TEJEDA-Bioseparaciones

Parte I

Captulo 1 IntroduccinEl cultivo de clulas con el objeto de obtener productos tiles, es una actividad que ha realizado el hombre prcticamente durante toda su historia. Recientemente a esta actividad se le ha denominado Biotecnologa. Esta ha evolucionado a partir de los conocimientos generados en diversas disciplinas, tanto del rea de las ciencias bsicas como de las ingenieras. Hoy la Biotecnologa puede ser definida como la coleccin de procesos industriales que involucran el uso de sistemas biolgicos (Wang, 1988). Las operaciones que comprenden los procesos biotecnolgicos a escala comercial, se han dividido tradicionalmente en operaciones previas (procesos "upstream") y operaciones posteriores o bioseparaciones (procesos "downstream"). Dentro de las primeras se considera la preparacin del medio, la esterilizacin y el funcionamiento del biorreactor (Cooney, 1990). Los procesos de bioseparacin como se muestra en la Figura 1.1, involucran la recuperacin y purificacin de productos provenientes del biorreactor. Comprenden todos los tratamientos que requiere el caldo de cultivo para la obtencin del producto en las condiciones de pureza y actividad deseadas. En un proceso dado, la parte correspondiente a las bioseparaciones puede representar hasta un 60% del costo total de produccin sin considerar las materias primas (Kalk, 1986). Debido a lo anterior, exite una relacin inversa entre el precio de venta de un producto biotecnolgico y la concentracin de ste en el caldo del biorreactor (Figura 1.2). Puede decirse entonces que el xito comercial de un proceso biotecnolgico

6

CAPTULO!. INTRODUCCIN

depende en gran medida de la adecuada seleccin del proceso de bioseparacin.

1.1

Evolucin de los Bioprocesos

Actualmente se pueden distinguir de manera general tres generaciones de procesos biotecnolgicos, en relacin al tipo de bioseparaciones que stos involucran. La primera generacin comprende el conjunto de procesos desarrollados mediante cultivos de organismos no recombinantes, cuyos productos se obtienen en forma activa tanto si son intracelulares o si son secretados al medio de cultivo. En esta generacin se encuentran los procesos de la Biotecnologa tradicional como los de la produccin de etanol, enzimas, cido ctrico, y antibiticos. Los productos de estos procesos se presentan en concentraciones altas al inicio de la etapa de separacin y no requieren de una extremada pureza para su venta. Los descubrimientos asociados con la Biologa Molecular y la Ingeniera Gentica logrados particularmente en las ltimas dos dcadas, han ampliado las capacidades biotecnologas del hombre. En esta etapa podemos situar una segunda generacin de productos de la Biotecnologa como la insulina humana, la hormona de crecimiento, y alfa interfern, entre otros. Estos son producidos intracelularmente utilizando clulas recombinantes de Escherchia coli. Se caracterizan por encontrarse en bajas concentraciones dentro de la clula, son de elevado peso molecular, tienen propiedades similares a los contaminantes y requieren un alto grado de pureza. Ademas, generalmente al producirse en la clula no poseen actividad biolgica por tratarse de cadenas peptdicas sin la conformacin o estructura apropiada; lo que se traduce en la necesidad de aplicarles tratamientos fisicoqumicos adicionales para lograr el producto en su estado activo. La tercera generacin de la Biotecnologa, la podemos caracterizar por procesos mediante los cuales se obtienen productos extracelulares en clulas recombinantes, la mayora de las cuales son eucariticas. En estos sistemas se ha observado la capacidad no slo de producir exgenamente el producto deseado, sino que ste se obtiene en forma activa. El factor VIII de la sangre y el agente tromboltico Activador

1.1. EVOL UCIN DE LOS BIOPROCESOS

Inoculo

Esterilizacin y preparacin del medio

Producto intracelular

Esterilizacin del caldo si es recombinante

Producto extracelular

Rompimiento celular

' Remocin de desechos celulares

Separacin celular

Recuperacin y concentracin del producto

Purificacin del producto

Figura 1.1: Operaciones de un proceso biotecnolgico: a). Operaciones previas b). Operaciones posteriores o bioseparaciones. Adaptada de: Bujurstrom, 1985.Reproducida reservados. con el permiso de Me Graw Hill. Copyright 1985. Todos los derechos

CAPTULO 1. INTRODUCCIN

(g/i).Etanol .Acidoctrico MSG , Penicilina ,Treonina > Cefalosporna kGentamioina . Acido Giberflico . Enzimas a granel . Glucosa oxidas Anticuerpos Enzimas d investigacin y diagnstica GlioroHosatodeshidrogenas* LucHerasa Factor VIII Urakinasa Enzimasteraputicas^"^

O

1

"* 10*

wr

IOZ ' K) I01 K)2 I03 K>4 K)5 O6 KJ7 K)" O9

Precio

de

venta

$/Kg

Figura 1.2: Relacin entre la concentracin inicial del producto en el caldo y el precio final de venta del producto. Fuente: Dwyer, 1984.Reproducida con el permiso de Nature Publishing Co. Copyright 1984. Todos los derechos reservados.

1.2. CARACTERSTICAS DE LOS BIOPROCESOSTabla 1.1: Caractersticas de los Procesos Biotecnolgicos.Caracterstica Perodo Tipo de clulas Fortaleza de las clulas Conocimiento de propiedades bsicas Conocimiento Tecnolgico Primera- 1975 No recombinantes Alta

Generacin Segunda

Tercera

1975Recombinantes AltaBajo Bajo

1985Recombinantes BajaBajo Bajo

Alto Alto

Tabla 1.2: Caractersticas de los Productos BiotecnolgicosCaracterstica Producto tipo Idealizacin Tamao Actividad al secretarse Pureza deseada Similitud con contaminantes Valor Primera Antibiticos Aminocidos Extracelular e intracelular IntermedioSi

Generacin Segunda Insulina humanaHC

Tercera Factor VIIItPA

Intracelular MacromolculasNo

Extracelular MacromolculasSi

Alta Baja Bajo

Muy alta Alta Alto

Muy alta Alta Alto

del Plasmingeno tisular (t-PA de sus siglas en ingls) son productos caractersticos de esta generacin. Debido a su empleo con fines teraputicos, estos productos deben ser obtenidos con un alto grado de pureza (Datar et a/, 1993) .

1.2

Caractersticas de los Bioprocesos

En la Tabla 1.1 y en la Tabla 1.2 se presentan algunas caractersticas asociadas a los procesos y a los productos de las tres generaciones de la Biotecnologa, aqu descritas.

10

CAPTULO 1. INTRODUCCIN

Los procesos biotecnolgicos tanto de la segunda como de la tercera generacin, se encuentran en una etapa de desarrollo que requiere ampliar el conocimiento de las propiedades fisicoqumicas de los productos y sus contaminantes, con el objeto de seleccionar las operaciones de separacin adecuadas debido al alto grado de pureza requerido por los productos. Los aspectos de rendimiento y pureza del producto son bsicos para determinar la viabilidad de un bioproceso, debido a que para lograr el grado de purificacin requerido por este tipo de productos, generalmente la purificacin debe realizarse en varios pasos. Un ejemplo de lo anterior se muestra en la Figura 1.3 con un diagrama de flujo del proceso para la obtencin de insulina humana a partir clulas de E. coli recombinante. Las operaciones de bioseparacin para un proceso deben seleccionarse cuidadosamente con el fin de que el costo sea mnimo. Es decir, si el rendimiento por paso de purificacin es bajo y se requieren varias pasos, puede tenerse un proceso no viable econmicamente debido a su an ms bajo rendimiento global. La Figura 1.4 muestra como decrece el rendimiento global en funcin del nmero de pasos de purificacin, considerando rendimientos por paso de 95 %, 90 %, 80 % y 60 %. Por ejemplo, si el rendimiento promedio por paso en un proceso de purificacin de 10 pasos es de 60 %, el rendimiento global del proceso de purificacin es de 0.6 %. Si debido a la desnaturalizacin del producto el rendimiento desciende a 30 % por etapa, el rendimiento global del proceso es 0.0006%. Esto significa que se require 1000 veces ms cantidad de materia prima para lograr la misma masa de protena purificada. Por otra parte si el rendimiento promedio por paso fuese de 95 %, el rendimiento total alcanzado sera del 60 % (Hearn y Anspach, 1990). Ejemplo 1.1: Estimacin de la pureza y el rendimiento de una enzima en un proceso de purificacin. En el desarrollo de un proceso para la obtencin de una enzima a partir de E. coli, se sabe que sta tiene un 80 % de humedad y que el 60 % de su peso seco es protema. El proceso de purificacin de la enzima consta de 4 pasos (Figura 1.5). En la tabla siguiente se presenta

1.2. CARACTERSTICAS

DE LOS BIOPROCESOS

11

Salida delire este'ril

Esterilizador continua (A)

i

uu. i[ J

Tanques de m

lLJJ

Sedimentador 1 Sedimentador2 o*1 (B) ' filtra de aire esteVH

TSrfii r tH i hiI ** t Fermentadorde produccin (O) Centrifugas

Tanque de almacenamiento

intercambiador de calor

e(E)

'.

