD intestinales. La presencia de este compuesto induce en las células T la expresión de los receptores intestinales α4β7 y CCR9, mientras suprime la expresión de ligandos asociados con la migración hacia la piel, como el CLA en humanos 102. Para organizar una respuesta inmune protectora contra los patógenos intestinales, los linfocitos T vírgenes intravasculares deben llegar a los órganos linfoides del intestino que son las PP, ILF y los NLM. Las células T vírgenes que llegan a estos sitios de inducción son activadas y posteriormente abandonan los tejidos linfoides a través de los vasos linfáticos eferentes, entran a la circulación sistémica y retornan nuevamente al tejido intestinal donde ayudan a eliminar los patógenos 117. Las CD encargadas de presentar los antígenos a las células T vírgenes migran desde la lámina propia y las PP hacia los NLM, lo que sugiere que estos nódulos son el principal sitio de activación de las células T vírgenes 118, 119. El tráfico de las células T hacia el tejido intestinal es un proceso complejo dividido en tres pasos principales de adhesión y señalización; el primero es el reconocimiento de los receptores en las células endoteliales, seguido por el “arrastre” de las células en la superficie del endotelio y finalmente la adhesión firme de los linfocitos al endotelio 117. La migración de las células T vírgenes desde el torrente sanguíneo hacia los nódulos secundarios intestinales ocurre exclusivamente en las vénulas endoteliales altas (VEA) que están constituidas por células endoteliales post-capilares

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especializadas 120, 121. Las VEA asociadas con las PP expresan MAdCAM-1, mientras que las asociadas con los NLM expresan MAdCAM-1 y PNAd 117, 120. Los linfocitos vírgenes expresan L-Selectina (CD62L) a través de las cual reconocen los marcadores MAdCAM-1 y PNAd presentes en las vénulas y son retenidos para posteriormente iniciar el proceso de “arrastre”. Las interacciones entre MAdCAM-1/CD62L y PNAd/CD62L son las más eficientes para reclutar células T vírgenes a los NLM, no obstante, las interacciones entre las moléculas MAdCAM-1/α4β7 son también importantes, especialmente en el reclutamientos de los linfocitos T en las PP 117, 120. Luego de este primer reconocimiento se presenta la interacción entre el CCR7 de las células T vírgenes con los receptores CCL21 y/o CCL19 presentes en las membranas de las células especializadas de las VEA. Finalmente, estas interacciones activan a LFA-1 y a α4β7 en las células vírgenes, permitiendo la adhesión de éstas a las moléculas ICAM-1 y MAdCAM-1, respectivamente. Estas interacciones promueven la adhesión firme de las células vírgenes al endotelio y posteriormente éstas migran hacia el interior de las PP y los NLM 117, 120. En presencia de agentes patógenos las células T vírgenes localizadas en los NLM y las PP entran en contacto con las CD activadas que les presentan los antígenos en el contexto de las MHC II. Aquellas células que reconozcan el antígeno inician el proceso de activación que lleva a las células a proliferar, perder la expresión de CD62L e incrementar la expresión de las moléculas específicas de tráfico intestinal, α4β7 y CCR9, además, también incrementan la expresión de LFA-1, α4β1 y CD44 117, 120. Posterior al proceso de activación las células T vuelven al torrente sanguíneo abandonando los NLM y las PP por las vénulas eferentes. Las células activadas tiene un patrón de migración diferente al de las células vírgenes, este se caracteriza por la interacción entre α4β7/MAdCAM-1 y CCR9/CCL25. Adicionalmente, las interacciones entre PSGL-1, LFA-1, α4β1 y CD44 con los receptores localizados en las VEA: P/E-selectina, ICAM-1 e ICAM-2, VCAM-1 e hialuronato, respectivamente, también son importantes 117, 120. Finalmente, cuando los linfocitos efectores retornan al intestino se re-encuentran con una población de células presentadoras más diversa, dentro de las que se encuentran macrófagos, CD y células B. La interacción secundaria con el antígeno resulta en una respuesta mucho más rápida y vigorosa por parte de las células T efectoras. Esta activación incrementa la producción de IFN-γ, IL-17, TNF-α, linfotoxina-α e IL-2. La IL-2 promueve la expansión clonal de las células T y B, mientras que el IFN-γ activa las células presentadoras y los macrófagos, que producen mayores cantidades de IL-12. El IFN-γ, el TNF-α y la IL-17 activan las células endoteliales para que expresen más moléculas de adhesión. Adicionalmente, los macrófagos activados por la acción del IFN-γ producen mayores concentraciones de citocinas proinflamatorias como IL-1, IL-6, IL-8, IL-12,

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IL-18 y TNF-α junto con reactivos de oxígeno y metabolitos del nitrógeno 117. Las interacciones que se establecen durante este proceso terminan con la producción de mediadores de inflamación que reclutan y activan un mayor número de poblaciones de linfocitos en el tejido intestinal, induciendo inflamación.

Respuesta inmune al rotavirus

La respuesta inmune en los modelos animales Los estudios realizados en modelos animales han sido muy útiles para mejorar el entendimiento acerca de la inmunidad frente a las infecciones por rotavirus 10. Los hallazgos en el modelo murino han mostrado que los anticuerpos secretores de tipo IgA son esenciales en la protección contra las reinfecciones, además, que las células T CD4 juegan un papel muy importante en la producción de cerca del 90% este tipo de inmunoglobulinas, pero aparentemente no tienen un efecto antiviral directo, mientras que las células TCR γ/δ no tienen ninguna influencia en la protección contra la infección de rotavirus 18. De otro lado, los linfocitos T CD8 de los ratones tienen un rol importante en la eliminación del virus a través de un efecto antiviral directo y son importantes en la inmunidad contra las reinfecciones virales; aunque, al parecer, el principal mecanismo antiviral protector está dado por los anticuerpos específicos contra rotavirus 18, 122, 123. La actividad citotóxica de los LT frente a la infección por rotavirus fue demostrada inicialmente usando ratones C57BL/6 124. De forma Simultánea se demostró que en la misma cepa de ratones, la actividad citotóxica de los LT estaba dirigida principalmente a la proteína VP7 y en un menor grado a las proteínas VP4 y VP6, además, también se observó que VP7 presentaba una reactividad cruzada con diferentes tipos de rotavirus 125. De igual forma en la cepa de ratones C57BL/6 se describieron por primera vez epitopes citotóxicos de las proteínas VP721, VP3 y VP6 126. También, se han descrito respuestas citotóxicas de las células T CD8 contra la proteína NSP1 del virus 25 y otros epítopes distintos de la proteínas en ratones BALB/c 127. Por otro lado, un epítope de células T CD4 restringido a moléculas de clase II derivado de la proteína VP6 también han sido reconocido en modelos murinos 24. Además, se observó que este último epítope, junto a otros epítopes de VP6 descritos, indujeron protección independiente de anticuerpos en los ratones 128. En un estudio realizado usando ratones C57BL/6 y BALB/c se identificaron tres nuevos epítopes T CD8 y uno TCD4 22. Adicionalmente, observaron la respuesta en distintos órganos y compararon los resultados observados en ratones lactantes y adultos. Los resultados de este estudio mostraron que luego de la infección con un virus homólogo, tanto en los ratones BALB/c como en los C57BL/6, hay ausencia de una respuesta por parte de las células T CD4, contrario a lo que sucede con la respuesta de las células T CD8. Además, se observó que las respuestas de los LT tiene un pico entre los días 5 y 7

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después de la infección y que luego caen muy rápidamente, que la respuesta frente a VP6 es predominantemente intestinal, mientras que para VP7 es más sistémica y finalmente que los animales lactantes y los adultos reconocen epítopes similares 22. Los estudios acerca de la producción de citocinas realizados en ratones han mostrado que existen diferencias en los perfiles de producción de citocinas cuando se comparan ratones adultos con ratones lactantes. En los ratones lactantes posterior a un reto con rotavirus homólogos y heterólogos mostró un perfil mixto entre Th1-Th2 129, mientras que los ratones adultos infectados con cepas homólogas y heterólogas presentan un perfil de secreción de citocinas Th1 130. Un estudio donde se evalúa la respuesta de las células T obtenidas de ratones lactantes de las cepa C57BL/6 de 5 días de nacidos mostró que la respuesta a la infección por un virus homologo (EC) en bazo, NLM, e hígado es similar a la observada en ratones adultos, sin embargo, la cinética y la calidad de la respuesta es significativamente menor en los ratones lactantes que en los adultos 22. En otro estudio, donde se compara la respuesta de las células T entre ratones adultos y lactantes, buscaba evaluar la respuesta a un rotavirus homólogo (EDIM), luego de una vacunación con una dosis de intranasal de una E. coli transgénica que expresaba la proteína VP6 de rotavirus, los resultados mostraron que los animales lactantes no estaban protegidos después de 10 días post-infección (dpi) y no tenían células CD4 ni CD8. Sin embargo, a los 28 y 42 dpi estos animales se encontraban protegidos y se detectaron células T de memoria específicas de rotavirus, pero no se desarrollaron anticuerpos. Por el contrario, los animales adultos tratados de igual forma estaban completamente protegidos 10 dpi y se observaron niveles de anticuerpos IgG y células T de memoria 131. Estudios realizados en el modelo de cerdos gnotobióticos han mostrado, consistentemente, que la inmunidad protectora contra la diarrea provocada por el rotavirus u otros patógenos intestinales depende principalmente de la producción de IgA intestinal y de la generación de células B de memoria en el sitio de replicación viral. También ha sido usado extensamente para identificar los correlatos de protección contra la infección por rotavirus, estudiar la diarrea causada por esta infección y para evaluar diferentes tipos de vacunas que se pueden usar en contra del patógeno 132. Usando grupos de cerdos inoculados con cepas humanas patógenas o atenuadas, se determinó que los animales inoculados con la cepa patógena desarrollaban una respuesta de células secretoras de anticuerpos y células de memoria B a nivel de la lámina propia intestinal, mientras que los inoculados con la cepa atenuada concentraban estas dos poblaciones celulares a nivel de bazo 133, 134. Para evaluar el papel de las citocinas durante una infección por rotavirus, se realizó una cinética de secreción de diferentes citocinas en varios órganos de los cerdos infectados con diferentes cepas de virus. Los autores observaron que la protección está asociada con respuestas balanceadas entre los perfiles TH1 y TH2, además, que la inducción temprana de citocinas proinflamatorias e IFN-γ pueden ser importantes para la generación de anticuerpos

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IgA a nivel intestinal y protección contra la infección 135. Usando cerdos gnotobióticos infectados con una cepa humana virulenta o vacunados con una cepa atenuada o partículas virales vacías (VLPs), se logró determinar que la protección contra el reto viral esta correlacionada con la presencia de células T intestinales productoras de IFN-γ 136. El modelo porcino también ha sido usado para evaluar preparaciones candidatas a vacunas, recientemente, un estudio mostró que luego de la administración de tres dosis de la vacuna derivada de la atenuación de una cepa humana CDC-9, solubilizada en fosfato de aluminio, indujo títulos de anticuerpos IgG, actividad neutralizante en suero y protección contra la excreción del virus frente al reto con una cepa virulenta Wa 137. A diferencia de los resultados obtenidos en el modelo de ratón con las células T γ/δ, en el modelo de cerdos gnotobióticos, se ha observado que los linfocitos T CD2+CD8- y CD2-CD8- γ/δ en intestino tienen una función pro-inflamatoria ya sea produciendo IFN-γ o induciendo a las células CD4 α/β a proliferar y producir IFN-γ, mientras que los linfocitos T CD2+CD8+ γ/δ tienen una función reguladora mediante la translocación de FoxP3la, producción de IL-10 y TGF-β directamente o estimulando a las CD4 α/β a que los produzcan 138. En modelos de primates no humanos, se han identificado dos péptidos derivados de una cepa humana de rotavirus. Los péptidos corresponden a los fragmentos de la proteína VP6 (301-315) asociado con la producción de IFN-γ, y un péptido de mayor tamaño VP6 (293-327) que está relacionado con la producción de TNF-α 26. La respuesta de células T específicas de rotavirus en humanos La respuesta de las células T específicas de rotavirus en humanos no ha sido caracterizada en profundidad. Los ensayos de linfoproliferación se comenzaron a usar desde finales de la década de los ochenta para ayudar a entender el papel de las células T en la infección por rotavirus. En 1988, Totterdell fue el primero en utilizar los ensayos de proliferación para evaluar la respuesta de células T en respuesta a la infección por rotavirus 139. En este estudio se observó que los adultos sanos tenían una respuesta de proliferación significativamente mayor que la observada en adultos mayores y pacientes que habían recibido trasplante renal. Sin embargo, los adultos mayores presentaban una respuesta de proliferación y producción de anticuerpos específicos luego de una infección por rotavirus. Además, también se evaluó la respuesta proliferativa y los anticuerpos específicos de rotavirus en sangre de cordón y se observaron títulos detectables de anticuerpos, pero no se evidenció una respuesta proliferativa 139. En 1990, M. Yasukawa observó la importancia de la respuesta celular en las infecciones por rotavirus; los resultados mostraron que las células de pacientes adultos sanos, al ser estimuladas con rotavirus, proliferaban y producían IL-2 e IFN-γ, además, también observaron que la mayoría de las células estimuladas eran

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CD3+CD4+CD8-, presumiblemente células T ayudadoras 44. Posteriormente, se evaluó la respuesta de células T en niños y en adultos de forma simultánea 43, los resultados de esos estudios mostraron que la mayoría de los adultos sanos y los niños convalecientes de una infección por rotavirus presentan células T específicas del virus circulantes, que proliferan cuando se realizan ensayos in vitro. Además, se observó que las células de los niños menores de 2 años mostraban respuesta de proliferación para al menos una de tres de las cepas analizadas en el estudio, y que el número de serotipos reconocidos aumentaba con el incremento de la edad 43. Un año después, el mismo grupo, usando una cohorte de 8 niños menores de 2 años infectados por rotavirus, a los que les evalúo la respuesta humoral y celular en el momento de la infección, 2-5 semanas y 3-5 meses después, mostró, por primera vez, que la respuesta de células T CD4 frente a los estímulos de las cepas de rotavirus humana w179 (P1G1) y HCR3a (P no humano, G3) aumentaba luego de la primoinfección 140. Otro grupo observó respuesta de proliferación al estímulo con la proteína recombinante NSP4 en 4 de 10 adultos sanos 141. Evaluando la respuesta proliferativa de las células de niños sin gastroenteritis entre 3 y 7 años frente al rotavirus, se observó que esta respuesta es transitoria y solamente estaba presente en el 35% de la población estudiada 45, 46. Adicionalmente, cuando se estimularon células de sangre periférica de estos individuos con rotavirus se detectaron aumentos en el ARNm para IFN-γ e IL-10 y TGF-β 46. Los resultados de estos estudios son compatibles con los que se hicieron con sueros de niños infectados de manera aguda en los que se observó un incremento en suero de IFN-γ, IL-10 e IL-6 142. Los hallazgos de laboratorio han mostrado que la frecuencia de células T circulantes específicas de rotavirus en adultos son similares a las virus de mucosas respiratorias 40. Las células TCD8+ y TCD4+ específicas de rotavirus de adultos sanos producen IFN-γ pero no producen IL-13 41, IL-4 38, IL-2, IL-6 o IL-10 47. Mayores porcentajes de células T secretando IFN-γ fueron detectados en adultos sintomáticos infectados por rotavirus, pero las frecuencias son bajas en comparación con el porcentaje de células observadas en infecciones por CMV o EBV. Las frecuencias de células secretoras de IFN-γ, IL-13, IL-4, IL-2, IL-10 o IL17 en niños sintomáticos infectados por rotavirus son comparativamente muy bajas o indetectables (por debajo del límite de detección del ensayo) 38, 40, 41. Otros estudios basados en el uso de la técnica de ELISPOT con células de adultos sanos demostraron que cerca del 90% de los individuos presentaban una respuesta de memoria a los antígenos de rotavirus, además, que era posible predecir la respuesta frente a VP6 143, resultados que sugieren que VP6 puede ser un blanco importante en la respuesta contra rotavirus en humanos. Resultados obtenidos previamente en nuestro laboratorio sugieren que las células T reguladoras pueden tener un papel en la respuesta contra rotavirus 40. CMSP derivadas de adultos sanos estimuladas con el antígeno de rotavirus y depletadas de las células CD25+ mostraron un incremento de la producción de IFN-γ en

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comparación con las CMSP de adultos sanos no depletadas de CD25 40. El mismo efecto se observó cuando las CMSP de los adultos sanos fueron tratadas con el inhibidor natural de TGF-β, la molécula LAP, o con el inhibidor de la vía de señalización del TGF-β, la molécula ALK5, sugiriendo que la actividad reguladora puede estar mediada por el TGF-β40. Hasta el momento se han identificado pocos epítopes reconocidos por LT humanos específicos de RV. En el 2006 se describió un péptido de Clase I derivado de la proteína VP6, ligado a la presentación por moléculas HLA-A*0201 28 mientras que para el 2009, usando inmunogenética reversa, se describió otro epítope citotóxico de VP7 restringido a las moléculas de clase I HLA-A2.1 27. En algunos casos los epítopes de rotavirus se han asociado con el desarrollo de diabetes tipo 1 144, 145. Recientemente se ha mostrado que algunos péptidos derivados de la proteína VP7 de rotavirus en pacientes con HLA-DR4 muestran una similitud con los péptidos propios IA2 y GAD65, específicos de los islotes de células β en el páncreas, además se observó que líneas derivadas de estos péptidos de rotavirus proliferan en presencia de los péptidos propios en el contexto de las moléculas HLA-DR4 144. Últimamente, usando una metodología combinada entre la marcación con tetrámeros y citometría de masas, se identificaron seis epítopes de rotavirus restringidos a las moléculas de clase I HLA A 0201 en sangre de individuos sanos 146. Aún más allá, los autores observaron que las células específicas de los péptidos derivados de la proteína VP3 de rotavirus expresaban marcadores de células en estadios de diferenciación mayores en comparación con las células específicas derivadas de los epítopes de otras proteínas, además se observó una disminución de la expresión del marcador de migración intestinal β7, mientras que las células de los demás epítopes expresan mayoritariamente marcadores intestinales 146. En modelo de ratón se ha identificado un péptido de clase II derivado de la proteína VP6 24, mientras que en monos Rhesus también ha sido identificado un péptido de células T CD4 derivado de la misma proteína 26. La complejidad del estudio de la respuesta inmune frente al rotavirus ha aumentado debido a la descripción de la antigenemia y viremia durante la fase aguda de la infección tanto en animales y como en humanos. Contrario al concepto de que la infección por rotavirus permanecía confinada al tracto gastrointestinal, diferentes estudios han reportado que la antigenemia es un hallazgo muy común en niños inmunocompetentes infectados 14, 147, 148. En un estudio publicado en 2003 se observó que el 67% de la población de niños evaluados presentaban antigenemia, mientras que en 2005 un reporte de una epidemia de rotavirus en Jamaica 37, mostró que el 43% de los niños tenia antigenemia 147. Otras complicaciones diferentes a la diarrea como hepatitis, nefritis, neumonía, exantemas, coagulación intravascular diseminada y complicaciones neurológicas también han sido reportadas, probablemente como consecuencia de la viremia 14.

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Los estudios que han evaluado la respuesta proliferativa de las células T CD4 específicas de rotavirus 39 y de las que secretan IFN-γ 38 han mostrado que dichas células expresan en su mayoría el marcador de migración intestinal α4β7, soportando la hipótesis de que fueron estimuladas en el intestino 38. Para el caso de las células T CD8 específicas de rotavirus se ha observado que la transferencia de células efectoras α4β7+ generadas en ratones infectados a ratones Rag-2 (deficientes de células T y B) infectados con rotavirus de forma crónica, mostraron ser altamente eficientes en la eliminación de la infección del virus 149. En conclusión, la respuesta en sangre de LT específicos de rotavirus comparte muchas de las características descritas para estas células en ratones. Son células que se encuentran en bajas frecuencias pero que proliferan cuando se estimulan con el antígenos de rotavirus. En adultos las múltiples exposiciones al virus ayudan a fortalecer la respuesta contra el virus y el patrón de secreción de citocinas es de tipo TH1, mientras que en niños es difícil de establecer 40, 41; además, la mayoría de las células presentan un perfil de migración intestinal representado por la expresión de α4β7 38, 39, 149.

Inmunidad Innata contra la infección por rotavirus Los resultados de diferentes investigaciones muestran que la respuesta inmune innata es muy importante como la primera línea de defensa limitando la replicación y la enfermedad en las infecciones por rotavirus 16, 150-153. En otros modelos virales la respuesta inmune innata juega un papel clave en la intensidad y la duración de la respuesta inmune adaptativa 154, 155. Por estas razones es crucial evaluar el papel de la respuesta inmune innata en la infección por rotavirus para poder entender la patogénesis y cómo se desarrolla una respuesta inmune efectiva 156. La inducción de IFN-I e IFN-III sucede cuando componentes virales son reconocidos por las células infectadas, en una gran mayoría de los casos el componente viral reconocido de forma habitual es el ácido nucleico que incluye ARN en diferentes formas 157. Dependiendo del origen, localización celular y las modificaciones químicas, el ARN viral puede ser detectado por varias proteínas que incluyen RIG-I, MDA-5 y las moléculas TLR3, TLR7 y TLR8. El reconocimiento de los ligandos a través de estás proteínas estimula la activación de intermediarios que finalmente terminan con la expresión de las moléculas de IFN-I e IFN-III. RIG-I y MDA-5 estimulan la producción de IFN a través de la señalización de las proteínas mitocondriales MAVS e IPS-1 que llevan a la activación de IRF3/7, mientras que TLR3 lo hace por medio de TRIF y TLR7 y 8 estimulando a MyD88 que terminan por activar las proteínas de señalización IRF 157. La evidencia más reciente sugiere que la replicación de rotavirus es reconocida por RIG-I y/o MDA-5 en líneas epiteliales intestinales que inducen al IFN-I y los genes estimulados por IFN (ISGs) 16, 156. La inducción de IFN-β en líneas de células

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epiteliales es una actividad complementaria de las actividades de RIG-I y MDA-5 en los modelos de infección por rotavirus 150, 158, 159. En modelos de ratones adultos deficientes de proteínas mitocondriales MAVS se ha observado que la replicación de cepas heterólogas RRV y SA11 (rotavirus de simios) es significativamente mayor si se compara con la replicación en animales normales 150. Por otro lado, la llave TLR3-TRIF no parece tener ningún efecto en la inducción de IFN-β, debido a que ratones deficientes de TLR3 no mostraron ninguna diferencia en la excreción del virus en heces comparándolos con ratones normales infectados con la cepa SA11, ni tampoco se observó una disminución de los niveles de ARNm del IFN-β en los animales deficientes de TLR3 150. Sin embargo, un estudio reciente mostró que la inducción de IFN-β por la actividad de TLR3-TRIF se presentaba en ratones adultos pero no en infantes durante la infección por la cepa homóloga EDIM, consistente con el aumento de TLR3 y la edad de los animales 152. Hasta el momento no se conoce por qué se observan diferencias en estos dos trabajos, sin embargo, se sospecha que puede ser debida al potencial de replicación de las cepas usadas, EDIM es una cepa homóloga con alta capacidad de replicación en los ratones, mientras que RRV y SA11 son cepas heterólogas con una menor capacidad de replicación en el modelo 156. Rotavirus ha desarrollado una estrategia para limitar la expresión de IFN-I en las células infectadas a través de la proteína NSP1, que tiene la habilidad de unirse a IRF3, IRF5 e IRF7 y mediar su degradación por el proteasoma 160, 161. La habilidad de la proteína NSP1 de rotavirus de disminuir la expresión de IFN-I parece estar muy bien conservada entre las diferentes cepas de rotavirus, a pesar de las variantes de las moléculas de IRFs 162. La inhibición está relacionada con la cepa viral y el tipo de célula; por ejemplo, algunos rotavirus animales degradan IRF3, IRF5 e IRF7, mientras que las cepas humanas degradan de forma predominante IRF5 e IRF7, lo que podría estar relacionado con una menor eficiencia en la inhibición de la respuesta de IFN 162. Sin embargo, la inhibición de la producción de IFN no es suficiente para que evada la respuesta inmune innata; por ejemplo, la infección de la línea HT-29 con RRV, un virus que reconoce de forma eficiente IRF3 e IRF7, induce niveles sustanciales de IFN-I 163. Como otros virus, rotavirus es capaz de reducir el efecto de IFN inhibiendo la señalización del mismo IFN 164, este fenómeno ocurre por mecanismos desconocidos que evitan la acumulación nuclear de STAT1 y STAT2 165, y puede estar potenciando la inhibición de IFN en diferentes niveles. Además de la producción de IFN, otras citocinas son importantes como parte de la respuesta inmune innata frente a virus, algunas de estas so producidas por células epiteliales, mientras que otras como el TNF-α y la IL-1β son productos exclusivos de las células del sistema inmune 156. A parte de cumplir su papel de atracción de otras células del sistema inmune, el TNF-α también tiene un efecto antiviral 166.

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Los primeros estudios que evaluaban la producción de citocinas luego de la infección por rotavirus usaron modelos con células epiteliales teniendo en cuenta que esta es la célula blanco primaria de la infección por rotavirus. En líneas HT-29, se observó una producción elevada de IL-8 167, que es un potente quimioatrayente de neutrófilos y aunque en modelos de cabras y pájaros se observó infiltrado de neutrófilos en el intestino, aún no es claro el papel que desempeñan estas células en la infección por rotavirus 156. A diferencia de los hallazgos en células HT-29, los estudios realizados con células Caco-2 no mostraron niveles incrementados de IL-8 durante la infección por rotavirus 168, 169. La expresión de muchas de las citocinas es dependiente de la activación del factor transcripcional NF-κB luego de que la células detecta la presencia del virus. Además de IL-8, otras citocinas han sido detectadas en líneas de células epiteliales y en intestinos de ratón luego de la infección por rotavirus, algunas de ellas son RANTES, GM-CSF, GRO-α, MIP-1β, e IP-10 168, 170, Sin embargo, a pesar de que muchas de estas citocinas son importantes en la atracción de otras células del sistema inmune su importancia individual en las infecciones por rotavirus aún está por establecerse 171. Debido a que NF-κB es importante para en la inducción de las citocinas, los virus han desarrollado estrategias para contrarrestar la actividad de esta molécula 164. En el caso de rotavirus se ha observado que algunas cepas inhiben la activación de NF-κB a través de NSP-1 inhibiendo la degradación de IκB, la molécula represora del NF-κB 172. Por ejemplo, la cepa humana Wa y la cepa bovina RRV (ésta a multiplicidades de infección altas) son eficientes en evitar la translocación de NF-κB 173, sin embargo, no se ha definido el mecanismo exacto por el cual estas cepas ejercen esta actividad antiviral, pero se sospecha que es dependiente de NSP1.

