Avances y Aplicaciones Avances y Aplicaciones BiotecnológicasBiotecnológicas

Lcdo. CARLOS R FELICITA

QUITO ECUADOR

14-06-08

Bancos de secuenciasBancos de secuencias Secuenciación de genomas completosSecuenciación de genomas completos Aplicaciones forensesAplicaciones forenses Sondas DNA en el diagnósticoSondas DNA en el diagnóstico Terapia génicaTerapia génica Diagnóstico Diagnóstico de enfermedades infecciosas Los anticuerpos monoclonales Análisis de ADN o ARN mediante PCR

Compendio de Aplicaciones Biotecnológicas

Fármacos producidos por ingeniería genética Nuevos tipos de alimentos Control medioambientalControl medioambiental Organismos Organismos transgénicostransgénicos ProcesosProcesos industriales enzimáticos industriales enzimáticos Biosensores Biochips Microformaciones (microarrays)

Compendio de Aplicaciones Compendio de Aplicaciones BiotecnológicasBiotecnológicas

El aislamiento del ADNEl aislamiento del ADN

Características de las Técnicas de aislamiento:Características de las Técnicas de aislamiento:

Se requiere tratamiento para romper a las células y liberar al ADNSe requiere tratamiento para romper a las células y liberar al ADN Un método para remover o desactivar a las enzimas que degradan al ADNUn método para remover o desactivar a las enzimas que degradan al ADN un método para separar al ADN de las proteínas y de otras moléculas un método para separar al ADN de las proteínas y de otras moléculas

contaminantes. contaminantes.

Se puede aislar ADN de bacterias, cebollas y de otros organismos. Se puede aislar ADN de bacterias, cebollas y de otros organismos.

Se utiliza calor y un detergente para romper a las células y desactivar las Se utiliza calor y un detergente para romper a las células y desactivar las enzimas que degradan al ADN. enzimas que degradan al ADN. Se usa la precipitación con alcohol para separar al ADN de los otros Se usa la precipitación con alcohol para separar al ADN de los otros contaminantes. contaminantes.

Bancos de secuencias de DNA y Bancos de secuencias de DNA y proteínasproteínas

Secuencia: orden en que Secuencia: orden en que aparecen los monómeros en aparecen los monómeros en un polímero. un polímero.

Dado que DNA, RNA y Dado que DNA, RNA y proteínas son polímeros que proteínas son polímeros que contienen información, sus contienen información, sus monómeros ("letras") son monómeros ("letras") son únicas y hay que únicas y hay que determinarlas. determinarlas.

Actualmente la Actualmente la secuenciación (descifrado de secuenciación (descifrado de la secuencia) de DNA están la secuencia) de DNA están al alcance. al alcance.

Abundante cantidad de Abundante cantidad de secuencias descifradas.secuencias descifradas.

Información se reúne en Información se reúne en bancos (Internet). bancos (Internet).

Bancos de secuencias de DNA y Bancos de secuencias de DNA y proteínasproteínas

Información una herramienta Información una herramienta fundamental.fundamental.

Cualquier secuencia obtenida Cualquier secuencia obtenida puede ser contrastada (puede ser contrastada (on lineon line) ) con secuencias previamente con secuencias previamente descritas, relaciones descritas, relaciones filogenéticas (evolutivas), etc.filogenéticas (evolutivas), etc.

Webs: Webs: ExpasyExpasy base de datos base de datos

secuencia de proteínassecuencia de proteínas NCBI NCBI , National Center for , National Center for

Biotechnology Information Biotechnology Information bases de secuencias genéticas. bases de secuencias genéticas.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de de la Universidad de Salamanca. Salamanca.

Secuenciación de Secuenciación de genomasgenomas completos completos

PERO PARA QUE SIRVE ? PERO PARA QUE SIRVE ? Determinar el orden exacto de las bases (o letras) de una Determinar el orden exacto de las bases (o letras) de una

molécula de ADN.molécula de ADN. Técnicas de secuenciación de DNA se aplican con éxito a Técnicas de secuenciación de DNA se aplican con éxito a

organismos completosorganismos completos El genoma de una bacteria contiene millones de El genoma de una bacteria contiene millones de nucleótidosnucleótidos Genoma humano, miles de millones. Genoma humano, miles de millones. Genomas secuenciados: virus, bacterias, Genomas secuenciados: virus, bacterias,

levaduralevadura Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae, Genoma humanoGenoma humano

SUS APLICACIOMES: Estudios filogenéticos y evolutivos SUS APLICACIOMES: Estudios filogenéticos y evolutivos relaciones entre razas, tipos, variedades y especies. relaciones entre razas, tipos, variedades y especies.

