PROYECTO.

Aplicación de biotecnología vegetal en el desarrollo de técnicas para la reproducción de plantas

con importancia económicas

S I P 2 0 0 6 0 1 2 3

DIRECTORA: Dra. Silvia Evangelista Lozano

PROGRAMA.

Biotecnología por cultivo de células vegetales para la producción de metabolitos secundarios y

propagación de plantas de interés económico

RESUMEN. Con base en el objetivo planteado que consistió en la aplicación de técnicas de propagación por

semilla en especies como cempazúchil (Tagetes erecta L.), helechos y orquídeas; así como

vegetativa en buganvilla (Bougainvillea glabra Choise), que son plantas con importancia económica

ornamental. Además de la utilización de sustratos alternativos para la aclimatización y producción

de planta sana y de calidad. En lo que se refiere al cempazúchil se obtuvieron resultados

satisfactorios en los estudios de germinación exponiendo las semillas en diferente calidad de luz

(roja, azul, blanca y en la oscuridad). Las plantas también expuestas bajo malla policromática (roja,

azul, gris y negra). Las semillas con mayor velocidad de germinación bajo luz roja y azul; las

plantas con mayor número de inflorescencias, diámetro de capítulo y mayor porcentaje de

xantofilas las expuestas bajo malla roja. Las especies de helechos silvestres Adiantum poiretii

Wikstr (Planta herbácea con rizoma rastrero; escamas lanceoladas, concoloras; pecíolo glabro;

lámina de 15-40 x 7-15 cm, deltada a lanceolada, 2-3 pinnada, glabra, segmentos semicirculares o

flabelados; soros 2-8 por segmento); Asplenium muenchii A. R. Sm. (Planta herbácea con rizoma

rastrero; escamas ovadas, clatradas; pecíolo sulcado adaxialmente; lámina de 16-36 x 5-11 cm,

deltada a lanceolada, 3-pinnado-pinnatífida, yema escamosa al nivel de la ultima pinna apical,

pinnas ovadas); Asplenium sessilifolium Desv. (Planta herbácea rupícola o epifita con rizoma

erecto; escamas deltadas, clatradas; lámina de 9.5-43 x 1.4-6 cm, elíptica, 1-pinnado-pinnatífida,

pinnas ovadas). Se colectaron esporas y después de la aplicación de cinco protocolos de

desinfectación, se logró la germinación; lo que dio lugar a realizar pruebas de viabilidad con lo que

se obtuvieron mejores resultados fue con el Reactivo de Mutzing, prueba generada para helechos,

así como la germinación en sustrato como perlita y medio MS. En la determinación de algunas

condiciones de regeneración in vitro y ex vitro de la orquídea silvestre: Trichocentrum Laelia

eyermaniana Rchb, las cuales fueron germinadas y aclimatizadas; la primera se obtuvieron

protocormos y se indujo multibrotación mediante el corte transversa, así como el protocormo

completo, obteniéndose mayor número de protocormos y plantulas (32) con ácido naftalenacético

1

(ANA) y bencil amino purina (BAP). La aclimatización del mayor número de plantas de ambas

especies fue en fibra (base del pecíolo) de palma soyate. Con referencia a la micropropagación y

aclimatización en cuerno de alce de logro el escalamiento y aclimatización, lo cual fue comprobado

con análisis de clorofila, estomas y mediciones periódicas de las plántulas. En buganvilla se

mantuvieron en invernadero, micropropagaron y se aclimatizaron; en el área de Laboratorio de

Propagación ex Vitro, se cuenta con plantas. Todos estas actividades y resultados obtenidos

fueron presentados en congresos nacionales e internacionales; además de generar tesis: cinco a

nivel licenciatura y tres a nivel Maestría. Los escritos de las tesis de maestría están en revisión de

los comités avalados por el Colegio Académico de Maestría del CEPROBI. La vinculación con los

productores nos llevó también a iniciar trabajos con la propagación de gladiolo (Gladiolus X

Gladiolus); esto se justifica ya que Morelos es uno de los estados con mayor producción de esta

flor de corte, vendiendo par el mercado nacional e internacional; en esta área se dio un curso de 20

horas y se pusieron a funcionar dos invernaderos de 240 m2, con alta densidad de cormos; así

también con un control extremo fitosanitario; la producción de flor fue de alta calidad (más de 15

flores por vara, con floración completa) y completamente sana. Este fue un proyecto altamente

satisfactorio, ya que se lograron las metas y financiamiento de la Fundación Produce de Guerrero.

Reconociéndose al Instituto Politécnico Nacional como una de las Instituciones que transfiere la

información que se genera en los Laboratorios.

2

INTRODUCCIÓN. En la cadena sistema producto ornamentales, la propagación es una actividad redituable; esto

obedece al grado de competitividad, el cual está determinado por los costos de producción, que

dependen de las materias primas, clima, mano de obra, infraestructura, demanda y desarrollo del

mercado, apoyo gubernamental, variables económicas y las oportunidades. Actualmente la

demanda está abierta, solamente que se requieren plantas libres de patógenos y adaptadas a

condiciones de semisombra. Otra oportunidad es el estudio de sustratos diferentes a los

tradicionales como es la hojarasca "tierra de hoja", que trae como consecuencias el saqueo de este

material de los bosques. La turba en combinación con otros materiales inertes, presentes en el

mercado y en la región. Además ahorro de agua y disminución en la cantidad de solución nutritiva

que se desperdicia y que se va a las corrientes de agua; por el exceso termina por considerarse

contaminante en el suelo

El trabajar con las especies propuestas tuvo como fundamento: el cempazúchil, es una fuente de

carotenoides para la industria de los alimentos; México es uno de los centros de origen de esta

especie; las variedades que se utilizan tanto para la industria como ornamental son extranjeras

(patentadas); los helechos, como los que aquí se estudiaron presentan arquitectura que los hace

importantes como ornamentales, los que se comercializan en México el 80% son importados y

patentados, el resto son saqueados de de sus áreas naturales de distribución. La importancia del

estudio de las orquídeas silvestres está en que también por sus inflorescencias saqueadas.

La solución más adecuada y deseable a esta problemática no es copiar o adaptar modelos

extranjeros, sino establecer los propios. Estos modelos particulares emanados de la observación y

el estudio de la realidad regional y nacional son los que conforman capacidades únicas, o sea,

características distintivas a una determinada región fortaleciendo, de esta manera, sus

capacidades para encarar la competencia.

Así también la gestión del conocimiento en la transferencia de tecnología no debe ser ideológica,

por el contrario, debe de ser dialéctica, para que a la par que mejore su calidad de vida dote, al

sujeto, de los sentidos necesarios para adquirir una conciencia de clase basada en su propio

devenir histórico y sus valores culturales

3

MÉTODOS Y MATERIALES. Mantenimiento de planta madre

Regado y fertilizado de planta madre, siembra y resiembra in vitro de: buganvilia, orquideas,

helechos y cempazúchil. Actividades necesarias para contar con materia prima. Los riegos se

realizaron con la fórmula comercial Raizal R, a una concentración de 0.1%; cada tres días se

realizaron germinaciones constantes de cempazúchil; las orquídeas y helechos las plantas madre.

