Unidad 4.- Bioseparaciones.

8/16/2019 Unidad 4.- Bioseparaciones.

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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE APATZINGÁN.

INGENIERÍA BIOQUÍMICA.

TRABAJO No. 4:

“UNIDAD IV: BIOSEPARACIONES”.

OPERACIONES UNITARIAS I.

PROFESOR.I.Q. JULIO CÉSAR PAZ RAMÍREZ.

PRESENTA: No. de Control:

MORÁN AGUILAR XIOMARA. 13020109

6° SEMESTRE.

Apatzingán, Michoacán. Fecha: 31/May/2016


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INTRODUCCIÓN.

La comercialización de nuevos productos obtenidos a través del empleo de la

“biotecnología” requiere un coordinado acople de operaciones unitarias a fin de

desarrollar un proceso eficiente. El objetivo general de este proceso es convertir

materia prima relativamente de bajo costo en productos de mayor valor comercial.

En este sentido la biotecnología se puede definir como “la colección de procesos

industriales que involucran el uso de sistemas biológicos”. El punto central de este

proceso es el biorreactor. En esta unidad de operación se utilizan catalizadores

biológicos (microorganismos, células vegetales o animales, enzimas, virus, etc.)

para la producción de sustancias, alimentos, agentes terapéuticos, etc. de interés.No obstante, el biorreactor no existe aislado, sino que la eficiencia y éxito de la

operación depende de un adecuado “upstream processing” (procesado previo) que

incluye desde el diseño del medio de cultivo hasta la esterilización del mismo. Por

otro lado, la recuperación del producto final requiere una serie de operaciones

referidas colectivamente como “downstream processing” (SP). Estas operaciones

comprenden todos los tratamientos que requiere el cultivo, una vez finalizado, para

la obtención del producto en las condiciones de pureza y actividad deseadas

(Universidad Nacional de Quilmes, 2005).

Los productos que resultan de los proceso biotecnológicos pueden ser muy

variados. La variedad estará dada por:

a).- La naturaleza química del mismo: sustancias simples (alcoholes, ácidos

orgánicos); proteínas, sustancias con actividad terapéutica (antibióticos,

hormonas) etc. (Universidad Nacional de Quilmes, 2005).

b).- El volumen de producción y la concentración del producto en el caldo de

fermentación: los llamados “commodities” (etanol, ácido cítrico, etc.) se obtienen

de a cientos o miles de ton/año y en altas concentraciones en la fermentación.

Mientras que los agentes terapéuticos de última generación (hormonas, factores

de coagulación, etc.) se producen sólo algunos kg/año y su concentración en la


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producción es baja. Esto determina la escala de producción (Universidad Nacional

de Quilmes, 2005).

c).- Los requerimientos de pureza del producto final. Las moléculas a ser

utilizadas en salud humana requerirán una pureza final muy diferente a lasenzimas a ser utilizadas en los polvos para lavar o de un acidulante para alimentos

(Universidad Nacional de Quilmes, 2005).

d).- Dejar el proceso más complejo (y por lo general más caro) para el final. Se

usan estos métodos cuando tenemos la sustancia a purificar concentrada y pre-

purificada (Universidad Nacional de Quilmes, 2005).

Biofiltros. También denominados filtros biológicos son dispositivos que eliminan una

amplia gama de compuestos contaminantes desde una corriente de fluido (aire o

agua) mediante un proceso biológico (Naranjo, 2012).

Funcionamiento general:

El aire es aspirado cerca del foco de emanación y habitualmente guiado a una

cámara de acondicionamiento. Aquí es saturado de humedad y luego guiado a un

lecho de biomasa fijada. Las sustancias contaminantes se absorben a la

biopelícula de biomasa formada sobre el relleno y aquí posteriormente son

digeridos por microorganismos. En el proceso de digestión y metabolización son

transformados en compuestos que ya no huelen (Naranjo, 2012):

Los compuestos orgánicos son degradados.

Así la superficie del relleno es siempre regenerada y no se satura. En principio

se trata de una oxidación de los contaminantes a baja temperatura y los

microorganismos pueden entenderse como catalizadores de esta reacción.

Los compuestos no volátiles (como los ácidos formados) son arrastrados por el

agua de lluvia o el agua de regadío aplicado sobre la biomasa.

En algunos casos, debido a la presencia de ácidos el pH de los lixiviados puede


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bajar a 1 o 2. Aun así, lo normal es que el relleno orgánico tenga una alcalinidad

suficiente como para neutralizar el pH de los lixiviados (Naranjo, 2012).

4.1.- FILTRACIÓN POR MEMBRANAS.


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La membrana filtra fundamentalmente en la superficie de la misma.

Partículas mayores que la porosidad nominal permanecen sobre el

filtro, mientras que las partículas más pequeñas pasan el filtro, a no ser que otras

interacciones en el filtro retengan éstas en la matrizde la misma. La filtración es claramente más lenta que con filtros de profundidad

(Naranjo, 2012).

