1

Tema 1

Base cromosómica de

la herencia

1er. Bloque. Fundamentos de Genética Molecular

El material hereditario

1866; 1900. Mendel y redescubridores Elementos o factores Sin base química ni localización

1902. Sutton y Boveri Teoría cromosómica de la herencia 1910. Morgan y Bridges Demostración de la teoría cromosómica Sin base química

Requisitos de las moléculas portadoras de la herencia

1. Información compleja y estable (genotipo) 2. Replicación fiel y reparto equitativo 3. Variación ocasional 4. Expresión (fenotipo)

Los primeros pasos

1.1

2

El material hereditario: Proteínas o ADN

- Polímero monótono, no informativo - Cuatro constituyentes en proporción 1:1:1:1 -  Polímero de reserva - Armazón estructural de los cromosomas

ADN (Phoebus Levene, años 20)

Proteínas

-  Familia heterogénea de macromoléculas Ejemplo: 10 aa; 2010 ≈ 1013 proteínas diferentes -  Funciones precisas -  Estructura precisa y relacionada con la función -  Errores congénitos del metabolismo (Garrod, 1908)

1.1

Experimento de Griffith (1928)

IIIS!

IIR!

IIIS!

IIIS!

IIR!

Neumococos

Descubrimiento de la transformación bacteriana

Dawson, 1931: La transformación también ocurre in vitro Alloway, 1933: Un extracto libre de células de bacterias S basta

1.1

3

El principio transformante es ADN y no proteína

Experimento de Avery, MacLeod y McCarty(1944)

1.1

El ADN es el material genético

Experimento de Hershey y Chase (1952)

1.1

4

Experimento de Fraenkel-Conrat y Singer (1957)

El material genético de algunos virus es ARN 1.1

La carrera por desvelar la estructura del ADN

•  Linus Pauling

•  Erwin Chargaff •  Maurice Wilkins,

Rosalind Franklin •  Francis Crick, James Watson

Nobel de Medicina y Fisiología Crick, Watson, Wilkins, 1962

1.2

5

Las bases nitrogenadas

Pirimidina Citosina Timina (ADN)

Uracilo (ARN)

Purina Adenina Guanina

1.2

Nucleósidos, nueclótidos y polinucleótidos

extremo 5’

extremo 3’

Enlace fosfodiéster

5ʼ! 3ʼ!

Ácido fosfórico

Desoxirribosa (ADN) Ribosa (ARN)

Purina ó Pirimidina

nucleósido

nucleótido

Terminología (ejemplo para la guanina): Nucleósido: Guanosina Desoxiguanosina Nucleótido: Ácido guanilico Ácido desoxiguanílico

1.2

6

La regla de Chargaff (1950)

Organismo % A % T % G % C A+G A+T T+C G+C

Streptococcus 29.8 31.6 20.5 18.0 1.01 1.59 Mycobacterium 15.1 14.6 34.9 35.4 1.00 0.42 Saccharomyces 31.3 32.9 18.7 17.1 1.00 1.79 Arenque 27.8 27.5 22.2 22.6 0.99 1.23 Rata 28.6 28.8 21.4 21.5 0.99 1.33 Hombre (timo) 30.9 29.4 19.9 19.8 1.03 1.52 Hombre (hígado) 30.3 30.3 19.5 19.9 0.99 1.53 Hombre (esperma) 30.7 31.2 19.3 18.8 1.00 1.62 ADN puro Tratamiento ácido Cromatografía en papel

En el ADN la cantidad de adenina es igual a la de timina y la cantidad de guanina es igual a la de citosina

1.2

La doble hélice (Watson y Crick, 1953) Puntos de partida

–  Reglas de Chargaff –  Difracción de rayos X

•  Atsbury; Franklin y Wilkins –  Uso de modelos –  Concepto genético de la molécula de la

herencia

Fuente de rayos X

Haz de rayos X

Cristal

Haces difractados Detector

(ej. película)