Secuenciación de Secuenciación de genomasgenomas completos completos

Estudio notable: Estudio notable: DNA MITOCONDRIALDNA MITOCONDRIAL en poblaciones humanas en poblaciones humanas actuales. actuales. Por su interés lo Por su interés lo describiremos brevemente:describiremos brevemente:

MitocondriasMitocondrias: : organelasorganelas celulares celulares que aparecen en los que aparecen en los eucarioteseucariotes

Función: "centrales Función: "centrales energéticas" de la célula.energéticas" de la célula.

Origen evolutivo es curioso: Origen evolutivo es curioso: Son en realidad Son en realidad procariotesprocariotes adaptados a vivir adaptados a vivir simbióticamentesimbióticamente con la célula con la célula eucariótica. eucariótica.

Por tanto tienen Por tanto tienen características de células características de células procarióticas, procarióticas, tienen su tienen su propio DNApropio DNA, distinto del , distinto del DNA nuclear que es propio DNA nuclear que es propio de la célula. de la célula.

Secuenciación de Secuenciación de genomasgenomas completos completos

En la fecundación, todas las mitocondrias que recibe el En la fecundación, todas las mitocondrias que recibe el nuevo individuo proceden de su madre, pero no de su nuevo individuo proceden de su madre, pero no de su padre; porque el espermatozoide no aporta nada más que padre; porque el espermatozoide no aporta nada más que su DNA. De esta manera, a través del DNA su DNA. De esta manera, a través del DNA mitocondrial se puede seguir el origen evolutivo de todas mitocondrial se puede seguir el origen evolutivo de todas las poblaciones humanas.las poblaciones humanas.

Se ha realizado un árbol evolutivo de toda la especie Se ha realizado un árbol evolutivo de toda la especie humana actual, RESULTADO Todos los seres humanos humana actual, RESULTADO Todos los seres humanos procedemos de una sola mujer que vivió en Africa hace procedemos de una sola mujer que vivió en Africa hace aprox 130.000 años. aprox 130.000 años.

Aplicaciones forensesAplicaciones forenses

En cuestiones médico-legales En cuestiones médico-legales Ej. pruebas de paternidadEj. pruebas de paternidad En las que el DNA de cada En las que el DNA de cada

persona es único y persona es único y perfectamente identificable.perfectamente identificable.

A partir de sangre y otros A partir de sangre y otros fluidos se determina la fluidos se determina la identidad de las personas.identidad de las personas.

Identificación de cadáveres Identificación de cadáveres de la familia imperial rusa de la familia imperial rusa asesinada en 1917 por asesinada en 1917 por comparación con el DNA de comparación con el DNA de sus descendientes y parientes sus descendientes y parientes actuales. actuales.

Se han clonado muestras del Se han clonado muestras del DNA del faraón Ramsés II a DNA del faraón Ramsés II a partir de su momia.partir de su momia.

Sondas DNA con aplicaciones Sondas DNA con aplicaciones diagnósticas diagnósticas

A partir de A partir de Hibridación molecularHibridación molecular, podemos ver si un , podemos ver si un gen contiene exactamente una determinada secuencia de gen contiene exactamente una determinada secuencia de "letras". A-T-G-C-A-G-T"letras". A-T-G-C-A-G-T

Podemos saber si en un genoma determinado está Podemos saber si en un genoma determinado está presente tal o cual mutación que causa enfermedad, por presente tal o cual mutación que causa enfermedad, por ejemplo. ejemplo.

Se ha ampliado el campo del diagnóstico molecular de Se ha ampliado el campo del diagnóstico molecular de enfermedades. Este diagnóstico puede hacerse enfermedades. Este diagnóstico puede hacerse perfectamente antes del nacimiento. perfectamente antes del nacimiento.