La ultrafiltración consiste en la separación por una membrana en donde se

aplica una alta presión (Naranjo, 2012).

Se realiza para separar partículas de 0.01 a 0.1 micrómetros.

Realiza una remoción del 90%. Presenta una reducción de costos (Naranjo, 2012).

Parámetros para la ultrafiltración.

Separación en donde se remueven las partículas coloidales y dispersas de

un líquido al hacerlo atravesar por una membrana aplicando alta presión. Permite

separar moléculas de alto peso molecular , como agua, sales, aminoácidos,

proteínas, etc. (Naranjo, 2012).

Remueve partículas de 0,001-0,1 micrómetros.

Remueve más del 90% de los contaminantes.

Reduce costo de disposición y/o reciclado hasta el 10%.

Requiere poca energía (Naranjo, 2012).


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Tabla No. 1.- Separación por membranas.

Fuente: (Mireia, 2009).

4.1.1.- CARACTERIZACIÓN DE MEMBRANAS.

Las membranas son derivados de la celulosa (acetatos y nitratos). Las

fibras sintéticas son de poliamidas, polisulfonas, etc. y sus matrices poliméricas

densas están compuestas por una mezcla de polímeros, quitosano, entre otros

(Mireia, 2009).

Los polímeros termoplásticos están constituidos por polipropileno, difluoruro

de polivinilideno, politetrafluoruro de etileno, etc. (Mireia, 2009).


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Figura No. 1.-

Membrana de acetato de

celulosa (Mireia, 2009).

Figura No. 2.-

Membrana de poliamida

(Mireia, 2009).

Figura No. 3.- Membrana

de politetrafluoroetileno

(Mireia, 2009).

Figura No. 4.- Membrana

de polietersulfona (Mireia,

2009).


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Tabla No. 2.- Características de las membranas.


4.1.2.- DISEÑO DE MEMBRANAS.

Tabla No. 3.- Parámetros de diseño.



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El diseño se basa en laminar el caudal punta de 13,680 m3/d en el

homogeneizador y tratar el caudal máximo de 8,550 m3/d. El caudal será

bombeado desde el homogeneizador al bioreactor y de éste mediante bombas

enviar el caudal necesario hasta los tanques de membranas para el tratamiento de

filtrado y el caudal necesario para mantener la concentración de sólidos óptima

dentro de los tanques y recircular el fango activo hasta el recinto biológico previo

al sistema de membranas de ultrafiltración (UPC, 2007).

Una vez alcanzado el máximo nivel de concentración de sólidos en el

reactor será necesaria la purga de fangos hasta el espesador de fangos, dispuesto

en planta depuradora (UPC, 2007).

Tabla No. 4.- Parámetros físicos.

Fuente: (UPC, 2007).


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Tabla No. 5.- Diseño Preliminar. Valores.


El diseño se basa en la utilización del bioreactor existente, después demodificar la infraestructura, para las zonas aerobias y las anóxicas. Construyendo

nuevos tanques de acero prefabricado alineados para membranas en el espacio

entre el bioreactor y el decantador secundario (UPC, 2007).


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Tabla No. 6.- Características carretes de membranas.


El diseño se basa en poner un tren fuera de servicio para la limpieza u otros

servicios de mantenimiento durante el caudal medio diario, durante el caudal

máximo diario un tren puede ser puesto fuera de servicio durante un período de

tiempo < 24 horas al día (UPC, 2007).


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Figura No. 5.- Membranas enrolladas en espiral (Mireia, 2009).

Figura No. 6.- Fibras huecas (Mireia, 2009).


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4.1.3.- SELECCIÓN DE MEMBRANAS.

Cuando los ingenieros de proceso necesitan separar, clarificar o fraccionar

corrientes de proceso, y cuando exigen un rendimiento confiable y repetible, lossistemas de filtración por membranas se están convirtiendo, cada vez con más

frecuencia, en su primera elección (Pearson, 2016).

En su nivel más básico, la filtración por membranas implica separar un

único flujo en dos corrientes, una más concentrada que la otra, utilizando presión

para que los materiales atraviesen, en forma selectiva, una barrera física

semipermeable: una membrana. Luego, las corrientes separadas pueden pasar

por un procesamiento adicional o, en el caso de una corriente de desechos, ser

desviadas a una salida adecuada (Pearson, 2016).

Con la capacidad de separar partículas de las especies disueltas y separar

las especies disueltas en sí, un sistema de membranas puede utilizarse para

producir un producto final más concentrado o purificado. Con la selección correcta

de las membranas, el proceso de filtración puede aislar especies disueltas de

tamaños específicos mientras que permite que otros componentes disueltos

traspasen la membrana (Pearson, 2016).