Escalamiento en la propagación

Propagar a nivel piloto el cultivo de buganvilia in vitro, por microesqueje y estacas de 14 cm en

condiciones de invernadero, colecta de esquejes, estacas, desinfección y preparación de sustrato.

Inducción de brotación múltiple

Se realizaron estudios diferentes concentraciones de ANA Y BAP para la inducción a la

multibortación de protocormos de orquídea Trichocentrum carthagenence), con reguladores del

crecimiento en protocormos completos y en cortes basales y apicales.

A partir de cápsulas verdes indehiscentes, desinfectadas con hipoclorito de sodio (CloralexR) al 30

% durante 1 minuto; las semillas de Trichocentrum carthagenence (Jacq.) Sw., fueron sembradas

en medio MS (Murashige & Skoog, 1962) al 50% más carbón activado (McKendrick, 2000).

Después de la germinación, los protocormos formados se seleccionaron dos grupos: el primero

para evaluar el efecto de RCV, sobre un diseño factorial fueron sembrados por separado,

protocormos completos, porciones apicales y porciones basales de los mismos, en medio MS al

50% más carbón activado adicionando BAP y ANA en concentraciones de 0.1 y 0.2 mg/l. se evaluó

la formación de PLB´s y número de plántulas

El segundo grupo de protocormos, se sembró y resembró en medio Knudson´C más carbón

activado (Ammirato y col., 1990), Plántulas de 12 meses de desarrollo in vitro, se transplantaron ex

vitro en los sustratos: vermiculita, fibra (fruto) de coco, y por separado fibra (base del pecíolo) y

hoja de palma soyate. Se evaluó como respuesta al sustrato, el número de plántulas

sobrevivientes. Ambos grupos se incubaron a 24 + °C, con fotoperiódo de 16/8 hrs. (luz/oscuridad).

Obtención de gametofitos y fraccionado para la inducción de multibrotación y la obtención de

esporofitos in vitro de helechos silvestres dos del Género Asplenium y uno del Adianto. Se

sembraron las esporas en medio de cultivo y sustratos como agrolita, vermiculita y turba (sustratos

por separado).

Helechos

La colecta de las plantas de helechos en estudio, así como la herborización y montaje se realizo

siguiendo los parámetros descritos en el Manual de Herbario del Consejo Nacional de la Flora de

México (Lot y Chiang, 1986) y por el INEGI (www.inegi.gob.mx.o). La identificación de los ejemplares se realizo basándose en la obra The Pteridophytes of México

(Mickel y Smith, 2004), y se corroboro la identificación en el Herbario ENCB de la Escuela Nacional

de Ciencias Biológicas del IPN, bajo la asesoría del curador del herbario, la M. en C. María de la

Luz Arreguín Sánchez (Marzo del 2006).

4

Al realizar la colecta de las plantas en campo se tomaron las siguientes variables ambientales: -Humedad relativa (HR) y temperatura (T), utilizando un higrótermometro (marca Taylor®, modelo 1455). -Intensidad luminosa (IL) con un cuántometro (marca Apogee® modelo QMSW-SS). De las

anteriores variables ambientales se tomaron de cada una tres lecturas al azar.

En cuanto a parámetros físicos del lugar se determino el pH del suelo, para lo cual se tomo una

muestra en campo de aproximadamente ½ Kg., posteriormente en el laboratorio se coloco 1 g de

muestra por cada 70 ml de agua desioinizada, se homogeneizo, se paso por papel filtro y se tomo

la lectura con un potenciómetro manual para sustratos (marca Testr 1®). Se realizaron tres

repeticiones por muestra.

Además se registraron las coordenadas geográficas (latitud y longitud) y altitud con un GPS (marca

Garmin® modelo GPS III Plus), para descripción del área de estudio.

También se estimo la abundancia de cada especie de estudio utilizando la escala de abundancia-

cobertura de Braun-Blanquet y se realizaron 3 transectos o líneas Canfield de 10m (con un

flexometro de 10 m marca Truper®), con el objeto de determinar el Índice de Densidad Lineal –DLi-

y la Cobertura Lineal -CL- (www.nps.gov.).

El realizar la descripción del sitio de colecta obedece a que se requirieron datos de condiciones

ambientales para mantener en vivero las plantas madre colectadas de campo, así mismo de los

requerimientos que se necesitaron para el mantenimiento in vitro de los explantes de hojas y la

inducción de la germinación de las esporas.

Protocolos de desinfestación de esporas. De las esporas colectadas se tomaron muestras para sembrarlas in vitro, los protocolos de desinfestación utilizados los que se describen (Cuadro 1) Cuadro 1. Protocolos de desinfestación. NÚMERO

DESINFECTANTE -tipo y concentración-

TIEMPOS DE EXPOSICIÓN min

1 NaOCl 1% 10 y 20 2 NaOCl 1% + Tween 80 10, 20, 30 y 40 3 NaOCl 0.5% + Tween 80 10, 20, 30 y 40 4

NaOCl 0.5% + Tween 80 + Estreptomicina (Cox et al., 2003)

3, 5 y 15

5 Aspersión con etanol al 96 % Se dejo evaporar NaOCl al 1% de cloro activo: 17 ml de cloro comercial (Clorox®) por cada 100 ml de agua. NaOCl al 0.5% de cloro activo: 8.5 ml de cloro comercial (Clorox®) por cada 100 ml de agua. Tween 80: 3 gotas (aprox. 1 ml), por cada 100 ml de agua. Estreptomicina: 2 mg/ml.

En los protocolos del 1 al 4 las muestras de esporas obtenidas de las frondas de los helechos se

colocaron en bolsas de 5 x 5 cm hechas de tela tipo Magitel®, las cuales se cerraron con un clip

del No. 2 (Baco®).

En el caso del protocolo 1 se coloco un sobre en un vaso de precipitado de 200 ml, los cuales

contenían solución de NaOCl al 1% de cloro activo, y se mantuvo 10 minutos. Al termino del tiempo

se sacaron y enjuagaron en agua desionizada estéril. A la par se hizo otra prueba pero

manteniendo el sobre en la solución de cloro 20 minutos.

5

Para el protocolo 2 un sobre que se coloco en una solución de NaOCl al 1 % de

cloro activo, que contenía 1 ml de Tween 80® (con la finalidad de romper la tensión superficial y

permitir que el NaOCl penetre adecuadamente en los esporangios), se mantuvo 10 minutos y al

final se enjuago con agua desionizada estéril. Se repitió el procedimiento a 20, 30 y 40 minutos.