Métodos para estudiar linfocitos T

Los tetrámeros La marcación de las células T antígeno específicas con multímeros de moléculas de MHC ha sido una de las herramientas más importantes para monitorear la respuesta inmune de las células T 29, 30. El concepto de usar ligando solubles para detectar receptores celulares es un protocolo muy útil para entender la función y la especificidad de una célula, sin embargo, solamente en los últimos 15 años este concepto ha sido aplicado en el análisis de las células T a través del uso de complejos MHC-péptido que se unen de manera específica a los TCR de las células T 30. El estudio de los linfocitos se caracteriza por la subdivisión de las poblaciones evaluando su especificidad antigénica 29. En los linfocitos B está aproximación no es tan problemática y su especificidad es evaluada mediante el uso de proteínas o

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haptenos específicos que son útiles para rastrar la respuesta específica de los anticuerpos 29, 174. Pero, debido a que la afinidad del TCR por los péptidos ligados a las moléculas de MHC es tan baja (tiene una constante de disociación cercana a los 50µM; 10.000 veces más débil que la interacción común entre antígeno-anticuerpo), era claro que la marcación usando de monómeros péptido-MHC no iba a ser suficientemente estable para soportar los lavados de los protocolos propuestos 175. Por lo tanto, los grupos de investigación en el área se concentraron en desarrollar diferentes métodos para multimerizar los complejos péptido-MHC con el objetivo de mejorar las características de unión del complejo. Los mejores resultados los obtuvieron usando protocolos en el que los complejos péptido-MHC eran marcados con moléculas de biotina y posteriormente podían ser tetramerizados con moléculas de estreptavidina marcada con fluocromos 176. Hasta el momento es el método más prevalente en los estudios de las células T 30. Los ensayos con tetrámeros han sido usados para la fenotipificación y conteo de células y este tipo de marcación ha mostrado tener un valor importante. Por ejemplo, ha probado ser un método más seguro de cuantificación del desarrollo de la respuesta inmune dependiente de antígeno que la clonación con dilución límite 177, ELISPOT o PCR de células individuales 30, permitiendo la recuperación de las células aisladas por medio de la citometría de flujo, sin tener en cuenta la actividad biológica de la célula 29, 30. Así, las células anérgicas pueden ser detectadas a pesar de su falta de respuesta proliferativa o la producción de citocinas 178.

Los tetrámeros de clase II Los tetrámeros de clase II se han convertido en una importante herramienta para la caracterización de la especificidad e identificar el fenotipo de las células T CD4 y han sido usadas en una variedad de estudios relacionados con vacunas y diferentes enfermedades. El mayor reto de los estudios con tetrámeros de clase II ha sido la baja frecuencia de células T CD4 específicas de antígeno en sangre periférica. Una alta respuesta posterior a una vacunación, como en el caso de tétanos e influenza, muestran niveles transitorios de células específicas de antígeno entre los rangos de 1:1.000 a 1:20.000. Células de memoria específicas de antígeno en individuos sin un refuerzo reciente se encuentran en rangos alrededor de 1:20.000 a 1:100.000; y respuestas muy raras o células de autoantígenos se observan en rangos que oscilan entre 1:100.000 a 1:1.000.000 30. Debido a estas bajas frecuencias de las células específicas de antígeno, la primera generación de ensayos con tetrámeros usaban la activación in vitro para poder detectar las células T CD4 específicas 179. No obstante, el mayor problema de estos protocolos eran los posibles cambios fenotípicos introducidos por la manipulación de las células, de la misma forma que los ensayos de ELISPOT o proliferación.

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Los métodos más recientes de la coloración de tetrámeros evitan el uso de la expansión in vitro y están basadas en tecnología de captura de células individuales 180-182 o en el análisis directo por citometría de flujo 183-186. Los criterios de selección astringentes y la purificación con perlas magnéticas se han venido usando como estrategia para eliminar las células sin especificidad por los tetrámeros. Como consecuencia, el enriquecimiento de las células específicas de antígeno se incrementa hasta 10.000 veces, permitiendo el reconocimiento de eventos raros. Adicionalmente, el uso de citometría multiparamétrica usando una variedad de marcadores celulares junto con los tetrámeros de clase II ha permitido la fenotipificación directa de las células específicas de antígeno 30.

Uso de tetrámeros de clase II en la identificación de células T específicas de antígeno en enfermedades infecciosas Los tetrámeros de clase II están siendo usados en una variedad de estudios relacionados con la inmunidad contra distintos patógenos, el desarrollo y evaluación de vacunas, respuestas antitumorales, respuestas alérgicas y autoinmunidad 30. Específicamente, se ha analizado la respuesta inmune contra influenza 187-190, Borrelia 191, Mycobacterium tuberculosis 192, 193, CMV 193, virus linfotróficoT humano 194, hepatitis C 195-197, ántrax 198, 199, SARS 200, papiloma virus humano 201 y VIH 202. Las células específicas de antígeno detectadas con los tetrámeros en sangre periférica dependen de la exposición previa al antígeno, la historia de las vacunaciones y el tiempo de inmunización. Con todo, la mayor limitante en estos estudios es la gran cantidad de epítopes posibles que se pueden presentar en los organismos complejos, no solamente en la cantidad de proteínas relacionadas con los patógenos, si no también los diferentes péptidos que se pueden procesar y presentar. Por ejemplo, hay múltiples epítopes que se pueden identificar en la respuesta contra Bacillus anthracis, y la dominancia de cada uno de ellos varía dependiendo del fenotipo del HLA del sujeto en estudio 199. Por el contrario, en algunos casos hay epítopes inmunodominantes de los patógenos que se unen indiscriminadamente a distintas moléculas de HLA: la hemaglutinina del virus de influenza H1N1 contiene un epítope (aminoácidos 306-319) que es reconocido por al menos 5 diferentes moléculas comunes de HLA humano, en consecuencia, muchas personas tienen células CD4 circulantes específicas del péptido generadas a través de la infección natural o la vacunación anual 189.

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OBJETIVOS

Objetivo general

Caracterizar los linfocitos T CD4 y T CD8 específicos de rotavirus presentes en sangre periférica de adultos sanos, niños sanos, niños vacunados y niños que recibieron placebo.

Objetivos específicos

1. Identificar cuáles de los epítopes predichos con un algoritmo, que combina los valores de unión con los de procesamiento y presentación natural, son reconocidos por los linfocitos T CD4 específicos de rotavirus en sangre periférica de adultos sanos.

2. Comparar los marcadores de migración y diferenciación que expresan los linfocitos T CD4 circulantes específicos de los péptidos de rotavirus, con los específicos del péptido de influenza, en células mononucleares de sangre periférica de adultos sanos y niños vacunados y niños que recibieron placebo. 3. Comparar los perfiles de producción de citocinas y la proliferación de linfocitos T CD4 y T CD8 de niños y adultos sanos estimulados con antígenos de rotavirus, toxoide tetánico e influenza.

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Artículos

Artículo número 1 Circulating human rotavirus specific CD4 T cells identified with a class II tetramer express the intestinal homing receptors α4β7 and CCR9. Miguel Parra, Daniel Herrera, J Mauricio Calvo-Calle, Lawrence J Stern, Carlos A Parra-López, Eugene Butcher, Manuel Franco, Juana Angel. Virology, 2014 vol. 452-453 pp. 191-201.

Introducción

La respuesta de los linfocitos TCD4 específicos de rotavirus no está bien caracterizada y en humanos la respuesta de anticuerpos protectores probablemente depende de estas células. Por lo tanto, es muy importante hacer una caracterización fina de las células T CD4 específicas de RV, marcándolas con tetrámeros de clase II, para entender cómo se desarrolla una respuesta protectora contra el rotavirus. Los tetrámeros permiten hacer una cuantificación y caracterización fenotípica ex vivo de las células T, sin necesidad de hacer una estimulación. Además, usando los marcadores de diferenciación CD62L y CD45RA, se pueden distinguir, en CMSP, las células vírgenes de las que han sido estimuladas con los antígenos de rotavirus. Incluso, usando los marcadores de migración intestinal CCR9 y α4β7 se puede determinar si las células de memoria específicas de rotavirus tienen la capacidad de migrar hacia el tracto gastrointestinal, específicamente hacia el intestino delgado. Actualmente hay dos vacunas contra rotavirus en el mercado, las cuales han sido incluidas en diferentes países dentro de los programas de inmunización nacionales. Pero, no hay certeza de que el uso de estos biológicos genere una respuesta de células T CD4. Usando el marcaje con los tetrámeros de rotavirus es posible comparar las poblaciones de células T CD4 de niños después de la segunda dosis de la vacuna Rotarix® y las poblaciones de T CD4 de niños que recibieron placebo, para determinar si la vacunación genera una respuesta de células específicas de rotavirus y adicionalmente, establecer los perfiles de diferenciación y migración de estas células.

Materiales y Métodos Análisis Bioinformático: para identificar los posibles epítopes específicos de DR1 de las células T CD4 específicas de rotavirus se usó un algoritmo diseñado por los

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Drs. Larry Stern y Mauricio Calvo-Calle, que combinan los puntajes de los algoritmos SYFPHEITI y P9 203. Tipificación del HLA DR-DQ en baja y mediana-alta resolución: se usaron los kits de SSP de baja y mediana-alta resolución de Dynal-Invitrogen, de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Estimulación de CMSP de voluntarios adultos sanos: CMSP de voluntarios adultos sanos fueron estimuladas con los péptidos identificados, organizados en 8 grupos de 5 péptidos cada uno; teniendo en cuenta los resultados observados, se hizo un análisis con péptidos individuales para identificar los péptidos reconocidos por los voluntarios. ELISA de competición: para establecer si los péptidos seleccionados se unían al HLA DRβ1*0101, se realizaron pruebas de ELISA de competición con los péptidos seleccionados contra un péptido de influenza (HA306-318) biotinilado que se une a las moléculas solubles de DRβ1*0101 y DRβ1*0401. Generación de líneas específicas a partir de CMSP de voluntarios adultos sanos: CMSP fueron estimulados con 10µg del péptido durante 12-14 días de cultivo en medio RPMI más suero humano AB en presencia de IL-2r. Se evaluó la especificidad de las líneas generadas re-estimulando las células con los péptidos específicos en presencia de células “alimentadoras” autólogas. Para establecer si la presentación de los péptidos ocurría a través de las moléculas de DR1 se bloqueó la presentación de los péptidos usando anticuerpos anti HLA-DR y anti HLA-DQ. Ensayos de proliferación: la proliferación de CMSP de los adultos DR1 se evaluó con CFSE. Las células fueron incubadas por 5 días a 37°C 5% CO2, posteriormente fueron teñidas con marcadores de células T y analizadas por citometría de flujo. Marcación con tetrámeros de las líneas específicas, CMSP frescas de adultos sanos y CMSP congeladas de niños: células de las líneas, CMSP frescas de 12 voluntarios adultos sanos DR1 y CMSP congeladas de 6 niños DR1 (3 que recibieron placebo y 3 vacunados) fueron marcados con los tetrámeros de rotavirus, influenza y transferrina; además, en las células T CD4 tetrámero positivas se evaluó la producción de citocinas y los perfiles de migración y diferenciación.

Resultados De los 39 péptidos identificados por el algoritmo, tres de ellos (NSP2-3, VP3-4 y VP6-7) fueron reconocidos por CMSP de los adultos sanos DR1. Los tres péptidos se unen fuertemente a las moléculas de HLA DRβ1*0101, pero no a las

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DRβ1*0401. El péptido VP6-7 fue reconocido por células derivadas de líneas expandidas con el virus RRV completo; además, las células de las líneas marcadas con el tetrámero específico del péptido son funcionales, porque producen IFN-γ y TNF-α luego de la re-estimulación específica. Cuando se evaluó la presentación de los péptidos se observó que los epítopes son presentados en el contexto de las moléculas DR. La coloración de CMSP frescas de adultos sanos mostró que las células de memoria de RV marcadas con los tetrámeros específicos expresan los marcadores de migración intestinal CCR9 y α4β7, mientras que las marcadas con los tetrámeros de influenza son en su mayoría dobles negativas. Al comparar las células de memoria de los niños vacunados y los niños que recibieron placebo, marcadas con el tetrámero de RV, también se observó que las células específicas de RV de los niños vacunados expresan los marcadores de migración intestinal.

Conclusiones Se encontró que las células T CD4 de memoria específicas del péptido de RV VP6-7 expresan marcadores de migración intestinal, hallazgo que sustenta la hipótesis de la compartimentalización de la respuesta inmune. También se evaluó al uso de los tetrámeros como posible herramienta para identificar las células T específicas de rotavirus en respuesta a la vacunación, teniendo en cuenta que los niños vacunados presentaban estas células y los que recibieron placebo carecían de ellas.

Limitaciones Debido a que los péptidos fueron seleccionados por métodos bioinformáticos, y sólo se tuvieron en cuenta los asociados con las moléculas de HLA DRβ1*0101, es necesario ampliar el estudio incrementando el número de péptidos y de moléculas de clase II. La cantidad de niños que se pudo evaluar fue muy pequeña, teniendo en cuenta la cantidad de sangre que se puede extraer de un niño de 4 meses de edad y debido a que en Colombia la mayoría de las personas son DRβ1*04 y DRβ1*07.

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Texto del artículo 1

Circulating human rotavirus specific CD4 T cells identified with a classII tetramer express the intestinal homing receptors α4β7 and CCR9

Miguel Parra a, Daniel Herrera a, J. Mauricio Calvo-Calle b, Lawrence J. Stern b,Carlos A. Parra-López c, Eugene Butcher d, Manuel Franco a, Juana Angel a,na Instituto de Genética Humana, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombiab Department of Pathology, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA 01655, USAc Facultad de Medicina, Departamento de Microbiología, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombiad Laboratory of Immunology and Vascular Biology, Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 4 October 2013Returned to author for revisions30 October 2013Accepted 20 January 2014

Keywords:Rotavirus (RV)T cellsIntestinal homing receptorsMHC class II tetramers

a b s t r a c t

Using a consensus epitope prediction approach, three rotavirus (RV) peptides that induce cytokinesecretion by CD4 T cells from healthy volunteers were identified. The peptides were shown to bind HLA-DRB1n0101 and then used to generate MHC II tetramers. RV specific T cell lines specific for one of thethree peptides studied were restricted by MHC class II molecules and contained T cells that bound thetetramer and secreted cytokines upon activation with the peptide. The majority of RV and Flu tetramerþ

CD4 T cells in healthy volunteers expressed markers of antigen experienced T cells, but only RV specificCD4 T cells expressed intestinal homing receptors. CD4 T cells from children that received a RV vaccine,but not placebo recipients, were stained with the RV-VP6 tetramer and also expressed intestinal homingreceptors. Circulating RV-specific CD4 T cells represent a unique subset that expresses intestinal homingreceptors.

& 2014 Elsevier Inc. All rights reserved.

Introduction

Rotavirus (RV) is the leading worldwide cause of severegastroenteritis in children under the age of 5 years (Tate et al.,2012). Two vaccines (Rotarix™ and Rotateq™) have been includedin national immunization programs in many countries (Glass et al.,2012), but their efficacy is relatively low in some African and Asiancountries, where they are most needed (Angel et al., 2012). Thus,improvement of current vaccines or generation of new RV vaccinesis desirable; however, an important drawback to this end is thelack of optimal immune correlates of protection after vaccination(Angel et al., 2012).

The protective immune response to RV in humans and animalsis mediated by intestinal IgA (Blutt et al., 2012; Franco et al., 2006),which is, at least partially, T cell dependent: on the one hand, inthe murine model the CD4 T cells are essential for the develop-ment of RV-specific intestinal IgA (Franco and Greenberg, 1997).On the other hand, children with T and/or B immunodeficienciesget chronically infected with RV, suggesting that both arms of theimmune system are important in clearance of RV infection (Gilgeret al., 1992). Our group has observed that higher frequencies of RV-specific CD8 and CD4 T cells secreting IFN-γ circulate in

symptomatically infected adults and RV-exposed laboratory work-ers, compared with healthy volunteers. (Jaimes et al., 2002). Incontrast, children with RV diarrhea had low or below detectionlevels of RV-specific CD8 and CD4 T cells secreting IFN-γ (Jaimeset al., 2002; Mesa et al., 2010; Rojas et al., 2003). Consequently,monitoring of RV-specific CD4 T cells responses after vaccinationmay require a direct and highly sensitive assay.

The expression of tissue-homing receptors defines subsets ofmemory T cells that preferentially home to the skin or gut (Butcherand Picker, 1996; Sallusto and Lanzavecchia, 2009). These recep-tors are imprinted by dendritic cells in developing T cells andpromote trafficking properties based on the site-specific expres-sion of their ligands (Sigmundsdottir and Butcher, 2008). Gastro-intestinal associated lymphoid tissue dendritic cells metabolizefood-vitamin A into retinoic acid, which induces the T cells toexpress high levels of the gut-homing receptors α4β7 and CCR9,predisposing the migration of the recent activated T cells from theblood to the effector sites in the gut mucosa (Mavigner et al.,2012). The natural ligand of the α4β7 integrin is the mucosaladdressing cell adhesion molecule-1 (MAdCAM-1), which isexpressed by endothelial cells of the lamina propria along theentire intestine. Whereas, CCL25, the ligand of CCR9, is onlyexpressed by small intestine endothelial and epithelial cells(Mavigner et al., 2012). Thus, T cells that express both markersare conditioned to home to the small intestine.

RV predominantly replicates in mature enterocytes of the smallintestine, but also has a systemic dissemination (Blutt et al., 2003)

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journal homepage: www.elsevier.com/locate/yviro

Virology

0042-6822/$ - see front matter & 2014 Elsevier Inc. All rights reserved.http://dx.doi.org/10.1016/j.virol.2014.01.014

n Correspondence to: Instituto de Genética Humana, Facultad de Medicina,Pontificia Universidad Javeriana, Carrera 7 No. 40-62, Bogotá, Colombia.Tel.: þ57 1 3208320x2790; fax: þ57 1 2850356.

E-mail address: [email protected] (J. Angel).

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and, consequently, both intestinally and systemically primed Tcells are expected to be generated (Franco et al., 2006). Usingpurified subsets of peripheral blood mononuclear cells (PBMC)that express the intestinal homing receptor α4β7, we found thatRV-specific CD4 T cells secreting IFN-γ from adult volunteerspreferentially express this receptor (Rojas et al., 2003). Withsimilar studies other investigators have shown that in healthyadults circulating CD4 T cells that proliferate in vitro in response toRV also express α4β7 (Rott et al., 1997). All of these studies havethe drawback that subsets of T cells expressing the homingreceptor have to be purified before their identification in thefunctional studies, which may change their phenotype. Moreover,no studies have assessed the expression of CCR9 on human RV-specific T cells.

Recently, the use of MHC class II tetramers for characterizationof CD4 T cells populations (Vollers and Stern, 2008) has appearedas a new important tool to characterize antigen-specific T cellsagainst different viruses (Nastke et al., 2012; Nepom, 2012). Also,tetramers have been used to examine the CD4 T cells responsesafter vaccination against influenza (Flu) (Danke and Kwok, 2003)and anthrax (Laughlin et al., 2007). The tetramers permit theex vivo quantification and phenotypic characterization of T cellswithout T cell activation.

In the present study, we identified the first HLA-DR1-restrictedhuman RV-specific CD4 T cell epitope, and used MHC class IItetramers to characterize the phenotype of the T cells specific to thisepitope. T cells specific for the RV peptide tetramer, but not for a Fluvirus peptide-tetramer, expressed intestinal homing receptors. More-over, antigen experienced CD4 T cells from children that received aRV vaccine, but not from placebo recipients, were stained with the RVtetramer and expressed intestinal homing receptors.

Results

Prediction of RV epitopes

We used a consensus approach that combined P9 binding andSYFPEITHI presentation algorithms to predict HLA-DR1-restrictedT cell epitopes (Calvo-Calle et al., 2007) from the KU strain of RV(Table S1). Thirty-nine 9-mer sequences with high scores wereselected: 11 were derived from non-structural proteins and theremaining 28 were derived from structural proteins (Table S1).Peptides were synthesized as 21-mers, containing the 9-mersequence of interest flanked by six aa residues on each side.

Screening of peptide pools and identification of individual peptidesrecognized by CD4 T cells from healthy adults

The 39 peptides were organized in eight pools of five peptideseach (pool 8 only had four peptides) according to the algorithmscore; the five peptides with the lowest scores were arranged inpool 1, and the four peptides with highest scores were joined inthe pool 8. We expected that HLA-DR1-peptides selected would berecognized by CD4 T cells from individuals of other MHC haplo-types, because of the broadly specific “promiscuous” peptidebinding motifs characteristic of most human MHC class II protein,that give rise to the concept of “MHC class II supertypes”(Greenbaum et al., 2011). For this reason, all 18 volunteers selectedfor our screening experiments expressed MHC haplotypes belong-ing to the DR-1 supertype (Table S2) (Greenbaum et al., 2011).

PBMC of 18 healthy volunteers were obtained and CD4 T cellresponses to pools of peptides were evaluated by ex-vivo intracel-lular cytokine staining of IFN-γ and IL-2. CD4 T cells from fourvolunteers (HA-02; HA-04; HA-05 and HA-06) responded againstthe peptide pools: cells from volunteer HA-06 recognized pools

7 and 8 (Fig. 1A), cells from volunteer HA-05 recognized pool 5(CD4 IL-2þ: 0,0232%), and cells from volunteers HA-02 (CD4 IL-2þ: 0.0208%) and HA-04 (CD4 IL-2þ: 1.284%) recognized pool 7(data not shown). Positive pools were deconvoluted to individualpeptides using the same assay. Fig. 1B shows the frequency of cellsfrom volunteer HA-06 producing IL-2 in response to peptides frompools 7 and 8. Three peptides (VP6-7, NSP2-3, and VP3-4) werefound to induce IL-2 production by CD4 T cells from the HLA-DR1-volunteers: VP6-7 induced IL-2 production in cells from volunteers

SEB DMSO 1 2 3 4 5 6 7 80.0

0.5

1.0

1.58

10

12

14

16

Peptide pool number

% C

D4-IL

2+%

CD4

-IL2+

SEB

DMSO

VP3-

4

VP2-

3

VP3-

3

NSP6

-1

VP6-

7

NSP1

-5

NSP2

-3

VP4-

5

NSP1

-4

0.000.010.020.030.040.05

1012141618

20

0.0 0.5 1.00.01

0.1

110

100DMSOSEBVP1-1VP3-4VP6-7

% C

D4-IL

2+

Peptide Concentration ug/ml

Fig. 1. CD4 T cells from one healthy adult recognize peptide pools and individualRV peptides. PBMC from HA-06 were stimulated with peptide pools (A),or individual peptides (B), at a concentration of 1 mg/ml or with different doses(C) during 10 h at 37 1C and for the last 5 h, 1 mg/ml of brefeldin A was added. Thefrequencies of T cells producing IL-2 and IFN-γ were evaluated by intracellularcytokine staining. SEB was used as a positive control. Responses were consideredpositive if the number of IL-2 or IFN-γ-producing CD4 T cells was at least twice thatof the DMSO control and above 0.02% (dashed lines). In the experiments shownT cells did not produce IFN-γ.

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HA-06 (Fig. 1B), HA-02, and HA-04; and also IFN-γ production incells from HA-06 (data not shown). In addition, VP3-4 induced IL-2production in cells from volunteer HA-06 (Fig. 1B), and NSP2-3 incells from HA-04 (data not shown). No response was seen toindividual peptides of pool 5 from volunteer HA-05 (data notshown).

The percentage of cells producing IL-2 in response to VP6-7peptide used to stimulate PBMC from the volunteers HA-06(Fig. 1C), HA-02, and HA-04 (data not shown) was dose dependent.A similar result was obtained stimulating cells from volunteerHA-06 with VP3-4 peptide (Fig. 1C), but no dose effect wasobserved with cells from volunteer HA-04 stimulated withNSP2-3 (data not shown).

RV peptides bind HLA-DR1 molecules

To evaluate if the initial 9-mer sequences defined using pre-diction algorithms bind to recombinant DR1 and DR4 MHCmolecules, the nine aa core of the peptides NSP2-3, VP3-4 andVP6-7, with one aa addition at both ends, were synthetized andtested for HLA-DR1 and HLA-DR4 binding in a competition bindingassay with a biotinylated high affinity DR1- and DR4-bindingpeptide from Flu haemagglutinin HA306–318 (Fig. 2). Compared toHA peptide (IC50 96 nM), VP6-7 (IC50 2 nM) and NSP2-3 (IC50

15 nM) peptides bound to the HLA-DR1 molecules with relativelyhigher affinity and VP3-4 peptide bound with similar affinity (IC50

73 nM). In contrast, all RV peptides show low affinity binding tothe HLA-DR4 molecules (IC50 from 0.8 μM to 55 μM) (Fig. 2). Basedon these results, DR1 tetramers were synthetized with the RVpeptides NSP2-3, VP3-4, and VP6-7.

RV peptide VP6-7 is recognized by RRV specific T cell lines

To evaluate if the selected peptides were processed andpresented after viral infection, RRV-T cell lines were derived from2 HLA-DR1 healthy volunteers (HA-02 and HA-41) and stainedwith the three RV DR1-tetramers. RRV-T cell lines derived fromboth volunteers only stained with VP6-7-tetramers (Fig. 3A anddata not shown). In addition, after restimulation of RRV-T cell linesfrom volunteers HA-02 and HA-52 with RRV and VP6-7 peptide,CD4 T cells producing TNF-α and/or IFN-γ were identified in bothcases (data not shown). Only one of these cell lines producedcytokines after restimulation with NSP2-3 and neither of themafter restimulation with the VP3-4 peptide (data not shown).