Uno de los factores de decisión principales utilizados para elegir la

membrana adecuada es la naturaleza del líquido de los procesos. Conocer el

contenido de los sólidos disueltos, el peso molecular de las especies disueltas y la

naturaleza y la carga de cualquier material en suspensión orientará a los

ingenieros hacia la selección y la geometría correctas de las membranas. El pH y

la temperatura de la corriente de proceso entrante también son factoresimportantes al momento de tomar la decisión final (Pearson, 2016).

Criterios de selección.

1.- Volumen de líquido a filtrar: laboratorio o industrial.


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Figura No. 7.- Proceso de

microfiltración (Valencia, 2012).

2.- Fuerza impulsora: gravedad, presión, vacío, fuerzo centrifuga.

3.- Grado de separación: tamaño de poro.

4. Producto que se selecciona: filtrado o torta.

5.- Resistencia térmica: el filtro debe esterilizarse.

6. El filtro debe ser compatible con el fluido: Tablas de compatibilidad entre

filtros y disolventes.

7.- Régimen de trabajo: continuo o discontinuo (Fernández, 2008).

4.1.4.- MICROFILTRACIÓN.

La filtración mediante membranas sigue el principio de la separación de

partículas basada en el tamaño de los poros y en su distribución. Las membranas

de microfiltración tienen tamaños de poro que varían de 0.075 micrones a 3

micrones. La microfiltración es un proceso de filtrado donde se opera con

membranas semi-permeables de baja presión. El objetivo de este proceso es la

eliminación de sólidos en suspensión pero no retiene el paso de sales disueltas y

macromoléculas. La microfiltración no altera las propiedades químicas de la

solución (Valencia, 2012).

Las membranas empleadas en este proceso son de estructura simétrica y

microporosa con tamaño de poro entre 0.1

µm a 10 µm. La diferencia de presión varía

entre 0.1 y 2 atm. Esta operación unitaria

es utilizada para la remoción de partículas,

bacterias, coloides y las macromóleculas

orgánicas de una solución acuosa en lasplantas de tratamiento de aguas (Valencia,

2012).


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En la microfiltración se alcanzan grandes velocidades de fluido en flujo

cruzado a través de la superficie del filtro mientras que la velocidad perpendicular

a la superficie es relativamente pequeña. De esta manera se evita la formación de

la torta filtrante y los problemas debido a la elevada resistencia de la torta. Este

tipo de filtración es una alternativa debido que las levaduras y bacterias son

mucho más difíciles de tratar por su pequeño tamaño. Por ejemplo Los micelios

fúngicos se pueden filtrar relativamente bien por un proceso de filtración debido a

que la torta filtrante micelial tiene una porosidad superficial grande (Doran, 1998,

citado por Valencia, 2012).

Una parte de la contaminación viral es atrapada en este proceso ya que, a

pesar de que los virus son de menor tamaño que los poros de la membrana, éstos

pueden acoplarse a las bacterias y por tanto ser eliminados (Valencia, 2012).

La microfiltración puede ser aplicada a muchos tratamientos de agua

cuando se necesita retirar de un líquido las partículas de un diámetro superior a

0.1 mm (Valencia, 2012).

Figura No. 8.- Microfiltración y Ultrafiltración (Valencia, 2012).

La microfiltración es básicamente lo mismo solo que el tamaño del poro es

más pequeño (Valencia, 2012).


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Tipos de membranas.

Las membranas están hechas de materiales como cerámica, polímeros y

metales sinterizados. Mientras las cerámicas y los metales se usan generalmente

en aplicaciones industriales, las membranas poliméricas se están convirtiendo enuna herramienta común para el tratamiento de agua potable y aplicaciones

municipales (Valencia, 2012).

Membranas a presión.

Las primeras membranas comercialmente disponibles estaban diseñadas

como láminas planas enrolladas para formar membranas en espiral. Estas

membranas no podían tolerar sólidos y requerían altas presiones para operar. Elelevado costo operativo de estas membranas dio lugar a que fueran poco usadas

para la microfiltración en aplicaciones municipales. Las membranas enrolladas en

espiral generalmente se usan en la nanofiltración y ósmosis inversa, y por lo

general se usan en la desalinización de agua salobre y agua de mar para la

producción de agua potable (Valencia, 2012).

Las membranas de fibra hueca se desarrollaron en la última década como

un medio para abordar las necesidades de la microfiltración con bajos costos deconsumo energético. Ellas rápidamente se convirtieron en el estándar de la

industria y varias empresas empezaron a elaborar estas membranas de gran

superficie para aplicarlas al área de agua potable (Valencia, 2012).

Existen dos tipos de membranas de fibra hueca operadas a presión:

Membranas d e adentro hacia afuera , en las que el afluente ingresa al

interior del lumen de la membrana y el agua limpia se obtiene al pasar del interior

de la membrana al exterior (Valencia, 2012).

Membranas de afuera hacia adentro , en las que el afluente viene por

fuera de la membrana y el agua limpia se obtiene al pasar del exterior de la

membrana al interior (lumen). (Valencia, 2012).


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Figura No. 9.- Modalidades de filtración – Membranas de fibra hueca

(Valencia, 2012).