El protocolo 3 consistió en colocar un sobre en una solución de NaOCl al 0.5 % de cloro activo mas

1 ml de Tween 80®, se mantuvo 10 minutos y al final se enjuago con agua desionizada estéril. Se

repitió el procedimiento a 20, 30 y 40 minutos.

La metodología descrita por Cox et al. 2003, para la desinfectación de esporas fue la que se uso

como protocolo 4.

Por ultimo para el protocolo 5, se utilizo Etanol al 96 %, el cual se asperjo con un atomizador de

250 ml, directamente sobre los esporangios de las frondas de los helechos, dejándose evaporar

Medios semisólidos de cultivo. Los medios semisólidos de cultivo que se utilizaron para la germinación de las esporas in vitro,

fueron el medio de Murashige y Skoog -MS-, (Murashige and Skoog, 1962); el medio de Knudson

-MK-, (Knudson, 1946) y el medio de Thompson -MT-, (Klekowski, 1969).

El medio MS utilizado es el de la marca Sigma®, de este medio se realizaron varientes (Ciuadro 2).

Cuadro 2. Variantes del medio MS utilizadas.

VARIANTE COMPONENTE DEL MS MS1 MS2 MS3 SALES 4.4 g/l 4.4 g/l 2.2 g/l 2.2 g/l SACAROSA 30 g/l 20 g/l 20 g/l - PHYTAGEL® 2.2 g/l - - - CARBÓN ACTIVADO 2.2 g/l - - - pH 5.7-5.8 5.7-5.8 4.8 5.7-5.8 En el caso del medio de Knudson se utilizo el de la marca Sigma®, a una concentración de 21 g/l,

con un pH de 5.8, sustituyendose el Agar por Phytagel® a una concentración de 2.2 g/l.

El medio de Thompson se elaboro según lo reportado por Mendoza-Ruiz (2001), a un pH de 5.8 y

el Agar también se sustituyo por Phytagel® a una concentración de 5.5 g/l.

Sustratos hortícolas. Se utilizaron los siguientes sustratos:

- Maquique, (MAQ), raíces secundarias de helechos arborescentes. - Turba -peat moss Sunshine®- (TUR). - Vermiculita -Hummert®- (VER). - Agrolita -Polinal®- (PER). - Sustrato para germinar esporas de helechos (SEH), según Luna, 2002.

Tanto para los medios semisólidos como para los sustratos se utilizaron frascos tipo “Gerber®”,

conteniendo aproximadamente 20 ml de cada medio y en el caso de los sustratos

aproximadamente 10 g y 30-40 ml de agua desionizada estéril.

Para medios semisólidos de cultivo se probaron los 5 protocolos de desinfestación y para los

sustratos solo el ultimo. La siembra de las esporas se llevo a cabo siguiendo la metodología

6

descrita por Montoya-Casimiro et. Al, 2000. De cada medio se hicieron tres repeticiones y de los

sustratos tres replicas con tres repeticiones.

Todo el proceso de siembra de las esporas tanto en los medios como en sustratos se llevo bajo

condiciones asépticas, en una campana de flujo laminar.

Pruebas de viabilidad de esporas

Se realizaron en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la UBIPRO de la FES-Iztacala, UNAM,

bajo la asesoría del Dr. Ernesto Aguirre León. Las muestras de esporas de las especies en estudio

se tamizaron usando tamices (marca ), con numero de malla 120, 60 y 45. Se colecto el tamizado

y se guardo en viales de vidrio de 5ml, que se sellaron con Kleen-Pack® y se guardaron en

refrigeración (4-5 oC).

Posteriormente se tomo una muestra de las esporas, se coloco en tubos ependoff® de 1.5 ml (4

por cada especie), se les agrego 0.5 ml de los siguientes reactivos:

-Tetrazolio - Diacetato de fluoresceína (DAF) - Azul de Evans - Reactivo de Mutzing Se dejo actuar 24 horas en el caso del Tetrazolio, Azul de Evans y Reactivo de Mutzing y por 10

min en el caso del DAF. Se realizaron observaciones en un microscopio óptico. En donde la prueba

dio positivo fue con el Reactivo de Mutzing, por lo que se realizaron dos repeticiones más,

contándose 50 esporas en cada una

Escalamiento en la propagación in vitro de helecho

Se emplearon 10 frascos tipo Gerber con plántulas in vitro de helecho cuerno de alce (Platycerium

bifurcatum, Sin. P. alcicorne) del laboratorio de Cultivo de Células Vegetales del Departamento de

Biotecnología en el CEPROBI-IPN. Primeramente se utilizó un frasco para la siembra preliminar; ya

dominada la técnica de siembra in Vitro, se trabajó con tres frascos, los cuales tenían 4 meses de

haber sido sembrados. Este material se localiza en el cuarto de incubación bajo las siguientes

condiciones:

Temperatura 25 ± 1 ºc Fotoperiodo 16 horas luz 8 horas oscuridad Intensidad luminosa 3000 lx. Preparación de medio de cultivo para helecho Reactivos. Sacarosa marca Fermont® Fitagel marca Sigma® Carbón activado 6-Benzilaminopurina citoquinina (BAP) Medio de cultivo El medio de cultivo MS (Murashige and Skoog, (1962)), está compuesto principalmente por sales,

vitaminas y aminoácidos, Se utilizó el recomendado por Evangelista y Col. (2004) (Cuadro 3), para

realizar el escalamiento en la resiembra.

7

Cuadro 3. Componentes utilizados para la preparación de un litro de medio para helecho

PRODUCTO CANTIDAD

M S (Murashige y Skoog, 1962) 4.4 g

Sacarosa 30 g

BAP 0.1 mg

Carbón activado 2 g

Fitagel 2.2 g

pH 5.8

Agua desionizada Aforado a un litro BAP (6-Benzilaminopurina citoquinina) Siembra In vitro de helecho cuerno de alce (Platycerium alcicorne sig. P. Bifurcatum) La metodología involucró dos experimentos, el primero para evaluar la cantidad de plántula

obtenida en frascos tipo Gerber y el segundo para valorar el desarrollo de plántulas de cuerno de

alce a los 20, 40, 60 y 80 días después de la siembra con tres explantes, de 1.0 y 0.5 cm2. De

acuerdo a la técnica propuesta por Evangelista et al., (2004).

Se extrajeron las plántulas con las pinzas y se colocaron en una caja de Petri con agua y se

enjuagó el exceso de medio que contenían las plántulas. Se abrió otra caja Petri y en ella se

volvieron a colocar las plántulas, con el bisturí se hizo el corte de rizoma; se flameó un frasco

Gerber con su respectiva tapa y con la pinza se colocaron tres explantes de rizoma por cada

frasco

En la primera siembra, se realizaron las evaluaciones en cuanto a: número de frascos

contaminados y frascos sanos y número de frondas en los explantes de 1.0 y 0.5 cm2. Esta

siembra fue de 56 frascos, 28 de cada tamaño de explantes (las evaluaciones se realizaron a los

20, 40, 60 y 80 días). Para la cuantificación del número de frondas por frasco, se evaluaron cinco

frascos de cada tratamiento

De manera particular se evaluaron las plántulas a los 80 días de los frascos con un explante, para

esto se dividieron en chicas, medianas y grandes, siguiendo el criterio propuesto por Rodríguez –

Serrano, (2006).