RV peptides are presented to CD4 T cells in the contextof HLA-DR molecules

To determine if the three RV peptides were presented in thecontext of HLA-DR molecules, peptide specific T cell lines from twoindividuals (HA-02 [DRB1n01:01] and HA-06 [DRB1n01:02]) wererestimulated with the corresponding or control peptides in theabsence or presence of LB3.1 or SPV-L3 antibodies (directedagainst HLA-DR or HLA-DQ molecules, respectively) and IFN-γproduction was evaluated by intracellular cytokine staining. Thefrequency of CD4 T cells specific for VP6-7, NSP2-3 and VP3-4producing IFN-γ decreased in the presence of LB3.1, but not in thepresence of SPV-L3 (Fig. 3B and data not shown): IFN-γ productionof VP3-4-T cell line from HA-02 volunteer was reduced approxi-mately 55% in the presence of LB3.1 and only 6% in the presence ofSPV-L3 (Fig. 3B). From volunteer HA-06, only a VP6-7 specific T cellline was obtained and the response of these cells was alsospecifically inhibited by LB3.1 (data not shown). These resultsprovide additional evidence that RV peptides are presented in thecontext of HLA-DR molecules, as indicated by tetramer staining.

VP6-7-MHC class II tetramers recognize functional peptide-specificCD4 T cells in T cell lines

To provide additional evidence that VP6-7-tetramers recognizefunctional VP6-7-specific CD4 T cells, T cell lines from twovolunteers (HA-02 and HA-19) were stained with tetramers (TRFor VP6-7) and restimulated with VP6-7 peptide or DMSO (asnegative control), and the production of IFN-γ and TNF-α wasevaluated by intracellular cytokine staining. When the VP6-7-T cellline from HA-02 was restimulated with VP6-7 peptide almost 70%of the VP6-7-tetramer positive CD4 T cells produced cytokines(TNF-α and/or IFN-γ), whereas in the control stimulated T cell lineonly a low number (10%) of tetramer positive cells producedcytokines (Fig. 3C). Similar results were obtained with a VP6-7-Tcell line derived from HA-19 volunteer (data not shown).

CD4 T cells from DR1 healthy adults proliferate and produce cytokinesafter stimulation with RV peptides

Fresh PBMC from eight DRB1n0101 (HA-02, HA-15, HA-19,HA-23, HA-29, HA-41, HA-51 and HA-52) and two DRB1n0102healthy volunteers (HA-04 and HA-06) were stimulated withthe three RV peptides and evaluated 10 h later by intracellular

100 101 102 103 104 1050

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

Peptide Concentration (nM)

HA peptideVP3-4aVP6-7aNSP2-3a

100 101 102 103 104 1050

10

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30

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Peptide Concentration (nM)

%HA

-Bio

Pep

tide

Fig. 2. RV peptides bind HLA-DR1 but not HLA-DR4. Competition binding assays for RV (NSP2-3, VP3-4, and VP6-7) and Flu (HA306-318) peptides were performed. Thegraphics show inhibition of binding of the biotinylated HA306-318 peptide to HLA-DR1 (A) and HLA-DR4 (B) by increasing amounts of RV and Flu peptides. Results wereanalyzed using GraphPad Prism Software version 6.

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cytokine staining (IL-2, TNF-α and IFN-γ), and 5 days later forproliferation using CFSE staining. Five DRB1n0101 (HA-15, HA-19,HA-29, HA-51 and HA-52) and one DRB1n0102 (HA-04) healthy adultshad detectable levels of cytokine producing CD4 T cells (Table 1). CD4T cells from HA-15 and HA-19 produced IL-2 after stimulation withVP6-7. CD4 T cells from HA-51 and HA-52 produced TNF-α afterstimulation with VP6-7. Cells from HA-29 responded to VP3-4stimulation producing TNF-α and cells from HA-04 responded toVP3-4 producing TNF-α and to VP6-7 producing IFN-γ (Table 1). CD4 Tcells of HA-02 proliferated in response to the three RV peptides (NSP2-3, VP3-4, and VP6-7), whereas CD4 T cells obtained from HA-19 andHA-23 only proliferated to NSP2-3 stimulus. Thus, although approxi-mately 60% of DR1 individuals have peptide-specific T cells detectableby intracellular cytokine staining or proliferation, these responses donot seem to occur simultaneously.

Antigen experienced CD4 T cells of healthy volunteers stained withVP6-7-tetramer are enriched in the populations expressing theintestinal homing receptors

Fresh PBMC from the same eight DRB1n0101 healthy donorsdescribed above were stimulated with the three RV peptides inorder to generate specific T cell lines. Specific T cell lines for VP6-7were obtained in all eight individuals and specific T cell lines forNSP2-3 and VP3-4 each in four individuals (Table 2). T cell linesfrom three volunteers (HA-02, HA-51 and HA-52) were expandedwith three peptides; T cell lines from two volunteers (HA-15 andHA-19) were expanded with two peptides and T cell lines fromthree volunteers only recognized VP6-7 (Table 2).

To compare the phenotype of RV- and Flu-specific T cells of thevolunteers in which T cell lines were expanded, PBMC were stainedwith the TRF-, Flu-, and the corresponding RV-peptide tetramers(Fig. 4A and B). The relative numbers of the CD4 T cells that stainedwith the tetramers VP6-7 and Flu (medians of 27/6.0!105 and45/6.0!105 CD4 T cells, respectively) were higher than those stainedwith the TRF-tetramer (median of 9/6.0!105 CD4 T cells) (Wilcoxontest p¼0.011 and p¼0.003, respectively). Most of the CD4 T cellsstained with VP6-7- and Flu-tetramers (medians of 63.5% and 67.05%,respectively) showed a phenotype of antigen experienced cells(CD62L#CD45RAþ /# and CD62LþCD45RA#) and no statistical differ-ences were observed in the frequencies of these cells (Table 2, Fig. 4C).Antigen experienced CD4 T cells stained with VP6-7-tetramer wereenriched in the populations expressing the intestinal homing recep-tors: α4β7þCCR9þ and α4β7þCCR9# (Table 2, Fig. 4B and D). In con-trast, antigen experienced CD4 T cells stained with Flu-tetramer wereenriched in the α4β7#CCR9# population (Table 2, Fig. 4B and D).

RV-tetramerþ CD4 T cells in vaccinated children are enriched in thepopulations expressing the intestinal homing receptors

To evaluate if RV vaccination induced the expansion of RV-CD4 Tcells of children, PBMC from three HLA-DR1-vaccinated and threeHLA-DR1-placebo recipient children, obtained 2 weeks after thesecond dose of the RIX4414 human attenuated RV vaccine or placebo(Rojas et al., 2007), were stained with the VP6-7- or control TRF-tetramers, and the same panel of markers previously used in adults.Because of the limited amount of sample available from vaccinatedchildren only direct PBMC staining and not T cell line experimentswere performed. The vaccinated, but not placebo recipient children,had detectable plasma levels of RV-specific IgA after two doses of RVvaccine (data not shown). In vaccinated children and placebo recipientchildren from 40–71% and 0–8%, respectively, of VP6-7-tetramerþ

cells had the phenotype of antigen-experienced cells (data not shown).In both groups of children, of the CD4 T cells stained with the TRF-tetramer only 0–30% of cells had this phenotype (data not shown). Invaccinated children, VP6-7 antigen experienced CD4 T cells weredetected at low frequencies (0.001–0.1%). In all 3 cases, most of theantigen experienced CD4 tetramerþ T cells expressed α4β7, and intwo children (Fig. 5A, two top panels), most cells expressed both, α4β7and CCR9, homing receptors. In vaccinated children the TRF-tetramer

Table 1Cytokine production and proliferation of CD4 T cells after stimulation with RVpeptides.

Healthyadult

Peptidestimulus

CD4 T cytokineproduction

CD4 Tproliferation

HA-02 NSP2-3 # þVP3-4 # þVP6-7 # þ

HA-15 NSP2-3 # #VP3-4 # #VP6-7 IL-2(þ) #

HA-19 NSP2-3 # þVP3-4 # #VP6-7 IL-2(þ) #

HA-23 NSP2-3 # þVP3-4 # #VP6-7 # #

HA-29 NSP2-3 # #VP3-4 TNF-α(þ) #VP6-7 # #

HA-41 NSP2-3 # #VP3-4 # #VP6-7 # #

HA-51 NSP2-3 # N.D.VP3-4 # N.D.VP6-7 TNF-α(þ) N.D.

HA-52 NSP2-3 # N.D.VP3-4 # N.D.VP6-7 TNF-α(þ) N.D.

HA-04a NSP2-3 # N.D.VP3-4 TNF-α(þ) N.D.VP6-7 IFN-γ(þ) N.D.

HA-06a NSP2-3 # #VP3-4 # #VP6-7 # #

þ , at least two-times background values.N.D.: not done.

a HLA DRB1 0102 Healthy volunteer.

Fig. 3. Response of RRV and peptide specific T cell lines. (A) A RRV-T cell line was obtained from a healthy adult (HA-02), then restimulated with RRV, NSP2-3, VP3-4 orVP6-7, and finally stained with the TFR-tetramer or the corresponding RV-tetramers. Left panel: RRV-T cell line restimulated with RRV and stained with the TRF-tetramer.Middle panel: RRV-T cell line restimulated with NSP2-3 peptide and stained with the NSP2-3-tetramer. Right panel: RRV-T cell line restimulated with VP6-7 peptide andstained with the VP6-7-tetramer. This T cell line only recognizes the VP6-7 tetramer. (B). A VP3-4 specific T cell line from HA-02 was restimulated with DMSO (upper leftpanel), VP1-4 as a control peptide (upper right panel), or VP3-4 in the absence (upper center panel) or in the presence of an isotype control antibody (lower left panel), LB3.1(lower center panel), or SPV-L3 (lower right panel) antibodies, which are directed against HLA-DR or HLA-DQ molecules, respectively, and the frequencies of cells producingIFN-γwere evaluated by intracellular cytokine staining. (C) A VP6-7 specific T cell line from HA-02 was stimulated with DMSO (left panels) or VP6-7 (middle and right panels)for 6 h at 37 1C and stained with the VP6-7-tetramer (upper right and left panels) or TRF-tetramer (upper center panels). Tetramerþ cells were evaluated by intracellularcytokine staining for TNF-α and IFN-γ production (lower panels). Numbers inside all graphics represent percentages of populations. Responses were considered positive if thefrequency of TNF-α and/or IFN-γ-producing CD4 T cells was at least twice that of the DMSO control stimulated cells.


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(Fig. 5A, left panels) stained from 4 to 10 times less antigenexperienced cells than the VP6-7-tetramer (from o0.0001% to0.01%). In placebo recipients (Fig. 5B), VP6-7- and TRF-tetramersdetected antigen experienced CD4 T cells at similar low levels(o0.0001–0.003%).

Discussion

We have identified a RV CD4 T cell epitope (VP6-7) and shown thatcells stained with HLA-DR1 tetramers loaded with a peptide corre-sponding to this epitope, but not a Flu peptide, expressed intestinalhoming receptors (Fig. 4). Moreover, studies with a low number ofvaccinated children showed that this type of reagent might be usefulto monitor the RV CD4 T cell response in vaccine trials (Fig. 5).

Of 39 predicted epitopes, three peptides were identified byscreening of PBMC from healthy adults by intracellular cytokinestaining; all of them also bound to HLA-DRB1n0101 molecules(Figs. 1 and 2). The VP6-7 peptide is probably processed andpresented after RV infection, since it was recognized by arotavirus-T cell line (Fig. 3A). Moreover, peptide specific T celllines were DR-MHC restricted (Fig. 3B) and VP6-7-tetramers wererecognized by cells of vaccinated but not placebo recipientchildren (Fig. 5), characterizing this peptide as a RV epitope. Thisepitope overlaps totally with one previously found in mice (Bañoset al., 1997) and partially with a VP6 epitope found in Rhesus

macaques (Zhao et al., 2008), which suggests that this region isparticularly prone to be recognized by CD4 T cells. Although a RVspecific class II restricted human T cell epitope had been previouslydescribed (Honeyman et al., 2010), our studies are the first tocharacterize epitope specific CD4 T cells with tetramers.

HLA supertypes are defined as a set of HLA (class I or II)associated with largely overlapping peptide/binding repertoires.Recently, three different class II DR supertypes were classified(main DR, DR4 and DRB3) (Greenbaum et al., 2011), and all of thehealthy adults volunteers for our screening experiments wereselected for having the main DR supertype, which includes HLA-DR1 and many other class II molecules. Contrary to our expecta-tions, only HLA-DR1 healthy adults recognized three peptides.However, in one DRB1n0102 individual VP6-7 T cell line weregenerated and their stimulation was inhibited by an anti-DRmonoclonal antibody, suggesting that at this level promiscuityfor HLA binding exists. The levels of promiscuity of viral epitopesvaries between studies from low (Kwok et al., 2008; Nepom, 2012)to moderate (Roti et al., 2008). Further studies are necessary toclarify the reasons for these differences.

Ex vivo tetramer staining of PBMC from healthy adults showed thatCD4 T cells specific for the VP6-7 peptide expressed intestinal homingreceptors. This result is in agreement with our previous report, inwhich we observed that RV-specific IFN-γ secreting CD4 T cells fromadult volunteers preferentially express the intestinal homing receptorα4β7 (Rojas et al., 2003). The present findings extend these results by

Table 2Ex vivo phenotyping of Tetramerþ CD4 T cells of DRB1n0101 healthy adults with RV peptide specific T cell lines.

Healthy adult Peptidetetraer

No. of Tetþ /6.0"105

CD4þ T cells% Antigenexperienced T cellsa

% α4β7(þ)CCR9(#) b

% α4β7(þ)CCR9(þ)b

% α4β7(#)CCR9(#)b

% α4β7(#)CCR9(þ)b

HA-02 TRF 8 54.5 33.3 33.3 33.3 0FLU 36 68.4 42.3 7.69 50 0NSP2-3 10 53.8 85.7 14.3 0 0VP3-4 16 61.1 54.5 9.09 27.3 9.09VP6-7 28 85.7 63.3 26.7 3.33 6.67

HA-15 TRF 4 0 c c c c

FLU 30 83.3 25 12.5 62.5 0VP3-4 16 23.1 50 0 50 0VP6-7 22 63.2 63.6 27.3 9.09 0

HA-19 TRF 10 85.7 8.33 33.3 33.3 25FLU 24 65.7 21.7 0 78.3 0NSP2-3 18 48.1 30.8 7.69 61.5 0VP6-7 26 64.1 28 4 64 4

HA-23 TRF 8 57.1 25 25 50 0FLU 60 91.2 32.7 3.85 61.5 1.92VP6-7 24 87 75 15 10 0

HA-29 TRF 14 50 0 50 50 0FLU 48 59.3 6.25 12.5 81.2 0VP6-7 32 38.9 57.1 14.3 28.6 0

HA-41 TRF 3 100 33.3 0 66.7 0FLU 42 97.1 3.03 0 90.9 6.06VP6-7 25 67.3 50 0 50 0

HA-51 TRF 98 36.7 44.8 20.7 27.6 6.9FLU 155 40.6 50.7 15.5 31 2.82NSP2-3 63 31.7 34.6 30.8 26.9 7.69VP3-4 54 37.5 45.8 12.5 29.2 8.33VP6-7 50 41.5 58.8 23.5 5.88 11.8

HA-52 TRF 72 27.3 66.7 0 33.3 0FLU 284 25.4 40.3 8.06 50 1.61NSP2-3 140 17 55.6 11.1 27.8 5.56VP3-4 149 22.6 35.7 0 57.1 7.14VP6-7 134 16.5 31.2 25 43.7 0

a Antigen experienced cells are CD62L# , CD45RAþ /# and CD62Lþ CD45RA# (Fig. 4B).b Percentages correspond to antigen experienced cells.c No antigen experienced cells were identified.


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showing that RV-tetramerþ antigen experienced (CD62L"CD45RAþ /" and CD62LþCD45RA") CD4 T cells express both α4β7 andCCR9 and, thus, are prone to home to the small intestine. Compared tototal non-antigen specific T cells, VP6-7 specific T cells are enrichedapproximately 10 times in CCR9 expressing cells (Fig. 4A and B),indicating that this is indeed a unique subset. Further studies arenecessary to determine if these circulating dual α4β7 and CCR9expressing RV-specific T cells have a unique TCR repertoire.

The generation of RRV- or RV peptide-specific T cell linessupport the results obtained with ex vivo tetramer staining.Characterization of T cell lines expanded with RRV showed thatVP6-7 and NSP2-3 are processed and presented by infected cells(Fig. 3A and data not shown). However, peptide-specific T cell lineswere obtained after stimulation of PBMC with all three peptides(Table 1). Moreover, responses of T cell lines specific for the threepeptides generated from PBMC obtained from an HLA-DRB1n0101

CD4 Tet+Antigen Exp.0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CD4 Tet VP6-7+CD4 Tet Flu+

% C

D4

Tetra

mer

+ cells

4 7+CCR9+ 4 7+CCR9- 4 7-CCR9- 4 7-CCR9+0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100p=0.0078 p=0.0195 p=0.0039

Fig. 4. Phenotype and expression of homing receptors of CD4 tetramerþ T cells of healthy adults. Fresh PBMC were obtained from HLA-DRB1n0101 healthy adults and stainedwith the Flu-tetramer (left panels), the TRF-tetramer (center panels) or the VP6-7-tetramer (right panels) and antibodies against differentiation markers and intestinal homingreceptors. After gating on live CD3 T cells, total (A) or tetramerþ (B) CD4 T cells (top panels) were analyzed to identify antigen experienced T cells CD62L"CD45RAþ /" andCD62LþCD45RA" (middle panels). The expression of α4β7 and CCR9 intestinal homing receptors was evaluated in antigen experienced cells (lower panels). Numbers inparenthesis in the lower row dot plots indicate number of events. Results from the eight volunteers for antigen experienced T cells VP6-7-tetramerþ and Flu-tetramerþ cells(C) and the expression of intestinal homing receptors (D) are summarized. Statistically significant differences determined with Wilcoxon tests are shown.


51

healthy adult were significantly blocked with an antibody againstDR and poorly against an antibody to DQ molecules (Fig. 3B anddata not shown), suggesting that the VP6-7 epitope and the twocandidate RV-epitopes (NSP2-3 and VP3-4) were presented in thecontext of HLA-DR molecules. T cell lines expanded with viruslysate preparations might select clonotypes associated with immu-nodominant peptides over low frequency and/or slowly growingclonotypes (Nastke et al., 2012). Thus, in some of the experimentswith the RRV-T cell lines the responses to the NSP2-3 and VP3-4candidate epitopes might have been masked.

The simultaneous staining of the majority of cytokine secretingcells from a VP6-7 T cell line with the VP6-7 tetramer (Fig. 3C)supports the specificity of the tetramer staining. Moreover, theyshow that most cells stained with the tetramer are functional.A correlation between cells staining with the tetramer and thoseproducing cytokines ex vivo is difficult to establish, because of thelow or inexistent level of cytokine secreting cells specific for theRV peptides (Table 1). However, the capacity of the tetramers toidentify specific T cells ex vivo seems more sensitive than theintracellular cytokine staining and proliferation assays (Table 1)and, thus, more suited to vaccine studies in children. Nonetheless,it is possible that some of the cells stained with the tetramermight be secreting cytokines not evaluated.

Staining of cells from vaccinated and placebo recipient childrenwith the VP6-7 tetramer showed that VP6-7-specific CD4 T cellscould be expanded after RV vaccination. Although the numbers ofcells observed in the vaccinated children were low (Fig. 5A), theywere all, as expected, α4β7 and in two cases they also expressedCCR9. The cells used in the present study had been frozen overseven years (Rojas et al., 2007), and it is expected that studies with

fresh cells may permit to obtain more cells to study and increase inthe sensitivity of the assay. Further studies are necessary toconfirm that CD4 T cells from HLA-DR1 vaccinated childrenrecognize the RV epitope we have identified.

In conclusion, we have shown that CD4 T cells specific for a RVepitope express intestinal homing receptors, which supports thehypothesis that cells primed in peripheral compartments mayconstitute a separate lineage (Sallusto and Lanzavecchia, 2009).We also describe MHC tetramers that could be used to analyze RV-specific CD4 T cell responses in vaccine studies. Similar studies inthe context of other MHC haplotypes are needed to expand thenumber of tetramers available to monitor the CD4 T cell response toRV vaccines and, hopefully, develop better correlates of protection.

Methods

Epitope prediction and peptides synthesis

To predict HLA-DR1 (DRB1n0101) binding epitopes, we used thesequences of the RV strain KU G1P[8] form the NCBI genomedatabases (BAA84966, BAA84967, Q82050.1, BAA84969, BAA84970,AAK15270.1, BAA84962, BAA84963, BAA84964, P13842, BAA84965,and BAA03847). Each potential 9-mer binding frame was evaluatedusing two independent prediction algorithms: P9 (Calvo-Calle et al.,2007; Hammer et al., 1994; Nastke et al., 2012; Sturniolo et al., 1999)and SYFPEITHI (Schuler et al., 2007), as previously described (Calvo-Calle et al., 2007; Nastke et al., 2012). Potential epitopes were selectedusing cutoff scores of Z1.5 for P9 and Z29 for SYFPEITHI. Overall,1440 possible 9-mer minimal epitopes were evaluated and 39

TRF Tetramer VP6-7 Tetramer TRF Tetramer VP6-7 TetramerCHV-1

CHV-2

CHV-3

CHP-1

CHP-2

CHP-3

CCR9

47

CCR9

47

Fig. 5. Expression of homing receptors on antigen experienced (CD62L!CD45RAþ /! and CD62LþCD45RA!) CD4 T cells from RV vaccinated and placebo recipient children.Frozen PBMC from HLA-DRB1n0101 RV vaccinated (A) or placebo recipient children (B) were stained as in Fig. 4 with the TRF-tetramer (left panels) and VP6-7-tetramer (rightpanels). Dot plots show the expression of α4β7 and CCR9 intestinal homing receptors of CD4-tetramerþ antigen experienced cells from individual children. Numbers inparenthesis in the dot plots indicate number of events.


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potential epitopes, scoring highly for both algorithms, were selected(Supplementary Table 1), extended by six residues on each side,and synthesized (Sigma-Aldrich PEPscreens) with an acetylatedN-terminal and amidated C-terminal.

Subjects

After written informed consent was signed, blood sampleswere obtained from 52 healthy volunteers, 23–52 years old that,as expected, had serum antibodies against RV. Frozen PBMC from35 RV IgA seropositive vaccinated children and 24 RV seronegativeplacebo recipient children (samples from a previous study (Rojaset al., 2007)), in whom the informed consent authorized furtherstudies, were also assessed. This was a double-blind randomizedcontrolled study, in which children received two doses of eitherplacebo (n¼160) or 106.7 focus-forming units of the attenuatedRIX4414 human RV vaccine (precursor of the Rotarix™ vaccine,n¼159). The first and second doses were administered at 2 and4 months of age, respectively, and children were bled 14–16 daysafter each dose. Studies were approved by the Ethics Committee ofthe San Ignacio Hospital and Pontificia Universidad Javeriana.

Human haplotype determination

DNA was obtained from blood samples using Illustra bloodgenomicPrep Mini Spin Kit (G/E healthcare, UK Buckinghamshire),according to manufacturer's instructions. The HLA class II haplo-type was determined using All set Gold-SSP HLA DRDQ lowresolution Kit (Invitrogen Corporation, Wisconsin USA), PCR-based protocols, according to manufacturer's instructions. Allsamples identified as a DRB1n01 in low resolution were analyzedfor high-resolution using the All set Gold-SSP HLA DRB1n01 high-resolution Kit (Invitrogen Corporation, Wisconsin USA), accordingto manufacturer’s instructions. (Supplementary Table 2).

Antigen stimulation of PBMC and intracellular cytokine staining

PBMC were purified from heparinized whole-blood samples byFicoll-Hypaque gradients (Lympho Separation Medium, MP Bio-medicals). The cells were washed twice with RPMI containing20 mM HEPES, 100 U of penicillin/ml, and 100 mg of streptomycin/ml plus 10% fetal bovine serum (FBS) (all from GIBCO, Carlsbad, CA,USA) (complete medium) and re-suspended in 1 ml of AIM-Vs

medium (life technologies, Carlsbad, CA, USA). PBMC (1"106 cellsin a final volume of 1 ml) were stimulated with the supernatant ofMA104 cells infected with RRV (Rhesus RV, MOI:7), the super-natant of mock-infected MA104 cells (negative control), the super-antigen staphylococcal enterotoxin B (SEB; Sigma, St Louis, Mo,USA), peptides pools (5 peptides per pool at 1 mg/ml each) orindividual peptides at different concentrations. Anti-CD28 (0.5 mg/ml) and anti-CD49d (0.5 mg/ml) (both from BD Biosciences, SanJose, CA) monoclonal antibodies were added to each sample as co-stimulators (Waldrop et al., 1997, 1998). Antigen stimulation wasdone in 15 ml polystyrene tubes (Becton Dickinson Falcon Lab-ware, Franklin Lakes, N.J., USA) incubated with a 51 slant for 10 h at37 1C with 5% CO2. The last 5 h of the incubation included brefeldinA (10 mg/ml; Sigma) to block the secretion of cytokines. At the endof the incubation, the cells were washed once with PBS–0.5%bovine serum albumin (Merck, Darmstadt, Germany) 0.02%sodium azide (Mallinckrodt Chemicals, Paris, Ky.) (Staining Buffer).Then, a 2 mM final concentration of EDTA (GIBCO, N.Y. USA) in PBSwas added for 10 min to detach plastic-adherent cells, and thesamples were washed once more with Staining Buffer. PBMC werestained with Aqua viability reagent (Invitrogen Molecular Probes,Eugene, OR) in PBS for 10 min at room temperature (RT), and thecells were stained with monoclonal antibodies (Mabs) against

CD14-V500 and CD19-V500, as a dump channel, CD3-pacific blue,CD4-PerCP-Cy5.5, and CD8-APC-H7 for 20 min at RT (all from BDBiosciences, San Jose, CA). After two wash steps with StainingBuffer, cells were treated with Citofix/Citoperm solution (BDBiosciences, San Jose, CA) for 30 min at 4 1C and washed twicewith 1 ml of Perm/Wash solution (BD Bioscience, San Jose, CA).Then, Mabs against IL-2-FITC, IFN-γ-PE-Cy7 and TNF-α-APC (allfrom BD Biosciences) were added and incubated for 20 min at RT.Production of IL-2 and IFN-γ by RV stimulated T cells was observedin our previous work; TNF-α secretion was also evaluated to makea more comprehensive analysis of multifunctional T cells(Gattinoni et al., 2011). Finally, the cells were washed twice withPerm/Wash, resuspended in 250 ml of Perm/Wash, acquired in aFACSAria flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) andanalyzed with FlowJo software v.9.3.2.