Terapia génicaTerapia génica

a) Insertar una copia sana de un gen en las células del paciente con una enfermedad genética, para compensar el efecto del gen defectuoso ( esto se consiguió con una niña que tenía una inmunodeficiencia grave).

b) Introducir de un gen diseñado para que proporcione una nueva característica a las células (por ejemplo, introducir en linfocitos un gen que produzca un inhibidor del virus del sida en pacientes afectados por el VIH).

Enfermedades genéticas debidas a un solo gen defectuoso ascienden a más de 4000 345 afectan al cromosoma X

La terapia génica cuarta revolución de la medicina Para su aplicación se siguen dos estrategias:

Diagnóstico de enfermedades Diagnóstico de enfermedades infecciosasinfecciosas

Métodos largos: cultivo microbiológico, bioquímicas y determinaciones en suero.

La Biotecnología moderna aporta nuevas herramientas al ser Mo difíciles de cultivar.Mo difíciles de cultivar.

No es necesario aislarlos. No es necesario aislarlos.

Nuevas técnicas como Nuevas técnicas como anticuerpos monoclonalesanticuerpos monoclonales, , hibridaciónhibridación o la o la secuenciación del DNA o RNAsecuenciación del DNA o RNA con con PCRPCR ha sido un logro biotecnológico ha sido un logro biotecnológico

Los anticuerpos monoclonalesLos anticuerpos monoclonales

Son idénticos entre sí (clones), reconocen al mismo antígeno. Son idénticos entre sí (clones), reconocen al mismo antígeno. Se desarrollan uniendo células productoras de anticuerpos (linfocitos B) con Se desarrollan uniendo células productoras de anticuerpos (linfocitos B) con

células de mieloma (cancerosas). células de mieloma (cancerosas). Las células híbridas se conocen como Las células híbridas se conocen como hibridomashibridomas Producen las mismas moléculas de anticuerpos, de ahí el nombre de anticuerpos Producen las mismas moléculas de anticuerpos, de ahí el nombre de anticuerpos

monoclonales. monoclonales. El hibridoma puede mantenerse indefinidamente en cultivo El hibridoma puede mantenerse indefinidamente en cultivo Por la propiedad de especificidad a los antígenos, los a.m. se utilizan para Por la propiedad de especificidad a los antígenos, los a.m. se utilizan para

análisis sensibles y precisos que detectan antígenosanálisis sensibles y precisos que detectan antígenos Se aplica en análisis de laboratorio ELISA, que detecta una amplia variedad de Se aplica en análisis de laboratorio ELISA, que detecta una amplia variedad de

agentes infecciosos.agentes infecciosos.

Análisis de ADN o ARN mediante PCRAnálisis de ADN o ARN mediante PCR

Obtención de millones de copias de un fragmento de Obtención de millones de copias de un fragmento de ADN o ARN.ADN o ARN.

Se basa en el proceso de replicación del ADN, para ello se utilizan unos oligonucleótidos que se han de diseñar como cebadores que inician la replicación "in vitro". La replicación se repite multitud de veces duplicando en cada ciclo la cantidad de ADN obtenido.

Análisis de ADN o ARN mediante PCRAnálisis de ADN o ARN mediante PCR

Esta síntesis artificial se realiza a altas temperaturas para que las dos cadenas de ADN se separen, gracias a la ADN polimerasa obtenida de una bacteria termófila.

Utilidades: pruebas de paternidadautoría de un delitoenfermedades hereditarias antes del nacimientoestudios filogenéticossecuenciaciones de genomas Detección de mutaciones (cambios en las secuencias de ADN) En microbiología para la identificación de patógenos virales, bacterianos. etc.

Fármacos producidos por ingeniería Fármacos producidos por ingeniería genética genética

La La BiotecnologíaBiotecnología dispone de técnicas dispone de técnicas para producir proteínas humanas en para producir proteínas humanas en organismos bacterianos.organismos bacterianos.