Todas las membranas de fibra hueca a presión están instaladas dentro de

recipientes presurizados que sirven para aplicar la presión necesaria para la

transferencia adecuada del fluido. La presión de operación típica de estas

membranas es de 15 a 30 psi (Valencia, 2012).

Membrana de fibra hueca operada al vacío – Membrana ZeeWeedä.

El proceso de tratamiento de agua potable basado en la membrana

ZeeWeedä es un proceso revolucionario que usa poca energía y consta de

módulos de microfiltración con membranas de fibra hueca de afuera hacia adentro

que se sumergen en el agua de alimentación. Este microfiltro tiene un tamaño de

poro nominal de 0.085 micrones y un tamaño de poro absoluto de 0.2 micrones, lo

cual asegura que no pasará al agua tratada ninguna partícula mayor a 0.2

micrones (Valencia, 2012).


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Las membranas operan bajo una succión pequeña creada dentro de las

fibras huecas por una bomba de filtración. El agua tratada pasa a través de la

membrana, entra a las fibras huecas y es bombeada para su distribución. Se

introduce un flujo de aire en el fondo del módulo de la membrana para crear una

turbulencia que frota y limpia el exterior de las fibras de la membrana y les permite

funcionar a una tasa de flujo alta. Este aire también oxida el hierro y otros

compuestos orgánicos, con lo que se obtiene agua de mejor calidad que la

suministrada por sólo microfiltración (Valencia, 2012).

Figura No. 10.- Concepto operativo de una membrana de afuera hacia

adentro sumergida sin casco (Valencia, 2012).

Aplicaciones. Esterilización por frío de bebidas y productos farmacéuticos.

Aclaración de zumos de frutas, vinos y cerveza.

Separación de bacterias del agua (tratamiento biológico de aguas

residuales).


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Tratamiento de efluentes.

Separación de emulsiones de agua y aceite.

Pre-tratamiento del agua para nanofiltración y ósmosis inversa.

Separación sólido-líquido para farmacias e industrias alimentarias

(Valencia, 2012).

Microfiltración en la industria alimenticia.

Microfiltración como protección de huevos y leche líquida. Usualmente para su

control se usa la pasteurización, proceso térmico que elimina los agentes

patógenos sensibles al calor pero algunos microorganismos resistentes a este

factor pueden sobrevivir. El consumidor puede evitar la infección si aplica una

adecuada cocción de los huevos antes de consumirlos, la microfiltración ofrece

una nueva posibilidad para compensar las posibles deficiencias de la

pasteurización (Valencia, 2012).

En la industria láctea, genera una reducción bacteriana significativa y al operar

a bajas temperaturas, posibilitan la obtención de productos con excelentes

características organolépticas y una calidad bacteriológica satisfactoria (Valencia,

2012).

4.1.5.- NANOFILTRACIÓN.

Es un proceso de filtración por membranas que se da por la aplicación de

presión; donde solutos de bajo peso molecular (1000 daltons) son retenidos,

mientras que algunas sales pueden pasar, total o parcialmente, a través de la

membrana con el filtrado (Abadiano, 2013).

El principio de la filtración se basa en la difusión de ciertas soluciones

iónicas (como sodio y cloruro), iones monovalentes, divalentes y multivalentes

(Abadiano, 2013).


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La presión operativa es más baja en la Nanofiltración que en la Ósmosis

Inversa (Abadiano, 2013).

Figura No. 11.- Tipo de filtración y su diámetro de partículas(Abadiano, 2013).

Las membranas orgánicas presentan una resistencia adecuada al pH entre

pH 2 y pH 11, en la mayoría de los casos; sin embargo, su resistencia a la

temperatura es por el momento inferior a los 100 ˚C, y estas membranas todavía

son demasiado sensibles a los solventes orgánicos y a algunas moléculas como

los surfactantes. Estos son los factores que limitan actualmente el desarrollo de la

nanofiltración en la industria química o la petroquímica (Abadiano, 2013).


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Tabla No.7.- Características de utilización de las principales

membranas de nanofiltración.

Fuente: (Abadiano, 2013).

Aplicaciones.

Industria Láctea: Reduce costos de transportación así como derecuperación de lactosa.

Eliminación de nitratos y sólidos de proteínas de suero.

Industria de Alimentos y Bebidas: Desalinización de gelatina para mejores

propiedades de batido y para mejorar la claridad de color.

Industria Farmacéutica: Incrementa el valor de los productos farmacéuticos

al obtenerlos más purificados.

Industria: Desalinización de tintes para un producto de valor más alto.

Reciclaje de aguas residuales en lavanderías.


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Agroindustria: La eliminación de pesticidas de las aguas subterráneas

(Abadiano, 2013).

4.1.6.- ÓSMOSIS INVERSA.