Peptide binding assays

Peptide binding to DR1 and DR4 was analyzed using an ELISA-based competition assay, as previously described (Parra-Lópezet al., 2006). Purified HLA-DR1 or DR4 molecules (0.05 mM) werediluted with freshly prepared binding buffer (100 mM citrate/phosphate buffer [pH 5.4], 0.15 mM NaCl, 4 mM EDTA, 4% NP-40,4 mM PMSF, and 40 mg/ml for each of the following proteaseinhibitors: soybean trypsin inhibitor, antipain, leupeptin andchymostatin) containing 0.025 mM biotin-labeled hemagglutininHA306–318, a well described binding peptide from Flu hemaggluti-nin (PKYVKQNTLKLAT) (Roche and Cresswell, 1990), and variousconcentrations of unlabeled competitor peptide (HA306-318, NSP2-3(SGNVIDFNLLDQRIIWQNWYA), VP3-4 (YNALIYYRYNYAFDLKR-WIYL) and VP6-7 (DTIRLLFQLMRPPNMTPAVNA)) in a total volumeof 120 ml. Peptides were diluted from stock solutions in bindingbuffer. After 48 h of incubation at RT, 100 ml were transferred to96-well ELISA microtiter plates (Immuno Modules MaxiSorp,Nunc, Denmark), which had been previously coated overnightwith a 10 mg/ml anti-HLA-DR Mab LB3.1, washed, and subse-quently blocked with PBS containing 3% bovine serum albumin.After 2 h of incubation at RT, plates were washed with PBS, 0.05%Tween-20 and incubated for 1 h with phosphatase-labeled strep-tavidin (KPL, Maryland, USA). Captured biotin-labeled peptide/DRcomplexes were revealed with 4-nitrophenylphosphate substrate(KPL, Maryland, USA). For determining peptide binding to HLA-DRmolecules a Ultramark ELISA plate reader (Bio-Rad, CA, USA) witha 405 nm filter was used. Results at each concentration areexpressed normalized with respect to the maximum observedbinding, and used to calculate IC50 values.

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) proliferation assay

Proliferation of cells was evaluated by CFSE staining as reportedby Quah (Quah and Parish, 2010; Quah et al., 2007), with somemodifications. Briefly, 4#10"106 fresh PBMC were resuspendedin 1 ml of PBS 1X, placed in a 15 ml conical tube, and stained withCFDA-SE (CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit). The cells wereincubated 5 min at RT, protected from light, and then washedthree times with 10 ml of PBS 1X-FBS 5% at RT. Finally, the cellswere diluted in 1 ml of RPMI supplemented with 10% ABþ humanserum (Multicell, human serum AB, Wisent INC, Canada). AfterCFSE staining, PBMC were stimulated with SEB and three RVpeptides (NSP2-3, VP3-4, and VP6-7) for 5 days at 37 1C with 5%CO2. Then, cells were harvested, washed twice with PBS 1X, andstained with Violet viability reagent (Invitrogen Molecular Probes,Eugene, OR) in PBS for 10 min; Mabs against CD3-PE, CD4-PerCP-Cy5.5 and CD8-APC-H7 were added and incubated for 30 min atRT. Finally, the cells were resuspended in 250 ml of PBS, acquired in


53

a FACSAria flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) andanalyzed with FlowJo software v.9.3.2.

T cell lines

T cell lines were generated from PBMC. 1!2"106 PBMC perwell were incubated in 24-well plates in 1 ml of RPMI 1640supplemented with ABþ human serum 10% (Multicell), 100 U/mlpenicillin, 100 μg/ml streptomycin, 1 mM sodium pyruvate, 2 mML-glutamine, and 1 mM nonessential amino acids. Antigen-specificpopulations were expanded by culture in the presence of NSP2-3,VP3-4 or VP6-7 peptides (10 mg/ml) or RRV infected MA104 celllysate (MOI:7). After 48 h of incubation at 37 1C with 5% CO2, freshT cell medium supplemented with 100 U/ml IL-2r (Proleukin;Chiron Corporation, Emeryville, CA) was added. This last stepwas repeated every 2 days until the culture completed 12 days.Then, autologous non-irradiated PBMC (ratio 2:1), pulsed with orwithout peptide (10 mg/ml) for 1 h, were used as source of antigen-presenting cells to stimulate the T cell lines. Finally, T cell lineswere evaluated by ICS, as described above. In some cases, the cellswere stained as described below with the class II tetramer.

Class II tetramer staining of PBMC from adults and children

Biotinylated HLA-DR1-peptide complexes were preparedusing proteins produced in insect cells, as previously described(Cameron et al., 2002). Class II tetramers with different peptides(HA306-318, a transferrin [TRF] control peptide [RVEYHFLSPYVSR-KESP (Chicz et al., 1992)], NSP2-3, VP3-4 or VP6-7) were preparedwith streptavidin-PE (Invitrogen, MD, USA) from a stock solutionat a final concentration of 1 mg diluted in 50 ml of PBS 1X. FreshPBMC obtained from 8 DR1 healthy adults were washed twice inPBS 1X and distributed in 5 ml polystyrene tubes (5"106 cells/50 ml per tube). Frozen PBMC of three vaccinated or three placeborecipient HLA-DR1 children were thawed at 37 1C and washedtwice with a 5 ml Benzonases (Novagen, San Diego, CA) solutionpre-heated at 37 1C. Then, the cells were distributed in 5 mlpolystyrene tubes. Fifty ml of Dasatinibs (Bristol-Myers SquibbCompany Princeton, NJ 08543 USA) solution (100 mM) was addedto each tube and incubated for 30 min at 37 1C (Lissina et al.,2009). Later, 10 ml of ABþ human serum was mixed with the cellsjust before tetramer solution (1 mg) was added and incubated for120 min at RT. Unlabeled mouse anti-CCR9 Mab was added andincubated for 20 min at RT, then the cells were washed oncewith PBS 1X, followed by addition of goat anti-mouse antibodies(AF-488 or Pacific Blue [Invitrogen Corporation, Wisconsin USA])and incubated for 20 min at RT. The cells were washed once withPBS 1X, then Aqua reagent was added and incubated for 10 min atRT; subsequently, Mabs against CD14-V500 and CD19-V500, as adump channel, CD3 (Pacific Blue or AF-700), CD4-PerCP-Cy5.5,CD8-APC-H7, CD45RA (FITC or PE-Cy7), CD62L-V450 or CCR7-PE-Cy7, and α4β7-APC (ACT-1) were added and incubated for 20 minat RT. Cells were washed and resuspended in 400 ml of PBS-BSA-sodium azide, acquired in a FACSAria flow cytometer (BD Bios-ciences, San Jose, CA) and analyzed with FlowJo software v.9.3.2.

ELISA for RV-specific IgA in plasma

For detection of RV-specific IgA, 96-well vinyl microtiter plateswere coated with 70 ml of a 1:10 dilution (in PBS, pH 7.4) of super-natant from RF (bovine RV) virus-infected MA104 cells or the super-natant of mock-infected MA104 cells (negative control) and incubatedovernight at 4 1C. The wells were then blocked with 150 ml of 5%nonfat powdered milk plus 0.1% Tween-20 in PBS (5% BLOTTO) andthe plates were incubated at 37 1C for 1 h. Then, the BLOTTO wasdiscarded, and 70 ml of serial plasma dilutions in 2.5% BLOTTO were

deposited in each well. After 2 h of incubation at 37 1C, the plates werewashed three times with PBS-Tween-20, and 70 ml of biotin-labeledgoat anti-human IgA (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg,Md.) diluted (1:1000) in 2.5% BLOTTO was added to the plates. Theplates were then incubated for 1 h at 37 1C. After three washes withPBS-Tween-20, 70 ml of streptavidin-peroxidase (Kirkegaard & PerryLaboratories, Gaithersburg, Md.) diluted (1:1000) in 2.5% BLOTTO wasadded, and the plates were incubated for 1 h at 37 1C. After threewashes with PBS-Tween-20, the plates were developed using 70 ml oftetramethyl benzidine substrate (TMB; Sigma, St. Louis, MO). Thereaction was stopped by the addition of 17.5 ml of sulfuric acid (2 M).Absorbance was read at 450 nm wavelength on an ELISA plate reader(Multiskan EK, Thermolab Systems). Samples were considered positiveif optical density (OD) in the well was 40.1 OD units and were twotimes higher than the OD of the negative control (Rojas et al., 2007).

Statistical analyses

Analysis was performed with GraphPad Prism version 6.Differences between groups were evaluated with the nonpara-metric Wilcoxon test.

Acknowledgments

This work was financed by grants from Colciencias 1203-408-20481 and the Pontificia Universidad Javeriana (ID5195). LJS andJMCC received support from NIH grant U19-AI057319 and EBfunding from R37-AI047822 and RC1-AI087257 also from theNIH, which funded Ab production. Miguel Parra was funded by ascholarship from Colciencias.

Appendix A. Supporting information

Supplementary data associated with this article can be found inthe online version at http://dx.doi.org/10.1016/j.virol.2014.01.014.

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55

Table S1. Peptides predicted to be RV epitopes using SYFPEITHI and P9

Peptide Number Protein aa Position Core sequence

P9 DR1-Bind S

SYFPEITHI AP Score

21aa peptide sequence

1 NSP2-1 82 ILICEALNS 1,5 28 MLIKVAILICEALNSIKVTQS 2 VP1-1 788 FMSLSSQKS 1,5 33 VYIQRAFMSLSSQKSGIADEI 3 VP1-2 782 VYIQRAFMS 1,5 33 GTTDDEVYIQRAFMSLSSQKS 4 VP4-1 364 MVYVRSLAA 1,55 29 SKAFRNMVYVRSLAANLNSVK 5 NSP3-1 296 FLMLKGLLK 1,6 27 QDYDRTFLMLKGLLKQCNYEY 6 VP1-3 4 YNLILSEYL 1,6 32 MGKYNLILSEYLSFVYNSQSA 7 VP1-4 961 YLVSLGVPL 1,7 26 EQEIQLYLVSLGVPLVDASAY 8 VP6-1 349 VRQEYAIPV 1,7 26 LANVTAVRQEYAIPVGPVFPP 9 VP6-2 150 FVFHKPNIF 1,7 26 RRQRTGFVFHKPNIFPYSASF

10 VP1-5 736 IIQMTSVAI 1,7 28 EFILTKIIQMTSVAITGSLRL 11 VP6-3 277 FGTIIARNF 1,77 33 NTYQARFGTIIARNFDTIRLL 12 VP6-4 63 FGLLGTTLL 1,79 35 RNWTFDFGLLGTTLLNLDANY 13 NSP1-1 191 FVRMSFLPA 1,8 25 LLDNVNFVRMSFLPASLQQEY 14 VP6-5 70 LLNLDANYV 1,8 32 GLLGTTLLNLDANYVENARTT 15 NSP1-2 355 FNINIGHCS 1,84 30 LRAFSKFNINIGHCSSQEKMY 16 NSP1-3 450 IRYMRNTPM 1,87 25 IYEWFDIRYMRNTPMVTFTID 17 VP4-2 361 FRNMVYVRS 1,9 26 WDDSKAFRNMVYVRSLAANLN 18 VP1-6 1067 WKKMWSITA 1,9 33 SEMIKLWKKMWSITALRSPYT 19 VP3-1 410 YAILDVWDI 1,92 29 EVRSEFYAILDVWDIITIKRF 20 NSP2-2 108 VRHLENLVL 2 27 LSRVVSVRHLENLVLRKENHQ 21 VP3-3 442 VFIQPPFKL 2 32 NITTENVFIQPPFKLKASPTD 22 VP6-6 116 LRKLAGIKF 2 37 APQSEALRKLAGIKFKRINFD 23 VP7-8 35 YRFLLITVA 2,09 30 IMDYIIYRFLLITVALFALTR 24 VP2-1 336 YVLARSVVP 2,1 26 TITTSNYVLARSVVPDLKEKE 25 VP4-3 436 FSILRTRTV 2,29 36 TVDEPSFSILRTRTVNLYGLP 26 NSP3-2 117 MRVLNACFS 2,3 34 KGIDQKMRVLNACFSVKRIPG 27 VP1-7 986 YKILESYVY 2,5 29 IYSQDKYKILESYVYNLLSIN 28 VP1-8 16 YNSQSAVQI 2,5 33 EYLSFVYNSQSAVQIPIYYSS 29 VP4-4 417 FVSLNSLRF 2,5 33 STQFTDFVSLNSLRFRFSLTV 30 VP2-2 391 FKTLIAAML 2,58 35 QAANDCFKTLIAAMLSQRTMS 31 NSP1-4 241 FKIQITRNC 2,59 27 NLHNPNFKIQITRNCSEMSFD 32 VP4-5 366 YVRSLAANL 2,6 27 AFRNMVYVRSLAANLNSVKCT 33 NSP2-3 257 FNLLDQRII 2,69 29 SGNVIDFNLLDQRIIWQNWYA 34 NSP1-5 392 FNCLEPVEL 2,7 34 TSIIEIFNCLEPVELDDVKYV 35 VP6-7 292 FQLMRPPNM 2,95 31 DTIRLLFQLMRPPNMTPAVNA 36 NSP6-1 65 MQMLACLWI 3,5 25 RMQLRQMQMLACLWIHQHNHD 37 VP3-3 381 CVKLTAMDL 3,59 27 GKAKVCCVKLTAMDLELPITA 38 VP3-4 620 YRYNYAFDL 3,84 28 YNALIYYRYNYAFDLKRWIYL 39 VP2-3 133 FRIFEPRQL 5,17 31 KKQMKLFRIFEPRQLPIYRTN

56

Table S2. Haplotype of healthy adults identified using SSP.

Volunteer Number DR/DQ Low Resolution Haplotype

HA-01 DRB1*04, DRB1*11, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*03, DQB1*03 HA-02 DRB1*01:01, DRB1*07, DRB4*01, DQB1*02, DQB1*05 HA-03 DRB1*04, DRB1*11, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*03, DQB1*03 HA-04 DRB1*01:02, DRB1*04, DRB4*01, DQB1*03, DQB1*05 HA-05 DRB1*11, DRB1*07, DRB4*01, DQB1*02, DQB1*03 HA-06 DRB1*01:02, DRB1*04, DRB4*01, DQB1*03, DQB1*05 HA-07 DRB1*04, DRB1*07, DRB4*01, DQB1*02, DQB1*03 HA-08 DRB1*04, DRB1*13, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*06,- HA-09 DRB1*08, DRB1*08, DQB1*03, DQB1*04 HA-10 DRB1*04, DRB1*07, DRB4*01, DQB1*02, DQB1*03 HA-11 DRB1*07, DRB1*14, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*02, DQB1*05 HA-12 DRB1*04, DRB1*11, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*03, DQB1*03 HA-13 DRB1*04, DRB1*12, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*03, DQB1*03 HA-14 DRB1*11, DRB1*13, DRB3*01, DQB1*03, DQB1*06 HA-15 DRB1*01:01, DRB1*13, DRB3*01,-,DQB1*05, DQB1*06 HA-16 DRB1*13, DRB1*14, DRB3*01, DRB3*02, DQB1*05, DQB1*06 HA-17 DRB1*07, DRB1*13, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*02, DQB1*06 HA-18 DRB1*03, DRB1*04, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*02, DQB1*03 HA-19 DRB1*01:01, DRB1*16, DRB5*01,-, DQB1*03, DQB1*05 HA-20 DRB1*04, DRB1*13, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*03, DQB1*03 HA-21 DRB1*13, DRB1*14, DRB3*01, DRB3*02, DQB1*05, DQB1*06 HA-22 DRB1*04, DRB1*07, DRB4*01,-, DQB1*02, DQB1*03 HA-23 DRB1*01:01, DRB1*13, DRB3*01,-, DQB1*05, DQB1*06 HA-24 DRB1*07, DRB1*14, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*02, DQB1*03 HA-25 DRB1*15, DRB1*15, DRB5*01,-, DQB1*06, DQB1*06 HA-26 DRB1*04, DRB1*16, DRB4*01, DRB5*01, DQB1*03, DQB1*03 HA-27 DRB1*03, DRB1*07, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*02,- HA-28 DRB1*07, DRB1*14, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*03,- HA-29 DRB1*01:01, DRB1*09, DRB4*01,-, DQB1*02, DQB1*05 HA-30 DRB1*01:01, DRB1*01:02,-, DQB1*05,- HA-31 DRB1*03, DRB1*07, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*02, DQB1*03 HA-32 DRB1*01:02, DRB1*03, DRB3*01,-, DQB1*03, DQB1*05 HA-33 DRB1*04, DRB1*07, DRB4*01, DQB1*02, DQB1*03 HA-34 DRB1*08, DRB1*14, DRB3*01,-, DQB1*03, DQB1*04 HA-35 DRB1*08, DRB1*08, DQB1*04, DQB1*05 HA-36 DRB1*01:01, DRB1*16, DRB5*01,-, DQB1*03, DQB1*05 HA-37 DRB1*04, DRB1*07, DRB4*01,-, DQB1*02, DQB1*03 HA-38 DRB1*10, DRB1*11, DRB3*01,-, DQB1*03, DQB1*05 HA-39 DRB1*04, DRB1*16, DRB4*01, DRB5*01, DQB1*03, DQB1*03 HA-40 DRB1*04, DRB1*07, DRB4*01,-, DQB1*02, DQB1*03 HA-41 DRB1*01:01, DRB1*11, DRB3*01,-, DQB1*03, DQB1*05 HA-42 DRB1*03, DRB1*14, DRB3*01, DRB3*01, DQB1*02, DQB1*03 HA-43 DRB1*04, DRB1*11, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*03 HA-44 DRB1*11, DRB1*15, DRB3*01, DRB5*01, DQB1*03, DQB1*06 HA-45 DRB1*01:03, DRB1*04, DRB4*01,-, DQB1*03, DQB1*05 HA-46 DRB1*13, DRB1*13, DRB3*01,-, DQB1*06,-

57

Volunteer Number DR/DQ Low Resolution Haplotype HA-47 DRB1*11, DRB1*13, DRB3*01,-, DQB1*03, DQB1*06 HA-48 DRB1*04, DRB1*07, DRB4*01,-, DQB1*03,- HA-49 DRB1*07, DRB1*13, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*02, DQB1*06 HA-50 DRB1*07, DRB1*11, DRB3*01, DRB4*01, DQB1*03, DQB1*03 HA-51 DRB1*01:01, DRB1*01:03, DQB1*05,- HA-52 DRB1*01:01, DRB1*04, DRB4*01,-, DQB1*03, DQB1*05

58

Figuras y tablas adicionales del artículo 1

Figura adicional 1. Estimulación de células CD4 con los grupos de péptidos obtenidas de CMSP de dos voluntarios DR1. El procedimiento está descrito en el artículo “Circulating human rotavirus specific CD4 T cells identified with a class II tetramer express the intestinal homing receptors α4β7 and CCR9”.

59

Figura adicional 2. Estimulación de células CD4 con los péptidos individuales del grupo 7 obtenidas de CMSP de dos voluntarios DR1. El procedimiento está descrito en el artículo “Circulating human rotavirus specific CD4 T cells identified with a class II tetramer express the intestinal homing receptors α4β7 and CCR9”.

60

Figura adicional 3. Estimulación de células CD4 a diferentes concentraciones de péptidos de rotavirus obtenidas de CMSP de dos voluntarios DR1. El procedimiento está descrito en el artículo “Circulating human rotavirus specific CD4 T cells identified with a class II tetramer express the intestinal homing receptors α4β7 and CCR9”.

61

Figura adicional 4. Fenotipo y expresión de los marcadores intestinales de las células CD4 marcadas con los tetrámeros de NSP2-3 y VP3-4. El procedimiento está descrito en el artículo “Circulating human rotavirus specific CD4 T cells identified with a class II tetramer express the intestinal homing receptors α4β7 and CCR9”

62

Ensayos no incluidos en el artículo número 1

Coloración para identificar los perfiles de regulación en CMSP En estudios previos se ha observado que los adultos sanos e infectados tienen frecuencias bajas de células CD4 circulantes específicas de rotavirus que producen IFN-γ pero no otras citocinas, mientras que en niños las frecuencias de estas células son más bajas e incluso indetectables 38, 40, 41. Una de las razones de por la cual esta respuesta es baja puede estar relacionada con la inducción de células Treg durante la infección por rotavirus. Como soporte a esta hipótesis, algunos estudios han mostrado que las células Treg pueden suprimir la respuesta de las células T en el modelo de ratón 204, además, este mecanismo es relevante porque las CD intestinales, que son las que primero entran en contacto con el virus, inducen una repuesta inmune anti-inflamatoria, tanto en humanos 205 como en ratones 206. Más recientemente, se observó que en CMSP de adultos sanos la frecuencias de células específicas de rotavirus productoras de IFN-γ se incrementaron luego de la disminución/eliminación de las células T CD25+ o luego de la inhibición de la actividad del TGF-β con su inhibidor natural LAP o mediante el bloqueo de la vía de señalización con la molécula ALK5 40. Estos hallazgos sugieren una posible actividad de las células Treg en la inmunidad contra rotavirus, por lo tanto, nos propusimos buscar estas células reguladoras en sangre periférica de adultos sanos, usando los tetrámeros específicos de rotavirus y los marcadores de regulación CD25, CD127 y FoxP3. Se analizaron CMSP frescas de seis adultos sanos y se identificó un número muy bajo de células Treg CD4+CD127-

CD25HihgFoxP3+ específicas del tetrámero VP6-7 de rotavirus (Tabla adicional 1). Las muestras obtenidas de los seis voluntarios fueron todas coloreadas con los tetrámeros cargados con los péptidos de TRF, influenza y VP6-7 de rotavirus, mientras que solamente los tetrámeros cargados con los péptidos de rotavirus NSP2-3 y VP3-4 fueron usados para teñir las CMSP frescas de los voluntarios HA-02 y HA-19 para NSP2-3, y HA-02 y HA-15 para el tetrámero de VP3-4 (protocolo detallado en el anexo número 8.1). No se observaron células con el perfil de regulación CD4+CD127-CD25HihgFoxP3+ para ninguno de los tetrámeros usados, excepto para VP6-7 en el que se identificaron células tetrámero positivas con el perfil de regulación en los voluntarios HA-19 (3 células), HA-23 (1 célula) y HA-41 (4 células) (Tabla adicional número 1). No obstante, tan bajos números de células reguladoras CD4+CD127-CD25HihgFoxP3+ tetrámero específicas no nos permiten concluir acerca de la importancia de las células reguladoras en la infección por rotavirus. Cinco gráficas representativas de los análisis realizados con CMSP del voluntarios HA-41 para la determinación de las célula Treg se muestran en las gráficas adicionales 5 a 9, mientras que la tabla adicional número 1 muestra el resumen de las coloraciones para la identificación de células Treg en los seis voluntarios evaluados.

63

Figuras adicionales 5-9. CMSP frescas obtenidas de adultos sanos con el alelo DRB1*0101 fueron teñidos con los tetrámeros de TRF, influenza y rotavirus, de acuerdo al protocolo descrito en “Circulating human rotavirus specific CD4 T cells identified with a class II tetramer express the intestinal homing receptors α4β7 and CCR9”. Posteriormente, se realizó la coloración con el reactivo de viabilidad Aqua, seguido de la adición de los anticuerpos contra los marcadores CD3, CD4, CD25 y CD127, además, se usaron marcadores contra CD19 y CD14 como “Dump channel”. Luego de dos lavados, las células fueron permeabilizadas y finalmente se adicionó un anticuerpo contra el factor de transcripción nuclear FoxP3.

64

Figura Adicional 6.

65

Figura Adicional 7.

66

Figura Adicional 8.

67

Figura Adicional 9.

68

Tabla adicional 1. Coloración de CMSP frescas con los tetrámeros y con

los marcadores de regulación en voluntarios adultos sanos.