Compresor Tratamiento de i* desechos Tanque de* 4sterilizaon

^ t t1 1 1

otras corrientes de desecho CNBr formato

nn i_r.f , 1

Reactor para eliminacin de CNBr (H)

Reactor de solubilizacin

Figura 1.3: Representacin esquemtica del proceso para la obtencin de Insulina Humana. Fuente: Datar y Rosen, 1990.Reproducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1985. Todos los derechos reservados.

12

CAPTULO 1.

INTRODUCCIN

Del tratamiento dCNBr

bufer tris

enzimas

Reactor de cuMonan (K) bufer bufer Iris tris*NaCt _,;?

?Td**eho i HiPLC (O) enzimatico (NJ

^desecho (M) acetato de amonio

Reactor de renaturalizacin (L)

3r1

IjUUhrafihraein vapor PRODUCTO Reactor de cristalizacin (Q) Centrifugacin Evaporador instantneo

Figura 1.3: Continuacin.

1.2. CARACTERSTICAS

DE LOS BIOPROCESOS

13

Rendimiento ( % )100 _

95%

90%

4 6 8 Nmero de pasos

Figura 1.4: Representacin grfica del rendimiento global de un proceso de purificacin de un producto biotecnolgico en funcin del nmero de pasos. Fuente: Hearn y Anspach, 1990.Reproducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1985. Todos los derechos reservados.

14

CAPTULO 1.

INTRODUCCIN

la cantidad de enzima y de protena total al final de cada paso. Protena Enzima Fraccin total (g) total (g) enzima xlO~ 3

Paso Rompimiento celular Precipitacin Intercambio inico Crom atografa gel

12.000 1.800 0.240 0.036

0.080 0.060 0.048 0.036

6.667 33.333 200.000 1000.000

Se desea obtener el factor de purificacin de la enzima en cada paso, el rendimiento por paso y el rendimiento global./-'

Solucin:El factor de purificacin, el rendimiento por paso y el rendimiento global del proceso se presentan junto con los datos del problema en la tabla siguiente:Paso Rompimiento celular Precipitacin Intercambio inico Cromatografagel

Prot. tot. (g)

Enzima tot. (g)

Fraccin enz. XlO~ 3

Factor de purific.

% Recup* racin Por etapa Global

12.000 1.800 0.240 0.036

0.080 0.060 0.048 0.036

6.667 33.333 200.000 1000.000

1 5 30 150

100 75 80 75

100 75 60 45

a). El factor de purificacin se obtiene mediante el cociente de la fraccin de enzima en cada paso, entre la fraccin de enzima inicial. b). El rendimiento en cada paso est dado por el cociente de la cantidad de enzima total obtenida en cada paso, entre la cantidad total de enzima al inicio del paso. c). El rendimiento global al final de cada paso est dado por el cociente de la cantidad de enzima total obtenida en ese paso entre la cantidad total de enzima inicial.

1.2. CARACTERSTICAS DE LOS BIOPROCESOS

15

Rompimiento celular con sulfato de amonio

i Precipitacin

Fraccin colectada

35

40

45

50

55

60

70

100

% de saturacin Cromatografa de intercambio inico

Carga

Elucin Nmero de fraccin

Cromatrografia de filtracin por gel

Producto

Nmero de fraccin

Figura 1.5: Proceso hipottico de cuatro pasos para la purificacin de una enzima.

16

CAPTULO 1.

INTRODUCCIN

El conocimiento tecnolgico de los procesos biotecnolgicos de segunda y tercera generacin es limitado. Actualmente es necesario profundizar en los mtodos de escalamiento de algunas operaciones, ya que generalmente se han adaptado a escala comercial a partir del laboratorio. En el proceso de escalamiento es necesario considerar los volmenes y normas del mercado para el producto (Nuil, 1987). La Biotecnologa ha adoptado con xito operaciones de la Ingeniera Qumica, en la purificacin de productos biotecnolgicos tradicionales. Sin embargo, existen limitantes para lograr sto cuando se trata de obtener productos caractersticos de la segunda y tercera generacin. Existe una necesidad real de desarrollar procesos de bioseparaciones apropiados, con la participacin de bioqumicos y bilogos con el propsito de lograr, tanto la pureza deseada del producto, como la eficiencia y rentabilidad del mismo (Wang, 1988).

1.3

Sumario

Los procesos de bioseparacin involucran la recuperacin y purificacin de productos provenientes del biorreactor. Las bioseparaciones comprenden todos los tratamientos que requiere el caldo de cultivo para obtener un producto biotecnolgico en las condiciones de pureza y actividad requeridas. La economa de los procesos biotecnolgicos depende en gran medida de las operaciones de bioseparacin que involucran, de tal manera que la correcta seleccin de estas operaciones tiene un fuerte impacto en el xito del proceso.

1.4.

PROBLEMAS

17

1.4

Problemas

1.1 .-Efectuar un anlisis comparativo en relacin a las operaciones de separacin que utilizan, de los procesos para la produccin de cido ctrico, penicilina e insulina. 1.2.- Un proceso para la recuperacin de hidroxibutirato deshidrogenasa consta de tres pasos: Un rompimiento de las clulas para liberar la enzima intracelular, seguido de dos pasos de adsorcin/ desorcin por afinidad. En la siguiente Tabla se presentan los datos obtenidos de actividad de enzima y protena total al final de cada paso. Calcular la actividad especfica, el ndice de purificacin y el % de recuperacin. Paso Rompimiento Ads/Des (1) Ads/Des (2) Actividad Total Protena Total (Unidades) (mg) 6,860 6,800 5,380 76,200 2,200 267

1.3.- Completar la siguiente tabla relacionada con la purificacin de una enzima:Vol.Material Extracto ler. pisomi50050

Conc. prot. mg/ml14 10

Prot. total "IR7 60

Act. enzim. U/ml

Act. total U

Act. esp. U/mg

Rend. Total Etapa

Fac. purif.

1.4.- En un proceso biotecnolgico para producir una enzima que se encuentra en desarrollo, se obtiene una concentracin de 0.1 mg/ml de la enzima en el caldo inicial. Si a los proyectos se les exige un margen sobre ventas del 50 %, estime el costo de produccin mximo del producto utilizando la Figura 1.2

18

CAPTULO!.

INTRODUCCIN

1.5

Bibliografa

Bujurstrom, E. 1985. Biotechnology. Chem. Eng. Feb. 18. Me Graw Hill. New York. 126-158. Cooney, C. L. 1990. Separations for biotechnology. Trends in Biotechnology. 8, 338-340. Datar, R.V., Cartwright, T. y Rosen, C.G. 1993. Process economics of animal cell and bacterial fermentations: A case study analysis of tissue plasminogen activator. Bio/Technology. 11, 349-357. Datar, R. y Rosen C. G. 1990. Downstream process economics. En: Separations Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel Dekker Inc. New York. 741-793. Dwyer, J. 1984. Scaling up bioproduct separaton with high performance liquid chromatography. Biotechnology. 2, 957-964. Hearn, M. T., y Anspach, B. 1990. Chemical, physical and biochemical concepts in isolation and purification of proteins. En: Separations Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel Dekker Inc. New York. 17-63. Kalk, J. P. y Langlykee, A. F. 1986. Cost estimation for biotechnology projects. En: Industrial Microbiology and Biotechnology. Demain, A.L. y Solomon, N. (Eds.). American Society for Microbiology. New York. 363-384. Nuil, H. R. 1987. Selection of a separation process. En: Handbook of Separation Process Technology. Rousseau, R.W*, (Ed.). John Wiley & Sons. New York. 982-995. Wang, D. I. C. 1988. Biotechnology: Status and perspectives. AIChE, 84-18, 1-21.