Ósmosis. El fenómeno de la Ósmosis está basado en la búsqueda del

equilibrio. Cuando se ponen en contacto dos fluidos con diferentes

concentraciones de sólidos disueltos se mezclarán hasta que la concentración sea

uniforme. Si estos fluidos están separados por una membrana permeable (la cual

permite el paso a su través de uno de los fluidos), el fluido que se moverá a través

de la membrana será el de menor concentración de tal forma que pasa al fluido de

mayor concentración (Binnie et. al . 2002).

Al cabo de un tiempo el contenido en agua será mayor en uno de los lados

de la membrana. La diferencia de altura entre ambos fluidos se conoce como

Presión Osmótica (Binnie et. al . 2002).

Ósmosis inversa. Si se utiliza una presión superior a la presión osmótica,

se produce el efecto contrario. Los fluidos se presionan a través de la membrana,mientras que los sólidos disueltos quedan atrás (Binnie et. al . 2002).

Para poder purificar el agua necesitamos llevar a cabo el proceso contrario

al de la ósmosis convencional, es lo que se conoce como Ósmosis Inversa. Se

trata de un proceso con membranas. Para poder forzar el paso del agua que se

encuentra en la corriente de salmuera a la corriente de agua con baja

concentración de sal, es necesario presurizar el agua a un valor superior al de la

presión osmótica. Como consecuencia a este proceso, la salmuera se concentrarámás (Binnie et. al . 2002).

Por ejemplo, la presión de operación del agua de mar es de 60 bar

(Binnie et. al . 2002).


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Figura No. 12.- Diferencia de ósmosis y ósmosis inversa

(Imagen de la derecha). (Abadiano, 2013).

1.- El agua fluye de una columna con un bajo contenido de sólidos disueltos

a una columna con una elevada concentración de sólidos disueltos

2.- La presión osmótica es la aplicada para evitar que el agua siga fluyendo

a través de la membrana y de esta forma crear un equilibrio.

3.- Para poder alcanzar una presión superior a la presión osmótica, el agua

debe fluir en sentido contrario. El agua fluye de la columna con un alto contenido

en solidos disueltos a la columna con bajo contenido en sólidos disueltos

(Binnie et. al . 2002).


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Figura No. 13.- Ósmosis inversa (Mireia, 2009).

Calidad de las membranas.

1.- Alta retención de sales minerales y compuestos orgánicos: TASA DE

DEPURACIÓN.

2.- Alta permeabilidad al agua pura.

3.- Poco espesor.

Baja biodegradabilidad.

Elevada inercia química.

Margen de pH amplio.

Buena resistencia mecánica.

Buena estabilidad en el tiempo (Mireia, 2009).

CAUDAL.


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4.1.7.- ELECTRODIÁLISIS.

Procedimiento de separación con

membranas que tiene por objeto concentrar

o diluir disoluciones de electrolitos

mediante el uso de membranas de

intercambio iónico y la aplicación de un

potencial eléctrico (Mireia, 2009).

Figura No. 14.- Instalaciones de

Ósmosis Inversa (Mireia, 2009).

Figura No. 15.- Electrodiálisis

(Mireia, 2009).


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Resinas de intercambio iónico.

Sustancias insolubles en agua que tienen iones lábiles fácilmente

intercambiables por otros iones del mismo signo presentes en una

solución acuosa (Mireia, 2009).

Son cadenas poliméricas de elevado peso molecular unidas por

un enlace iónico a un contraión (Mireia, 2009).

Figura No. 16.- Resinas de intercambio iónico (Mireia, 2009).

Figura No. 17.-

Electrodiálisis (Mireia, 2009).


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Inconvenientes:

Bajo rendimiento: 40 –66% electrolitos.

No elimina moléculas no ionizadas ni coloides (Mireia, 2009).

Aplicaciones:

Producción de agua potable a partir de agua salobre de baja mineralización

(0.8 a 2 g/ℓ).

Desalinización de soluciones coloidales u orgánicas (desmineralización de

sueros). (Mireia, 2009).

4.2.- TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS.

ELECTROFORESIS.

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la

movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual

finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo dela técnica que se use (Morales, 2008).

Figura No. 18.- Electroforesis (Morales, 2008).


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La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa

impregnada de un electrolito. Sus extremos se sumergen en dos depósitos

independientes que contienen ambos al electrolito y están unidos a los electrodos

del generador de corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeño trazo

transversal en la tira. La distancia de migración se mide en relación un marcador

interno. Las placas son reveladas con sales de plata, azul de Coomassie, o

reactivos en particular (Morales, 2008).

Fundamentos y Conceptos Básicos.

La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que se ha

desarrollado gracias a los avances de la cromatografía líquida de alta eficacia

junto con los procedimientos más tradicionales de electroforesis. Esta técnica

permite separar bastante bien biomoléculas, donde la cromatografía líquida se

muestra menos eficaz, y compuestos de pequeña masa molecular, difíciles de

estudiar por los procedimientos clásicos de electromigración en soporte (Morales,

2008).

Figura No. 18.- Esquema representativo de la electroforesis (Morales, 2008).