Adulto sano Tetrámero-péptido

#Tet+/6.0x105 T CD4+

# CD4+CD127-

CD25lowFoxP3+ # CD4+CD127-

CD25medFoxP3+ # CD4+CD127-

CD25hihgFoxP3+

HA-02 TRF 16 0 0 0

FLU 35 1 0 0

NSP2-3 19 0 0 0

VP3-4 26 0 0 0

VP6-7 32 0 0 0

HA-15 TRF 8 1 1 0

FLU 22 1 2 0

VP3-4 25 0 1 0

VP6-7 13 0 0 0

HA-19 TRF 3 0 0 0

FLU 25 0 0 0

NSP2-3 15 1 1 0

VP6-7 22 1 1 3

HA-23 TRF 15 2 0 0

FLU 30 1 0 0

VP6-7 50 3 1 1

HA-29 TRF 20 2 0 0

FLU 112 1 1 0

VP6-7 29 0 1 0

HA-41 TRF 22 4 2 0

FLU 88 4 3 0

VP6-7 73 4 5 4

69

Estimulación y fenotipificación de las células CD4 extraídas de muestras de intestino humano

La infección por rotavirus ocurre de forma típica en el intestino de los huéspedes susceptibles, por lo tanto, la respuesta inmune de las células T se localiza en el compartimiento intestinal. La respuesta contra rotavirus en animales y humanos es mediada principalmente por la IgA 15, sin embargo, en el modelo de ratón se ha observado que las células CD4 son esenciales en el desarrollo de la IgA intestinal específica de rotavirus 18. Aún más, se ha observado que niños con inmunodeficiencias de células T y/o B se infectan de forma crónica por rotavirus, lo que demuestra que las dos líneas de defensa del sistema inmune son esenciales en el control de las infecciones por rotavirus 20. Estudios realizados previamente mostraron que la infección por rotavirus genera una respuesta específica de células CD4 de memoria que expresan principalmente el marcador de migración intestinal α4β7, mostrando que el tráfico intestinal involucra la generación de células de memoria relacionadas con los antígenos de patógenos intestinales 39. Para identificar las células CD4 intestinales de lámina propia específicas de rotavirus, muestras de tejido intestinal obtenidas a partir de un paciente sometido a cirugía bariátrica electiva y de siete pacientes con cáncer sometidos a una colectomía fueron digerida enzimáticamente (protocolo detallado en el anexo número 8.2) y las células mononucleares intestinales (CMIH) fueron individualizadas y separadas. Posteriormente, las células fueron estimuladas con los antígenos de rotavirus (péptidos y virus completo), SEB, toxoide tetánico e influenza. Adicionalmente, una fracción de las células extraídas del paciente sometido a cirugía bariátrica electiva fue marcada con los tetrámeros de TRF, influenza y rotavirus (NSP2-3, VP3-4 y VP6-7), para identificar los perfiles de diferenciación y migración de la misma forma que la coloración descrita para las CMSP. No se observaron diferencias en la producción de IL2, IFN-γ o TNF-α luego de la estimulación con los antígenos usados y los controles negativos, pero si después de estimulación con SEB en las CMIH obtenidas del paciente sometido a cirugía bariátrica (figuras adicionales 10 a 12 y tabla adicional 2). A diferencia de los resultados observados luego de la estimulación de CMSP de los voluntarios adultos sanos, las muestras de CMIH mostraron niveles de ruido de fondo muy altos, invalidando los resultados obtenidos luego de la estimulación con los diferentes antígenos. En el caso de la coloración de las CMIH frescas obtenidas del voluntario sometido a cirugía bariátrica, tampoco se observaron diferencias entre los porcentajes de las células marcadas con el tetrámero de TRF y los porcentajes de las células marcadas con los tetrámeros de influenza y rotavirus. De nuevo, los ruidos de fondo con las CMIH marcadas con el tetrámero de TRF de este voluntario fueron

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muy altos y no logramos determinar si habían o no células específicas de rotavirus identificadas con está metodología (figura adicional 13). Las CMIH extraídas de los tejidos intestinales de los pacientes con cáncer, sometidos a colectomía, fueron estimuladas con SEB, rotavirus (Lisado de RRV multiplicidad de infección de 7) y Mock en todos los casos (tabla adicional 3). Dependiendo del número de células, las muestras fueron estimuladas con DMSO y los diferentes grupos de los péptidos de rotavirus. Solamente se observaron respuestas positivas en las células CD4 de los pacientes con cáncer cuando se estimulaban con el SEB, produciendo las citocinas IL-2 e IFN-γ. Por el contrario, ninguna respuesta frente a los antígenos de rotavirus (virus completo o grupos de péptidos) fueron observadas, pero, como en todos los ensayos realizados con las CMIH, los ruidos de fondo siempre estuvieron altos, por lo tanto no pudimos observar las respuestas frente a los antígenos de rotavirus en las células CD4. Para la células CD8, se observó que las CMIH respondían en todos los casos al estímulo con SEB produciendo IL-2 e IFN-γ. Además, las CMIH derivadas de los pacientes Int013 e Int011 respondieron al estímulo con rotavirus (RRV) produciendo IL-2 en el caso de la muestra del Int013, y las dos citocinas (IL-2 e IFN-γ) en el caso de Int011 (tabla adicional número 3). Incluso, se observó una respuesta al estimulo con los péptidos de rotavirus agrupados en el grupo 7 en el caso del paciente Int013. A pesar de estos resultados positivos, los controles negativos siempre permanecieron con porcentajes muy altos impidiendo nuevamente concluir acerca de la respuesta de las células CD8 frente a los demás antígenos usados.

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Figura adicional 13. Perfiles de migración de las células CD4 antígeno-experimentadas intestinales humanas de un paciente de cirugía bariátrica DRβ1*0101. CMIH fueron aisladas de muestras de tejido de intestino humano obtenidos de pacientes sometidos a cirugía bariátrica electiva, las células mononucleares se individualizaron mediante un protocolo de digestión enzimática seguida de una separación en gradientes de Percoll. Una vez individualizadas las células se marcaron con los tetrámeros de TRF, influenza y rotavirus (NSP2-3, VP3-4 y VP6-7), posteriormente las células se marcaron con anticuerpos contra las moléculas CD3, CD4 y CD8, adicionalmente se usaron anticuerpos contra los marcadores CD62L y CD45RA para determinar el perfil de diferenciación y α4β7 más CCR9 para determinar los perfiles de migración intestinal.

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Tabla adicional 2. Resumen de la estimulación de las CMIH obtenidas del paciente Bar10 (HLA DRβ1-0101) sometido a cirugía bariátrica electiva.

Paciente Estimulo CD4+ IL2+

CD4+ IFN-γ+

CD4+ TNF-α+

CD8+ IL2+

CD8+ IFN-γ+

CD8+ TNF-α+

Bar10 SEB 0.135 1.38 0.718 0.0165 0.316 0.0955

Dializado 0.0519 0.407 0.191 6.04e-3 0.0972 0.0314

Rotavirus (TLPs) 0.0699 0.592 0.225 6.26e-3 0.153 0.0308

PBS 0.121 0.724 0.256 0.016 0.248 0.0424

Toxoide 0.114 0.539 0.267 0.014 0.159 0.0441

Influenza (vaxigrip) 0.106 0.556 0.261 6.43e-3 0.186 0.0269

DMSO 0.102 0.662 0.206 1.03e-3 0.189 6.21e-3

NSP2-3 0.113 0.793 0.268 8.67e-3 0.22 0.0316

VP3-4 0.106 0.717 0.22 0.0126 0.256 0.0308

VP6/7 0.135 0.812 0.271 0.01 0.254 0.0332

Los resultados mostrados en rojo corresponden a las respuestas consideradas como positivas frente al control negativo en cada caso.

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Tabla adicional 3. Resumen de la estimulación de las CMIH obtenidas de pacientes con cáncer de colon sometidos a colectomía.

Paciente Estimulo CD4+ IL2+IFN-γ-

CD4+ IL2+IFN-γ+

CD4+ IL2-IFN-γ+

CD8+ IL2+IFN-γ-

CD8+ IL2+IFN-γ+

CD8+ IL2-IFN-γ+

Int013 SEB 1.38 2.91 11.1 0.76 1.68 16.1

Mock 0.33 0.16 0.59 0.16 0.083 0.74

RRV 0.31 0.082 0.2 0.41 0.043 0.2

DMSO 0.43 0.056 0.2 0.29 6.6e-3 0.12

Grupo 6 0.2 0.024 0.096 0.35 0 0.11

Grupo 7 0.39 6.e-3 0.048 1.07 5.71e-3 0.051

Int009 SEB 3.68 6.19 2.81 0.69 3.5 8.3

Mock 0.86 0.6 0.48 0.17 0.14 0.38

RRV 0.95 0.55 0.61 0.12 0.22 0.62

DMSO 1.06 0.62 0.72 0.1 0.2 0.38

Grupo 1 0.76 0.5 0.73 0.18 0.13 0.5

Grupo 2 0.94 0.58 0.6 0.13 0.095 0.32

Grupo 3 0.77 0.34 0.57 0.22 0.11 0.27

Grupo 4 0.91 0.57 0.47 0.16 0.17 0.34

Grupo 5 0.83 0.63 0.67 0.14 0.16 0.49

Grupo 6 0.72 0.52 0.57 0.13 0.14 0.36

Grupo 7 0.61 0.35 0.54 0.085 0.085 0.31

Grupo 8 0.59 0.4 0.54 0.12 0.088 0.32

Int010 SEB 1.74 2.07 10.2 N.A. N.A. N.A.

Mock 0.34 0.058 0.096 N.A. N.A. N.A.

RRV 0.24 0.039 0.16 N.A. N.A. N.A.

Int014 SEB 4.74 4.03 1.35 1.15 2.16 3.57

Mock 0.49 0.018 0.055 0.16 0.014 0.043

RRV 0.25 0.025 0.029 0.11 0 0.052

DMSO 0.41 0.031 0.049 0.13 0 0.049

Grupo 1 0.29 0.034 0.034 0.15 0 0.028

Grupo 2 0.4 0.02 0.03 0.11 0.016 0.047

Grupo 3 0.48 0.021 0.041 0.14 0.01 0.01

Grupo 4 0.41 0.028 0.042 0.15 0 0.029

Grupo 5 0.45 0.039 0.039 0.094 0.016 0.031

Grupo 6 0.23 0.018 8.97e-3 0.078 0 0.042

Grupo 7 0.24 0.016 0.043 0.043 6.18e-3 0.062

Grupo 8 0.35 0.031 0.052 0.18 0 0.057

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Paciente Estimulo CD4+ IL2+IFN-γ-

CD4+ IL2+IFN-γ+

CD4+ IL2-IFN-γ+

CD8+ IL2+IFN-γ-

CD8+ IL2+IFN-γ+

CD8+ IL2-IFN-γ+

Int015 SEB 7.04 5.99 1.09 1.48 2.69 3.38

Mock 2.36 0.7 0.38 0.13 0.39 0.53

RRV 2.16 0.76 0.44 0.2 0.53 0.73

DMSO 2.8 0.8 0.42 0.2 0.4 0.71

Int011 SEB 5.9 6.46 1.61 2.69 6.09 4.51

Mock 0.53 0.143 0.183 0.0405 0.0338 0.0338

RRV 0.558 0.117 0.142 0.134 0.0587 0.117

Int008 SEB 5.5 5.24 3.62 5.75 6.56 1.7

Mock 1.65 0.322 0.443 1.57 0.326 0.544

RRV 1.28 0.205 0.731 1.54 0.529 0.639

Los resultados mostrados en rojo corresponden a las respuestas consideradas como positivas frente al control negativo en cada caso. N.A. análisis no realizado.

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Artículo número 2 Rotavirus-specific T cells have a poor functional profile. Miguel Parra, Daniel Herrera, María Fernanda Jácome, Martha Mesa, Luz-Stella Rodriguez, Carolina Guzman, Juana Angel, Manuel Franco. Sometido a Virology.

Introducción De forma parecida a la infección natural, la vacunación contra rotavirus genera una inmunidad no esterilizante en niños y aproximadamente un 50% de los adultos a cargo de niños con GE por rotavirus terminan infectándose, de ellos la mitad presentan manifestaciones clínicas entre leves y moderadas, lo que demuestra que la inmunidad contra rotavirus, aún en adultos, no es completamente protectora. Los ensayos de proliferación frente a rotavirus mostraron que casi todos los adultos y los niños tienen células T específicas de rotavirus en la fase convalesciente de una gastroenteritis por este virus. Mediante las técnicas de ELISPOT y citometría de flujo se ha observado que los adultos sanos tienen células CD4 y CD8 ciruculantes específicas de rotavirus que producen IFN-γ o IL-2, mientras que los nivles de IL-4, IL-13, IL-10 o IL-17 se encuentran por debajo del límite de detección de la técnica usada. Este trabajo está dividido en dos secciones, en la primera parte lo que pretendemos es hacer una evaluación de las poblaciones de células T específicas de rotavirus mediante los ensayos de proliferación y de producción de citocinas, y además compararlas con las células específicas de otros antígenos, como son el virus influenza y el toxoide tetánico. En la segunda parte, proponemos que la deficiencia de la respuesta contra rotavirus por parte de las células T es debida a la inducción de anergia de estas células, por lo tanto se pretende revertir la anergia de las células incubándolas con los inhibidores de anergia IL-2, IL-12 y el inhibidor de la diacilglicerolkinasa-α, R59949. Para el desarrollo de este trabajo de tesis, solamente se tuvieron en cuenta los resultados correspondientes a la primera parte, que fueron los ensayos que yo realicé en colaboración con mi compañero Daniel Herrera. El modelo lineal de la diferenciación de las células T propone que las células CD4 y CD8 multifuncionales con un potencial de proliferación elevado están relacionadas con protección, mientras que las poblaciones monofuncionales (productoras de IFN-γ, exclusivamente) y de baja capacidad de proliferación, son células de memoria en estado terminal, que no ofrecen protección porque producen bajas concentraciones de citocinas, cuando se comparan con las multifuncionales. Para el caso de infecciones por los virus del dengue, VIH y VHC, parásitos como L.major o bacterias intracelulares como M. Tuberculosis se ha observado que las células multifuncionales están relacionadas con protección. En el caso de las células

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específicas de rotavirus se ha observado que la capacidad de proliferación de las células es menor cuando se comparan con células específicas de otros antígenos y además, sólo producen IFN-γ, relacionando a estas poblaciones con células en estado terminal. No obstante, en los estudios previos no se había incluido el análisis de TNF-α, una citocina importante para la clasificación funcional de estas células.

Materiales y Métodos Estimulación de CMSP derivadas de adultos y niños sanos. CMSP obtenidas de adultos y niños sanos fueron estimuladas con los antígenos de SEB, RRV (rotavirus de mono Rhesus), toxoide tetánico y una vacuna comercial de influenza (Vaxigrip®) durante 10h en presencia de Brefeldin A. Luego de la incubación, las células fueron teñidas para detectar la producción de IL-2, IFN-γ y TNF-α en las células T CD4 y CD8. Finalmente, usando “boolean gates” se evaluó la multifuncionalidad de las células en siete poblaciones productoras de citocinas. Ensayo de proliferación de CMSP. La proliferación de las CMSP se evaluó con la coloración de CFSE. CMSP obtenidas de adultos y niños sanos se estimularon con SEB, RRV, toxoide tetánico y la vacuna comercial de influenza (Vaxigrip®) durante 5 días, posteriormente, las células fueron marcadas para diferenciar las CD4 y las CD8 y se analizó la proliferación frenta a cada uno de los antígenos usados.

Resultados Los resultados mostraron que las células T CD4 específicas de rotavirus están enriquecidas en células monofuncionales que solamente producen IFN-γ, mientras que las células T CD4 especificas del toxoide tetánico y de influenza están enriquecidas en células multifunciones (triple o doble positivas). Adicionalmente, el perfil de las células T CD8 específicas de rotavirus es similar al de las T CD4 de rotavirus, solamente que las T CD8 específicas de rotavirus producen mayor cantidad de TNF-α en comparación con las células T CD8 específicas de influenza. Mientras que las frecuencias de proliferación las células T CD4 y CD8 específicas de rotavirus son significativamente menores que las de las observadas para las células T CD4 y CD8 específicas del toxoide tetánico y de influenza.

Conclusiones Teniendo en cuenta el modelo de diferenciación lineal y al observar la capacidad de proliferación y la multifuncionalidad de las células estimuladas con los diferentes antígenos, se puede sugerir que las células T CD4 específicas de rotavirus están

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más relacionadas con las poblaciones de células de memoria efectoras terminales, mientras que las de toxoide tetánico e influenza parecen estar más relacionadas con las poblaciones de memoria central. Estos hallazgos pueden ayudarnos a entender por qué los niños están parcialmente protegidos luego de una infección primaria o de la vacunación.

Limitaciones

En este estudio sólo podemos sospechar que las células monofuncionales de rotavirus corresponden a células efectoras de memoria, mientras que las células específicas de toxoide tetánico e influenza están más relacionadas con las poblaciones de memoria central, teniendo en cuenta el modelos lineal, porque no se realizaron las tinciones específicas de los perfiles de diferenciación, usando anticuerpos contra CD45RA/RO, CCR7 y/o CD62L, esto debido a la limitación de número de fluorocromos analizables en los citómetros de flujo disponibles.

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Texto del artículo 2

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Rotavirus-specific T cells have a poor functional profile

Miguel Parra1*, Daniel Herrera1*, María Fernanda Jácome2, Martha Mesa2, Luz-

Stella Rodríguez1, Carolina Guzmán3, Juana Angel1, Manuel A. Franco1,&

1Instituto de Genética Humana, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad

Javeriana, Bogotá, Colombia.

2Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad

Javeriana, Bogotá, Colombia.

3Departamento de Pediatría, Hospital Universitario San Ignacio, Facultad de

Medicina, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.

* these authors contributed equally to this work.

Running title: Rotavirus specific T cells.

Keywords: Rotavirus (RV), T cells, cytokines, proliferation

& Correspondence to: Dr. Manuel Franco, Instituto de Genética Humana,

Pontificia Universidad Javeriana, Carrera 7 # 40-62, Bogotá, Colombia.

Phone: 57-1-3208320 Ext 4077. Fax: 57-1-2850356.

*ManuscriptClick here to view linked References

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ABSTRACT

Frequencies of circulating T cells producing IFN- , TNF- , and IL-2, and

percentages of T cells proliferating after stimulation with rotavirus (RV), tetanus

toxoid, and influenza were compared in PBMC derived from healthy adults and

children. In addition, the potential anergic state of RV-specific T cells was

analyzed by stimulation of PBMC with RV antigen in presence of three anergy

inhibitors (rIL-2, rIL-12, or DGK -i). The quality and magnitude of RV-T cell

responses were significantly lower than those to tetanus toxoid and influenza

antigens. RV-CD4 T cell response was enriched in monofunctional IFN- + cells,

while influenza-CD4 and tetanus toxoid-CD4 T cell responses were enriched in

multifunctional T cells. Moreover, rIL-2 unlike rIL-12 or DGK -i increased the

frequencies of RV-CD4 TNF- +, CD4 IFN- +, and CD8 IFN- + cells. Thus, RV-T

cells seem to have a relatively poor functional profile that may be partially

reversed in vitro by the addition of rIL-2.

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INTRODUCTION

Before the introduction of routine immunization, rotavirus (RV) was the main

etiological agent of severe acute gastroenteritis (GE) in children worldwide and

the cause of approximately 453,000 deaths of those under the age of 5 (Tate et

al., 2012). RV immunization has decreased the RV disease burden and has

provided protection rates of approximately 44%, 76%, and 80% against severe

RV-GE in countries with low, intermediate, and intermediate to high per capita

income, respectively (Patel et al., 2012; Payne et al., 2013; Wikswo et al.,

2013). Thus, as for other enteric vaccines like polio (Paul, 2007a, b), RV

vaccines are less effective where they are needed the most and development of

a new generation is desirable. However, a marker of protection after vaccination

remains unidentified.

Similar to natural infection, vaccination provides non-sterilizing immunity in

children (Angel et al., 2007), and around 50% of adult guardians of children with

RV-GE become infected, and 50% of them can present slight to mild RV

disease (Rodriguez et al., 1987), suggesting that even in adults RV long-term

immunity is incompletely protective. Evidence in animal models and humans

indicate that RV specific T (RV-T) cells are important for development of a

protective immune response (Franco et al., 2006).

Initial (Offit et al., 1992; Yasukawa et al., 1990) and more recent (Mäkelä et al.,

2004; Mäkelä et al., 2006; Parra et al., 2014) studies that characterized the T

cell responses to RV in humans by lymphoproliferation assays showed that

most, but not all, healthy adults and children have circulating RV-T cells in the

convalescent phase of RV-GE. Moreover, using this method it was established

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that in healthy adults approximately 50% of RV-CD4 T cells express the

intestinal homing receptor 4 7 (Rott et al., 1997).

Using ELISPOT and intracellular cytokine staining assays, we previously

showed that healthy adults have circulating RV-CD4 and RV-CD8 T cells that

secrete IFN- or IL-2, whereas cells producing IL-4, IL-13, IL-10, or IL-17 were

below detection limits (Jaimes et al., 2002; Mesa et al., 2010; Narváez et al.,

2005; Rojas et al., 2003). The frequencies of RV-CD4 IFN- + and RV-CD8 IFN-

+ T cells circulating in these subjects are comparable to those specific for

several mucosal respiratory viruses (Mesa et al., 2010). However, the majority

of RV-CD4 T cells were IFN- single producers, followed by a low percentage of

double IFN- +/IL-2+ cells, while IL-2 single producers were below the limit of

detection level. Also, RV-CD8 T cells obtained from healthy adults were

preferentially single IFN- + whereas double IFN- +/IL-2+ and single IL-2+ RV-

CD8 T cells were rarely observed (Jaimes et al., 2002; Mesa et al., 2010;

Narváez et al., 2005; Rojas et al., 2003). These findings suggested that both

RV-CD4 and CD8 T cells found in healthy adults are probably terminally

differentiated effector cells, unable to provide long-term immunity (see below).

Compared with healthy individuals, in adults with acute infection, the

percentage of RV-CD4 IFN- + cells was increased, a subset of RV-CD4 IL-10+ T

cells became evident, and the RV-CD4 IL-2+ T cell subset was diminished

(Jaimes et al., 2002; Mesa et al., 2010). During convalescence, the IL-10+

subset became undetectable, the IFN- + subset decreased, and the IL-2+

subset increased, in most individuals, to the levels found in healthy adults. RV-

CD8 IFN- + T cells behaved in a similar way to CD4 IFN- + T cells during acute

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RV-GE and convalescence phases, but CD8 IL-2+ or IL-10+ T cells were barely

detected during these states, and only in a few individuals (Mesa et al., 2010).

Unexpectedly, very low or undetectable frequencies of circulating RV-CD4 and

RV-CD8 IFN- + T cells were detected in children with RV-GE, compared with

RV infected and healthy adults (Jaimes et al., 2002; Mesa et al., 2010; Rojas et

al., 2003). Levels of CD4 and CD8 T cells producing IL-2, IL-4, IL-10, IL-13 or

IL-17 were below detection levels (Jaimes et al., 2002; Mesa et al., 2010; Rojas

et al., 2003). Consequently, monitoring the RV-CD4 T cells response after

vaccination, to evaluate its value as a marker of protection, is a challenging task

and the development of new strategies are needed for this purpose.

The linear functional differentiation model for TH1 CD4 T cells proposes that

CD4 T cells producing only TNF- or IL-2, cells producing both cytokines (TNF-

+/IL-2+), and multifunctional T cells (TNF- +/IL-2+/IFN- +) correspond to central

memory T cells (TCM) with the highest potential for expansion. Double IFN-

+/TNF- + and IFN- +/IL-2+, which have diminished their proliferative potential,

could be related to effector memory T cells (TEM), whereas single IFN- + T cells

producing at least 10 times less IFN- and with a very low proliferation

capacity would be in a terminal effector stage (TTE) (Sallusto et al., 2004;

Seder et al., 2008). It was also proposed that CD8 TCM cells may be related to

cells producing the three cytokines (TNF- +/IL-2+/IFN- +), whereas TEM could

correspond to cells that have lost IL-2 secretion capacity, and IFN- single

producers may be CD8 TTE (Sallusto et al., 2004; Seder et al., 2008). The

frequencies of T cells that simultaneously produce TNF- , IL-2, and IFN- and

that proliferate in response to RV have not been determined and thus their

classification into these functional subsets is uncertain.

86

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

RV predominantly replicates in mature enterocytes of the small intestine and

has a systemic dissemination (Blutt et al., 2003); consequently, both intestinally

and systemically primed T cells are generated, with most circulating RV-CD4 T

cells expressing intestinal homing receptors (Parra et al., 2014; Rojas et al.,

2003). Some evidences suggest that regulatory mechanisms could be triggered

in the tolerogenic gut environment in response to RV: the finding of potentially

terminally differentiated RV-CD4 T cells, transient RV-CD4 IL-10+ T cells in

adults with RV-GE, and the low frequency of RV-T cells observed in children

with RV-GE. Consistent with this hypothesis, we observed higher frequencies of

RV-CD4 IFN- + T cells after depletion of CD25+ T cells and/or the blocking of

the TGF- signaling pathway in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of

healthy adults. However, the TGF- regulatory mechanism that modulates RV-T

cells in adults was unobserved in children (Mesa et al., 2010), suggesting that

RV-CD4 T cells could be modulated by other tolerogenic mechanisms, such as

anergy.

Three strategies have been described for reversing the state of anergy of T

cells in culture: stimulating T cells with the antigen in the presence of IL-2 (Choi

and Schwartz, 2007), IL-12 (Dybul et al., 2000; Suzuki et al., 1999), or R59949,

a pharmacological diacylglycerol kinase alpha (DGK- ) inhibitor (Olenchock et

al., 2006; Zha et al., 2006). Increased frequencies of antigen-specific cells are

observed in cultures stimulated in the presence of these molecules, contrasted

with those cultured in their absence.

In the present study, we directly compared, in healthy adults and children, the

frequencies of circulating T cells producing cytokines (IFN- , TNF- , and IL-2)

and proliferating after stimulation with RV, influenza, and tetanus toxoid.

87

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Furthermore, we explored if increased frequencies of cytokine producing RV-

CD4 and CD8 T cells were detected in the presence of IL-2 (Choi and

Schwartz, 2007), IL-12 (Dybul et al., 2000; Suzuki et al., 1999), or R59949

(Olenchock et al., 2006; Zha et al., 2006), the three strategies previously

described for reversing the state of anergy of T cells in culture.

We observed that the frequencies of circulating RV-T cells producing any

cytokine studied or proliferating in response to RV were lower than those

specific for tetanus toxoid and influenza. In addition, the RV-CD4 T cell

response was enriched in IFN- + cells, while tetanus toxoid-CD4 and influenza-

CD4 T cell responses were enriched in cells that produce at least two cytokines.

Finally, we found that rIL-2 unlike rIL-12 or DGK -i increased the frequencies

of RV-CD4 TNF- +, RV-CD4 IFN- + and RV-CD8 IFN- + cells in the cultures of

PBMC from adults.

88

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

RESULTS Frequencies of RV-CD4 T cells producing IFN- , TNF- , or IL-2 are lower

than their tetanus toxoid and influenza virus counterparts

PBMC from healthy adults were stimulated with SEB (positive control), RV,

tetanus toxoid, influenza virus, dialyzing medium (negative control for RV), or

PBS 1x (negative control for tetanus toxoid and influenza). We compared the

frequencies of T cells producing any of three cytokines (IFN- , TNF- , and IL-2)

after stimulation with the different stimuli using intra-cellular cytokine staining

and flow cytometry. Frequencies of CD4 T cells producing any cytokine after

stimulation with RV, tetanus toxoid, or influenza virus (Figure 1A), and CD8 T

cells stimulated with RV and influenza virus (Figure 1B) were significantly higher

than those stimulated by their respective negative controls. The net (stimulus

minus control) frequencies of RV-CD4 T cells producing any cytokine were

significantly lower than those specific for tetanus toxoid (p=0.021, data not

shown) and influenza virus (p=0.006, data not shown); whereas the frequencies

of RV- and influenza-CD8 T cells were not statistically different (p=0.061, data

not shown). Similar results were obtained for CD4 T cells in studies realized

with PBMC from five healthy children, and statistically significant RV-CD8 T

cells responses were unobserved (Supplementary figure 1).