Wilkins, Cold Sp. Harb. Symp. 21: 75-88; 1956

1.2

7

Cavendish laboratory (Cambridge, Inglaterra)

La doble hélice (Watson y Crick, 1953) 1.2

La doble hélice (Watson y Crick, 1953)

- Hélice dextrógira de 20 Å de diámetro

- Dos cadenas antiparalelas

- Enrollamiento plectonémico

- Esqueleto pentosa-fosfato exterior

- Bases apiladas perpendiculares al eje

- Estabilización por puentes de hidrógeno

y apilamiento hidrófobo de las bases

- Un par de bases por cada 3,4 Å

- Dos bases adyacentes, un ángulo de 36º

- 10 pares de bases por vuelta

34 Å

20 Å

3,4 Å

surco mayor

surco menor

ADN-B 3’ 5’

Publicación original: Watson y Crick. Nature 171: 737; 1953

1.2

8

Adenina

Timina

Guanina

Citosina

La doble hélice (Watson y Crick, 1953)

Complementariedad La hélice de 20 Å sólo permite los apareamientos A=T y G≡C

1.2

Las dos caras del ADN

bbbATGGCTGACCACCTTTATGCGAGAAAGAATGATGCTCTCAATGTCAACCGTGAGCCATATCAGCCCCTCAAGTCTAAATGCGCTGACTAACAATTCACTATAGCTGACATTGTCAATGGGCAACGCAGTGACATTAACATTACCGTCAGAGGCTCTGACTGGTACTGGGCTGTCTGCGCAGGTGTGTACAAGAAAAATACGTCCAGGATTTTGGGATGCAAAGACTAACTGTTCTCAGTCATGACCGTTTCAACCTTTGCGTTTCTCGGGCTTGGAATGAGAAAGCCTCGCACCGATCGTATCTTCCAGTAAGTTCCATCAGAGTTCCATTGTACATTCTTTCTTTCTTGTTGATCTATGAGTATCCATTGAGTAAGGTGTCATGTGCTTTACTGACCTGCTTAGCTACATCACTGCAGGTATCACCATGATCGCATCTATCGCATATTTCACGATGGCTTCAAATCTTGGCTGGACTCCTATCGCGGTTGAGTTCCAGAGGTCCAACCATAGGGTCGCCGGGATCTACAGAGAGATTTTCTATGCAAGATACATTGACTGGTTCTTGACAACTCCCCTTCTACTCACAGATCTTCTCCTTACTGCTGGCATGCCCTGGCCGACTGTGCTGTGGGTGATTCTTGTGGACTGGGTGATGATTGTCACTGGACTGGTCGGAGCCCTCGTGAAGAGTTCTTACAAGTGGGGTTATTTCGCCTTCGGTAAGTCGGCTTCCAAACACTGACACCATCATCACTGACATACCTCCAAGGTTGCGCTGCCCTCGCATACATCGTTTACGTGCTCGCTTGGGAAGCTCGTCTACATGCTAAGCACGTTGGCCCTGATGTCGGTCGAACCTTTGTCATGTGCGGTTCCCTCACAGCCGTTGTCTGGATTCTCTATCCTATTGCCTGGGGTGTCTGTGAAGGCGGTAACTTGATTGCCCCTGACTCTGAGGCTGTCTTCTACGGCATTCTTGATCTCATAGCGAAGCCTGTCTTTGGAGCCTTGCTTCTCTGGGGACACCGAAACATCGACCCTGCTCGTCTTGGTCTACGTATTCGCGACATTGACGAGCGTATCTTCCCAGATGGTCCCAACAACAAGGTTGCATCTGGACATGGTGCTCGAAACGATACTGCCACTGCCTCTGGCTCTAATGTCAACCCAAACGCCTGA-3’!

5’-!