A los 80 días se evaluó el tamaño y número de frondas obtenidas por frasco, listas para

aclimatización, clasificándose en Chicas (0.3 a 0.1.0), medianas (1.3 a 1.8) y grandes (1.6 a más

de 2cm). Se cuantificó el promedio y la desviación estándar

Aclimatización de plántulas de helecho cuerno de alce, utilizando filtros de color, se uso azul,

amarillo, rojo, testigos negro y blanco.

Procedimiento para preparar sustrato para helecho de Platycerium alcicorne Los componentes utilizados en el sustrato fueron: agrolita, vermiculita y turba. La proporción de las

cantidades a realizar, fue de 60-20-20 v/v/v, hidratando con agua purificada mezclando

perfectamente. Una vez obtenida la mezcla se tomó el pH y posteriormente la conductividad

eléctrica del sustrato; sino estaba dentro de los rangos se ajustaba entre (6.0-7.0 �s). Ajustado el

8

pH y tomada la conductividad eléctrica, se colocaron las macetas dentro de la charolas para

después llenarlas con el sustrato preparado, teniendo cuidado que las macetas no quedaran

demasiado saturadas ya que la porosidad es importante para que nuestro sustrato se mantenga

perfectamente hidratado (Figura 1).

Figura 1. Mezclado del sustrato y llenado de macetas para el trasplante de platycerium alcicorne El transplante de plántulas de helechos (Platycerium alcicorne), provenientes de in vitro a charolas,

se realizó en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional en el

Laboratorio de Biotecnología de cultivo de células vegetales y el laboratorio de cultivo ex vitro, para

después llevarlas a su aclimatización en el cuarto de incubación, ubicado en el mismo lugar, a una

temperatura de 26 0C y a una Humedad Relativa del 35%.

Procedimiento para el transplante de plántulas de helechos Platycerium alcicorne de frascos tipo Gerber a charolas Primero se verificó en las charolas que el sustrato que tenían las macetas fuera el suficiente, para

poder transplantar las plántulas de Platycerium alcicorne. Posteriormente se colocaron las tapas

de la caja Petri con agua purificada (una de las tapas de la caja Petri con las plántulas), con

objeto de quitarle el exceso de medio que tenían.

Posteriormente se realizaron los cortes con ayuda de pinzas, quitando siempre lo maltratado y

podrido que tenía la plántula. Una vez obtenidos los cortes, se colocaron en la otra tapa de la caja

Petri, para que no se deshidrataran y subsiguientemente, se sembraron los cortes de las plántulas

en las macetas, con el sustrato preparado anteriormente, cuidando que siempre quedaran al

centro de la maceta, para que así la plántula aproveche todo el sustrato a su alrededor y enraíce

perfectamente.

Las plántulas fueron organizadas en la charola por tamaños, clasificándose como pequeñas,

medianas y grandes. Una vez plantadas todas las charolas, se les agregó Raizal-400R para que no

se deshidrataran las plántulas sembradas, tanto la parte superior como en la inferior. La parte

superior de las plantas se regó con el atomizador. Una vez regadas se taparon las charolas con

los domos, para así mismo rotular cada charola con los datos que tenía de in vitro y la fecha en

que se aclimataron y por último se colocaron en la cámara de incubación.

9

Preparación de solución nutritiva para riego La preparación de solución nutritiva para riego, se realizó en el Centro de Desarrollo de Productos

Bióticos del Instituto Politécnico Nacional en el Laboratorio de Biotecnología de cultivo de células

vegetales para después utilizarla en los helechos Platycerium alcicorne realizados anteriormente

Aclimatización de plántulas Platycerium alcicorne expuestas a diferente filtros de luz La aclimatización de plántulas Platycerium alcicorne, se realizó en el Centro de Desarrollo de

Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional en el Laboratorio de Biotecnología de cultivo

de células vegetales, para después colocar en el cuarto de incubación

Las plántulas se evaluaron cada 15 días después del transplante, tomando en cuenta la longitud de

las frondas y el número de hojas. Se presentaron los datos en promedio y la desviación estándar

por tamaño.

Se utilizó papel celofán (rojo, azul y papel aluminio). Forrando los domos con los colores: rojo, azul,

como testigos el domo sin forro (transparente) y con forro de papel aluminio (negro), sellando con

cinta mágica los domos. Las charolas con los tratamientos de color permanecieron en el cuarto de

incubación (fotoperiodo de 16 horas luz), se registraron los datos de: temperatura, humedad,

intensidad luminosa (dentro y fuera de las charolas). En la planta el número y tamaño de frondas.

Los datos fueron valorados cada 15 días. El color se evaluó a los 0, 30, 60 días. Teniendo 3

repeticiones por tratamiento.

Por tratamiento se evaluaron 36 muestras (12 plantas por charola, tomando las del centro).

Las plantas expuestas a los filtros (papel celofán de color rojo, azul, como testigos el domo

transparente y negro). Se tomaron muestras de la epidermis de las frondas de la parte axial

(superficie de la fronda) y adaxial. Y se elaboraron preparaciones fijas para ser observadas al

microscopio compuesto (10X); así también se evaluó el tamaño y forma de los estomas en el

microscopio de imágenes

Elaboración de preparaciones fijas Se tomó una hoja de cada charola, para después colocarle una capa fina de barniz (de uñas

transparente) dejándolo secar y posteriormente con las unas pinzas se le quitó la capa fina de

barniz colocándola en el portaobjetos (las muestras se deben tomar de la parte central de la hoja

por que es ahí donde están creciendo los estomas), se extrajeron tres muestras por hoja tanto de

la parte axial como de la parte adaxial, para después colocarles unas cuantas gotas de safranina

(para teñir), dejando reposar por 2 minutos aproximadamente, se le quitó la safranina con papel

higiénico, para después agregarle gelatina y colocarle el cubreobjetos, se sellaron las orillas con

barniz y por último se rotula la preparación que se realizó con las datos de donde provenía .

Evaluación de calidad de plantas y flores de cempazúchil

Exposición de semillas para inducir la germinación en diferentes calidades de luz. En laboratorio

(lámparas) y bajo malla policromática (azul, roja, negra y gris) Evaluación del desarrollo de plantas,

intensidad de floración y contenido de carotenoides.

10

Para la investigación se utilizo semilla de Tagetes erecta de la Variedad Nana. Con lo que se

aseguro la calidad del material en cuanto a porcentaje de germinación y homogeneidad en el

desarrollo.