La electroforesis capilar constituye una adaptación particular de la técnica

de electroforesis. Esta técnica separativa se basa en la migración de las especies

de la muestra en disolución, portadoras de una carga eléctrica global, bajo el


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efecto de un campo eléctrico y en contacto con un soporte (medio de

desplazamiento) adecuado (Morales, 2008).

Figura No. 19.- Electroferograma (Morales, 2008).

En electroforesis capilar la tira se reemplaza por un tubo capilar abierto en

sus extremos, fabricado con un diámetro pequeño (15 a 150µm). El capilar oscila

entre 20 y 80 cm, y está lleno de una solución buffer. Un detector se encuentra

ubicado en un extremo del capilar, cerca del compartimiento catódico. La señal

obtenida es la base de la obtención del electroferograma, que muestra el registro

de la composición de la muestra. Solo las especies que se dirigen hacia el cátodo

serán detectadas (Morales, 2008).

Métodos de Detección.

En la detección UV-Vis se mide la intensidad de la luz que pasa a través

del capilar en una pequeña zona en la que se ha eliminado el revestimiento opaco

(Morales, 2008).

Figura No. 20.- Detector (Morales, 2008).


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La detección por fluorescencia resulta más sensible si se emplea una fuente

láser muy intenso, asociado a menudo a un procedimiento de preformación de

derivados de los analitos portadores de un fluoróforo (Morales, 2008).

4.2.1.- CLASIFICACIÓN DE TÉCNICAS

ELECTROFORÉTICAS.

1.- Electrofo resis c api lar en zona o en dis olu ción l ibre (CZE).

Es el procedimiento de electroforesis más habitual, en el cual el capilar esrecorrido por el electrolito a través de un medio buffer que puede ser ácido (fosfato

o citrato), básico (borato), o anfótero (carácter ácido y básico). El flujo

electroosmótico crece con el pH del medio electroforético (Morales, 2008).

2.- Electr ofo resi s cap ilar elec tro cinética m icelar (MEKC).

En esta variante del procedimiento anterior se añade a la fase móvil un

compuesto catiónico o aniónico para formar micelas cargadas. Estas

pequeñísimas gotitas inmiscibles con la disolución retienen a los compuestos

neutros de un modo más o menos eficaz, por afinidad hidrófila-hidrófoba. Se

puede utilizar este tipo de electroforesis para moléculas que tienen tendencia a

migrar sin separación, como es el caso de algunos enantiomeros (Morales, 2008).

3.- Electrofor esis c api lar en g el (CGE).

Esta es la transposición de la electroforesis en el gel de poliacrilamida o de

agarosa. El capilar está relleno con un electrolito que contiene al gel. Se produce

un efecto de filtración que ralentiza a las grandes moléculas y que minimiza los

fenómenos de convección o de difusión. Los oligonucleótidos, poco frágiles, se

pueden separar de este modo (Morales, 2008).


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4.- Isoelec tro enfoqu e capilar (CIEF).

Esta técnica, también conocida como electroforesis en soporte, consiste en

crear un gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada que contiene un

anfótero. Cada compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que supunto isoeléctrico (al pI su carga neta es nula). Seguidamente, bajo el efecto de

una presión hidrostática y manteniendo el campo eléctrico, se desplazan las

especies separadas hacia el detector. Las altas eficiencias obtenidas con este

procedimiento permiten separar péptidos con pI que apenas difieren entre sí 0.02

unidades de pH (Morales, 2008).

Electrocromatografía Capilar. Este tipo de separación asocia la electromigración de los iones, propio de la

electroforesis, y los efectos de separación entre fases presentes en la

cromatografía. La técnica consiste en la utilización de un capilar relleno con una

fase estacionaria, cuyo papel es doble: actúa como material selectivo que debe,

por otro lado, participar en la migración del electrolito (Morales, 2008).

Figura No. 21.- Detector fluorimétrico (Morales, 2008).


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El factor de separación es muy elevado, pero existen un cierto número de

problemas que limitan su aplicación, como el efecto de los modificadores

orgánicos sobre el flujo electroosmótico y la dificultad de un control preciso del

volumen de muestra introducido en el capilar (Morales, 2008).

4.2.2.- DISEÑO Y SELECCIÓN DE TÉCNICAS

ELECTROFORÉTICAS.

Diseño.

Figura No. 22.- Métodos

electroforeticos zonales

(Krause, 1996).

Se aplican pequeñas cantidades de la

disolución de proteínas a un soporte sólido, que se

impregna con una solución tampón. Los soportes son

en general polímeros y forman un gel poroso que

restringe el movimiento de las moléculas a través de

medio durante la electroforesis y disminuyen los

flujos de convección del solvente (Krause, 1996).

Como soporte han sido utilizados pape

(celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de

celulosa, entre otros. Este método tiene gran pode

resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de

proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud

del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicación

(Krause, 1996).


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Figura No. 23.- Electroforesis en gel de

poliacrilamida (Krause, 1996).