Captulo 2 Seleccin del Proceso2.1 Introduccin

El desarrollo de un proceso biotecnolgico para la obtencin de un producto de inters comprende varios aspectos, fundamentalmente los econmicos relacionados con el mercado y los tcnicos que involucran el diseo del proceso . El estudio de mercado permite evaluar el potencial econmico del proceso y es requisito indispensable para la formulacin del proyecto a desarrollar. Por ejemplo, an cuando la factibilidad tcnica de un proceso dado pueda ser atractiva, el valor esperado del producto pudiera no justificarlo (Knight, 1990). En el diseo de un proceso es necesario un trabajo completo y cuidadoso que permita desarrollar y evaluar varios esquemas de operacin con el propsito de aproximarse al diseo ptimo, bajo las restricciones presupustales establecidas. (Kelly, 1987). Un aspecto central en el diseo de un bioproceso, es la especificacin de la secuencia de operaciones de separacin que se requieren, debido al alto costo que stas representan. En este captulo en la seccin 2.2 se presenta los principales aspectos econmicos y tcnicos a considerar para la seleccin de un proceso biotecnolgico, particularmente en su secuencia de operaciones de bioseparacin. Los equipos ms comunes para realizar dichas operaciones se describen en la seccin 2.3. Las metodologs utilizadas para19

20MERCADO

CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO

ESPECIFICACIN DEL PRODUCTO

PROCESO - Operaciones y secuencia -Escala Etapas o tiempo por operacin -Costo

PRODUCTO

Figura 2.1: Elementos para la seleccin de un bioproceso. la seleccin apropiada de la secuencia de bioseparaciones para un proceso se establecen en la seccin 2.5.

2.2

Fundamentos

Los factores que intervienen en la seleccin de un proceso biotecnolgico son de dos tipos (Figura 2.1): Econmicos: Relacionados principalmente con el mercado y las especificaciones del producto. Tcnicos: Relacionados directamente con el el proceso.

2.2.

FUNDAMENTOS Tabla 2.1: Influencia del mercado en el precio del producto.Caso tipo Compaa Producto Precio por dosis Demanda Anual (USA). No. de Dosis Masa

21

1 2

GENENTECH Diversas

t-PABST*

$ 2000.00$

100,0005 X 10*

10 Kg100 Tons.

0.50

Datos de: Spalding, 1991. * Somatotropina de Bovino

2.2.1

Mercado y Especificacin del Producto

El mercado es un factor muy impoortante para el establecimiento de un bioproceso, ya que determina el precio del producto. El mercado de los productos biotecnolgicos puede enmarcarse entre dos casos extremos (Tabla 2.1): 1. Productos de alto valor, bajo volumen de produccin y libres de competencia, como el t-PA. 2. Productos de alto volumen de produccin, en mercados muy competitivos, como la BST. En los productos libres de competencia, es posible que se seleccione el primer proceso exitoso que se logre en el laboratorio. Sin embargo, si el mercado del producto aumenta y aparecen nuevos competidores, la economa del proceso cobra especial importancia (Spalding, 1991). Actualmente varios productos biotecnolgicos modernos estn libres de competencia, pero existe una tendencia hacia un incremento en la competitividad del mercado. Es en esta transicin donde el diseo adecuado de los bioprocesos presenta especial relevancia. El primer paso en la seleccin de un proceso es la definicin del objetivo del mismo, especificando claramente la pureza y recuperacin que se desea obtener. Con frecuencia las especificaciones sobre pureza

22


del producto son establecidas por regulaciones legales o por el mercado. Las especificaciones de recuperacin son fijadas para asegurar la economa del proceso. Idealmente la recuperacin debe ser una variable dependiente del diseo de proceso, en la bsqueda de la optimizacin del mismo. En la prctica, debido a limitaciones de tiempo esta fase no siempre se concluye (Nuil, 1987).

2.2.2

El Proceso

El diseo de un proceso comprende todo el trabajo conceptual que es necesario realizar antes de construir una planta productiva, y tiene como objetivo definir las principales caractersticas del proceso como: La secuencia de operaciones de proceso. La escala del proceso. Nmero de etapas por operacin. El costo del proceso.

Operaciones de Separacin y su SecuenciaUna vez definido el producto (o productos) que se desea obtener, as como su pureza y la recuperacin deseada, el siguiente paso es determinar que operaciones son capaces de realizar la produccin y la separacin del producto. En este trabajo slo se abordan estas ltimas. Las operaciones de separacin se basan en las diferencias que existen entre las propiedades fsico-qumicas de los componentes presentes en el caldo de cultivo. El objetivo del diseo de un proceso de separacin es explotar esta diferencia en las propiedades en la forma mas econmica. Generalmente existe una propiedad diferente que es la base primaria para la separacin. Los mtodos de separacin usados con ms frecuencia, as como la propiedad en que se basan, se muestran en la Tabla 2.2 En un anlisis realizado con datos de 100 artculos publicados sobre purificacin de protenas, se observa que hay una secuencia preferencial aunque no estricta, con la cual se desarrollan las operaciones de separacin (Bonnerjea y Hoare, 1986). Tal y como se observa en la

2.2.

FUNDAMENTOS

23

Tabla 2.2: Operaciones de separacin y su propiedad bsica. Mtodo (Operacin) Propiedad

Destilacin Extraccin Cristalizacin Adsorcin Osmosis Inversa Ultrafiltracin Intercambio Inico Dilisis Electrodilisis Membranas Lquidas Electroforesis Cromatografa Filtracin por Gel

Presin de vapor Distribucin entre fases b'quidas inmiscibles Punto de fusin o solubilidad Sorcin superficial Difusividad y solubilidad Tamao molecular Equilibrio Difusividad Carga elctrica y movilidad inica Difusividad y equilibrio Carga elctrica y movilidad inica Depende del tipo de fase estacionaria Tamao y forma molecular

24


i

2

a

4

sAfinidad

e

__ Homogmizactn Intercambio inico Filtracin n Gl

PrecipiUcin

Figura 2.2: Secuencia de operaciones utilizadas en un proceso de purificacin de protenas. Fuente: Bonnerjea et al, 1986.Reproducida con el permiso de Nature Publishing Co. Copyright 1986. Todos los derechos reservados.

Figura 2.2 frecuentemente la homogeneizacin va seguida de una precipitacin, despus la cromatografa de intercambio inico, la separacin por afinidad y finalmente la filtracin por gel. Esta secuencia es valida generalmente en el caso en que el producto sea una protena, la realidad es que cada producto presenta una secuencia de separacin ptima diferente.

Escala de OperacinFrecuentemente la escala de operacin es el factor econmico determinante en la seleccin entre procesos de separacin alternativos. Cualquier proceso de separacin que se escoja, deber ser compatible con la escala industrial a la cual se va a disear. Esto es importante porque varios procesos desarrollados en el laboratorio no tienen su contraparte

2.2. FUNDAMENTOS

25

industrial. Muchas operaciones de separacin tienen un lmite respecto de la capacidad mxima que pueden manejar y esto limita la escala de produccin para la cual esa operacin puede ser considerada. En algunos casos, este lmite superior se debe a una restriccin impuesta por un fenmeno fsico inherente a la operacin de separacin, mientras que en otros casos el lmite superior se debe simplemente a las limitaciones que ofrece la fabricacin de equipo comercial. En la Tabla 2.3 se pueden observar las capacidades mximas en una sola etapa de algunas operaciones de separacin. Cada operacin de separacin tiene en s misma una determinada confiabilidad que es producto de la experiencia y conocimiento de la misma. As se tiene que la destilacin es la operacin ms confiable de los procesos de separacin por el conocimiento que de ella se tiene. La electroforesis en cambio, es una operacin que se realiza a pequea escala, entonces la nica forma de tener confiabilidad a gran escala es usando mltiples unidades en arreglo paralelo. Debido a consideraciones de confiabilidad del diseo, puede ser necesaria una planta piloto para probar la operacin integrada del proceso. En tal caso, todas las operaciones deben ser incluidas en la planta piloto an cuando no se requieran pruebas individuales de confiabilidad de cada una de ellas. Nmero de Etapas por Operacin Otra variable importante en la seleccin de un proceso de separacin (Figura 2.1), es el nmero de etapas de contacto que se realizan por operacin. En la mayora de los casos una operacin de una sola etapa es ms econmica que una operacin de etapas mltiples. Las operaciones de separacin que aparecen en la Tabla 2.1 tienen diferente habilidad para realizar una separacin en una sola etapa. As por ejemplo, la destilacin es una operacin capaz de separar una mezcla binaria en una sola etapa, siempre y cuando no haya formacin de mezclas azeotrpicas entre los componentes que sern separados. La extraccin requiere de al menos dos etapas de contacto para separar un flujo de alimentacin en dos corrientes y obtener el producto en condiciones aceptables. La adsorcin es una operacin que consiste de