Se realizaron dos experimentos uno en el que se evalúo la germinación, emergencia y crecimiento

de la plántula bajo lámparas de luz de diferente calidad

Se utilizaron 20 semillas por caja Petri de cada tratamiento (5 repeticiones). Los datos se

analizaron mediante Modelos Lineales Generalizados con el programa SAS.

En cuanto a la emergencia y crecimiento se evaluaron los mismos tratamientos, con la técnica

propuesta por Evangelista Lozano, et al. (1998), colocando semillas en macetas negras de 7

pulgadas con sustrato mezcla, elaborado con turba, agrolita y vermiculita (3-1-1 v/v), pH ajustado a

5.8 ± 0.3, porosidad del 86%, regadas a capacidad de campo con agua natural.

La lectura de los datos se realizó cada 24 Hr durante 15 días. Con los datos obtenidos se evaluó

color, altura de la planta y número de hojas definitivas.

Establecimiento del cultivo de Tagetes erecta en invernadero

La segunda etapa para evaluar el desarrollo, floración y contenido de carotenoides de

inflorescencia de plantas expuestas bajo diferentes mallas de color. Las emillas fueron germinadas

en charolas de de 38 cavidades con sustrato mezcla en el laboratorio de Propagación ex vitro del

CeProBi-IPN. Plantas con tres hojas definitivas y con un tamaño de 12 ± 2cm (30 días de edad

contando desde la siembra). Estas fueron trasladadas al Centro de Desarrollo Tecnológico de

Tezoyuca del FIRA, ubicado en Tezoyuca, Municipio de Emiliano Zapata, Morelos. Aquí las plantas

de Tagetes erecta se transplantaron en macetas de 7 pulgadas en una mezcla de sustrato que

consistió en una mezcla de turba, agrolita y vermiculita en proporción 3:1:1 con un pH de 5.8 ± 2 y

con una porosidad del 86%. El invernadero utilizado fue tipo casa sombra con 2.5 m de altura, la

separación entre malla y malla fue de 12 metros con un porcentaje de sombra del de 50%. Las

mallas utilizadas fueron Chromatinet de la marca Polysack®, de los siguientes colores: negro, gris,

azul y rojo.

Color de la planta (cartas para tejidos vegetales Munsell),

Aspecto general de la planta (calidad comercial de las plantas).

En cada una de las mallas se midió, la temperatura, la humedad relativa (HR %) y la intensidad de

luz que fue medida con una cuantómetro marca Apogee® con un rango de 0-1000 µmol de fotones

m-2 s-1.

Para la caracterización de los pigmentos en inflorescencias se realizó en inflorescencias las cuales

se procesaron en el laboratorio de Biogeoquímica de la Unidad de Biotecnología y Prototipos de la

FES-Iztacala de la UNAM.

Identificación y cuantificación de pigmentos mediante hplc en fase reversa y en gradiente Se realizó la identificación y cuantificación de las inflorescencias de los diferentes estados de

desarrollo. La técnica utilizada fue cromatografía de líquidos de alta resolución, HPLC, para lo cual

se utilizó un cromatógrafo de líquidos Hewlett Packard modelo 1100 equipado con una bomba

11

cuaternaria y un detector UV-Vis con arreglo de diodos. Las condiciones cromatográficas fueron las

siguientes: Fase móvil constituyente de:

a) Disolvente A: Acetonitrilo-Metanol-TRIS*HCl pH 8.0 0.1 M 108/12/4.5 (v/v, v/v, v/v).

b) Disolvente B: Metanol-Hexano 80/ 20 (v/v, v/v, v/v)

La elución fue en gradiente; iniciando con 100% del disolvente A durante 5 min y en 2.5 min se

cambia con el disolvente B al 100% manteniéndose durante 7.5 min teniendo un tiempo total de

corrida de 15 min, con un flujo constante de 2.0 mL/min con un detector de arreglo de diodos a

470 nm y un barrido entre 300 y 700 nm. Para la identificación de pigmentos se realizó con una

columna Allsphere ODS 1-5 µl

Vinculación con productores

Recorridos en viveros, entrevistas con productores sobre Impartición de conferencias, tallares y

transferencia de tecnología de ornamentales. Se trabajo con productores del Estado de Guerrero,

con Fundación produce de Guerrero.

12

RESULTADOS Mantenimiento de planta madre Se cuenta en el área de viveros, denominada dentro del Organigrama como LABORATORIO DE

CULTIVO EX VITRO, con plantas madre de buganvilla de las variedades Sorpresa, Variegata,

morada y San Vicente. Estas e4stan en desarrollo y constante mantenimiento, y son mostradas en

cada visita que hacen productores, así como estudiantes.

En Cempazúchil se trabajo con la Variedad nana para las pruebas de germinación y desarrollo y

floración con diferente calidad de luz. Así también se trabaja en vinculación con el Dr. Miguel Ángel

Serrato Cruz, Investigador de la Universidad Chapingo, quien nos proporcionó ejemplares de

plantas de una de sus selecciones, que hizo con fin ornamental que denominamos “PORTE BAJO

CHAPINGO”, estas están en campo. Se realizaron nuevas plantaciones considerando las plantas

proporcionadas como PROGENITORAS, se realizó colecta de semilla y se tiene la FILIAL 1 (F 1).

esta en proceso de germinación para la Filial 2. a más tardar en el mes de junio del 2007, se

tendrán plantas de la F 4. En reunión de trabajo con el DR. Serrato, se acordo realizar el registro

de la variedad, en la que estaremos como autores. Ya que estamos colaborando con la

reproducción, toma de datos de tamaño de receptáculo, segregación, tamaño. Este es un trabajo

de continuidad. Y forma parte de las metas del Proyecto 2007 0099.

Las orquídeas después de la obtención de las vainas, que posteriormente se utilizaron para

siembra in vitro; se donaron, ya que por las condiciones ambientales, no era posible mantenerlas

en el área.

Las plantas madre de Helechos continúan dándoles mantenimiento.

Para todas las plantas el mantenimiento cosiste en: regado cada semana o cuando requieran el

riego, estas se mantienen con un contenedor que permite almacenar el agua y el regado es por

capilaridad, también es un sistema desarrollado y probado en el CEPROBI. La solución de riego es

un producto comercial a una concentración del 0.1% RAIZALR.

En buganvilla además de los riegos el mantenimiento consiste en realizar podas constantes, ya

que se mantienen en condiciones de intemperie e invernadero (Figura 4).

Figura 4. Primera imagen buganvilla Variedad Sorpresa, Segunda San Vicente y última muestra plantas en invernadero con sistema de riego por capilaridad (Sin gasto de energéticos).

13

Escalamiento en la propagación

El material con que se cuenta es producto del escalamiento en la propagación, los microesquejes

de buganvilla fue posible repetir los resultados en este caso ya con raíz en la segunda resiembra

con en medio MS (Murashige and Skoot, 1962). Propagar a nivel piloto el cultivo de buganvilia in

vitro, por microesqueje y estacas de 14 cm en condiciones de invernadero, colecta de esquejes,

estacas, desinfección y preparación de sustrato.