Los geles de poliacrilamida se forman

por polimerización de la acrilamida por acción

de un agente entrecruzador, es químicamente

inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser

preparado de forma rápida y reproducible.

Forma, además, geles transparentes con

estabilidad mecánica, insolubles en agua,

relativamente no iónicos y que permiten buena

visualización de las bandas durante un tiempo

prolongado. Además tiene la ventaja de que

variando la concentración de polímeros, se

puede modificar de manera controlada en el

tamaño del poro, lamentablemente cada vez

se emplea menos en diagnostico debido a su

neurotoxocidad (Krause, 1996).

Figura No. 24.- Electroforesis en gel de gradientes (Krause, 1996).

El uso de geles de poliacrilamida que

tienen un gradiente creciente de concentración

de archilamida + bisacrilamida, y en

consecuencia un gradiente decreciente en eltamaño del poro, pueden tener ventajas sobre

los geles de concentraciones uniformes de

acrilamida. En un gel en gradiente la proteína

migra hasta alcanzar una zona donde el

tamaño de poro impida cualquier avance. Una

vez se alcanza el límite del poro no se produce

una migración apreciable aunque no se detiene

completamente. Una de las ventajas de este

tipo de geles es que resuelve mejor las bandaspues las concentra en regiones más estrechas,

además de incrementar el rango de

pesos moleculares que se pueden resolver en

un mismo gel comparado con los de una

concentración fija. (Krause, 1996).


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Figura No. 25.- Electroforesis en gel

de agarosa (Krause, 1996).

La agarosa es un polisacárido

(originalmente obtenido de algas, como el agar-

agar, pero de composición homogénea), cuyas

disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseenla propiedad de permanecer liquidas por encima

de 50 grados C y formar un gel, semisólido al

enfriarse. Este gel está constituido por una

matriz o trama tridimensional de fibras

poliméricas embebida en gran cantidad de

medio líquido, que retarda el paso de las

moléculas, se usa usualmente para separarmoléculas grandes de alrededor 20.000

nucleótidos Krause, 1996 .

Figura No. 26.- Electroforesis capilar (Krause,1996).

La electroforesis capilar se basa

en los mismos principios de las técnicas

electroforéticas convencionales, pero

utiliza condiciones y tecnología distinta

que nos permiten obtener una serie de

ventajas al respecto, Esta separación de

péptidos realizada sobre un capilar de

silica fundida a potenciales elevados 20

a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm

refrigerados por aire. (Krause, 1996).


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Figura No. 27.- Isoelectroenfoque

(Krause, 1996).

Se basa en el desplazamiento de las moléculas e

un gradiente de pH. Las moléculas amfotéricas, como lo

aminoácidos, se separan en un medio en el que existe un

diferencia de potencial y un gradiente de pH. La región de

ánodo es Ácida y la del cátodo es alcalina. Entre ambos sestablece un gradiente de pH tal que las moléculas que s

han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro de

rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran e

regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estará

cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo

mientras aquellas que se encuentran en medios con p

más bajos que su punto isoeléctrico tendrán carg

negativa y migraran hacia el ánodo. La migración le

conducirá a una región dónde el pH coincidirá con s

punto isoléctrico, tendrán una carga neta nula y s

detendrán. De esta forma las moléculas amfotéricas s

sitúan en estrechas bandas donde coincide su punt

isoeléctrico con el pH (Krause, 1996).

Figura No. 28.- esquema de una electroforesis

bidimensional

(Krause, 1996).

La electroforesis

bidimensional se basa en separarlas proteínas en una mezcla

según sus dos propiedades

moleculares, una en cada

dimensión. El procedimiento más

usado se basa en la separación

en una primera dimensión

mediante isoelectroenfoque y la

segunda dimensión según peso

molecular mediante electroforesis

en poliacrilamida. (Krause, 1996).


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La electroforesis permite separar bastante bien biomoléculas, donde la

cromatografía líquida se muestra menos eficaz, y compuestos de pequeña masa

molecular, difíciles de estudiar por los procedimientos clásicos de electromigración

en soporte (Cruz et al, 2016).

La electroforesis capilar constituye una adaptación particular de la técnica

de electroforesis. Esta técnica separativa se basa en la migración de las especies

de la muestra en disolución, portadoras de una carga eléctrica global, bajo el

efecto de un campo eléctrico y en contacto con un soporte (medio de

desplazamiento) adecuado (Cruz et al, 2016).

Tipos de módulos:

Fibras huecas-capilares: membrana de diámetro muy pequeño.

Tubular: se soportan mediante una vasija a presión.

Monolíticos: se convierte en un módulo mediante la conexión

de accesorios terminales y un medio de recolección de filtrado.

Espiral: la membrana de lámina puede adaptarse a un módulo

barato y compacto mediante enrollado espiralplaca y estructura: es el único modo comúnmente empleado en la ED (Cruz et al,

2016).