26


Tabla 2.3: Capacidades mximas por operacin.Operacin de Separacin Destilacin Extraccin Cristalizacin Adsorcin Osmosis Inversa Lmite Comercial por Operacin Simple Sin lmite Sin lmite 10-70xl06 kg/ao Sin lmite 0.45xl06 kg/ao flujo de agua por mdulo, con varios mdulos por unidad 0.45xl06 kg/ao de flujo de agua por mdulo, con varios mdulos por unidad 450xl06 kg/ao de ' flujo de agua 0.45x106 kg/ao de flujo de agua 1000 kg/ao de producto O.OQxlO6 kg/ao de lquido 100 kg/ao de producto

Ultrafiltracin

Intercambio Inico Electrodilisis Electroforesis Separaciones Cromatogrficas Filtracin por Gel

Fuente: Nuil, 1987.Reproducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1987. Todos los derechos reservados.

2.2. FUNDAMENTOS

27

dos etapas, la adsorcin en si misma, y la regeneracin del adsorbente. Tericamente la ultrafiltracin puede separar dos solutos de alto peso molecular si la diferencia en tamao molecular es del orden de 10; en caso de que esto no sea as, la separacin requiere varias etapas. En cualquier caso de los sealados anteriormente, se requieren etapas de procesamiento adicionales para obtener el producto con la pureza deseada. En el caso de las operaciones de electroforsis, cromatografa, y la filtracin en gel; dado que separan el producto por dilucin, requieren etapas de concentracin posteriores.

CostosUna vez que ha sido definido el objetivo de la separacin, esto es, que se ha identificado el producto que se desea obtener y se ha establecido el proceso, se debe estimar el costo del mismo. Esto comprende la estimacin del costo total del producto y del capital necesario para la inversin. Ambos parmetros, conjuntamente con los ingresos esperados, determinan la rentabilidad del proceso. Costo Total del Producto.- Como se muestra en la Tabla 2.4, el costo total del producto se divide comunmente en dos partes: costos de fabricacin y gastos generales. En los costos de fabricacin se ubican los costos de operacin, los costos fijos y la parte proporcional de los gastos generales de la planta. Dentro de los costos de operacin directos se puede resaltar los costos de las materias primas que son consumidas directamente en el proceso de produccin del producto o que son usadas en la recuperacin del mismo, debido a que stas constituyen la'mayor parte de estos costos. Los costos de las materias primas son ms relevantes en sistemas de produccin basados en procesos biolgicos que en plantas qumicas convencionales. En los primeros las materias primas pueden representar del 30 al 80 % del costo de produccin, mientras que en los convencionales slo representan del 10 al 50 % de ese costo (Kalk y Langlykke, 1986). En los procesos de produccin biotecnolgicos, no solamente las materias primas principales (aquellas que se convierten directamente a producto) tienen un impacto significativo sobre la economa del proceso, sino que

28


Tabla 2.4: Factores que intervienen en el costo total del producto.I.Costos de Operacin Directos A. Materias primas y suministros a. materia prima primaria b. materia prima secundaria c. fletes d. operacin e. mantenimiento f. laboratorio g. otros B. Mano de obra y supervisin a. salarios y estmulos b. horas extras C. Servicios a. b. c. d. vapor electricidad agua tratamiento de desechos

II.

Costos Fijos A. Depreciacin B. Impuestos C. Seguros D. Renta

III.IV. V. VI.

Proporcin de Gastos Generales de la Planta Administracin Mercadotecnia Investigacin y Desarrollo Para estimacin de costos: Costo de Fabricacin (CF) = I+II+IH Gastos Generales (GG) = IV+V+VI Costo Total del Producto =CF-f GG

-

2.2.

FUNDAMENTOS

29

I. Costos de Operacin Directos (59 % ) II. Costos Fijos ( 1 1 % ) III. Proporcin de Gastos Generales de la Planta ( 1 0 % ) IV. Gastos Generales (20 % )

de

0stos

?ara

un

Producto biotec-

tambin las materias primas secundarias como cofactores, enzimas inductores y materiales de recuperacin, influyen considerablemente en los costos de produccin. Los sueldos y salarios representan una fraccin importante del total de los costos de fabricacin, esto es, del 10 al 40 %. Los costos fijos comprenden la depreciacin de maquinaria y equipo impuestos y seguros principalmente. ' La parte proporcional de los gastos generales de la planta que se le asignan al producto, son aquellos que se requieren para la operacin eficiente de la planta pero no son asignables directamente al producto y se estiman entre el 10 y 50 % de los sueldos y salarios (Kalk y Langlykke, En la Figura 2.3 se presenta una estructura de costos tpica para un producto biotecnologa). Estimacin del Capital de Inversin.- El capital de inversin total se conforma del capital fijo y del capital de trabajo. El capital fijo se refiere a todos los fondos necesarios para el diseo, construccin y

30


arranque de la planta. Es en este punto donde se hacen las estimaciones de escala del proceso y la estimacin del costo de los equipos necesarios para las operaciones previas y las bioseparaciones. Cuando se comparan dos procesos de separacin alternativos, se escoge el que requiere mayor capital solamente si la rentabilidad generada es tan grande que justifica la diferencia de requerimientos de capital entre ambas alternativas. Los costos de arranque son difciles de estimar y pueden ir desde menos del 5 % del capital de inversin fijo para una planta basada en una tecnologa ya establecida, hasta ms del 50 % del capital fijo para nuevas tecnologas donde no se tiene experiencia, como son los proyectos biotecnolgicos. El capital de trabajo es la inversin necesaria para la operacin normal de la planta una vez contruda, y comprende los requerimientos de sueldos e inventarios. Ejemplo 2.1- Produccin de somatotropina porcina. Cuando se administra a cerdos la hormona somatotropina porcina (SP) se incrementa la velocidad de su crecimiento hasta en un 30 % y disminuye su contenido de grasa. Cada cerdo requiere de una sola dosis de 200 mg. Para producir SP mediante un cultivo de clulas recombinantes, se cuenta con los siguientes datos: 1. Mercado: Produccin estimada = 6,000 Kg/ao Precio por dosis de 200 mg = $6.00 dlls. (base: 1988) 2. Tcnicos: Concentracin celular al final de la fermentacin en peso seco 35

g/i

Peso protena/peso celular: 57 % Protena SP/protena total : 20 % Recuperacin total esperada: 25 % Duracin del ciclo de fermentacin: 30 h Das de operacin anual: 330 das

2.2. FUNDAMENTOS Impuesto sobre la renta (ISR): 45 % 3. Estimados: (a) Produccin de peso seco celular:

31

= 6000

ao 0.25 Kg = 210,500 Kg/ao

1 Kg 1 Kg 1 Kg x . . x ___ ? x *0.2 Kg

0.57

(b) Volumen de fermentacin total (Vt): 210,000 Kg*

35 f = 6,015,037 /

~

(c) Volumen por ciclo de fermentacin

Vc =Vc

6,015,037 /dias x ciclo x "24 h ^ ~ ~ .,

= 22,784 I ciclo

Este volumen de 22,784 I/ciclo puede ser manejado por un solo fermentador. Si se considera el volumen de fermentacin como el 70 % del volumen total del fermentador, entonces el volumen de fermentacin V/ es:

Vj = 32,500 /Considerando este fermentador se realizan las siguientes estimaciones de costos.