Obtención de alcaloides vegetales Obtención de alcaloides vegetales mediante cultivo mediante cultivo in vitroin vitro de células de las de células de las plantas. Ej la digoxina, producida por la plantas. Ej la digoxina, producida por la planta planta Digitalis purpureaDigitalis purpurea, (Rp de , (Rp de enfermedades cardíacas) enfermedades cardíacas)

Desarrollo de proteínas de interés Desarrollo de proteínas de interés farmacéutico en mamíferos y obtener que farmacéutico en mamíferos y obtener que sean segregados en la leche, por ejemplo. sean segregados en la leche, por ejemplo.

Síntesis de la somatostatina en Escherichia coli

Sustancias antimicrobianas (antibióticos)VacunasVitaminasHormonas peptídicas (como la insulina, la hormona del crecimiento o somatotropina)Factores hipotalámicos (como la somatostatina)Enzimas.

Fármacos producidos por ingeniería genéticaFármacos producidos por ingeniería genética

Nuevos tipos de alimentosNuevos tipos de alimentos

Reino Unido, investigación de “Proteína Monocelular". Reino Unido, investigación de “Proteína Monocelular".

Masa bacteriana producida por Mo específicos que Masa bacteriana producida por Mo específicos que crecen sobre efluentes industriales o contaminantes crecen sobre efluentes industriales o contaminantes medioambientales, como el crudo de petróleo. medioambientales, como el crudo de petróleo.

Esta masa es un aditivo rico en proteínas que se añade a Esta masa es un aditivo rico en proteínas que se añade a la alimentación animal convencional. la alimentación animal convencional.

Otros alimentos: Otros alimentos: transgénicostransgénicos..

Organismos Organismos transgénicostransgénicos

Mediante Ingeniería Genética Mediante Ingeniería Genética introduciendo genes introduciendo genes determinados en el determinados en el genomagenoma de de otros organismos.otros organismos.

Desarrollo de "organismos Desarrollo de "organismos transgénicos"transgénicos"

Ej. Introducción de genes Ej. Introducción de genes que confieren resistencia a que confieren resistencia a plagas y enfermedades en plagas y enfermedades en diversos vegetales. diversos vegetales.

Tomate transgénico (Tomate transgénico (Flavr Flavr SavrSavr), ),

Plantas resistentes a la Plantas resistentes a la sequía.sequía.

Hay animales transgénicos Hay animales transgénicos Así, podemos introducir Así, podemos introducir características de resistencia características de resistencia a enfermedades, a enfermedades, producción de carne o producción de carne o leche, etc. leche, etc.

Control medioambientalControl medioambiental

Mediante especies de mo capaces de crecer Mediante especies de mo capaces de crecer sobre efluentes industriales, como el crudo de sobre efluentes industriales, como el crudo de petróleo. petróleo.

BiomineríaBiominería: técnica mediante la cual se tratan : técnica mediante la cual se tratan minerales extraídos mediante la acción minerales extraídos mediante la acción bacteriana, lo que implica la no utilización de bacteriana, lo que implica la no utilización de productos químicos altamente contaminantes productos químicos altamente contaminantes (ácidos, lejías, etc.) (ácidos, lejías, etc.)

Procesos industriales enzimáticosProcesos industriales enzimáticos

EnzimasEnzimas: catalizadores específicos de reacciones metabólicas. : catalizadores específicos de reacciones metabólicas. Uso industrial de las enzimas se remonta hace 40 años. Uso industrial de las enzimas se remonta hace 40 años. Veamos un resumen de sus aplicaciones industriales: Veamos un resumen de sus aplicaciones industriales:

1. Industrias derivadas del 1. Industrias derivadas del almidónalmidón. . a) Producción de biocombustibles a) Producción de biocombustibles b) Producción de jarabes de b) Producción de jarabes de fructosafructosa

2. Industria de los detergentes+ Enzimas 2. Industria de los detergentes+ Enzimas proteolíticasproteolíticas (enzimas que (enzimas que degradan proteínas), facilitan la eliminación de manchas degradan proteínas), facilitan la eliminación de manchas orgánicas. orgánicas.