RV-CD4 T cells are enriched in IFN- or TNF- single producers, whereas

tetanus toxoid- and influenza-CD4 T cells are multifunctional

We used Boolean gates to evaluate net frequencies of multifunctional and

monofunctional cytokine producing CD4 T cells after stimulation with RV (Figure

89

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

2A), SEB (Figure 2B), tetanus toxoid (Figure 2C), or influenza virus (Figure 2D).

In general, CD4 T cells stimulated with RV, SEB, tetanus toxoid, and influenza

virus were different regarding the response quality. The majority of RV-CD4 T

cells were single IFN- + or TNF- + producers; CD4 T cells stimulated with SEB

were mainly double IL-2+/TNF- + and single IL-2+ or TNF- +; tetanus toxoid-

CD4 T cells were double IL-2+/TNF- +, single TNF- +, and triple IL-2+/IFN-

+/TNF- +; finally, the majority of influenza virus-CD4 T cells were triple IL-

2+/IFN- +/TNF- + and single IFN- + or TNF- +.

Compared with RV-CD4 T cells, those stimulated with SEB had higher

frequencies of IL-2+/TNF- + (p=0.0005) and IL-2+ (p=0.0005) cells, but lower

frequencies of IFN- +/TNF- + (p=0.027) cells. In contrast, frequencies of RV-

CD4 IFN- + T cells were significantly higher than CD4 IFN- + T cells observed in

response to SEB (p=0.001), tetanus toxoid (p=0.0005), and influenza (p=0.021).

Both tetanus toxoid- and influenza-CD4 T cells had higher percentages of cells

producing the three cytokines (IL-2, IFN- , and TNF- , p=0,026 and p=0.002,

respectively) compared with RV-CD4 T cells. Also, tetanus toxoid-CD4 T cells

IL-2+/TNF- + were significantly higher than the RV-CD4 T cells counterpart

(p=0.0005). Additionally, frequencies of influenza-CD4 IL-2+/IFN- + T cells were

significantly higher (p=0.0005) than RV-CD4 IL-2+/IFN- + T cells. Comparable

results (predominance of monofunctional RV-T cells vs polyfunctional tetanus

toxoid and influenza T cells) were observed when the responses of CD4 T cells

from children were analyzed in a similar fashion (Supplementary Figure 2).

Globally, the functional profiles of CD8 T cells stimulated with RV (Figure 3A),

SEB (Figure 3B), and influenza virus (Figure 3C) were similar. RV- and

influenza-CD8 T cells were enriched in IFN- single producers followed by

90

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

double IFN- +/TNF- + cells; likewise, after stimulation with SEB CD8 T cells

were mainly single IFN- + and double IFN- +/TNF- +, followed by single TNF- +.

Comparatively, frequencies of RV-CD8 IFN- + T cells (Figure 3A) were

significantly higer than those observed after SEB stimulation (p=0.026) (Figure

3B), but similar to influenza-CD8 IFN- + T cells (Figure 3C); furthermore,

frequencies of RV-CD8 TNF- + T cells were higher than the influenza-CD8

TNF- + T cells (p=0.039). After stimulation with SEB, CD8 IL-2+/TNF- +

(p=0.009) and IFN- +/TNF- + T cells (p=0.039) were significantly higher than

the corresponding RV-specific T cell subsets.

In conclusion, RV-CD4 T cells are enriched in monofunctional cells (IFN- + and

TNF- +), preferentially single IFN- + cells, whereas tetanus toxoid and

influenza-CD4 T cells have higher frequencies of double IL-2+/TNF- +, and

triple IL-2+/IFN- +/TNF- + cells, respectively. The functional profile of CD8 T

cells stimulated with RV, SEB, and influenza virus were similar, but percentages

of RV-CD8 single TNF- + T cells were higher than their influenza counterpart.

Lower frequencies of CD4 and CD8 T cells proliferating in response to RV

are observed in comparison with tetanus toxoid and influenza virus

Next, the frequencies of T cells that proliferate after stimulation with RV, tetanus

toxoid, or influenza were compared using CFSE staining. PBMC of healthy

adults were stimulated and cultured for 5 days as described below. The

frequencies of CD4 (Figure 4A) and CD8 T cells (Figure 4B) that proliferated in

response to RV, tetanus toxoid, and influenza were significantly higher than

those in the corresponding negative controls. The net (stimulus minus control)

frequencies of CD4 and CD8 T cells proliferating after stimulation with RV

91

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

in culture. For these experiments we included in the flow cytometry panel

antibodies against CD69 to evaluate recently activated T cells, and IL-13 for

detecting potential TH2 cells; as stated before, although RV-T cells are

predominantly TH1, we previously observed RV-IL-13+ T cells in samples of a

few children and adults (Mesa et al., 2010).

In these experiments, the frequencies of CD69+-TNF- +, IFN- +, IL-13+, and IL-

2+ CD4 and CD8 T cells in control cultures (Medium) did not increase

significantly (p 0.05; Wilcoxon test) after exposure to 100 IU/mL rIL-2. CD69+-

IL-13+ and IL-2+ CD4 T cells were not evidenced in cultures exposed to RV nor

after exposure to RV plus rIL-2. On the contrary, CD69+-TNF- + and IFN- +

CD4 T cells evidenced in cultures with RV increased significantly (p 0.05;

Wilcoxon test) when exposed to RV plus rIL-2; specifically, CD69+-TNF- + CD4

T cells increased from a median of 0.020% (range 0.011-0.026%) to 0.040%

(range 0.018-0.061%), and CD69+-IFN- + CD4 T cells rose from 0.05% (range

0.015-0.150%) to 0.115% (range 0.097-0.374%) (Figure 6A). CD69+-TNF- +,

IL-13+, and IL-2+ CD8 T cells were not evidenced in cultures with RV; after

exposure to rIL-2, TNF- + (Figure 6B), and IL-13+ CD8 T cells, but not IL-2+

(data not shown) increased slightly; however, CD69+-IFN- + CD8 T cells

detected in cultures with RV increased in the presence of rIL-2 from 0.056%

(range 0.044-0.078%) to 0.153% (range 0.098-0.268%), respectively (Figure

6B, p 0.05; Wilcoxon test).

A Boolean gating analysis of the net frequencies of cytokine+ CD4 and CD8 T

cells, evidenced that the principal effect of rIL2 was on the single IFN- + RV-T

cells, although a small increment (p 0.05; Wilcoxon test) was also observed for

double IFN- +/TNF- + RV-T cells (Supplementary figure 4).

92

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

(median 1.18%; range: 0.09% to 3.23%, and median 1.46%; range: 0.06% to

4.93%, respectively) were significantly lower than those observed after tetanus

toxoid (median 3.61%; range: 0.52% to 21.4%; p=0.002, and median 3.87%;

range: 0.1% to 11.4%; p=0.024, respectively) or influenza virus stimulation

(median 3.88%; range: 0.1% to 11.4%; p=0.009, and median 1.46%; range:

0.06% to 4.93%; p=0.019, respectively). Statistically significant proliferative

responses of CD4 and CD8 T cells from children were unobserved after

stimulation with any of the three antigens (Supplementary figure 3).

Supernatants from these PBMC proliferation cultures stimulated with RV and

dialyzing medium were harvested for quantitation of cytokines/chemokines by

CBA. In comparison with PBMC from healthy adults treated with dialyzing

medium, RV treated PBMC secreted IFN- , TNF- , GM-CSF, RANTES, MCP-1

and IL-10 (Figure 5, p<0.05, Wilcoxon test). RV did not induce the secretion of

IL-4, IL-6, IL-17A, IL-9, and IL-2 (data not shown). No significant differences

were evidenced in cytokines/chemokines present in PBMC cultures

supernatants from healthy children stimulated with RV and dialyzing medium

(data not shown).

rIL-2, unlike rIL-12 or DGK -i, increased RV-T cell responses detected in

adults

To explore if potentially anergic RV-T cells exist in healthy adults, PBMC from

these individuals were stimulated with RV in the absence or presence of rIL-2

(Choi and Schwartz, 2007), rIL-12 (Dybul et al., 2000; Suzuki et al., 1999), and

diacylglycerol kinase alpha inhibitor (DGK -i) (Olenchock et al., 2006; Zha et

al., 2006) three strategies proposed for reversing the state of anergy of T cells

93

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

In the cultures exposed to rIL-12 (Supplementary Figure 5), significant

increments were observed for RV-CD4 T cells CD69+-IFN- + and RV-CD8 T

cells CD69+-IFN- +. However, significant increments in the frequencies of CD4

and CD8 T cells CD69+-IFN- + were also observed in their respective control

cultures (Medium+rIL-12), compared with medium without rIL-12 (Medium)

(Supplementary Figure 5).

In the cultures stimulated in the presence of DGK -i (Supplementary Figure 6),

significant increases were observed for RV-CD4 T cells CD69+-TNF- + and

IFN- + (Supplementary Figure 6). However, in their corresponding control

cultures (Medium+DGK -i), significant increments in the frequencies of RV-CD4

T cells CD69+-TNF- + and IFN- + were also observed (Supplementary Figure

6).

In summary, the addition of rIL-2 increased the frequencies of CD69+-TNF-

and IFN- T cells activated in the presence of RV but not control antigen. The

rIL-12 and DGK -i increased frequencies of cells both in RV and control media

stimulated cells.

DISCUSSION

Frequencies of cytokine producing and proliferative responses of circulating T

cells from healthy adults and children stimulated with RV, tetanus toxoid, and

influenza virus were compared. Frequencies of RV-CD4 T cells producing

cytokines were significantly lower compared with tetanus toxoid- and influenza-

CD4 T cells (Figure 1). In contrast, frequencies of RV- and influenza-CD8 T

cells producing cytokines were similar. RV-CD4 T cells were enriched in single

IFN- or single TNF- , whereas tetanus toxoid- and influenza-CD4 T cell

responses were enriched in cells that produce at least two cytokines. Moreover,

94

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

the magnitudes of proliferative responses were significantly higher in response

to tetanus toxoid and influenza than to RV stimulus. Finally, the stimulation of

PBMC with RV in the presence of rIL-2 but not rIL-12 or DGK -i increased

the frequencies of RV-CD4 TNF- + or IFN- + and RV-CD8 IFN- + cells detected

in the cultures of PBMC from adults.

Frequencies of RV-CD4 and RV-CD8 T cells IFN- + detected in this study are in

agreement with our previous results (Jaimes et al., 2002; Narváez et al., 2005;

Rojas et al., 2003). Also in agreement with our previous studies, low

percentages of RV-CD4 T cells IL-2+ were detected in some healthy adults

PBMC (Mesa et al., 2010; Mesa et al., 2007; Narváez et al., 2005). This is the

first report of frequencies of T cells secreting TNF- after PBMC stimulation

with RV. In the past, increased plasma levels of TNF- , evaluated by ELISA,

were detected in acutely RV infected children compared with uninfected

children (Azim et al., 1999). Besides, TNF- in serum, measured by Luminex

assays, was related to the presence of fever and more diarrheal episodes in the

acute phase of infection in children (Jiang et al., 2003).

Our results are in accord with previous reports showing that tetanus toxoid-CD4

T cell response has a greater proportion of double positive cells IL-2+/TNF- +

followed by triple IL-2+/TNF- +/IFN- + CD4 T cells (Livingston et al., 2013). Our

results are also in agreement with studies of influenza-CD4 T cells showing a

TH1 pattern of cytokine expression, including triple IL-2/TNF- /IFN- CD4 T

cells (Kannanganat et al., 2007; Weaver et al., 2013).

RV, tetanus toxoid, and influenza-CD4 T cells are particularly enriched in CD4 T

cells that produce one, two, and three cytokines, respectively (Figure 2). In the

context of the linear functional differentiation model for TH1 CD4 T cells

95

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

proposed by Seder et al. (Seder et al., 2008), RV-CD4 T cells may correspond

to TTE populations, whereas tetanus toxoid- and influenza-CD4 T cells may be

related with TCM memory populations (Seder et al., 2008). The RV-CD8 T cells

(Figure 3) seem also to be related with TTE, because the majority of cells were

IFN- single producers and had low proliferation capacity (Sallusto et al., 2004;

Seder et al., 2008), whereas influenza-CD8 T cells were IFN- single producers

but with an increased proliferative response and may thus probably be related

with TEM (Sallusto et al., 2004; Seder et al., 2008).

This is the first time we have studied cytokine secreting and proliferating RV-T

cells in healthy children. The response seems to be comparable to that of

children of similar age (2-8 years) with non RV diarrhea studied in the past

(Jaimes et al., 2002; Narváez et al., 2005; Rojas et al., 2003) and lower than

that of healthy adults (compare Figure 1 and 4 to Supplementary figures 1 and

3). Of note, the predominance of monofunctional RV-Tcells was also observed

in children (Supplementary Figure 2), indicating that the presence of

monofunctional RV-T cells in adults is not solely due to the age of the subjects,

but that this characteristic appears after infection at an early age.

CD4 and CD8 proliferative responses to all three antigens (RV, tetanus toxoid,

and influenza) were observed (Figure 4). The frequencies of CD4 T cells

proliferating to tetanus toxoid in the 7th (Livingston et al., 2013) or 8th day of

cultures (Salkowitz et al., 2004) are similar to our results and highlight the

robustness of the assay. Proliferation responses to RV were also comparable to

those reported in previous studies (Mäkelä et al., 2006; Offit et al., 1992;

Yasukawa et al., 1990). The percentages of CD4 and CD8 T cells that

proliferated in response to RV were significantly lower compared with those to

96

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

tetanus toxoid (Wilcoxon test, p=0.002 and p=0.024, respectively) and influenza

(Wilcoxon test, p=0.009 and p=0.019, respectively) suggesting that this function

is related to their poor capacity to secrete IL-2.

After 5 days of stimulation of PBMC from healthy adults with RV, we observed a

significant increase of IFN- , TNF- , GM-CSF, RANTES, MCP-1, and IL-10

(Figure 5) in the proliferation supernatants, compared with controls. These

cytokines and chemokines could reflect preferentially a TH1-biased response

associated with an antiviral immune function (Barouch et al., 2002). However,

the detection of IL-10 could reflect a regulatory T cell response at late times of

infection, as previously proposed by our group (Mesa et al., 2007). Although no

statistical differences were found in levels of cytokines in supernatants from

PBMC of healthy children stimulated with RV (data not shown), some of these

cytokines have been detected in the serum of infected children (Chen et al.,

2012; Jiang et al., 2003). It remains to be determined which populations of the

PBMC are responsible for the production of each cytokine.

Multifunctional CD4 and CD8 T cells are associated with protection against

different pathogens such as Leishmania major (Darrah et al., 2007), HIV (Boaz

et al., 2002), HCV (Semmo et al., 2005), dengue virus (Weiskopf et al., 2013),

and M. tuberculosis (Millington et al., 2007). RV-CD4 and CD8 T cells were

enriched in cells that only produce IFN- and had a low proliferative response;

these results suggest that RV-CD4 and CD8 T cells correspond to

monofunctional terminal effector cells, and may help explain why children are

only partially protected after primary RV infection or vaccination.

As previously stated, the unexpected low frequency of circulating RV-T cells

detected in children with GE could be characteristic of highly regulated intestinal

97

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

immune responses. We previously described a TGF-

that modulates RV-T cells in adults, which was unobserved in children (Mesa et

al., 2010) suggesting that RV-CD4 T cells could be modulated by other

tolerogenic mechanisms. It has been described that the absence of IL-2 (a key

T cell growth factor) during antigen-specific T cell stimulation induces anergic T

cells (Choi and Schwartz, 2007). To explore this posibility, the effect of rIL-2,

rIL-12, or DGK -I on the frequency of CD69+ cytokine+ RV-T cells detected in

adults was explored; significant increments of RV-CD69+ IFN- + or TNF- + T

cells were observed in cultures exposed to rIL-2, but not to IL-12 or DGK -I.

Specifically, the increases were in single IFN- + CD4 and CD8 T cells and a

small increase in double IFN- +/TNF- + T cells; both types of cells subsets

correspond to LTEM (Seder et al., 2008). The improved response of CD8 T cells

in the presence of IL-2 suggests that CD4 T cell help for its development, as

has been described in some animal viral models and in HIV patients (Lieberman

et al., 2001). In the present study, the higher frequencies of RV-T cells TNF- +

or IFN- + revealed in the presence of rIL-2 seem to be specific due to the

absence of increments in the control cultures exposed to medium. These

observations are at odds with previous data reporting increments in the

production of TNF- and IFN- from cultures of PBMC with rIL-2 and without

antigen after 24 hours, a difference that could be attributed to the time of

incubation (Sereti et al., 2000). Other reports that have used rIL-2 for reversing

anergy in humans have been performed mostly with T cell lines or clones, with

variable results in proliferation, cytokine production or antigen specificity (Boon

et al., 2005; Lyngstrand et al., 2002). In ex-vivo human T cell cultures, rIL-2

98

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

increased the frequency of CD4+ IFN- + T cells detected in HIV infected patients

(Gu et al., 2007).

The frequencies of RV-T cells increased after stimulation with RV and rIL-12

(RV-CD4 and CD8 T cells IFN- +) or RV plus DGK -i (RV-CD4 T cells TNF- +

and IFN- +), but so did the frequencies of the control stimuated cells

(Medium+rIL-12 and Medium+DGK -i). These effects could be attributed to

TCR-independent activation. Additional experiments are needed to further

determine the specificity of RV-T cells revealed in the presence of molecules

used for reversing the state of anergy of T cells. For example, simultaneous

staining with RV class I and class II tetramers (Parra et al., 2014) could

contribute to determine the specificity of RV-T cells that are increased in the

presence of these molecules.

Studies stimulating RV-T cells in the presence of rIL-2 or rIL-12 could be useful

to evaluate the T cell response in vaccinated children, as these infants may

have poorly-functional APCs (Krumbiegel et al., 2007; Velilla et al., 2006).

Although we could not detect a specific effect of IL-12 on RV-T cells from

adults, it could be necessary to explore the effect of this cytokine in children;

particularly, since higher frequencies of measles IFN- + T cells were detected in

samples from children cultured with IL-12 and IL-15 (Gans et al., 2008).

In summary, altogether our experiments suggest that RV-CD4 T cells are

related to CD4 TTE, whereas tetanus toxoid- and influenza- CD4 T cells are

related to CD4 TCM. These results may partially explain why immunity to RV is

relatively inefficient. Moreover, addition of rIL-2 increased the cytokine

production of RV-T cells, suggesting that this treatment may be useful to study

99

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the T cell response induced by RV vaccines in infants, and its assessment as a

marker of protection.

ACKNOWLEDGMENTS

This work was financed by grants from the Pontificia Universidad Javeriana (ID

4202 and 4422). Miguel Parra was funded by a scholarship from Colciencias.

We would like to thank the subjects and parents of children that participated in

this study for their generosity.

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MATERIALS AND METHODS

Subjects

After written informed consent had been signed by adult volunteers, parents or

legal guardians of children, heparinized blood samples were obtained from 23

healthy adults (19-50 years old) and five children (2-8 years old). PBMC were

isolated by density gradient centrifugation (Lympho Separation Medium, MP

Biomedicals, Santa ana, CA) and stimulated immediately. Studies were

approved by the Ethics Committee of the San Ignacio Hospital and Pontificia

Universidad Javeriana.

Antigens

The RRV strain of simian RV (obtained from Dr. H. B. Greenberg, Stanford

University CA) was grown in MA104 cells and viral Triple-Layer Particles (TLPs)

were purified by ultracentrifugation in CsCl gradient (Jaimes et al., 2002). The

purified TLPs preparations had titters between 2.5 × 108 and 1 × 109 focus

forming units (ffu)/ml. The TLPs were dialyzed against RPMI three times prior to

use and the third fraction of these dialyzing media was used as control

(Medium). The TLPs protein concentration was calculated by Bradford or BCA

(Pierce Biotechnology, Rockford, IL) methods.

To assess influenza-specific T cell responses the inactivated split virus

influenza vaccine (Vaxigrip , Sanofi Pasteur) produced for the southern

hemisphere 2009-2010 season (A/Brisbane/59/2007 (H1N1)-like strain,

A/Brisbane/10/2007 (H3N2)-like strain, B/Brisbane/60/2008-like strain) was

used. Tetanus Toxoid (Statens Serum Institute, Denmark) for in vitro tests (606

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Lf/ml) was used to evaluate tetanus-specific T cell responses. For both Vaxigrip

and tetanus toxoid, PBS was used as a negative control.

For each antigen used in the intracellular cytokine staining and

lymphoproliferative assays, the ideal concentration in terms of g/ml to

stimulate T cells was stablished in titration assays according to the maximum

viability and signal to noise ratio obtained (data not shown).

Stimulation of PBMC with RV, tetanus toxoid, and influenza vaccine

PBMC obtained by Ficoll-Paque density gradient centrifugation were washed

twice with PBS 1x and resuspended in AIM-V medium (Life technologies,

Carlsbad, CA). Then, one million PBMC/ml were distributed in 15 ml

polystyrene tubes (Becton Dickinson Falcon Labware, Franklin Lakes, N.J.) and

stimulated with 1.25 µg/ml superantigen staphylococcal enterotoxin B (SEB;

Sigma, St. Louis, MO), 1 µg/ml dialyzed RRV TLPs, 0.25 µg/ml influenza

vaccine, 12 µg/ml tetanus toxoid, Medium, or PBS. Anti-CD28/CD49d

monoclonal antibodies (Mabs) (1 µg/ml each; BD Biosciences, San Jose, CA)

were added as co-stimulators (Waldrop et al., 1998; Waldrop et al., 1997). In

assays for evaluating the state of anergy of T cells, PBMC were stimulated as

previously described in the presence of 100 IU/ml rIL-2 (Chiron, Emeryville,

CA), 5 IU/ml rIL-12 (Preprotech, Rocky Hill, CT) or 25 M DGK -i (Sigma);

these concentrations were set according to previous titration assays.

Stimulated PBMC were incubated with a 5° slant for 10 h at 37°C with 5% CO2;

10 µg/ml Brefeldin A (Sigma) was added for the last 5 h of the incubation; in

the experiments for anergy 5 µg/ml Brefeldin A and 5 ug/ml Monensin (Sigma)

were used.

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Intracellular cytokine detection

After incubation, cells were washed once with 10 ml of PBS 1x. Then, 2 mM

EDTA (GIBCO, N.Y.) in PBS was added for 5 min to detach plastic-adherent

cells, and the samples were washed again with PBS. PBMC were stained with

Aqua viability reagent (Invitrogen Molecular Probes, Eugene, OR) for 10 min at

room temperature (RT), followed by staining with conjugated Mabs against

CD14-V500 and CD19-V500, as a dump channel, CD3-pacific blue, CD4-

PerCP-Cy5.5, and CD8-APC-H7 for 20 min at RT. After two wash steps, the

first one with PBS and the second one with staining buffer (SB; PBS plus 0.5%

bovine serum albumin [Merck, Darmstadt, Germany] plus 0.02% sodium azide

[Mallinckrodt Chemicals, Paris, Ky.]), cells were permeabilized with 250 l of

Cytofix/Cytoperm solution (BD Biosciences) for 30 min at 4°C and washed twice

with 1 ml of Perm/Wash solution (BD Biosciences). Then, Mabs against IL-2-

FITC, IFN- -PE-Cy7 and TNF- -APC were added and incubated for 20 min at

RT. For anergy experiments the fluorochrome combination was slightly modified

and included Mabs against CD69-PE-Cy7, IL-13 PE, IL-2-Alexa Fluor 700

(Biolegend), IFN- -FITC and TNF- -APC. All antibodies used in the study were

from BD Biosciences, except where indicated. Finally, the cells were washed

twice with Perm/Wash and resuspended in 250 l of the same solution.

Cells were acquired on FACSAria (BD Biosciences) or LSR Fortessa (BD

Biosciences) flow cytometers with FACSDIVA software 6.1.2 (BD Biosciences);

application settings were implemented to guarantee constant fluorescence

intensity values among experiments run on different days and regardless of the

flow cytometer used. At least 300,000 lymphocytes, gated on a forward scatter

window, were acquired and afterwards analyzed with FlowJo software v.9.3.2.

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(Treestar, Ashland, OR). After excluding doublets and dead cells, T cells were

gated on a CD3 window and were further divided in CD4 and CD8 T cells.

Based on these windows total IL-2, IFN- , and TNF- producing CD4 or CD8 T

cells were defined. Subsequently, a Boolean gating analysis was performed

and seven populations were defined in addition to the total IL-2+, IFN- +, and

TNF- + CD4 or CD8 T cells subsets. Responses were considered positive if the

frequency of the defined subsets was at least twice that of the respective

control and above 0.02%. For anergy assays, results are reported as

percentage of cytokine positive CD69+CD4+ or CD69+CD8+ T cells in cultures

exposed to control media and RV antigen. Additionally, Boolean gating analysis

was performed and fifteen populations were defined in addition to the total IL-

2+, IFN- +, IL-13+ and TNF- + CD4 or CD8 T cells subsets; these results are

reported as net values (RV minus Medium or RV+treatment minus

Medium+treatment ).

PBMC proliferation assay

T cell proliferation was evaluated by carboxyfluorescein succinimidyl ester

(CFSE) staining, as previously reported (Quah and Parish, 2010; Quah et al.,

2007), with some modifications. Briefly, 4-10x106 fresh PBMC were

resuspended in 1 ml of PBS 1X, placed in a 15 ml conical tube, and stained

with CFDA-SE ( Invitrogen Molecular

Probes). The cells were incubated 5 min at RT, protected from light and then

washed 3 times with 10 ml of PBS 1X-FBS 5% at RT. Finally, the cells were

diluted in 1 ml of RPMI supplemented with 10% AB+ human serum (Multicell,

human serum AB, Wisent INC, Canada). After CFSE staining, PBMC were

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stimulated with the antigens as previously described, except for tetanus toxoid

that was used at 4.8 g/ml, and cultured for 5 days at 37°C with 5% CO2. Then,

cells were harvested, washed twice with PBS 1X, and stained with Violet

viability reagent (Invitrogen Molecular Probes) for 10 min and then with anti-

CD3-PE, CD4-PerCP-Cy5.5 and CD8-APC-H7 and incubated for 30 min at RT.