32

CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO 4. Costos (dlls. base 1988)I. Costos de operacin directos. (A) Materias primas y suministros: (B) Mano de obra y supervisin: (C) Servicios (agua, vapor, electricidad y tratamiento de desechos): II. Costos fijos. (A) Depreciacin: (B) Impuestos: (C) Seguros: (D) Renta: (E) Mantenimiento: III. Gastos generales de planta: IV. Administracin: V. Mercadotecnia: VI. Investigacin y Desarrollo: Total: 6,315,581.00 580,720.00 1,054,864.00 Subtotal: 2,939,746.00 587,949.00 293,975.00 000 000.00 1,763,848.00 Subtotal: 5,585,518.00 1,469,873.00 85,680.00 000.00 2,500,000.00 $ 17,592,236.00 7,951,165.00

5. Capital de inversin:Inversiones fijas. (A) Equipo de proceso, instalacin e instrumentacin: (B) Instalaciones elctricas: (C) Edificios: (D) Instalaciones: Inversiones diferidas. (A) Ingeniera, construccin y contratos: Capital de trabajo. 2 meses de materias primas, servicios e investigacin y desarrollo:

10,618,780.00 487,100.00 2,191,950.00 2,679,050.00 Subtotal: 13,420,579.00 Subtotal: 1,756,141.00 Subtotal: Total: 1,756,141.00 $ 31,153,600.00 13,420,579.00 15,976,880.00

Estimar para este proceso: 1. El retorno sobre la inversin. 2. El costo promedio del producto.

2.2. FUNDAMENTOS 3. El costo porcentual de cada concepto del producto.

33

Solucin:1. Clculo del retorno sobre la inversin: Ingreso anual: 6,000 j x ^92 Menos costo anual Utilidad bruta Menos 45 % ISR Utilidad neta Mas depreciacin 180,000,000 17,592,236 162,407,764 73,083,494 89,324,270 2,939,746

Flujo de efectivo neto

$ 92,264,016

El retorno sobre la inversin RSI expresado en porcentaje, est dado por el cociente del flujo efectivo neto y el capital de inversin por 100, por lo tanto:RSI

$3115300 RSI = 296%Esto significa que el proyecto es muy atractivo bajo las condiciones establecidas. 2. Costo promedio del producto: El costo promedio del producto se obtiene mediante el cociente del costo anual y la produccin estimada del producto, esto es: $17,592,236/ano G ost o F promedio = --6, 000 Kg/ao Costo promedio = 2, 932 $/Kg

=

$92,264016

3. Costo porcentual del producto por concepto.

34


Este costo est dado por el cociente del costo de cada concepto entre el costo de operacin: Concepto Materias primas y suministros Servicios Depreciacin Mantenimiento Gastos generales Inversin y desarrollo Otros Costo porcentual6,315.581 17,592,236X

1,054,864 .. 17.592,236 X 2.939,746 17,592,236 1,763,848 17,592,236 1,469,873 y 1 00 - 8 4% 17,592,236 X 1UU ~ O.1VO 2,500,000 . . 17,592.236 X8.8%

100 16 7% x iuu - 1 D - /0 ~ '

Total:

100.00 %

2.3

Equipo

Parte importante en la seleccin de un proceso biotecnolgico consiste en determinar el equipo necesario para realizar una determinada operacin. Varios tipos de equipos pueden ser empleados para una misma operacin y la seleccin depende en gran medida del tipo de producto que va a obtenerse. La Tabla 2.5 muestra las operaciones ms comunes por etapa en funcin de las caractersticas de los procesos y productos biotecnolgicos. Algunos de los equipos ms usados en cada una de esas etapas son los siguientes: 1. Remocin de insolubles: Con frecuencia se usan sistemas de filtracin al vacio, sistemas de filtracin intermitentes, as como centrfugas tubulares, de discos con descarga intermitente o de canasta.

2.3. EQUIPO

35

Tabla 2.5: Operaciones de bioseparacin empleadas de acuerdo a las caractersticas del procesoGeneraciones Etapa Primera Segunda Tercera

Remocin de Insolubles

Filtracin Centrifugacin

-

Filtracin Microfiltracin Ultrafiltracin Centrifugacin

Microfiltracin Ultrafiltracin Centrifugacin

Rompimiento - Homogeneizacin - Abrasin - Permeabilizacin

Concentracin - Extraccin por solventes - Adsorcin - Destilacin Extraccin en dos fases acuosas Adsorcin Precipitacin Ultraftracin

Purificacin - Adsorcin - Cromatografa - Cromatografa - Ultrafiltracin - Electroforesis

36

CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO 2. Rompimiento celular: En esta etapa los equipos que ms se manejan son los homogeneizadores y los molinos de perlas. 3. Concentracin: En la concentracin del producto se emplean extractores que pueden funcionar en forma continua o intermitente, as como tambin tanques agitados y lechos empacados con diversos tipos de adsorbentes. 4. Purificacin: En esta etapa se emplean diversos sistemas cromatogrficos que se traducen en la utilizacin desde equipos muy sencillos como puede ser una simple columna, hasta equipos muy sofisticados como los utilizados en cromatografa liquida de alta resolucin. Tambin son utilizados en esta etapa sistemas de electroforsis. 5. Acabado: En la etapa de acabado, dependiendo de la presentacin con que se va a lanzar el producto al mercado, pueden utilizarse liofilizadores secadores y cristalizadores.

2.4

Diseo

El diseo de un proceso biotecnologa) comprende diversas actividades basadas en la experiencia, la teora y el apoyo computacional disponible. Entre estas actividades podemos destacar las siguientes: Sntesis: Establecimiento de las operaciones del proceso o diagrama de flujo. Anlisis: Modelacin y establecimiento de los valores de las variables del proceso. Evaluacin: Economa, seguridad y confiabilidad del proceso. Optimizacin: Determinacin de las condiciones para lograr el valor ptimo de una funcin objetivo. El xito de un diseo depende fuertemente de la sntesis del proceso ya que las tres actividades restantes: anlisis, evaluacin y optimizacin, se derivan del diagrama de flujo seleccionado.

2.4. DISEO

37

Actualmente existe un gran inters por el desarrollo de mtodos computacionales para el diseo de procesos que incluyan la sntesis de los mismos y que permitan el anlisis y la evaluacin de diversas alternativas, para encontrar en forma rpida el diseo ptimo. En la prctica los procesos rara vez se seleccionan de esta manera, dado que ni los algoritmos computacionales, ni las descripciones cuantitativas de los mtodos de separacin estn suficientemente desarrollados. Sin embargo, estos mtodos cada vez son ms utilizados como apoyo en algunas fases de la seleccin del proceso. En esta seccin se describen los dos enfoques complementarios utilizados para la seleccin de un proceso: Desarrollo de un Caso Base. Sntesis de procesos. Mtodo heurstico Mtodo algortmico Sistemas expertos

2.4.1

Desarrollo de un Caso Base

En la prctica normal el caso base representa el juicio cualitativo del ingeniero de diseo y presupone ser el proceso de separacin ms econmico que pueda ser desarrollado dentro de las restricciones que en tiempo y dinero tiene el proyecto (Nuil, l)87). Una vez que el caso base ha sido seleccionado, el diseador de proceso determinar los costos de operacin y capital con el mayor detalle posible. Cuando el caso base ha sido evaluado, se hace un juicio sobre el ms prximo proceso econmicamente competitivo. El proceso alternativo se evala con las mismas restricciones que el caso base. Si el proceso modificado tiene costos de operacin y capital ms bajos, entonces ste nos lleva a un nuevo caso base de diseo. Este nuevo caso base vuelve a probarse hasta encontrar un caso base ptimo.

38


2.4.2

Sntesis de Proceso

La investigacin que se realiza para seleccionar un proceso, es decir la secuencia de operaciones para transformar una serie de materias primas en productos, se llama sntesis de proceso. El mtodo heurstico, el mtodo algortmico y los sistemas expertos, son producto de este tipo de trabajos.

Mtodo HeursticoEl mtodo heurstico trata de limitar las alternativas posibles para un proceso usando reglas desarrolladas a travs de diseos previos y la experiencia. Al basarse en la experiencia, el sentido comn y la intuicin del ingeniero, la aproximacin heurstica no garantiza la solucin ptima. An as, estos mtodos han probado ser una herramienta valiosa en la optimizacin de la estructura del proceso. Algunas de estas reglas heursticas son generales y aplicables para la sntesis de procesos de bioseparacin. Cuatro de tales reglas heursticas son (Petrides et a/, 1989): 1. Primero remover el componente ms abundante. 2. Primero remover lo que sea mas fcil. 3. Hacer las separaciones mas caras y difciles al final. 4. Seleccionar el proceso que permita aprovechar al mximo las diferencias entre las propiedades del producto y los contaminantes. Existen reglas heursticas ms especficas que las mencionadas anteriormente, como las usadas en el diseo de procesos de purificacin de protenas a gran escala: 1. Si el producto es intracelular, se requiere romper la clula. 2. Si la clula cultivada es de mamfero, el producto es extracelular. 3. Si el rompimiento de la clula se lleva a cabo por mtodos mecnicos, se requiere precipitar los cidos nucleicos.