3. Industrias lácteas: queso, la leche + cuajo, suero lácteo 3. Industrias lácteas: queso, la leche + cuajo, suero lácteo y la eliminación enzimática de la y la eliminación enzimática de la lactosalactosa. . Utilización de enzimas que hidrolizan la lactosa (glucosa Utilización de enzimas que hidrolizan la lactosa (glucosa y galactosa)y galactosa)

4. Industrias de la fruta: incremento del rendimiento y 4. Industrias de la fruta: incremento del rendimiento y clarificación de jugos.clarificación de jugos.

5. A5. Antibióticosntibióticos (preparación de penicilinas semisintéticas) (preparación de penicilinas semisintéticas)

Procesos industriales enzimáticosProcesos industriales enzimáticos

BiosensoresBiosensores

Enzimas no solamente se aplican aEnzimas no solamente se aplican a industriaindustria

Se emplean en técnicas analíticas. Se emplean en técnicas analíticas. Reactivos de laboratorio clínico se basan en Reactivos de laboratorio clínico se basan en

enzimas. enzimas. Un desarrollo importante es el de reactivos en Un desarrollo importante es el de reactivos en

fase sólida fase sólida (tiras reactivas) (tiras reactivas)

Pero más importante es el de los Pero más importante es el de los biosensoresbiosensores. .

Qué es un Biosensor?Qué es un Biosensor?

Elementos miniaturizados, que incorporan enzimas para Elementos miniaturizados, que incorporan enzimas para reconocer compuestos específicos, de tal manera que la reconocer compuestos específicos, de tal manera que la interacción produce una corriente eléctrica. interacción produce una corriente eléctrica.

Sí utilizamos una enzima que reconoce a la glucosa, podemos Sí utilizamos una enzima que reconoce a la glucosa, podemos medir en tiempo real la concentración de glucosa en sangre. medir en tiempo real la concentración de glucosa en sangre.

El ejemplo más exitoso y difundido es el Accucheck El ejemplo más exitoso y difundido es el Accucheck

Se ha desarrollado un páncreas artificial que libera Se ha desarrollado un páncreas artificial que libera insulinainsulina en en función de la glucosa presente en la sangre.función de la glucosa presente en la sangre.

Hoy día existen biosensores basados en enzimas para Hoy día existen biosensores basados en enzimas para muchísimas aplicaciones, tanto clínicas como industriales. muchísimas aplicaciones, tanto clínicas como industriales.

BiochipsBiochips

Consiste en la incorporación de enzimas a Consiste en la incorporación de enzimas a elementos de microelectrónica.elementos de microelectrónica.

Abre posibilidades en todos los campos, y Abre posibilidades en todos los campos, y particularmente en la medicina (visión y audición particularmente en la medicina (visión y audición artificial, etc.). artificial, etc.).

Introducción de proteínas como elementos Introducción de proteínas como elementos básicos de ordenadores electrónicos. básicos de ordenadores electrónicos.

Microformaciones (microarrays)Microformaciones (microarrays)

Hasta hace poco, la pregunta ………Hasta hace poco, la pregunta ………““¿Cuáles genes son expresados en células cancerosas que no ¿Cuáles genes son expresados en células cancerosas que no

son expresados en células normales?” son expresados en células normales?”

Requería un laborioso análisis gen por gen. Requería un laborioso análisis gen por gen. Hoy existen técnicas (chip de genes o microarrays)que permiten Hoy existen técnicas (chip de genes o microarrays)que permiten analizar la expresión de muchos genes simultáneamente. analizar la expresión de muchos genes simultáneamente. Estas microformaciones se llevan a cabo sobre un portaobjetos Estas microformaciones se llevan a cabo sobre un portaobjetos de vidrio o sobre un chip de silicona y contienen cientos o miles de vidrio o sobre un chip de silicona y contienen cientos o miles de pedacitos de genes en una pequeña sección del portaobjetos o de pedacitos de genes en una pequeña sección del portaobjetos o del chip de silicona. del chip de silicona. En este procedimiento, los genes expresados son aislados de las En este procedimiento, los genes expresados son aislados de las células. Luego estos genes son detectados examinando cual ADN células. Luego estos genes son detectados examinando cual ADN del portaobjetos se combina con cuales genes de las células.del portaobjetos se combina con cuales genes de las células.

Gracias…!Gracias…!