4.3.- CROMATOGRAFÍA PREPARATIVA.

Es parte de los proceso de separación utilizada para separar moléculasdispersas en mezclas homogéneas (Cruz et al, 2016).

La cromatografía preparativa comprende un amplio campo de aplicaciones,

desde el aislamiento de 1 µg. de muestra para identificación espectroscópica

hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g. La


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cromatografía preparativa se diferencia de la técnica básica en muchos aspectos,

desde la preparación de la papilla. Ésta debe hacerse con menos agua que de

ordinario. Una papilla más espesa ayuda a estabilizar el grosor de las placas que

se precisa para una carga de mayor magnitud. El espesor óptimo oscila desde un

mínimo de 1 mm. hasta un máximo de 2 mm. (textoscientificos.com, 2007).

Las placas utilizadas en cromatografía preparativa son placas grandes, de

aproximadamente 20x20 cm. que permiten separar aproximadamente 1 g. de

mezcla utilizando unos 35 g. de adsorbente (textoscientificos.com, 2007).

La siembra de la muestra se realiza mediante la ayuda de una jeringuilla o

tubo capilar. La siembra se realiza a lo largo de una línea recta (existen en el

mercado diverso utensilios para evitar torcerse). Si al terminar la primera siembra

todavía queda muestra, se seca la primera siembra y se aplica la segunda,

intentando que ésta quede sobre la anterior, para así conseguir que el frente sea

lo más estrecho posible. La siembra debe realizarse a lo ancho de la placa

(textoscientificos.com, 2007).

Una vez sembrada la muestra se desarrolla la cromatografía. Se utiliza un

adsorbente con indicador fluorescente para ver en la lámpara ultravioleta dondehan quedado las manchas de los diferentes compuestos, dichas manchas se

marcan (textoscientificos.com, 2007).

Una vez localizados los compuestos, éstos se extraen de la fase

estacionaria, uno a uno, con la ayuda de una espátula, sobre un papel de filtro u

otro soporte. Posteriormente se coloca cada componente en un Erlenmeyer, y se

mezcla con un disolvente (metanol). Una vez disuelto el compuesto se filtra varias

veces para separar el compuesto y la fase estacionaria. Una vez separado se

elimina el disolvente (destilación), con lo cual se obtiene el componente separado



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Si no se dispone de indicador fluorescente, no se pueden usar reveladores

químicos sobre toda la placa. El proceso a seguir es el siguiente: se raya la placa

separando totalmente una pequeña franja de placa, sobre la cual se aplica el

revelador químico, y a partir de esta franja se marcan las franjas de compuestos


4.3.1.- CLASIFICACIÓN.

De acuerdo al estado de agregación de la fase líquida los sistemas

cromatográficos se dividen en (Cruz et al, 2016):

Cromatografía de gases (GC).

Cromatografía líquida (LC).

Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC).

Cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC).

Cromatografía en capa fina (TLC).

De acuerdo a la naturaleza de las moléculas de adsorción y la

superficie del adsorbente (Cruz et al, 2016):

Moléculas gaseosas/Superficie sólida.

Moléculas líquidas/Superficie sólida.

Moléculas gaseosas/Superficie líquida.

Moléculas líquidas/Superficie líquida.


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4.3.2.- SELECCIÓN Y DISEÑO.

Selección.

Depende del:

Rendimiento.

Productividad.

Economía.

Escala de separación.

Velocidad de separación.

Presión. Adsorbente.

Fase móvil (Cruz et al, 2016).

Diseño.

Columna:

Corriente continua dado un diámetro interior y una longitud.

Acero inoxidable vidrio o materiales plásticos.

Estable mecánicamente y químicamente (Cruz et al, 2016).

Tabla No.8.- Diseño de la cromatografía.

Fuente: (Cruz et al, 2016).


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CONCLUSIONES.

Las bioseparaciones son muy importantes como una operación unitaria en

la producción de alimentos, ya que permite separar impurezas y/o sustancias deinterés que se encuentran en ellos, por medio de membranas capaces de retener

partículas diminutas de hasta diámetros de unas cuantas micras (0.1 a 15µ). Así

mismo, estas técnicas son muy utilizadas en la purificación del agua para hacerla

potable. Debido a que su finalizad es para consumo humano, ésta requiere de una

estricta calidad y cumplimiento de normas de higiene. Para ello, se aplican las

membranas, quienes son capaces de retener impurezas del agua, ya sea de

carácter físico, químico o biológico (en el caso de los microorganismos retenidos

que se encuentran presentes en el agua).

Gracias a la filtración por medio de membranas se pueden separar

endotoxinas, virus, proteínas, microplasmas, levaduras, hongos y bacterias.

Es importante mencionar que en una bioseparación interfiere la porosidad

del medio, la presión del filtrado, el área de la membrana, resistencia mecánica

del material, tiempo, temperatura, y el espesor.


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Unidad 4.- Bioseparaciones.

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Transcript of Unidad 4.- Bioseparaciones.