Finally, the cells were resuspended in 250 µl of PBS, acquired in a FACSAria

flow cytometer and analyzed with FlowJo software v.9.3.2.

Quantification of cytokines and chemokines in proliferation assay

supernatants

Human IFN- , IL-2, TNF- , IL-10, IL-6, IL-4, IL-17A, IL-9, GM-CSF, MCP-1, and

RANTES were measured using a cytometric bead array (CBA) flex set system

0.002 pg/ml to 11.2 pg/ml). Briefly, 50 µl of proliferation assays supernatants

were deposited in polystyrene tubes followed by 50 µl of mixed capture beads

and incubated 1h at RT. Afterwards, 50 µl of the mixed PE detection reagent

were added and samples were incubated for another 2h at RT. The tubes were

then washed, centrifuged at 200 g for 5 min and resuspended in 300 µl of wash

buffer. Samples were acquired on a LSRFortessaTM flow cytometer and CBA

analysis was performed using FCAP array software v3.0.1 (BD Biosciences).

Statistical Analysis

Friedman and Wilcoxon tests were performed for evaluating differences among

several or only two antigens or treatments, respectively, using GraphPad Prism

software v.5.0a for Mac OS X, GraphPad Software (La Jolla, CA). Significance

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was established if p 0.05. Data are shown as median and range.

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111

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

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children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus

113

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

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G.A., Curns, A.T., Lopman, B., Vinjé, J., Parashar, U.D., Payne, D.C., Hall, A.J.,

114

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

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115

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

FIGURE LEGENDS

Figure 1. Frequencies of T cells producing any cytokine (IL-2, IFN- and

TNF- in response to RV, tetanus toxoid or influenza. Fresh PBMC from

healthy adults were cultured with SEB (1.25 µg/ml, positive control), RV (TLPs,

1 g/ml), tetanus toxoid (TT, 4.8 µg/ml), influenza (Vaxigrip, 0.25 µg/ml),

Medium (RV-TLPs dialyzing media, negative control for RV), or PBS 1x

(negative control for tetanus toxoid and influenza) in the presence of anti-CD28

and anti-CD49d MAbs for 10 h; brefeldin A was added for the last 5 h of

incubation. Frequencies of live CD4 (A) and CD8 (B) T cells producing IL-2,

IFN- , and TNF- were evaluated by ICS and flow cytometry. Wilcoxon tests

were used to evaluate differences among groups.

Figure 2. Comparison of the patterns of cytokine production by CD4 T

cells of healthy adults stimulated with RV, SEB, tetanus toxoid, and

influenza antigens. Boolean analysis of net specific CD4 T cells producing

cytokines (from figure 1A) was used to determine the relative frequencies of RV

(A), SEB (B), tetanus toxoid (C), and influenza (D) CD4 T cells that produce IL-

2, IFN- , and TNF- individually or in combination. Wilcoxon tests were used to

assess differences between groups. Letters inside graphics represent

significant differences in cytokine production: a (RV vs. SEB), b (RV vs. tetanus

toxoid), and c (RV vs. influenza).

Figure 3. Comparison of the patterns of cytokine production by CD8 T

cells of healthy adults stimulated with RV, SEB, and influenza antigens.

Boolean analysis of net specific frequencies of CD8 T cells producing cytokines

116

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

(from figure 1B) were used to determine the relative frequencies of RV (A), SEB

(B), and influenza (C) CD8 T cells that produce IL-2, IFN- , and TNF-

individually or in combination. Wilcoxon tests were used to assess differences

between groups. Letters inside graphics represent significant differences in

cytokine production cells: a (RV vs. SEB) and c (RV vs. influenza).

Figure 4. Proliferation of T cells after stimulation with RV, tetanus toxoid,

and influenza antigens. Fresh PBMC from healthy adults were stained with

CFSE and cultured with SEB (1.25 µg/ml, positive control), RV (TLPs, 1 g/ml),

tetanus toxoid (TT, 12 µg/ml), influenza (Vaxigrip, 0.25 µg/ml), medium (RV-

TLPs dialyzing media, negative control for RV), or PBS 1x (negative control for

tetanus toxoid and Vaxigrip) in the presence of anti-CD28 and anti-CD49d

MAbs, and incubated in complete culture medium for 5 days. Cells were stained

with antibodies against CD3, CD4, and CD8: proliferation of CD4 (A) or CD8 (B)

T cells was evaluated by CFSE dilution. Wilcoxon tests were used to evaluate

differences among groups.

Figure 5. PBMC stimulated with RV secrete IFN- , TNF- , GM-CSF,

RANTES, MCP-1, and IL-10, but not IL-4, IL-6, IL-17A, IL-9, or IL-2. Fresh

PBMC from healthy adults were cultured with SEB (1.25 µg/ml, positive control),

RV (TLPs, 1 g/ml), and medium (RV-TLPs dialyzing media, negative control

for RV) for 5 days. Levels of cytokines and chemokines accumulated in culture

supernatants were measured using CBA. Horizontal line and bars represent

median with interquartile range values of 11 independent experiments. The

117

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

dotted lines represent the limit of detection for each analyte. Wilcoxon tests

were used to evaluate differences among groups.

Figure 6. Effect of rIL-2 on the frequencies of RV-CD69+ T cells producing

cytokines. PBMC from healthy adults were cultured for 10 h with RV (TLPs, 1

g/ml) or medium (RV-TLP dialyzing media, negative control for RV) in the

presence of anti-CD28 and anti-CD49d MAbs, and in the absence or presence

of rIL-2 (100 UI/ml); brefeldin A and monensin were added during the last 5 h.

Production of IFN- , TNF- , IL-2, and IL-13 were evaluated in CD4 (A) and CD8

(B) T cells by ICS and flow cytometry. Friedman test (p value at bottom of each

graph), and Wilcoxon test (p on the lines) were used to compare differences

among several or only two antigens or treatments, respectively.

118

SEB

Medium RV

PBS TTFLU

0.001

0.01

0.1

1

10

100

p=0.0005 p=0.001

p=0.0005

% C

D4

cyto

kine+

(IL-2

,IFN

-!,T

NF-"

)

SEB

Medium RV

PBS TTFLU

0.001

0.01

0.1

1

10

100

p=0.001 p=0.002

% C

D8

cyto

kine+

(IL-2

,IFN

-!,T

NF-"

)

A. B.

Figure 1

FigureClick here to download Figure: figures 160414.pdf

119

RV

0

20

40

60

80

100

a,b a a,b,cb,c c a

+++

++-

+-+

-++

+--

-+-

--+

IL-2IFN-!TNF-"

% C

D4

cyto

kine+

TT

0

20

40

60

80

100

b bb

+++

++-

+-+

-++

+--

-+-

--+

IL-2IFN-!TNF-"

% C

D4

cyto

kine+

SEB

0

20

40

60

80

100

IL-2IFN-!TNF-"

+++

++-

+-+

-++

+--

-+-

--+

a a aa

% C

D4

cyto

kine+

FLU

0

20

40

60

80

100

c c c

+++

++-

+-+

-++

+--

-+-

--+

IL-2IFN-!TNF-"

% C

D4

cyto

kine+

A. B.

C. D.

Figure 2

120

RV

0

20

40

60

80

100 a aa c

IL-2IFN-!TNF-"

+++

++-

+-+

-++

+--

-+-

--+

% C

D8

cyto

kine+

SEB

0

20

40

60

80

100

IL-2IFN-!TNF-"

+++

++-

+-+

-++

+--

-+-

--+

a a a

% C

D8

cyto

kine+

FLU

0

20

40

60

80

100 c

IL-2IFN-!TNF-"

+++

++-

+-+

-++

+--

-+-

--+

% C

D8

cyto

kine+

A. B.

C.

Figure 3

121

SEB

Medium RV

PBS TTFLU

0.01

0.1

1

10

100

p=0.002 p=0.001p=0.007

% C

D4

Pro

lifer

atio

n

SEB

Medium RV

PBS TTFLU

0.01

0.1

1

10

100

p=0.001 p=0.002p=0.001

% C

D8

Pro

lifer

atio

n

A. B.

Figure 4

122

IFN-!

SEB

Medium RV

0.1

1

10

100

1000

10000

100000

p=0.0337

GM-CSF

SEB

Medium RV

0.01

0.1

1

10

100

1000

10000

p=0.0093

MCP-1

SEB

Medium RV

1

10

100

1000

10000

100000 p=0.0337

TNF-"

SEB

Medium RV

0.1

1

10

100

1000p=0.0156

RANTES

SEB

Medium RV

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

10000 p=0.0010

IL-10

SEB

Medium RV

0.01

0.1

1

10

100

1000p=0.0078

pg/m

lpg

/ml

pg/m

l

Figure 5

123

0.00

0.05

0.10

0.15

rIL-2 UI/ml 0 0 100 100

Medium RV Medium RV

p=< 0.0001

p=0.03

p=0.03p=0.03

0.00

0.05

0.10

0.15

p=< 0.0001

rIL-2 UI/ml 0 0 100 100

p=0.03

Medium RV Medium RV

p=0.03

0.00

0.15

0.30

0.45

0.60

p=0.0001

rIL-2 UI/ml 0 0 100 100

p=0.03

p=0.03p=0.03

Medium RV Medium RV

0.00

0.15

0.30

0.45

0.60

p=< 0.0001

rIL-2 UI/ml 0 0 100 100

p=0.03

p=0.03p=0.03

Medium RV Medium RV

CD69

+ TN

F-!

+

CD4

RV T

cel

ls (%

) A B

CD69

+ IF

N-"+

CD4

RV T

cel

ls (%

)

CD69

+ TNF

-!+

CD8

RV T

cel

ls (%

) CD

69+ I

FN-"+

CD8

RV T

cel

ls (%

)

Figure 6

124

SUPPLEMENTARY FIGURE LEGENDS

Supplementary figure 1. Frequencies of T cells producing any cytokine (IL-2,

IFN-γ , and TNF-α) in response to RV, tetanus toxoid, or influenza. Fresh

PBMC obtained from children were stimulated and stained as described before for

healthy adults. Frequencies of live CD4 (A) and CD8 (B) T cells producing IL-2, IFN-

γ, and TNF-α were evaluated by ICS and flow cytometry. Wilcoxon tests were used

to evaluate differences among groups.

Supplementary figure 2. Comparison of the patterns of cytokine production

by CD4 T cells of healthy children stimulated with RV, SEB, tetanus toxoid,

and influenza antigens. Boolean analysis of net specific CD4 T cells producing

cytokines (from supplementary figure 1A) was used to determine the relative

frequencies of RV (A), SEB (B), tetanus toxoid (C), and influenza (D) CD4 T cells

that produce IL-2, IFN-γ, and TNF-α individually or in combination. Wilcoxon tests

were used to assess differences between groups. Letters inside graphics represent

significant differences in cytokine production: a (RV vs. SEB), b (RV vs. tetanus

toxoid), and c (RV vs. influenza).

Supplementary figure 3. Proliferation of T cells after stimulation with RV,

tetanus toxoid, and influenza antigens. Fresh PBMC from healthy children were

stimulated and stained as described before for healthy adults. Proliferation of CD4

125

(A) or CD8 (B) T cells was evaluated by CFSE dilution. Wilcoxon tests were used to

evaluate differences among groups.

Supplementary figure 4. Comparison of the pattern of cytokines produced by

T cells of healthy adults stimulated with RV in the presence or absence of rIL-

2. Boolean gating analysis of net CD4 (A) and CD8 (B) T cells producing cytokines,

as described in figure 2, were used to determine the relative frequencies of T cells

that produce IFN-γ, IL-2, IL-13, and TNF-α individually or in combination. Wilcoxon

tests were used to assess differences between groups (*p<0.05). Open and black

squares represent net values for responses to RV and to RV+rIL-2, respectively.

Supplementary Figure 5. Effect of rIL-12 on the frequencies of RV-CD69+ T

cells. PBMC from healthy adults were cultured for 10 h with RV (TLPs, 1 µg/ml) or

medium (RV-TLP dialyzing media, negative control for RV) in the presence of anti-

CD28 and anti-CD49d Mabs, and in the absence or presence of rIL-12 (5 UI/ml);

brefeldin A and monensin were added during the last 5 h. Productions of IFN-γ,

TNF-α, IL-2, and IL-13 were evaluated in CD4 (A) and CD8 (B) T cells by ICS and

flow cytometry. Friedman test (p value at bottom of each graph), and Wilcoxon test

(p on the lines) were used to compare differences among several or only two

antigens or treatments, respectively.

126

Supplementary Figure 6. Effect of DGKα-i on the frequencies of RV-CD69+ T

cells. PBMC from healthy adults were cultured for 10 h with RV (TLPs, 1 µg/ml) or

medium (RV-TLP dialyzing media, negative control for RV) in the presence of anti-

CD28 and anti-CD49d Mabs and in the absence or presence of DGKα-i (25 µΜ);

brefeldin A and monensin were added during the last 5 h. Productions of IFN-γ,

TNF-α, IL-2, and IL-13 were evaluated in CD4 and CD8 T cells by ICS and flow

cytometry. Friedman test (p value at bottom of each graph), and Wilcoxon test (p on

the lines) were used to compare differences among several or only two antigens or

treatments, respectively.

127

SEBMed

iaTLP

sPBS TT

FLU

0.001

0.01

0.1

1

10

100

p=0.0313p=0.0313p=0.0313

% C

D4

cyto

kine

+ (IL

-2,IF

N-!

,TN

F-"

)

SEBMed

iaTLP

sPBS TT

FLU

0.001

0.01

0.1

1

10

100

% C

D8

cyto

kine

+ (IL

-2,IF

N-!

,TN

F-"

)

A. B.

Supplementary figure 1

128

TLPs

0

20

40

60

80

100a,b a c

IL-2IFN-!TNF-"

+++

++-

+-+

-++

+--

-+-

--+

% C

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129

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A. B.Supplementary figure 3

130


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131

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132

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p=0.03

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Medium RV Medium RV

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Medium RV Medium RV

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CD

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)

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B


133

Figura adicional del artículo 2

Figura adicional 14. Comparación de los patrones de producción de citocinas por células CD8 de niños sanos luego del estímulo con los antígenos de rotavirus, toxoide tetánico e influenza. Análisis “booleanos” de los porcentajes netos de las células CD8 se usaron para determinar las frecuencias relativas de las células CD8 monofuncionales o multifuncionales productoras de IL-2, IFN-γ y/o TNF-α. Letras en la gráfica representan diferencias significativas, a (rotavirus vs SEB), b (rotavirus vs toxoide tetánico) y c (rotavirus vs influenza).

134

Discusión General

Las gastroenteritis virales agudas son las enfermedades más comunes en niños alrededor del mundo y se considera que en países con condiciones socioeconómicas precarias las gastroenteritis agudas son el mayor causante de muertes en la población infantil 66. El rotavirus se constituye como el agente viral más importante relacionado con la gastroenteritis severa en niños menores de 5 años 4. Las infecciones por rotavirus ocurren en todos los países del mundo, incluyendo países industrializados como países con bajos ingresos per cápita, por lo tanto, no es fácil asociar las condiciones higiénicas con la presencia de las infecciones por rotavirus. Sin embargo, los estudios de vigilancia han mostrado que los niños de los países con menores recursos económicos se infectan más temprano que los niños de países con los mejores índices económicos. Además, se ha observado que la mortalidad también es más alta, debido principalmente al acceso precario a los servicios de salud 66, consecuentemente, el desarrollo de vacunas efectivas se constituye en una estrategia para disminuir la mortalidad ocasionada por la infección de este virus. En el año de 1998 la vacuna Rotashield® fue aprobada por el CDC como parte de los programas de vacunación de la población infantil para uso en los Estados Unidos 207. Más de 600.000 niños recibieron la vacuna en los primeros meses de uso, pero, un evento adverso relacionado con el uso del biológico hizo que la vacuna fuera retirada del mercado precipitadamente 208. Desde el 2006 se han licenciado dos vacunas nuevas (Rotarix® y RotaTeq®) que han sido incluidas en los programas de inmunización de varios países 209. En países con altos y medios ingresos per cápita, las vacunas han funcionado satisfactoriamente, las hospitalizaciones debidas a infecciones por rotavirus han disminuido entre un 49% a un 89% 63. A pesar de el éxito obtenido, existen diferencias marcadas entre los resultados obtenidos en los países con mejores ingresos comparados con los países de menores ingresos. En países menos favorecidos, donde la tasa mortalidad por las infecciones de rotavirus es alta, las vacunas han mostrado una eficacia entre el 39% al 49%, mientras que en países con ingresos medios la protección se ubica entre el 72% y el 83%, y en países de alto ingreso económico la protección supera el 90% 12, 16. No se conoce con certeza cual es la causa de este comportamiento de las vacunas en estas regiones geográficas, pero se ha propuesto que los altos títulos de anticuerpos maternos, la interferencia con otras vacunas como la de la polio, deficiencias nutricionales, infecciones por otros patógenos como otros virus, bacterias o helmintos e incluso diferencias en la alimentación pueden estar relacionadas con la baja eficiencia de las vacunas 210. De forma similar a lo que ocurre con la vacuna de polio 211, 212, las vacunas de rotavirus son menos eficientes en los lugares donde más se necesitan, además, Rotarix® y RotaTeq® son vacunas compuestas por virus vivos atenuados tal como Rotashield®, y a pesar de

135

que los aumentos en los casos de intususcepción por el uso de las vacunas Rotarix® y RotaTeq® han sido considerados menos relevantes que sus beneficios existe el riesgo latente de que se produzcan efectos colaterales indeseados, por lo tanto, es necesario implementar el uso de otras estrategias diferentes a los virus vivos atenuados para desarrollar la nueva generación de vacunas contra rotavirus. No obstante, la implementación de estrategias diferentes a las vacunas vivas atenuadas implica tener un amplio conocimiento de la patogénesis y la respuesta inmunológica frente al virus. Los resultados obtenidos en este trabajo contribuyen al conocimiento de la respuesta de las células T contra rotavirus en cuatro diferentes aspectos: 1. Se describieron tres posibles péptidos de rotavirus asociados a la presentación por moléculas de clase II DRβ1*0101 y que son derivados de dos proteínas estructurales (VP3 y VP6) y una no estructural (NSP2) (Primer artículo). 2. Usando la técnica de tetrámeros de clase II cargados con el péptido derivado de la proteína VP6 se determinó que las células de memoria específicas de rotavirus presentan los marcadores de migración intestinal α4β7 y CCR9 (Primer artículo). 3. Al comparar las células específicas de rotavirus entre niños vacunados y niños que recibieron placebo se observó que la vacunación genera células de memoria específicas de rotavirus con patrones de migración intestinal (Primer artículo). 4. Se determinó que las células T circulantes específicas de rotavirus en adultos y en niños sanos son monofuncionales, que están enriquecidas en células monoproductoras de IFN-γ, de baja capacidad proliferativa, que estarían relacionadas con células efectoras terminales, lo que podría explicar por qué la respuesta inmune contra rotavirus es parcialmente protectora (Segundo artículo). En las siguientes páginas se discutirán estas conclusiones y se determinará un punto de inicio para continuar con futuras investigaciones. Definir los péptidos inmunogénicos de un patógeno no es una tarea fácil, actualmente existen dos aproximaciones que se usan comúnmente con este fin 213. La primera es el uso de péptidos sintéticos de 11 a 15 aminoácidos sobrelapados, generalmente en 10-11 aminoácidos, que cubren toda la secuencia de aminoácidos de una proteína en particular. Esta metodología resulta ser muy complicada y costosa, además, se requiere de una fuente de células bastante amplia para probar los múltiples péptidos. Por otro lado, se están utilizando métodos bioinformáticos que buscan hacer una predicción de la secuencia de los péptidos que tienen más probabilidad de ser presentados en el contexto de un MHC definido. Hasta hace algunos años las bases de datos y el software para la predicción de los péptidos presentados por el MHC I era bastante acertada, pero no lo era para los péptidos de MHC II. En este estudio se utilizó un algoritmo nuevo, creado en la Universidad de Massachusetts 203, 214, que combina dos algoritmos previos, P9 y SYFPEITHI. P9 evalúa la capacidad del péptido de unirse a una molécula de clase II específica, mientras que SYFPEITHI tiene en cuenta el procesamiento endógeno y presentación natural del mismo 203.

136

Usando el algoritmo desarrollado en la Universidad de Massachusetts se lograron identificar 39 probables epítopes de clase II restringidos al alelo DRβ1*0101 distribuidos en todas la proteínas del virus. Luego de los ensayos funcionales realizados con CMSP de adultos voluntarios sanos DRβ1*0101, se identificaron tres de los péptidos probables previamente seleccionados por el algoritmo. El péptido VP6-7 (DTIRLLFQLMRPPNMTPAVNA) derivado de la proteína mayoritaria VP6 fue reconocido por los 8 voluntarios, mientras que los péptidos NSP2-3 (SGNVIDFNLLDQRIIWQNWYA) y VP3-4 (YNALIYYRYNYAFDLKRWIYL) derivados de las proteínas estructural VP3 y no estructural NSP2, respectivamente, sólo fueron reconocidos por 4 voluntarios. Adicionalmente, se evidenció, en ensayos de unión in vitro, que los tres péptidos son reconocidos por las moléculas DR1, pero no las DR4. Finalmente, líneas generadas con los tres péptidos mostraron que la presentación de éstos está restringida a las moléculas DR y no se observa presentación por otros componentes clásicos de las moléculas de clase II, como DQ. A pesar de que previamente ya se había descrito un péptido de clase II (HLA-DR4) en humanos 144, este estudio es el primero en el que se describe un epítope de rotavirus identificado mediante el uso de tetrámeros de clase II en CMSP frescas, sin necesidad de hacer expansión de las células específicas del mismo. Además, la secuencia del péptido VP6-7 coincide con una secuencia de un péptido reconocido en ratón 24 y parcialmente con otro péptido descrito en el modelo de mono Rhesus 26. Los resultados indican que está región de la proteína VP6 tiene secuencias particulares que son reconocidas por las células CD4, no sólo en humanos si no también en otros modelos. Para entender este fenómeno hay que tener en cuenta las características de la proteína VP6: como primera medida, debido a que su masa molecular es de 45kD y en cada virión se encuentran 780 copias, VP6 se constituye como la proteína mayoritaria de rotavirus 215, adicionalmente, es una proteína muy conservada entre los diferentes aislamientos del grupo A de rotavirus, independientemente del tipo de hospedero del cual se deriva 216. Otras propiedades de la proteína VP6 son: 1. es la proteína que genera mayor porcentaje de anticuerpos luego de una infección por rotavirus 217 y 2. hace parte del complejo de replicación del virus a nivel citoplasmático 53, convirtiendo a VP6 en una proteína importante para la respuesta inmune contra rotavirus. Las células T CD4 reconocen los antígenos en el contexto de las moléculas del CMH de clase II, por lo tanto los péptidos presentados por está vía son el resultado del procesamiento de proteínas obtenidas por la vía endocítica. Sin embargo en el caso de las infecciones virales, muchas de las proteínas producidas al interior de las células infectadas son liberadas al medio extracelular, especialmente en virus con capacidad citolítica como rotavirus, de tal forma que estas proteínas extracelulares ingresan a las células presentadoras por endocitosis y se comportan como antígenos exógenos. Teniendo en cuenta que VP6 es la proteína mayoritaria de rotavirus y que se produce en altas cantidades, es posible que VP6 entre como un antígeno exógeno

137

a las células presentadoras y que terminen generándose péptidos con secuencias muy similares después del procesamiento debido a la escasa variabilidad de la proteína. El diseño inicial pretendía identificar por métodos bioinformáticos los posibles péptidos que podían ser presentados por las moléculas DRβ1*0101, y se esperaba que también fueran reconocidas por otros alelos del supertipo “main DR” de acuerdo con la clasificación publicada en el 2011 218. Por está razón, en los ensayos con los grupos de péptidos se incluyeron voluntarios adultos sanos que expresaban otras moléculas de DR diferentes a DRβ1*0101. No obstante, sólo se observaron respuestas positivas en pacientes que expresaban el alelo DRβ1*0101, limitando la población de estudio. Con los ensayos de unión se comprobó que efectivamente los péptidos probables sólo eran reconocidos por la moléculas DR1 y no por las DR4. La limitación que se presentó fue importante porque la población colombiana es mayoritariamente DR4 y DR7, mientras que la prevalencia de DR1 es menor del 7% 219. A pesar de esto, los resultados del estudio revelan que el uso de las herramientas informáticas es adecuado, además, facilita y disminuye los costos de los análisis para la identificación de los péptidos específicos de un patógeno en particular. Como parte de la continuación de este trabajo proponemos que el estudio de los péptidos con esta herramienta bioinformática se amplíe a otras moléculas del MHC de clase II que sean propias de la población colombiana, como las moléculas DR4 y DR7, de esa manera se pueden identificar otros posibles epítopes de rotavirus asociados a otras moléculas del MHC II y también será posible tener una población con un mayor número de voluntarios. Los tetrámeros de clase II han evolucionado para convertirse en una importante herramienta para la caracterización y fenotipificación de las células CD4 30. Las metodologías actuales han permitido identificar las escasas células específicas de un antígeno dentro de una población numerosa de células T sin necesidad de expandir la población previamente, por el contrario, técnicas de enriquecimiento usando perlas magnéticas o tinción directa de células ex vivo son usadas para la identificación de eventos muy escasos 182, 184. Para el desarrollo de este trabajo se usaron cinco tetrámeros formados con moléculas solubles del HLA DR1 cargados con los 3 péptidos de rotavirus identificados previamente (NSP2-3, VP3-4 y VP6-7), otro con el péptido de influenza HA306-318 (PKYVKQNTLKLAT) y otro con el péptido del receptor de transferrina (TRF) (RVEYHFSPYVSRKESP) usado como control negativo. CMSP fueron extraídas de voluntarios adultos sanos que expresaban el HLA DRβ1*0101 y se tiñeron directamente con los tetrámeros sin hacer ningún tipo de expansión. Solamente se usó el Dasatinib® para mejorar la sensibilidad de la tinción. El pre-tratamiento de las CMSP con este inhibidor de protein-kinasas mejora la tinción del tetrámero en las células T CD4 y CD8 específicas de un determinado antígeno, impidiendo que el TCR de las células se