El ADN es un texto El ADN es una molécula

Gen carO del hongo Fusarium (1182 pb)

1.2

9

1. Estabilidad Permanencia por largo tiempo 2. Secuencia Contiene información 2. Sin límite de tamaño Información ilimitada 3. Complementariedad (1) Replicación y reparto 4. Complementariedad (2) Mecanismo de transcripción 5. Posibilidad de cambio Variación ocasional

Implicaciones biológicas de la doble hélice 1.3

Superenrollamiento 1.3

10

Propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos

Absorción de radiación ultravioleta (max. 260 nm)

Densidad En el ADN de doble cadena es función del contenido en G + C Temperatura de fusión Función del contenido en G + C Cinética de reasociación Permite estimar la complejidad de una muestra de ADN

Permite estimar concentración y pureza de ADN El ADN de cadena simple absorbe más que el de cadena doble

1.3

Densidad y contenido en G-C La densidad de flotación del ADN es proporcional a su contenido en pares G≡C

1.3

11

Densidad de flotación

densidad (g/cm3)

La densidad de flotación del ARN es mayor que la del ADN

El ADN eucariota no tiene un contenido G+C uniforme

1.3

Desnaturalización y renaturalización del ADN

Las cadenas del ADN pueden separarse reversiblemente

1.3

12

Desnaturalización del ADN: efecto hipercrómico

El ADN de cadena simple absorbe más a 260 nm que el ADN de cadena doble

1.3

Temperatura media de fusión y porcentaje G-C

La temperatura media de fusión del ADN depende de su contenido en pares G-C

1.3

13

Cinética de reasociación: C0t 1/2

Co: Concentración inicial de ADN de cadena sencilla C: Concentración restante de ADN de cadena sencilla t: tiempo

ADN 1

c (C

/Co)

Cot (Molar x s)

1.3

Cinética de reasociación y complejidad del ADN

El valor C0t 1/2 aumenta con la complejidad del ADN

1.3

14

Cinética de reasociación del ADN eucariota

Las cinéticas de reasociación muestran la existencia en los genomas eucariotas de secuencias únicas y repetidas Las seceuencias repetidas se reasocian mucho más deprisa

1.3

Modelos teóricos para la replicación del ADN

Semiconservativo

Conservativo

Dispersivo

1.4

15

Centrifugación en gradiente de densidad

ADN normal ADN pesado

ADN normal: aislado de un organismo incubado en un medio normal

ADN pesado: aislado de un organismo incubado en un medio con 15N

Una vez equilibrado el gradiente, el ADN se coloca en el lugar correspondiente a su densidad

1.4

Cultivos de E. coli líquido en agar

Experimento de Meselson y Stahl (1958)

Demostración experimental de que la replicación del ADN es semiconservativa

1.4

Cultivo de E. coli con 15N

Generaciones:

Separación del ADN en gradiente de densidad

16

En 1957, Kornberg aisla la primera enzima capaz de catalizar la síntesis de ADN in vitro (ADN polimerasa I)

Requiere:

•  ADN molde •  Desoxirribonucleósidos 5’-trifosfato •  Cebador

Nobel de Medicina y Fisiología. Kornberg, 1959

Goulian, Kornberg y Sinsheimer (1967) demuestran que la ADN polimerasa I es capaz de dirigir la síntesis de ADN biológicamente activo

Cadena molde

Cadena creciente (cebador)

desoxirribosa

Polimerización de ADN

Polimerización del ADN 1.4

La replicación es bidireccional: en una cadena la síntesis es contínua y en la otra es discontinua

Fragmentos de Okazaki

5’

3’ 5’

3’

La polimerización ocurre en sentido 5’→3’

Polimerización del ADN

La ADN polimerasa sólo puede añadir nucleótidos al extremo 3’ de la cadena en crecimiento Orquilla de replicación

1.4

17

Unión de los fragmentos de Okazaki 1.4

En la cadena donde la síntesis es discontinua, la síntesis se hace por segmentos (fragmentos de Okazaki) que se van uniendo después