2.4. DISEO

39

4. Si la concentracin de la protena total al final de la recuperacin y antes de la purificacin, es menor que 60 g/l, se requiere concentrar el producto. 5. Si la alimentacin para la purificacin por cromatografa no es un caldo claro, se requiere un pretratamiento. 6. Si uno o dos pasos de intercambio inico producen una pureza similar a la de cromatografa de afinidad, debe escogerse el intercambio inico. 7. La filtracin en gel se puede utilizar como una etapa de separacin intermedia slo para la eliminacin de sales. 8. La filtracin por gel se puede utilizar como un paso de acabado slo para separar fracciones proteicas. Este tipo de reglas son utilizadas conjuntamente con otras an ms especficas, en el desarrollo de bases de conocimientos para sistemas expertos (Prokopakis y Asenjo, 1990). Aproximacin Heurstica para la Seleccin de un Proceso de Bioseparacin.- Se presenta en esta seccin una aproximacin heurstica de la sntesis de un proceso de bioseparacin de materiales biolgicos tpico (Petrides et a/, 1989). El primer paso en la sntesis de un proceso, consiste en desarrollar un diagrama de bloques de sus principales etapas. Posteriormente, se seleccionan para cada etapa las operaciones alternativas posibles. El desarrollo del diagrama de bloques est basado en la estructura general que se prqsenta en la Figura 2.4 1. Etapas de Recuperacin Primarias: Productos Intracelulares. En el desarrollo de un diagrama de bloques para un nuevo proceso, es necesario distinguir entre productos extracelulares e intracelulares. La recuperacin y purificacin de los productos extracelulares es comparativamente ms fcil de realizar que la de los productos intracelulares. En el caso de los productos intracelulares, las operaciones que se utilizan son las siguientes:

40


BtORREACTOR

Producto intracelular COSECHA DE CLULAS Centrifugacin Microfirtracin UKraftracin

Producto extraoelular REMCOON DE BIOMASA Filtracin al vaco Centrifugacin Microfiltracin Ultrafiltradn Filtracin en prensa Filtracin en cmara Rotacin

ROMPIMIENTO DE CLULAS Homogenizacin Molino d perlas Choque osmtico EXTRACCIN DELPROOUCTO Solventes orgnicos REMOCIN DE DESECHOS Centrifugacin Micfufilb acin Filtracin al vaco Filtracin por presin Polmero -s Ruidos supx Adsorcin Micelas inv Destilacin

RENATURAUZACION Solubilizacin Reoxidacin

CONCENTRACIN Ultrafiltradn Evaporacin Osmosis inversa Precipitacin Cristalizacin Extraccin Adsorcin Destilacin

Especificaciones de afta pureza

Especificaciones de baja pureza

PURIFICACIN FINAL Adsorcin Filtracin gei Eledrodialisis Diafiltracin Electroforesis

DESHIDRATAOON Secado por aspersin Secado por Ikrfilizaon Secado en lecho fluidizado

Figura 2.4: Diagrama de flujo de un proceso de bioseparacin. Fuente: Petrides et al, 1989.Reproducida con el permiso de American Institute of Chemical Engiixeers. Copyright 1989 AIChE. Todos los derechos reservados.

2.4. DISEO

41

(a) Cosecha de Clulas: El primer paso en un proceso para la recuperacin de productos intracelulares es la cosecha de clulas. Remover primero el lquido extracelular, est en completa concordancia con la primera regla heurstica: primero remover el componente ms abundante. Como se establece en la Figura 2.4, la centrifugacin y la filtracin por membrana son las nicas tcnicas usadas para cosecha de clulas a gran escala. La centrifugacin tiene ventajas para microorganismos grandes (dimetro mayor que 2 mieras y densidad mayor que 1030 kg/m3). Para microorganismos ms pequeos pueden usarse tcnicas de coagulacin para aumentar el tamao de la partcula que sedimentar. La filtracin por membrana tiene ventajas para cosechar clulas pequeas como la de E. coli. Cuando el flujo es mayor que 20 //m 2 h, la filtracin por membrana es la que produce mejores resultados. Otra ventaja de la filtracin por membrana es la recuperacin del producto. Con la centrifugacin siempre se pierden de 1 a 5 % de las clulas. Con filtracin por membrana se recuperan todas las clulas, siempre que no se presente rompimiento o lisis. (b) Rompimiento de Clulas: Con frecuencia el segundo paso en la obtencin de productos intracelulares es el rompimiento de la clula. El rompimiento de bacterias y levaduras es realizado por homogeneizadores a alta presin o con molinos de perlas. Para altas capacidades (varios m3/h) solamente se puede disponer de homogeneizadores. Para el rompimiento celular, tambin se utilizan mtodos qumicos. Dentro de stos se puede destacar el uso de la digestin enzimtica para liberar protena intracelular de bacterias gram-positivas, la disolucin lipdica para el caso de bacterias gram-negativas, as como el choque osmtico que puede utilizarse para liberar protenas del espacio periplsmico. (c) Remocin de Desechos Celulares: Una vez que la clula se rompe y el producto es liberado, los desechos son eliminados por medio de una o varias operaciones como: centrifugacin, microfiltracin o filtracin por presin.

42

CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO Cuando el producto es soluble, ste es recuperado en la fase ligera de una centrfuga o en el filtrado de un filtro. Las centrfugas son eficientes para la separacin de partculas grandes como los restos celulares, de tal manera que cuando se usen para este efecto, deben ser acompaadas de una operacin de filtrado para eliminar las partculas ms pequeas; debido a que stas pueden ocasionar problemas en etapas de bioseparacin posteriores, principalmente en las de cromatografa. Cuando se usan microfiltros para remover los desechos, se requiere posteriormente realizar una diafiltracin. Cuando el producto es insoluble (por ejemplo los cuerpos de inclusin), debe ser separado primero de otras partculas y posteriormente tratado para que adquiera su forma activa. Este es un problema comn de muchas protenas eucariticas producidas por microorganismos procariotes, por ejemplo la hormona de crecimiento producida por E. coli. Las protenas recombinantes forman cuerpos de inclusin dentro de la clula husped. Estos pueden ser separados de los restos celulares con una centrfuga de discos. La purificacin es realizada por resuspensin y recentrifugacin de la fase pesada en 2 o 3 pasos. Posteriormente se pueden usar detergentes para remover otros contaminantes. La separacin del producto de los desechos puede ser llevada a cabo tambin por extraccin con solventes orgnicos o con algunas soluciones de polmeros. Los sistemas de dos fases acuosas han sido aplicados para la recuperacin de protenas. La separacin del producto de los desechos y su concentracin simultnea puede ser alcanzada utilizando tcnicas de extraccin-adsorcin utilizando ya sea adsorbentes de afinidad o de intercambio inico. En este proceso, las clulas rotas y el producto son mezclados en un tanque agitado con un adsorbente. Posteriormente sigue un paso de lavado en el cual muchos de los desechos y contaminantes son eliminados.

2.4. DISEO Etapas de Recuperacin Primaria: Productos Extracelulares.

43

(a) Eliminacin de Biomasa: La eliminacin de biomasa es el primer paso que se realiza en un proceso de separacin cuando el producto es extracelular. Este paso se ajusta a la segunda regla heurstica. En esta operacin los equipos ms empleados son: la centrfuga decantadora, los filtros prensa y los filtros con membranas. Cada uno de ellos tiene ventajas y desventajas segn el tipo de producto y tipo de clula, haciendo de la seleccin un problema difcil. No hay una alternativa nica para todos los productos. 2. Operaciones de Alta Resolucin. Una vez realizada la separacin primaria del producto ya sea ste intracelular o extracelular, la purificacin es llevada a cabo mediante operaciones de alta resolucin. Si el producto es soluble, primero es necesario concentrarlo. Si el producto es insoluble y se encuentra desnaturalizado, entonces primero se renaturaliza y despus se purifica. (a) Concentracin. Despus de una primera clarificacin del caldo obtenido del biorreactor o una vez rota la clula, el producto se encuentra diluido; para su concentracin las operaciones alternativas son: Ultrafiltracin, Extraccin, Osmosis inversa, Evaporacin, Precipitacin y Destilacin. i. Ultrafiltracin: Es una operacin usada ampliamente para la concentracin de protenas. La presin de operacin tpica vara entre 0.2 y 0.5 MPa y el flujo promedio entre 20 y 50 l/m2 - h. ii. Extraccin: La extraccin con solventes es una operacin ampliamente usada en la concentracin de productos biotecnolgicos, particularmente en la obtencin de antibiticos. Se requiere que el coeficiente de particin del sistema sea alto para poder llevar a cabo la concentracin del producto en el menor nmero de etapas de contacto.