En cuanto al sustrato el mejor para el estaca de buganvilla es la Mezcla elaborada con: turba

(60%), agrolita (20%), vermiculita calibre mediano (20%), y el pH ajustado a 5.8 ± 0.3. Este sustrato

presenta características de pH, porosidad (85%), tales que permiten la aireación de las raíces,

motivo por el que es posible reproducir estacas en bolsas sin perforaciones, con que se tienen un

ahorro en solución nutritiva de riego y en mano de obra.

Inducción de brotación múltiple

Se realizaron estudios diferentes concentraciones de ANA Y BAP para la inducción a la

multibortación de protocormos de orquídea Trichocentrum carthagenence), con reguladores del

crecimiento en protocormos completos y en cortes basales y apicales.

A los 4 meses, de la siembra, se formaron protocormos definidos. Los protocormos completos y

con RGV se obtuvo mayor ganancia en peso fresco de PLB´s y plántulas, que en las porciones

apicales y basales (Cuadro 4).

Cuadro 4. Resultados de peso y plántulas generadas de protocormos completos y porciones con RCV

Tratamiento Corte/ mg/l ANA/ mg/l BAP

P F(g) PLB´s

PF (g) Total **

Núm. plántulas.

Apical 0.2 ANA /0.0 BAP 0.6 6.65 11 Basal 0.0 ANA/ 0.0 BAP 5.52 6.92 11 Completo 0.2 ANA / 0.2 BAP 3.32 7.25 32

P. F.: peso fresco ** plantas y PLB´s Trichocentrum carthagenence (Jacq.) Sw., presenta mayor sebrevivencia y desarrollo en fibra (base del pecíolo) de palma soyate. En cuanto a la obtención de gametofitos de helechos silvestres: Descripción del sitio de colecta. Con respecto a los ejemplares colectados en campo de las especies en estudio, se obtuvieron 2

plantas adultas con un duplicado cada una. Se lleno las formas LABC-01 (información del sitio de

colecta) y LABC-02 (información de cada ejemplar), ambas propuestas por el INEGI

(www.inegi.gob.mx) para colectas de plantas en campo. A los ejemplares herborizados y

montados, con base a lo establecido en Manual de Herbario del Consejo Nacional de la Flora de

México, se les anexo las formas antes mencionadas. La mitad de los ejemplares se quedaron en el

Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos Vegetales y la otra mitad se depositaran en el Herbario

ENCB de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.

Se identificaron los ejemplares colectados con ayuda de bibliografía especializada (Mickel y Smith,

2004) y con la asesoría del curador del herbario, la M. en C. María de la Luz Arreguín Sánchez del

14

Herbario ENCB de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN. El nombre científico de las

especies en estudio es:

Adiantum poiretii Wikstr.(Figura 5) Asplenium muenchii A. R. Sm. .(Figura 6) Asplenium sessilifolium Desv.(Figura 7)

5 6 7 Figura 5. Fronda de un individuo de Adiantum poiretii Wikstr Figura 6. Aspecto general de un individuo de Asplenium muenchii A.R. Sm Figura 7. . Aspecto general de un individuo de Asplenium sessilifolium Desv., Ges Con respecto al registro de las coordenadas geográficas (latitud y longitud) y altitud con el GPS

(marca Garmin® modelo GPS III Plus), los resultados se muestran en el Cuadro 5.

. Cuadro 5. Ubicación geográfica del sitio de colecta

En la parte de la estimación de la abundancia de cada especie de estudio utilizando la escala de

abundancia-cobertura de Braun-Blanquet y el Índice de Densidad Lineal –DLi- y la Cobertura Lineal

-CL- (www.nps.gov.), obtenidos por transectos (Cuadro 6).

ESPECIE SITIO DE COLECTA (Edo. de Morelos)

COORDENADAS ALTITUD msnm

Asplenium muenchii

A. R. Sm.

El Salto Tetela del Volcán

N 18o 55.21´ WO 098o 45.922’

2305

Asplenium sessilifolium Desv.

Barranca Agua Bendita Jumiltepec

N 18o 55.22´ WO 098o 45.924´

2284

Adiantum poiretii Wikstr.

Barranca Agua Bendita Jumiltepec

N 18o 55.22´ WO 098o 45.924´

2284

15

Cuadro 6. Abundancia de las especies en estudio.

Medias de tres determinaciones de cobertura con la escala de Braun-Blanquet y de tres transectos ± error estándar

TRANSECTOS (LINEA CANFIELD) ESPECIE

COBERTURA (Braun-Blanquet)

INDICE DE DENSIDAD LINEAL DLi

COBERTURA LINEAL CL

Asplenium muenchii

A. R. Sm.

3.33±0.57 1±0.2 0.8±0.1

Asplenium sessilifolium Desv.

3.66±0.57 1.3±0.2 0.8±0.26

Adiantum poiretii Wikstr.

1.56±0.57 1.03±0.51 0.73±0.25

Establecimiento del medio semisólido de cultivo y sustrato hortícola adecuado para la germinación de las esporas in vitro. Los resultados de los 5 protocolos de desinfestación de las esporas en los medios MS, K, MT y los

sustratos hortícolas (MAQ, TUR, VERM, PER y SEH), en cada una de las especies se muestran en

los Cuadros 7, 8 y 9:

16

Cuadro 7. Germinación de las esporas de Asplenium muenchii A. R. Sm. en medios y sutratos

Los datos son medias de la evaluación de tres frascos por cada tratamiento.

PROTOCOLO DE DESINFESTACIÓN

MEDIO DE CULTIVO Y/O SUSTRATO

GRADO DE GERMINACIÓN* DE LAS ESPORAS

1 0 2 0 3 0 4 0 5

MS1

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5

MS2

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5

MS3

2.66 1 0 2 0 3 0 4 0 5

MK

1.33 1 0 2 0 3 0 4 0 5

MT

0.66 5 MAQ 2.66 5 TUR 0 5 VER 3 5 PER 1.66 5 SEH 0.66

17

Cuadro 8. Germinación de las esporas de Asplenium sessilifolium Desv. en medios y sustratos

Los datos son medias de la evaluación de tres frascos por cada tratamiento

PROTOCOLO DE DESINFESTACIÓN

MEDIO DE CULTIVO Y/O SUSTRATO

GRADO DE GERMINACIÓN* DE LASESPORAS

1 0 2 0 3 0 4 0 5

MS1

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5

MS2

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5

MS3

2.33 1 0 2 0 3 0 4 0 5

MK

0.66 1 0 2 0 3 0 4 0 5

MT

2.33 5 MAQ 3 5 5 SEH 0.33 5 VER 2.66 5 PER 1.33

18

Cuadro 9. Germinación de las esporas de Adiantum poiretii Wikstr en medios y sustratos

Los datos son medias de la evaluación de tres frascos por cada tratamien

PROTOCOLO DE DESINFESTACIÓN

MEDIO DE CULTIVO Y/O SUSTRATO

GRADO DE GERMINACIÓN DE LASESPORAS

1 0 2 0 3 0 4 0 5

MS1

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5

MS2

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5

MS3

1.33 1 0 2 0 3 0 4 0 5

MK

0.33 1 0 2 0 3 0 4 0 5

MT

5 MAQ 2 5 5 SEH 1 5 VER 1.66 5 PER 0.66

El grado de germinación de las esporas (*) se evaluó usando una estimación porcentual subjetiva,

basada en la respuesta de las esporas a cada protocolo de desinfestación, medio y/o sustrato. La

escala es la siguiente:

0= Sin germinación, ya sea por contaminación del medio o sustrato, o por no presentarse

germinación aún sin contaminarse el medio o sustrato.