138

internalice y además disminuyendo la mortalidad de las células T 220. Adicionalmente a la marcación con los tetrámeros, las CMSP de los voluntarios fueron teñidas simultáneamente con los marcadores de diferenciación CD62L y CD45RA más los marcadores de migración Intestinal α4β7 y CCR9. Los resultados obtenidos luego de la tinción ex vivo, mostraron que las células antígeno-experimentadas CD4 específicas del péptido VP6-7 de rotavirus presentaban preferencialmente los marcadores de migración intestinal α4β7 y CCR9, mientras que las células antígeno-experimentadas de influenza no expresaban estos marcadores. Los resultados obtenidos corroboran hallazgos previos que mostraban que las células específicas de rotavirus expresaban el marcador de migración intestinal α4β7 38, 39. Adicionalmente, estos resultados también muestran que las células antígeno-experimentadas T CD4 específicas de rotavirus migran hacia el intestino delgado debida a la co-expresión de los marcadores α4β7 y CCR9. Al comparar las coloraciones hechas en CMSP de cuatro voluntarios adultos sanos con los otros dos tetrámeros de rotavirus (NSP2-3 y VP3-4) con el tetrámero de influenza, se observó que las células antígeno experimentadas específicas del péptido NSP2-3 presentan patrones de migración similares a los observados en la coloración con el tetrámero de VP6-7, mientras que las células antígeno experimentadas específicas del péptido VP3-4 son más parecidas a las células específicas del péptido de influenza, sugiriendo que estas células no presentan patrones de migración intestinal. Recientemente, usando tetrámeros de clase I restringidos a la molécula HLA A*0201 se identificaron seis péptidos específicos de rotavirus, dentro de los cuales se determinó que las células CD8 específicas de los péptidos derivados de la proteína VP3 presentaban patrones de diferenciación y migración distintos a los observados para las células CD8 específicas de los otros péptidos 146. Las células específicas de la proteína VP3 exhibían un estadio de diferenciación mayor que el de las células específicas del resto de las proteínas (TCM) y además expresaban en bajas o nulas proporciones la molécula de migración intestinal β7, lo que sugiere que estas células no presentan un patrón de migración clásico de células intestinales, a pesar de que las CD8 células específicas de la proteína VP3 se encontraban en abundancia en el epitelio intestinal 146. Este estudio ayuda a entender los hallazgos del presente trabajo, además permiten sugerir que la migración intestinal también es dependiente del tipo de antígeno que se esté presentando a las células T. Los hallazgos realizados en el modelo murino muestran que para que las células B se desplacen hacia el intestino y puedan mediar su actividad antiviral es necesaria la expresión del marcador de migración α4β7 221 222, de igual forma sucede para las células CD4 223. En contraste, a pesar de que la estimulación por vía oral induce la expresión de este marcador en las células CD8 y que facilita la migración hacia

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el tejido intestinal, la expresión de éste no es esencial en la actividad antiviral o la migración de estas células 224. Aplicando la misma estrategia usada para la tinción de CMSP frescas de los voluntarios adultos sanos, CMSP congeladas de 3 niños vacunados y 3 que recibieron placebo fueron teñidas con el tetrámero de VP6-7. Todos los niños expresaban el alelo del HLA II DRβ1*0101. Debido a que las células habían permanecido congeladas por un periodo de tiempo prolongado, la combinación de los marcadores de diferenciación usados para la tinción en adultos (CD62L y CD45RA) se cambió a CCR7 y CD45RA. La expresión del marcador de migración CD62L (L-selectina) disminuye de forma significativa durante el proceso de congelación y descongelación de las células 225, 226, mientras que la expresión de CCR7 no se ve afectada por los protocolos de criopreservación. Adicionalmente, la cantidad de células obtenidas a partir de las muestras congeladas de los niños fue mucho menor que el número de células obtenidas a partir de las muestras de los voluntarios adultos sanos, por lo tanto, las pruebas estadísticas usadas no mostraron diferencias significativas. A pesar de esto, la distribución de los pocos eventos que logramos identificar en los niños vacunados vs los niños que recibieron placebo muestran una marcada diferencia fenotípica. El fenotipo de memoria de las células T se adquiere fundamentalmente por la exposición a un antígeno en particular, sin embargo, en un estudio en el que se evalúan las células CD4 mediante el uso de tetrámeros de clase II DR4, se detectaron células de memoria específicas de varios virus en pacientes adultos, sin que estos hubieran estado previamente en contacto con los virus 227. Estos hallazgos pueden deberse al fenómeno de reactividad cruzada de las células T CD4, principalmente debido a la flexibilidad de los sitios de unión del TCR con el MHC, lo que le permite a una células reconocer diferentes moléculas de HLA 227. Los autores también evaluaron muestras de cordón umbilical para determinar si esos fenotipos de memoria estaban presentes al momento del nacimiento. Usando los tetrámeros DR4 cargados con los péptidos de VIH, los autores lograron determinar que en las dos muestras de cordón se observaban células específicas del antígeno, pero, contrariamente, cuando evaluaron el fenotipo de esas células se evidenció que la gran mayoría eran células vírgenes. Así, los autores concluyeron que los neonatos poseen un repertorio de células que puede reconocer los antígenos propios y no propios, pero que los fenotipos de memoria de las células CD4 se va adquiriendo a medida que los niños van creciendo y van reconociendo diferentes antígenos 227. Los resultados observados en los niños vacunados y los que recibieron placebo en el presente trabajo muestran que los tetrámeros reconocen células CD4 específicas del péptido VP6-7 en ambos grupos de niños, sin embargo, el porcentaje de células vírgenes en los niños que recibieron placebo es mucho mayor (92%, 94% y 92%) en comparación con los niños vacunados que ya tuvieron un encuentro con el antígeno a través de la vacunación (56%, 28% y 60%, respectivamente). Estos resultados soportan los hallazgos realizados por

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Davis y publicados recientemente 227. Además, estos resultados pueden ayudar a explicar por qué los niños son más susceptibles a sufrir enfermedades infecciosas y, en el caso de rotavirus, ayudaría a explicar por qué en la primoinfección la sintomatología es más severa. Teniendo en cuenta los resultados, proponemos que una vez se identifiquen mas epítopes de rotavirus en diferentes moléculas de clase II, formar tetrámeros con esos nuevos epítopes y hacer un seguimiento de niños antes de la vacunación y después de la vacunación, con el ánimo de evaluar la progresión de las células específicas de los péptidos de rotavirus de células vírgenes hacia células de memoria con patrones de migración intestinal. El modelo de diferenciación de las células CD4 TH1 propone que las células CD4 que producen IL-2 o TNF-α, que producen una combinación de estas dos citocinas (IL-2/TNF-α) y las triple productoras de IL-2, TNF-α e IFN-γ, y que además tienen una alta capacidad de proliferación son células que corresponden a la población de células T de memoria central (TCM). Por otro lado, las células doble productoras de IL-2/IFN-γ o TNF-α/IFN-γ, que tiene capacidad de proliferación menor que la de las células TCM, corresponden a las células T de memoria efectora TEM. Por último, las células monoproductoras de IFN-γ con baja capacidad de proliferación se relacionan con las células T efectoras terminales TTE 42, 48. Respecto a las células T CD8 se asume que las células triple productoras de IL-2, TNF-α e IFN-γ están relacionadas con las células TCM, mientras que las que han perdido la capacidad de producir IL-2 corresponden a la población de células TEM y las monoproductoras de IFN-γ pertenecen a las células TTE

42, 48. En modelos de infecciones de Leishmania major 228, SIDA 229, hepatitis C 230, dengue 231, y M. Tuberculosis 232, la presencia de células multifuncionales CD4 y CD8 está relacionada con protección. Para evaluar la respuesta contra rotavirus de voluntarios adultos sanos y de niños sanos, y además compararla con la respuesta frente a otros antígenos de origen diferente (toxoide tetánico e influenza), CMSP de los voluntarios fueron estimuladas con SEB (control positivo) y con los antígenos de rotavirus, toxoide tetánico e influenza. Se analizó la producción de citocinas y la proliferación de las células frente a los diferentes estímulos. Los resultados mostraron que las células CD4 estimuladas con el antígeno de rotavirus presentaron menores frecuencias de células productoras de citocinas al compararlas con las estimuladas con toxoide tetánico e influenza. En contraste, en las células CD8 estimuladas con rotavirus mostraron frecuencias de células productoras de citocinas similares a las frecuencias observadas después de la estimulación con el antígeno de influenza. Por otra parte, se constató que las células CD4 estimuladas con rotavirus estaban enriquecidas en células monofuncionales productoras de IFN-γ o TNF-α de baja proliferación, que se pueden relacionar con células TTE, mientras que las células estimuladas con los otros dos antígenos estaban enriquecidas en células multifuncionales con mejor respuesta proliferativa que corresponden a células TCM.

141

Los resultados observados sugieren que las respuesta ineficiente frente a rotavirus puede estar relacionada con el hecho de que las células específicas de rotavirus tengan un fenotipo de células TTE, las cuales producen cantidades menores de citocinas como el IFN-γ, no se expanden de forma eficiente y mueren más rápidamente que las células TCM o TEM. Debido a la falta de mayor número de canales en el citómetro no se logró hacer una análisis simultáneo de la producción de citocinas con los marcadores de diferenciación celular, así, solamente podemos sugerir que las células estimuladas con el antígeno de rotavirus pueden estar relacionadas con las TTE, mientras que las de los otros dos antígenos pertenecen a células TCM. Debido a este inconveniente, planteamos la posibilidad de evaluar nuevamente las células específicas de rotavirus en CMSP de voluntarios adultos sanos, niños sanos, niños vacunados y niños con infección natural, haciendo una coloración conjunta entre la producción de citocinas y los marcadores de diferenciación celular al mismo tiempo, disponiendo de un citómetro que nos permita evaluar una mayor cantidad de canales. Adicionalmente a los experimentos mostrados en los artículos referenciados en este trabajo de tesis, también se realizaron otros tipos de análisis, relacionados con la detección de células reguladoras específicas de rotavirus usando la coloración con los tetrámeros y con la detección de células específicas de rotavirus en tejido intestinal humano. Se ha propuesto que las bajas frecuencias de las células específicas de rotavirus circulantes tanto en adultos como en niños se pueden deber a la inducción de células reguladoras durante la infección por rotavirus. En el modelo murino se ha observado que estás células son capaces de inhibir la actividad de las células T efectoras específicas de rotavirus 204. Además, también se ha observado un incremento en la producción de IFN-γ en CMSP cuando son retiradas las células con fenotipo regulador CD4+CD25+, o cuando es inhibida la actividad reguladora del TGF-β usando su inhibidor natural LAP o a través de la supresión de la respuesta intracelular usando la molécula ALK-5 40. Para determinar si las células T reguladoras específicas de rotavirus estaban presentes en la circulación, CMSP fueron teñidas con los tetrámeros específicos de rotavirus previamente usados (NSP2-3, VP3-4 y VP6-7) y la tinción se complemento usando los marcadores CD3, CD4, CD25, CD127 y FoxP3. Seis voluntarios adultos sanos que expresaban el alelo del MHC II DRβ1*0101 fueron evaluados con la coloración descrita anteriormente. El fenotipo de las células T reguladoras es CD4+CD25HighCD127-FoxP3+. Los resultados de la coloración de tetrámeros combinada con los perfiles de regulación en células específicas de rotavirus circulantes no mostraron la presencia de las células reguladoras, por lo

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tanto, no se logró hacer una conclusión acerca del papel que ejercen las células reguladoras CD4+CD25HighCD127-FoxP3+ en la infección por rotavirus. Las gráficas adicionales 5 a 9 muestran la coloración con los diferentes tetrámeros del voluntario adulto sano HA-41, mientras que la tabla adicional 1 contiene el resumen de los resultados obtenidos en los seis pacientes evaluados. El rotavirus se replica principalmente en las células intestinales y la respuesta contra este patógeno se debe concentrar en este sitio anatómico. Previos estudios han mostrado que las células T circulantes específicas de rotavirus expresan el marcador de migración intestinal α4β7 38, 149, lo que permite suponer que las bajas frecuencias de células productoras de citocinas en sangre periférica se deben a que la mayoría de las células específicas de rotavirus se concentran en el compartimiento intestinal. Para poder determinar la presencia y la función de las células específicas de rotavirus en el intestino, se tomaron muestras de tejido intestinal de siete pacientes con cáncer de colon sometidos una colectomía y de un paciente obeso sometido a cirugía bariátrica electiva. Las CMIH fueron individualizadas luego de un protocolo enzimático para degradar completamente la muestra de tejido intestinal, posteriormente, las células fueron separadas mediante gradientes de percoll y finalmente, se realizaron los protocolos de estimulación con los antígenos de rotavirus (péptidos y virus completo), SEB como control positivo y en el caso del paciente con cirugía bariátrica las células también se estimularon con los antígenos de toxoide tetánico e influenza. Adicionalmente, con las CMIH derivadas del paciente sometido a cirugía bariátrica se realizó la tinción con los tetrámeros de rotavirus (NSP2-3, VP3-4 y VP6-7), influenza y TRF. Los resultados obtenidos con los pacientes con cáncer mostraron que en las células CD4 intestinales solamente se observa respuesta positiva al estímulo con SEB, representada en la producción de IL-2 y/o IFN-γ. De forma contraria, los estímulos con el virus RRV o los grupos de péptidos de rotavirus en los pacientes no mostraron diferencias cuando se compararon con los controles negativos respectivos (Mock y DMSO). De otro lado, las células CD8 también respondieron al estimulo de SEB produciendo IL-2 y/o IFN-γ, sin embargo, se observó que las CMIH obtenidas a partir del paciente Int013 produjeron IL-2 en respuesta al estímulo con RRV. Además, también se observó producción de IL-2 en respuesta al estímulo con el grupo 2 de péptidos en la muestra obtenida a partir del paciente Int009. Finalmente, también se observó respuesta de producción de IL-2 e IFN-γ, en las CMIH del paciente Int011 como respuesta al estimulo con el virus RRV. Para el caso de la muestra obtenida a partir del paciente sometido a cirugía bariátrica también se observó producción de IFN-γ y TNF-α por parte de las células CD4 como respuesta al estímulo de SEB, pero no se observó producción de las citocinas frente al estímulo con el resto de los antígenos (rotavirus completo (TLPs), toxoide tetánico, influenza (Vaxigrip®) y los péptidos de rotavirus (NSP2-3, VP3-4 y VP6-7)). Para el caso de las células CD8 se observó respuesta frente al

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estímulo de SEB produciendo TNF-α únicamente y también se observó respuesta de TNF-α al estimulo con los péptidos de rotavirus en los tres casos. A pesar de que en la mayoría de los casos se observaba una frecuencia de producción de citocinas más alta que la observada en CMSP, los valores del ruido de fondo no permitieron establecer si esa respuesta era real o no, especialmente para las células CD4 en todos los casos. CMIH derivadas del voluntario Bar10 sometido a una cirugía bariátrica electiva fueron teñidos con los tetrámeros de rotavirus (NSP2-3, VP3-4 y VP6-7), influenza y TRF. Aunque se observó que las células tetrámero positivas estaban presentes en todos los casos y que las células antígeno-experimentadas presentaban marcadores de migración intestinal, nuevamente el ruido de fondo hizo que los resultados perdieran valor y no se logró hacer ninguna conclusión acerca de las células específicas de rotavirus en el compartimiento intestinal. Los principales inconvenientes encontrados en el estudio de las CMIH fueron, en primer lugar, la deficiencia en la separación de las células mononucleares de las células epiteliales, a pesar de los tratamientos con DTT (Ditiotreitol) y la separación con los gradientes de percoll, las células se veían muy contaminadas con células epiteliales. Además, creemos que el protocolo de digestión es muy prolongado (cerca de 10h) lo que puede afectar las células de la lamina propia. También observamos que la mortalidad de las células era muy alta en comparación con los resultados observados en CMSP. La mortalidad en las CMIH vario entre 25% a 60% mientras que en las CMSP no superaba el 10%. Para poder continuar con los ensayos con células intestinales humanas obtenidas a partir de los pacientes sometidos a cirugía bariátrica proponemos establecer una protocolo de enriquecimiento negativo usando perlas magnéticas y de esta forma lograr aislar y enriquecer las poblaciones específicas de rotavirus para identificarlas con el uso de la coloración de tetrámeros. En conclusión, el rotavirus ingresa al organismo por vía gastrointestinal, luego de activarse por el ácido estomacal infecta los enterocitos maduros de las crestas de las vellosidades intestinales. Además del efecto citolítico de la infección por rotavirus, el aumento en la concentración de Ca2+ al interior de las células infectadas desestabiliza las uniones intercelulares afectando la integridad de la mucosa intestinal, hecho que podría explicar la detección del virus en el compartimiento sistémico, fenómeno observado en ratones y en niños 13, 14, 37. Debido a que la infección por rotavirus es citolítica las partículas virales que son liberadas luego de la lisis celular son captadas por las células dendríticas tanto mielodes como plasmocitoides. Los resultados de ensayos In Vitro han mostrado que el virus es capaz de infectar todos los tipos de células de las CMSP, especialmente las células dendríticas plasmocitoides (CDp) y mieloides (CDm) 233, adicionalmente en humanos se ha observado que las células CDp juegan un papel

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importante en la estimulación de las células T de memoria específicas de rotavirus y son las principales productoras de IFN-α 233; incluso los resultados mostraron que la disminución de la producción de IFN-α de las CDp afecta la producción de IFN-γ por parte de las células T específicas de rotavirus. De otro lado las CDp en ratones son importantes para la estimulación de las células B 234. Por el contrario los hallazgos realizados en las CDm han mostrado que a pesar de que el RV no es un buen antígeno que estimule la maduración de las CD, si inducen (especialmente las CDm inmaduras) a las células T vírgenes a adquirir un perfil de secreción de citocinas tipo Th1, especialmente las CDm inmaduras 47. Los resultados del presente trabajo sugieren que las células T CD4 circulantes específicas de rotavirus identificadas con tetrámeros expresan los marcadores migración intestinal α4β7 y CCR9, aún más, este fenotipo se observó en muestras de CMSP obtenidas de niños vacunados, mientras que en niños que recibieron placebo no se detectaron. Sin embargo, los estudios también mostraron que las células T CD4 circulantes estimuladas con rotavirus son monofuncionales y solamente producen IFN-γ. La protección incompleta que sucede después de una infección por rotavirus se puede explicar por la baja funcionalidad de las células T específicas del virus, que brindan una menor coestimulación a las células T CD8 y a las células B en comparación con las células triple y doble positivas 235. Debido al carácter agudo de la infección por rotavirus el sistema inmune requiere de exposiciones repetidas al virus para incrementar la inmunidad y la protección contra el virus 42.

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Perspectivas 1. Expandir la identificación de péptidos específicos de rotavirus a otros HLA de

clase II diferentes al DRB1*0101 y que sean comunes en Colombia, como el DR4 y DR7.

2. Hacer el seguimiento de niños antes de la vacunación y después de la vacunación para observar el incremento de los porcentajes de las células T CD4 antígeno experimentadas específicas de rotavirus.

3. Evaluar la posibilidad de usar la marcación con tetrámeros específicos de rotavirus como un posible correlato de protección.

4. Mejorar la purificación de las células mononucleares intestinales con el ánimo de hacer ensayos de estimulación, proliferación y marcación con tetrámeros, disminuyendo el ruido de fondo a su mínima expresión.

5. Implementar una coloración combinada para determinar los perfiles de diferenciación de los LT posterior a la estimulación para poder correlacionar directamente las células secretoras de citocinas con el estadio de diferenciación.

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Anexos 1. Protocolo de coloración para la identificación de perfiles de regulación más tetrámeros de rotavirus, influenza y TRF en CMSP de adultos voluntarios sanos. Preparación de los tetrámeros (TRF, influenza, rotavirus (NSP2-3, VP3-4, VP6-7). Para formar los tetrámeros, las moléculas DR1 cargadas con los diferentes péptidos de TRF, influenza y rotavirus se llevaron a una concentración de 1µg en 44µl de PBS1x estéril. Posteriormente se adicionaron 0,25µg la SAV diluidos en 6µL de PBS 1x estéril, todo a 4°C. Los tetrámeros se incubaron por 30min a a 4°C, y posteriormente fueron usados para marcar las CMSP obtenidas de los voluntarios adultos sanos. Coloración de regulación en CMSP. Se extrajeron muestras de sangre de seis voluntarios adultos sanos anticoaguladas con Heparina, suficientes para obtener cerca de 20 millones de células de cada voluntario (20ml de sangre aproximadamente). Posteriormente las CMSP fueron separadas por el método de Ficoll, lavadas y resuspendidas en PBS 1x estéril. Las células fueron resuspendidas a una concentración de 3 a 5 millones de células en 50µl de PBS1x estéril precalentado a 37°C en tubos de poliestireno de 5ml. Posteriormente se adicionaron 50µl de una solución de Dasatinib® 50ng/ml precalentados, y se incubo está solución por 30min en baños de maría a 37°C. Luego de la incubación se adicionaron 20µl de SHAB, y los 50µl de las soluciones de los tetrámeros previamente formados. Las CMSP se incubaron por 2h a TA en oscuridad para la marcación de las células tetrámero positivas. Una vez termino la incubación con los tetrámeros, las células se marcaron con el reactivo de viabilidad AQUA por 10min a TA en oscuridad, seguido de la adición del coctel de anticuerpos CD3 pacific blue (BD), CD4 PerCpCy5.5 (BD), CD25 PE (BD), CD127 FITC (eBioscience), CD25 PeCy7 (BD), CD19 V500 (BD) y CD14 V500 (BD), que se incubaron a TA en oscuridad por 20min. Después del paso anterior, se hicieron 2 lavados con PBS 1x y se realizo el proceso de permeabilización usando el kit de fijación/permeabilización de eBioscience de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. (Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent). Luego de 30min de incubación a 4°C, las CMSP se lavaron con PBS-BSA-Azida dos veces y se adicionó el anticuerpo contra el factor de transcripción nuclear FoxP3 APC (eBioscience). Las células se incubaron por 20min a TA en oscuridad y finalmente se lavaron 2 veces con PBS-BSA-Azida, se resupendieron y se analizaron en un citometro Aria IIr.

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2. Extracción de células Mononucleares Intestinales Humanas (CMIH) a partir de muestras de intestino delgado.

Lavado del tejido intestinal. Muestras de tejido intestinal de siete pacientes con cáncer y uno con cirugía bariátrica electiva fueron obtenidas en sala de cirugía y transportadas al laboratorio en un frasco de vidrio estéril en solución salina estéril. Posteriormente el tejido se lavo con una solución de PBS estéril+ ABs (penicilina, estreptomicina y anfotericina) + EDTA 1mM frio (5 veces) en un tubo de 50ml al menos 5 veces. Luego, se colocaba el tejido (Anillo de mas de 2cm) en una caja de petri estéril y se realizaba un corte longitudinal, dejando la zona epitelial del tejido hacia el lado de arriba. La zona epitelial se lavaba con PBS estéril +AB + EDTA frio para limpiar el moco y otros detritos nuevamente en un tubo nuevo de 50ml (5 veces). De forma seguida, el tejido se tranfería a otra caja de petri estéril y con el bisturí se retiraba la capa mucosa de la submucosa. Finalmente, la capa mucosa se tranfería a un tubo de 50ml y se lavaba con 12-15ml una solución de solución salina de Hanks estéril (HBSS)+ ditiotreitol (DTT)+ Antibióticos. Las células se incubaron por 15 minutos agitando suavemente. La muestra era filtrada en un colador metálico para recuperar finalmente el tejido mucoso. Este procedimiento se repitió hasta que la solución salía traslucida. Digestión enzimática. La mucosa lavada previamente se colocaba en una caja de petri con 5ml de RPMI frio y era cortarla en pedazos de 1cm aproximadamente, para facilitar la digestión. Luego, las piezas se transferían a un tubo de 50ml con 12-15ml de la solución de digestión (RPMI+10mM HEPES+2 mM l-glutamina+10% de SFB + colagenasa 3,2mg-ml+DNAsa 0,2ug-ml) y se e incubaba por 30 minutos a 37 grados C en baño maría , en constante agitación. La reacción enzimática se detenía adicionando 10-15 ml de medio de cultivo frío (RPMI+10% de SFB). Posteriormente, la muestra se centrifugaba a baja velocidad (200g x 10 minutos) para desplazar el tejido y recuperar el sobrenadante. El sobrenadante se recogía filtrando la preparación usando un colador metálico estéril y el resto del tejido era transferido a un tubo de 50ml nuevamente. Al tejido recuperado se le adicionaban entre10-15 ml de solución de digestión y se incubaba nuevamente. Los sobrenadantes recogidos se mantuvieron a 4°C y finalmente se mezclaban luego de varios ciclos de digestión. Las células recuperadas se lavaban con medio de cultivo frio y se resuspendían en 50ml de medio fresco. Enriquecimiento de las células recuperadas. la fracción celular recuperada se filtraba usando un cell strainer de 100uM. Posteriormente, la fracción se lavaba con 50 ml de medio de cultivo y se volvía a filtrar por un cell strainer de 50uM. Luego de la filtración, el pellet se resuspendía en 18ml de un gradiente de Percoll 20% (Percoll+RPMI) a temperatura ambiente. Seguidamente, se adicionaba a un tubo de 50ml los gradientes de Percoll de 40% y 80%, junto con la fracción de 20% que contenía las células de la muestra. Esta preparación se centrifugaba a 500g x 30 minutos a TA. Finalmente, se Recuperaba la fracción celular entre los gradientes

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de 40% y 80% en un tubo nuevo, se lavaba en RPMI fresco a TA y se evaluaba el número y la viabilidad de las células haciendo una tinción con azul de tripan. Dependiendo del número y la viabilidad de las células recuperadas la primera fracción se estimulaba con diferentes antígenos (SEB, rotavirus, influenza, toxoide tetánico), una segunda fracción se usaba para hacer la coloración con tetrámeros descrita en el articulo “Circulating human rotavirus specific CD4 T cells identified with a class II tetramer express the intestinal homing receptors α4β7 and CCR9” y la ultima se congelaba en nitrógeno líquido.

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