44

CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESOiii. Osmosis Inversa: Se usan unidades con membranas de tamao de poro pequeo para la concentracin de soluciones de productos con bajo peso molecular. Operan a altas presiones (4 a 6 MPa) y a bajas temperaturas. iv. Evaporacin: Se utilizan evaporadores de pelculas delgadas los cuales operan a bajas temperaturas (4050(7) al vaco. Estas unidades compiten en el mercado con la ultrafiltracin y la osmosis inversa para la concentracin de compuestos tanto de alto como de bajo peso molecular. v. Precipitacin: Es una operacin usada para concentracin y purificacin. Comnmente se usan sales, solventes y polmeros para la precipitacin selectiva de compuestos de inters. La precipitacin es usada para remover contaminantes. vi. Destilacin: En los procesos de bioseparacin esta operacin se utiliza generalmente para la recuperacin de solventes orgnicos. (b) Renaturalizacin. Las protenas eucariticas producidas por organismos procariticos, frecuentemente forman cuerpos de inclusin en la clula recombinante. Estos cuerpos de inclusin pueden ser solubilizados mediante el uso de sales y agentes reductores. Despus que la protena desnaturalizada es solubilizada, se eliminan los solubilizantes utilizando cromatografa o diafiltracin. Al final se obtiene una solucin de protena diluida. 3. Purificacin. Las operaciones para la purificacin final dependen fuertemente de la pureza requerida del producto, distinguindose los productos farmacuticos por su alta pureza en comparacin a la de los productos industriales. Para productos de pureza relativamente baja como las enzimas para detergentes, la operacin de purificacin final consiste slo en la eliminacin del solvente. Para productos de alta pureza, las operaciones de purificacin finales son normalmente la cromatografa y la ultrafiltracin.

2.4. DISEO

45

(a) Cromatografa: Es una operacin que se realiza al final de un proceso, en concordancia con la regla heurstica "hacer las separaciones ms difciles y caras al final". Existen diferentes tipos de cromatografa como la de intercambio inico, la de filtracin por gel y la de afinidad, entre otras. Normalmente se requiere de una secuencia de varias operaciones cromatogrficas para alcanzar la pureza deseada del producto. En la seleccin de la secuencia de estas operaciones debe observarse la cuarta regla heurstica: "seleccionar el proceso que permita aprovechar al mximo las diferencias entre las propiedades del producto y los contaminantes. i. Cromatografa de Filtracin en Gel: Este tipo de cromatografa separa molculas en base a su tamao molecular; tiene dos aplicaciones principales: remocin de pequeas molculas de las protenas y remocin de protenas contaminantes de la protena producto. En el fraccionamiento de protenas, la filtracin por gel es lenta comparada con otras tcnicas cromatogrficas. ii. Cromatografa de Intercambio Inico: Esta separacin se basa en la diferencia de la carga molecular de las biomolculas. Puesto que el la carga depende del pH y la fuerza inica, cualquier anin o catin en un soporte puede ser usado para realizar la separacin. En la prctica sin embargo, la seleccin normalmente est determinada por el pH al cual es estable el producto que se desea purificar. iii. Cromatografa de Afinidad: Las separaciones por afinidad o reconocimiento molecular, estn basadas en las interacciones especficas entre biomolculas. Es una operacin apropiada en cualquier etapa de la purificacin del producto y particularmente lo es para el manejo de grandes volmenes de material con baja concentracin de producto y gran cantidad de contaminantes. Es una operacin altamente eficiente ( ms del 90 % ). Su limitante es el alto costo de los materiales (ligandos) involucrados.

464. Acabado.


Las operaciones de acabado comprenden aquellas que se realizan para la esterilizacin y estabilizacin del producto. Los microfiltros de membrana son utilizados para esterilizar soluciones biofarmacuticas, removiendo cualquier contaminacin bacteriana. Una limitante de estas membranas es la incapacidad para la remocin de pirgenos y virus. Para minimizar el riesgo de contaminacin el agua utilizada deber estar libre de pirgenos. Para incrementar la vida del producto se utilizan como agentes estabilizadores algunas sales como sulfato de amonio, cloruro de calcio o cloruro de sodio. Algunos productos son ms estables como slidos. Las tcnicas ms comunes de deshidratacin para productos inestables son la liofilizacin y la cristalizacin. Mtodo Algortmico El uso de algoritmos matemticos para desarrollar la sntesis de un proceso, es en teora el nico camino vlido para desarrollar un proceso ptimo. Esto se basa en el hecho de que todas las secuencias posibles para el procesos pueden considerarse rigurosamente. El desarrollo de estos algoritmos se lleva a cabo mediante tcnicas de programacin matemtica. Actualmente la lnea principal de investigacin en tcnicas de programacin matemtica, aplicadas a la optimizacin estructural de un proceso, se basa en el uso de la programacin lineal (o no lineal) entera mixta (MILP o MINLP de sus siglas en ingls). La idea principal de estas tcnicas es la formulacin de una superestructura que consiste en un diagrama de flujo que contiene todas las posibles alternativas de diseo. A cada operacin unitaria de la superestructura se le asocia una variable binaria (una variable que slo puede tomar los valores O 1) y se construye una formulacin ptima. A continuacin se presenta una descripcin de estas tcnicas para una situacin particular. Generalmente el problema consiste en separar una mezcla que tiene TV componentes: /4, B, (7,. . . y esta separacin puede ser realizada mediante M mtodos de separacin. La sntesis consiste en obtener la

2.4. DISEO

47

secuencia ptima de separacin utilizando el costo total como funcin objetivo. Para desarrollar este problema se hacen las siguientes consideraciones: 1. Se parte de una mezcla ternaria (ABC) y como resultado de una separacin o varias separaciones de la mezcla se obtienen los subgrupos: 1. (ABC), 2. (AB), 3. (BC\ 4. (AC), 5. (A), 6. (), 7. (C) 2. Los mtodos de separacin son: 1. destilacin y 2. extraccin 3. Los componentes en cualquier mezcla estn colocados en orden descendente con respecto a la propiedad caracterstica en la que se basa el mtodo de separacin. En el caso de la destilacin el orden de los compuestos de la mezcla es (ABC), lo que significa que el compuesto A tiene mayor volatilidad que el compuesto C. De esta manera pueden tener lugar dos separaciones en la columna de destilacin: (A/BC) o (ABIC). En el caso de la extraccin el orden en el cual se encuentran los componentes de la mezcla es (BAC), lo que significa que el componente B tiene mayor solubilidad que el componente C. En el extractor las separaciones que tienen lugar son: (B/AC) o (BA/C). 4. La funcin primaria de una etapa de separacin es separar los dos componentes adyacentes. Se denominan fase ligera y fase pesada a los componentes adyacentes entre los cuales tiene lugar la separacin. En la Figura 2.5. se muestra a superestructura que origina el problema de separacin de la mezcla ternaria considerando slo los mtodos de separacin alternativos: destilacin y extraccin. En la parte superior de dicha figura se muestra el proceso utilizando como operacin de separacin la destilacin y en la parte inferior se muestra la separacin por extraccin. La destilacin o la extraccin pueden ser usadas en cualquier nivel de la separacin.

48


(ABC)]->(AB/C) DESTILAaON EXTRACCIN-H (B/A) -H (A/B)

-4(BAq

-J (A/C)

Figura 2.5: Superestructura de todas las secuencias de separacin alternativas para una mezcla ternaria. Fuente: Prokopakis y Asenjo, 1990.Reproducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1990 . Todos los derechos reservados.