1= Las esporas germinadas (que formaron gametófitos) cubren entre 25 y 50% del frasco de

cultivo.

2= Las esporas germinadas (que formaron gametófitos) cubren entre 50 y 75% del frasco de

cultivo.

3= Las esporas germinadas (que formaron gametófitos) cubren entre 75 y 100% del frasco de

cultivo (Figura 8).

19

Figura 8. Formación de gametofitos, como resultado de la germinación de las esporas, en medios de cultivo semisólidos y en sustratos hortícolas: A. Gametofitos de Adiantum poiretii Wikstr en medio MS, B. Gametofitos de Asplenium sessilifolium Desv. creciendo en medio MS,C. Gametofitos de Asplenium muenchii A. R. Sm en agrolita y D. Gametofitos de Asplenium sessilifolium Desv. sobre vermiculita Pruebas de viabilidad de esporas. Los resultados de someter las muestras de esporas a diferentes colorantes fueron negativos en

tres de los cuatro colorantes: tetrazolio, diacetato de fluoresceína (DAF), Azul de Evans,

obteniendo una reacción positiva solo con el Reactivo de Mutzing, cuyos resultados se muestran

en el cuadro 10.

Cuadro 10. Viabilidad de las esporas de los helechos en estudio, utilizando el reactivo de Mutzing. ESPECIE

% VIABILIDAD

Asplenium muenchii A. R. Sm 68.5±12.3

Asplenium sessilifolium Desv. 73.4±7.85

Adiantum poiretii Wikstr 54.3±4.56

Los datos son promedios de tres repeticiones, ± desviación estándar.

20

En cada repetición se contaron 50 esporas, separándolas en viables cuando la tinción fue total e

inviables cuando no se observo tinción o fue parcial y de ahí se obtuvo el porcentaje de viabilidad.

En cuanto a la descripción del sitio de colecta se obtuvieron datos de las variables ambientales y

físicas del hábitat de cada especie (Cuadro 4), los cuales fueron usados en la germinación de las

esporas, aclimatización de plantas madre de campo y de la siembra de explantes de hojas jóvenes

y yemas apicales, sobre todo en lo que respecta a los datos de temperatura, humedad relativa y

pH.

Se identificaron las especies de estudio y se obtuvieron datos de su abundancia en los sitios de

colecta (con los valores de abundancia-cobertura de Braun-Blanquet, índice de densidad lineal –

DLi- y cobertura lineal-CL-), los cuales nos indican, en general, que las especies de estudio

presentan una abundancia de baja a intermedia(www.nps.gov)-Cuadro 6-, lo cual es adecuado

para fines de obtención de material para esporas o de explantes, además de que el impacto

ecológico de las poblaciones de campo estaría en un nivel medio, en comparación si su

abundancia fuera baja en todos los sitios de colecta.

En lo referente a la aclimatización de las plantas madre de campo (es decir de plantas de campo

que se seleccionaron como fuentes de esporas o explantes, que cubrían las características

fenológicas más importantes de las especies en estudio y sobre todo aquellas para fines

ornamentales), los resultados no fueron adecuados, ya que la generación de frondes jóvenes fue

muy lenta, y esto redujo el no. de explantes disponibles, además de que no se formaron yemas o

esporas.

El no lograr una buena aclimatización de las plantas madre de campo posiblemente se debió a que

las condiciones ambientales, sobre todo de temperatura y humedad relativa, de estas especies en

campo (Cuadro 4), no son las que prevalecieron en el vivero ni en el cuarto de incubación. Es por

ello que se decidió obtener explantes directamente de plantas de campo.

En el establecimiento de el medio y/o sustrato de cultivo para la germinación de las esporas, los

primero 4 protocolos de desinfestación, así como los medio MS1 y MS2 no generaron respuesta

positiva, ya que los frascos con medio se contaminaban con hongos y bacterias y aquellos en lo

que no se observo contaminación, tampoco se presento germinación de las esporas.

Esto ultimo debido quizá a que el NaOCl daña la pared de las esporas, facilitando que penetre

hasta la célula germinal, provocando que pierda su viabilidad. Es por ello que se decidió hacer

pruebas de viabilidad de las esporas usadas en los cultivos (Cuadro 11), de los reactivos que se

usaron el único que dio respuesta fue el de Mutzing, el cuál al contener carmín acético tiñe las

esporas que contienen ácidos nucleicos, lo cual es un indicativo de viabilidad (Andrada et al.,1998).

El protocolo que resulto favorable para la germinación de las esporas fuel el 5, así como el medio

MS3 MK, MT y los sustratos hortícolas MAQ, SEH, VER y PER. El que germinaran las esporas

utilizando el protocolo 5 sugiere que el etanol no disminuye considerablemente la viabilidad de las

esporas. Además de que resulta efectivo para controlar problemas de contaminación en los medios

de cultivo y sustratos utilizados.

21

A pesar de obtener germinación adecuada tanto en medios de cultivo como en sustratos, la

mayoría de los gametófitos formados no forman plántulas, lo cual se puede deber a varias causas:

por influencia del medio o sustrato, de las condiciones ambientales de los mismos o por la

información genética propia de cada especie, por lo que no se logro obtener explantes de hojas o

rizomas de origen in vitro.

Escalamiento en la propagación in vitro de helecho

Producción de plantulas de helecho, en resiembras, para calcular el número de plantulas por

frasco, provenientes de explantes de raíz a nivel piloto de helecho cuerno de alce.

Otro tipo de factores externos al cultivo in vitro, que pueden modificar el desarrollo de las plantas,

para el caso de Platycerium bifurcatum, serían: fotoperiodo, iluminación y temperatura y

competencia por nutrientes, que pueden influir en el número de frondas formadas y su tamaño.