Polimerasas de ADN de E. coli

Propiedades I II III

Inicio de la síntesis - - -

Polimerización 5'-3’ + + +

Actividad exonucleasa 3'-5’ + + +

Actividad exonucleasa 5'-3’ + - -

Subunidades 1 ≥ 4 ≥ 10

Nº (polimerasa/célula) 400 ? 15

Tasa de elongación (nucleótidos/s) 16-20 40 250-1.000

Continuidad 3-200 1500 ≥ 500.000

Función Eliminación de cebadores de ARN Relleno de huecos

entre frag. Okazaki Reparación

Reparación Replicación

1.4

18

Fidelidad de la replicación

La polimerasa de ADN lleva incorporado un mecanismo corrector Si introduce un nucleótido incorrecto, utiliza su actividad exonucleasa 3’-5’ para eliminarlo y luego reanuda la síntesis en sentido 5’-3’

1.4

La actividad correctora reduce las tasas de error de las polimerasas de ADN

Enzima Dominio sintético

Dominio corrector

Tasa de error Sin corrección Con corrección

ADN polimerasa I E. coli aa 200-600 N-terminal 10-5 5 x 10-7

ADN polimerasa III E. coli subunidad α subunidad ε 7 x 10-6 5 x 10-9

ADN polimerasa Fago T4 C-terminal N-terminal 5 x 10-5 10-7

ADN polimerasa Fago T7 ? 118-145 10-5 10-6

1.4

19

Organización de los genomas

Genomas bacterianos Cromosomas de ADN (Normalmente circulares) Plásmidos y episomas

Genomas eucariotas Cromosomas de ADN nuclear (lineales) ADN de orgánulos (circulares)

Genomas víricos Enorme

diversidad

1.5

Genomas víricos

Existen virus de ADN y de ARN, de molécula circular o lineal, de cadena doble y de cadena simple Ejemplos

Virus del mosaico del tabaco: ARN cadena simple

Bacteriófago lambda:

ADN de cadena doble circular en el citoplasma bacteriano lineal en la cápsida

1.5

20

Organización del cromosoma

bacteriano

B. Dominios de lazos C. Lazos superenrrollados

A. Estructura en ovillo

Nucleoide de E. coli (80% ADN)

1.5

Plásmidos ADN doble cadena, circular Se encuentran en muchas bacterias No son esenciales Se replican autónomamente

0,2 µm

1.5

21

Genomas de orgánulos

ADN mitocondrial Circular, doble cadena 17 kb en humanos 5-10 copias por orgánulo en humanos 20-40 copias en plantas

ADN cloroplástico Circular, doble cadena 195 kb en Chlamydomonas 134 kb en plantas 75 copias por orgánulo en Chlamydomonas

1.5

La replicación es bidireccional a partir de un punto, llamado origen de replicación

Replicación del cromosoma de E. coli

origen de replicación

1.6

22

43 Cairns, 1963

modelo θ (zeta)

Replicación del cromosoma de E. coli 1.6

Prueba de la replicación bidireccional 1.6

23

La replicación altera la estructura del ADN

El avance de las horquillas de replicación provoca superenrollamientos que deben ser eliminados con la girasa

1.6

Maquinaria enzimática de la replicación 1.6

24

Replicación por círculo rodante Corte

nucleasa

El ciclo puede

repetirse

Replicación de una cadena. Desplazamiento

de la otra

La cadena desplazada puede circularizar y servir de molde

1.6

Heterocromatina y eucromatina

Heterocromatina - Tinción más intensa con reactivo de Feulgen - Región más condensada - Transcripcionalmente inactiva - Estado permanente o temporal (constitutiva o facultativa)

Eucromatina - Tinción menos intensa - ADN menos empaquetado

1.7

25

El “collar de perlas” eucariota 1.7

Componentes del nucleosoma 1.7

26

Modelo tridimensional del nucleosoma 1.7

El enorme grado de empaquetamiento permite almacenar mucho ADN

Compactación del ADN en un cromosoma

Eliminación de las histonas

1.7

27

Cromosoma eucariota: estructura de la cromatina 1.7

Metacéntrico

Submetacéntrico

Acrocéntrico

Telocéntrico

Cromosomas humanos 1.8

28

constricción primaria

constricción secundaria

telómero

cinetocoro

centrómero

constricción secundaria del organizador nucleolar

brazo corto (p)

brazo largo (q)

cromátidas hermanas

Cromosoma eucariota: cromátidas hermanas

Cada cromátida contiene una molécula lineal de ADN

ADN ADN

1.8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

8.4 8.0 6.8 6.3 6.1 5.9 5.4 4.9 4.8 4.6 4.6 4.7 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 2.9 2.7 2.6 1.9 2.0 5.1 2.2