2.4. DISEO

49

Para sistematizar el anlisis se emplean las convenciones siguientes: 1. Se definen los siguientes ndices: i: subgrupo j: mtodo de separacin empleado k: fase ligera obtenida en la separacin 2. Se introduce una variable binaria 3/,,jk para cada operacin. Por ejemplo la variable binaria 3/1,1,1 se asocia a la separacin que se realiza en el grupo ABC ', por medio de la destilacin y cuya fase ligera es A. 3. Se define la variable costo C,,jt, para cada operacin. Esta variable es funcin de parmetros operacionales como : temperatura (T), presin (P) y flujo (F). 4. Se establece la funcin objetivo que permite la optimizacin del proceso, para la obtencin de la secuencia de separacin de costo mnimo. Esta funcin puede puede formularse como:

i

3

k

de tal manera que el costo total CT sea mnimo. La funcin objetivo est sujeta a las siguientes restricciones: 1. Una y solamente una separacin que involucre al subgrupo con N componentes (mezcla original) de,be existir en la secuencia.MN-l

y^k = lj=l k=\

Para = 1, . 2" - 1

(2.2)

2. Para cualquier subgrupo, cuando mucho una separacin que involucre a ese subgrupo puede existir en la secuencia. Cualquier subgrupo que haya sido procesado no puede aparecer nuevamente en otra separacin.

50

CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESOM Ni-1

Z/ZXfc = 1 P s v.9^22

-> ^1 := _> ^^ m^m 5: 1 = 0.4A i9^2 3 |Q4 2 5^

O.1

1( 323

6^22

9l(J2

9

t

2

9 ^2

Nmero d Reynolds

Re = Ou,, />,: Densidad del fluido. [M/L3]. \\ Viscosidad del fluido. [M/L t]. VQO'. Velocidad terminal de la esfera. [L/t]. Es importante hacer notar que si la partcula parte del reposo en el proceso de sedimentacin, conforme la velocidad de la partcula se incrementa la fuerza de arrastre se incrementa. Al alcanzar el equilibrio de fuerzas la partcula se mueve a la velocidad constante VQQ (velocidad terminal).

4.2. FUNDAMENTOS DE LA CENTRIFUGACIN

115

La ecuacin (4.1) puede ser modificada para presentarse como una expresin de la Ley de Stokes, de la siguiente manera: (pp - PL)

(4.2)

O

La velocidad de sedimentacin de una partcula de acuerdo a la ecuacin (4.2) es la siguiente:

" =donde: A/> = pp pL Se puede expresar la velocidad de sedimentacin de la partcula en dos casos lmites de inters: - Sedimentacin por accin de la gravedad. - Sedimentacin por accin de una fuerza centrfuga.

4.2.2

Sedimentacin por Accin de la Gravedad

En varios procesos de separacin slido-lquido la fuerza impulsora de la sedimentacin es slo la de la gravedad. La velocidad de sedimentacin por gravedad de una sustancia, proporciona informacin bsica necesaria para el diseo de cualquiera de los procesos de sedimentacin. De acuerdo a la Ley de Stokes si la aceleracin de la sedimentacin es la de la gravedad, la velocidad de sedimentacin que se obtiene por medio de la ecuacin (4.3) es: ((A 4) (4 A\

-

donde: a = g: Aceleracin de la gravedad. [L/t2]. vg: Velocidad terminal en un campo gravitacional. [L/t].

116

CAPTULO 4.

CENTRIFUGACIN

4.2.3

Sedimentacin Centrfuga

En las separaciones centrfugas slido-lquido la velocidad de sedimentacin es mayor que la sedimentacin libre o gravitacional, debido a que los equipos al girar producen una mayor aceleracin de las partculas (Brunner y Hemfort, 1988). Bajo estas condiciones la velocidad de sedimentacin derivada de la ecuacin (4.3) es:2

r

donde: a =w2r: Aceleracin centrfuga. [L/t2]. u>: Velocidad de rotacin en radianes, ["1]. r: Distancia radial del eje de rotacin a la partcula. [L]. Varias aplicaciones importantes pueden obtenerse de los principios inherentes a las ecuaciones (4.4) y (4.5), a continuacin se presentan algunas de ellas: El dimetro aparente de las bacterias es del orden de diez veces menor que el de las levaduras, por lo que su velocidad de sedimentacin es cien veces menor, ya que sta es proporcional al cuadrado del dimetro de la partcula. Las clulas contienen ms del 70 % de agua por lo que su densidad es muy semejante a la de los caldos, por lo tanto el parmetro A/9 puede ser muy bajo. Algunos caldos biolgicos son muy viscosos propiedad que dificulta la sedimentacin. La velocidad de sedimentacin puede ser incrementada en un equipo centrfugo aumentando la velocidad de rotacin o la distancia de sedimentacin (dimetro de la centrfuga).


117

Para obtener una expresin para flujo no laminar la ecuacin (4.2) puede ser expresada como:24

odonde:

=

AKf

A: rea caracterstica. [L2]. K: Energa por unidad de volumen. [M/Lt2]. f : Factor de friccin. [Adimensional.] En la Figura 4.1 tambin se presentan correlaciones de factores de friccin para casos diferentes a la Ley de Stokes. Ejemplo 4.1.- Separacin centrfuga diferencial. El principio de separacin por centrifugacin diferencial se basa en las diferentes velocidades de sedimentacin de las partculas.En el caso de hornogeneizados biolgicos las diferentes partculas celulares suelen ser separadas por centrifugacin diferencial. Estimar el tiempo de sedimentacin relativo de una partcula celular de dimetro 5 /zm (ncleo) con respecto al de una de dimetro de 1 fim (mitocondria), suponiendo que ambas tienen la misma densidad y estn sujetas al mismo campo centrfugo1 en una centrfuga de tubos (Figura 4.2) los cuales giran perpendicularmente al eje . Solucin: De acuerdo a la ecuacin (4.5) y a la geometra del sistema, la velocidad de sedimentacin est dada por:dr v,,, = = dt

18/i

118

CAPTULO 4.

CENTRIFUGACIN

sFuerza Centrfuga

Figura 4.2: Centrifugacin diferencial. Fuente: Bailey y Ollis, 1986Reproducida con el permiso de Me Graw Hill Inc. Copyright 1986. Todos los derechos reservados.

La expresin anterior puede ser utilizada para el clculo del tiempo de sedimentacin integrando entre los lmites:

una vez realizada la integracin se obtiene la expresin siguiente:

t=

In

Ri

Aplicando la expresin anterior a cada partcula, (al ncleo N y a la mitoconda M) se pueden obtener las siguientes proporciones:NM

N

=25


119

donde tjy es el tiempo que tarda la partcula N en avanzar de R\ a R< 0-01 lr. >< h f (10 x 10- ) cm' x (1.05 - 1) ^3 x = 2471 s4 2

18

4.2.4

Factor G

En la caracterizacin y escalamiento de centrfugas frecuentemente se emplea el factor G, que es una medida relativa de la velocidad de sedimentacin de una partcula en un campo centrfugo con respecto a su velocidad de sedimentacin en el campo gravitacional. De acuerdo a lo anterior mediante las ecuaciones (4.4) y (4.5) se obtiene:

120

CAPTULO 4.

CENTRIFUGACIN

(4.6)

G puede ser referida a un radio caracterstico el cual generalmente es el radio exterior del campo centrfugo. Esto permite desarrollar expresiones prcticas para estimar la G como la siguiente: G = 5.6 x W~7N2D donde N est en rpm, el dimetro del tazn de la centrfuga (o punto de inters) D en mm y G es adimensional.

4.3

Equipo de Centrifugacin

La filtracin y la sedimentacin centrfuga constituyen los principios bsicos de los principales equipos de centrifugacin que se emplean para separar lquidos, o lquidos de slidos (Svarousky, 1979). La principal clasificacin de los equipos de centrifugacin se basa en el diseo de su tazn o tina, y en la forma como se descargan de los slidos sedimentados (Figura 4.3). En esta seccin se presentan los principales equipos de centrifugacin existentes de acuerdo a su clasificacin, en dos grupos: Equipos de Centrifugacin-Filtracin. Equipos de Sedimentacin Centfuga: Centrfugas tubulares, de cmara mltiple, de tazn slido, decantadoras y de discos.

4.3.1

Equipos de Filtracin-Centrfuga

Los equipos de filtracin centrfuga constan de una tina o canasta perforada la cual est recubierta con un medio filtrante (una tela o membrana). La suspensin de slidos es alimentada a la tina que al girar a altas velocidades provoca el depsito de slidos sobre el medio filtrante y la salida de lquido claro. Estos equipos funcionan como un filtro, slo que la fuerza impulsora del filtrado es la centrfuga y no una diferencia de presin (Figura 4.4).

4.3. EQUIPO DE CENTRIFUGACIN

121

Tubular

Cmara mltiple

Sedimentadoras

Tazn slido

Decantadoras

Discos Centrfugas

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