Número % longitud relativa

Cromosomas grandes

Cromosomas medianos

Cromosomas pequeños

Cromosomas sexuales

Cromosomas humanos 1.8

29

Técnicas de bandeo y marcaje de cromosomas

Bandas específicas de cromosomas tras uso de métodos específicos de tinción

X 4 5

Bandas G (zonas ricas A-T) Bandas Q (heterocromatina) Bandas C (centrómero; heterocromatina) Bandas R (zonas ricas G-C)

1.8

FISH (hibridación in situ)

Representación ordenada del juego completo de cromosomas de las células de un individuo tal y cómo se observa en la metafase mitótica mediante microscopía óptica

Cariotipo humano (hombre) Nótense las bandas

Cariotipo 1.8

30

Nombre común Especie Nº par de cromosomas

Hombre Homo sapiens 23 Mosquito Culex pipiens 3 Mono rhesus Macaca mulatta 21 Gato Felis domesticus 19 Trigo Triticum aestivum 21 Levadura Saccharomyces cerevisiae 12 Carpa Cyprinus carpio 52

Número de cromosomas ! 1.8

Los números de cromosomas son muy variables. Algunos ejemplos:

Replicones eucariotas

Múltiples orígenes de replicación: 250-400 en levaduras, 25000 en mamíferos Mayor cantidad de ADN por célula Menor velocidad de las polimerasas: 50 nucleótidos/s

1.9

Organismo Nº de replicones

Longitud media (kb)

Movimiento de la horquilla (pb/s)

Levadura 500 40 60

Mosca 3500 40 40

Sapo 15000 200 8

Ratón 25000 150 37

Bacteria 1 4200 800

Fragmentos de Okazaki más cortos: 100-150 nucleótidos Las histonas deben disociarse del ADN en replicación y volver a asociarse a las moléculas hijas Cromosomas lineales, problemas para replicar los telómeros

31

Orígenes de replicación eucariotas

En los cromosomas eucariotas hay muchos orígenes de replicación

1.9

El problema de la replicación de los telómeros 1.9

32

Telomerasa 1.9

Cromosomas sexuales

X e Y humanos

1.10

33

Cromosomas sexuales o gonosomas!

(1)   Machos heterogaméticos Mamíferos

(XX, hembra; XY, macho) Hemípteros y Ortópteros (XX, hembra; X0, macho)

(2) Hembras heterogaméticas Aves; Lepidópteros (ZZ, macho; ZW hembra) (ZZ, macho; Z0 hembra)

Esperma

Óvu

lo

Determinación cromosómica del sexo 1.10

El problema de la dosis génica

Machos 1X Hembras 2X

Las hembras poseen el doble de copias de los genes del cromosoma X

Embriogénesis (~15 días)

Solución: inactivación de unos de los dos cromosomas X Al inactivar un cromosoma X, machos y hembras presentan aproximadamente la misma dosis génica Mecanismos epigenéticos (Tema 3)

Hipótesis de Lyon (1961)

Inactivación del cromosoma X 1.11

34

El cromosoma X inactivado se encuentra en los núcleos en interfase en forma de heterocromatina, formando el llamado corpúsculo de Barr

Inactivación del cromosoma X: corpúsculo de Barr

El corpúsculo de Barr está pegado a la membrana nuclear

1.11

Consecuencias de la inactivación del cromosoma X

XoXo

X+Y X+Xo

gatos tigre

1.11

Las hembras son mosaicos para el cromosoma X (quimeras de dos tipos celulares diferentes)