En cuanto al número de frondas presentadas por los explantes de 1.0 (Grandes) y 0.5 cm2

(pequeños), se cuantificó mayor cantidad en los explantes de 1.0 cm2 (Cuadro 11). Las frondas de

los explantes pequeños tuvieron un tamaño muy semejante como lo indica el dato de la desviación

estándar. Sin embargo, para optar por una propagación masiva, se recomienda utilizar los

explantes de rizoma con un tamaño que oscile en un centímetro cuadrado, ya que fueron las que

presentaron mayor número de frondas

Cuadro 11. Número de frondas por frascos con explantes de 1.0 y 0.5 cm2 en la primera fase de

siembra de Platycerium bifurcatum.

NÚMERO DE FRONDAS POR MUESTREO (0, 20, 40, 60 y 80 días) EN EXPLANTES DE 1.0 Y 0.5 cm2

20 40 60 80 FRASCOS

0

1.0 0.5 1.0 0.5 1.0 0.5 1.0 0.5

1 0 2 2 9 5 16 7 19 9 2 0 1 2 10 4 15 6 18 7 3 0 2 4 8 5 12 6.5 15 8 4 0 3 3 11 6 13 8 16 10 5 0 2 2 12 4 14 6 17 8 PROMEDIO 0 2 2.6 10 2.6 14 6.7 17 8.4 DESVEST 0 0.63 0.8 1.41 0.8 1.41 0.75 1.58 1.14

A los 80 días es recomendable fraccionar los explantes, ya sea para resiembra o para llevarlos a la

aclimatización. Debido a que en este tiempo están listos; además es importante considerar que por

el número de frondas, se presenta competencia por los nutrientes y el espacio.

Este análisis se complementó realizando la siembra con uno y con tres explantes, (Cuadro 12). A

los 80 días los frascos con un explante presentaron 12.8 ± 3.76 frondas en promedio y los de 3

explantes 18.6 ± 1.34. Los frascos con 3 explantes aunque presentaron mayor número de frondas,

la mayoría presentó un tamaño pequeño (datos no presentados).

22

Cuadro 12. Número de frondas por frasco con uno y tres explantes de helecho cuerno de alce

NÚMERO DE FRONDAS POR MUESTREO (0, 20, 40, 60 y 80 días) CON UNO Y TRES EXPLANTES POR FRASCO DE 1.0 cm2

20 40 60 80 FRASCOS

0

1 3 1 3 1 3 1 3

1 0 1 8 2 10 5 15 9 18 2 0 2 10 3 15 6 18 15 20 3 0 1 8 2 12 4 14 18 17 4 0 1 11 2 16 4 18 14 20 5 0 2 12 3 14 5 16 8 18 PROMEDIO 0 1.4 9.8 2.4 13.4 4.8 16.2 12.8 18.6

DESVEST 0

0.55 1.6 0.55 2.15 0.84 1.79 3.76 1.34 A los cuatro meses, las plántulas ya estaban aptas para ser transplantadas a sustrato (Cuadro 13). Cuadro 13. Número de plántulas obtenidas por frasco para aclimatización

Tamaño de frondas Número frasco Chicas Medianas Grandes Total 1 9 18 5 32

2 14 12 6 32

3 4 17 11 32

4 2 20 10 32

5 5 25 2 32 PROMEDIO 6.8 18.4 6.8 32.0 DESVEST 4.8 4.7 3.7 0.0 PORCENTAJE 21.2 57.6 21.2 100

Se sugiere que debido al crecimiento de las frondas, cuando se requiera resembrar para

mantenimiento in vitro, se coloquen tres explantes; no así, cuando se pretenda resembrar para

aclimatizar las plántulas. En este último caso se recomienda colocar un solo explante por frasco,

con lo que se dará mayor libertad de desarrollo a las frondas, evitando así el agotamiento del

medio; ya que aunque sean menos plántulas, el tamaño es mayor. En frascos con plántulas de

cuatro meses, es posible obtener un promedio de 32 plántulas con tamaño que va del chico al

grande, y de acuerdo a lo reportado por Rodríguez-Serrano, (2006), tienen mayor desarrollo las

que tienen frondas medianas

Aclimatización de plántulas de helecho cuerno de alce, utilizando filtros de color, se uso azul,

amarillo, rojo, testigos negro y blanco. Se cuantifico el número de plantas sobrevivientes, número

de frondas, longitud de la fronda más grande fértil, número de estomas, durante la aclimatización.

Evaluación del número y desarrollo de frondas a los 0, 15, 30, 45 y 60 días durante la aclimatización con domo blanco (transparente), rojo, azul y negro (papel aluminio) A partir del transplante de plántulas a sustrato y durante las evaluaciones desde los 0 hasta los 60

días, el número más alto de frondas formadas en promedio fue de 2.6 en el tratamiento azul, y el

más bajo de 2 en el tratamiento rojo. En el Cuadro 14 se reportan los datos de cada uno de los

23

muestreos. Hubo plántulas que presentaron una sola fronda y la mantuvieron; otras ganaron

frondas a los 15, 30 o 45 días después del transplante.

También hubo algunas plántulas que sus frondas se marchitaron y se desprendieron; sin embargo,

se observaron algunas plántulas excepcionales que de tener una fronda ganaron hasta 10 a los 60

días. En el caso del tratamiento negro, se dieron de baja las plántulas ya que no sobrevivieron en

la oscuridad total.

Cuadro 14. Total de frondas ganadas desde los 0 hasta los 60 días en los diferentes tratamientos (CEPROBI, 2006). Exposición de helechos a diferentes filtros de color Macetas Transparente Rojo Azul Negro 1 2 2 1.7 Baja 2 2 3 2.3 Baja 3 2 4 3.3 Baja 4 2.7 3 2.7 Baja 5 1.7 3 3.3 Baja 6 2.3 3 2.7 Baja 7 3.3 3 3.7 Baja 8 2 2 3.0 Baja 9 2.3 3 2.7 Baja 10 1 4 2.0 Baja 11 0.7 2 2.3 Baja 12 6 2.3 1.3 Baja Prom. 2.3 2 2.6 Baja Des. Est. 1.3 2 0.7 Baja Las charolas con filtro de color rojo presentaron en promedio 2 frondas a los 60 días con una

desviación estándar de 2.0. Mientras que la plantas con filtro azul tuvieron una ganancia de 2.6

frondas a los 60 días después del transplante y sujetas a 26° C y un fotoperiodo de 16 horas luz y

8 horas de oscuridad. Es muy importante mencionar que el número de frondas por planta fue muy

similar en este tratamiento no presentarán segregación (desviación estándar 0.7) (Cuadros 14). El

productor en los compromisos de venta, ya que el número de frondas será parejo entre los

helechos.

La longitud de las plantas fue mayor en las expuestas al domo transparente (1.4), dato numérico

diferente a las expuestas al filtro rojo y azul; estas dos últimas muy semejantes (Cuadro 15). Es

posible que para la propagación comercial, se expongan las plántulas a filtro azul para obtener un

mayor número de frondas y después de 60 días retirar el filtro para incrementar la longitud de

estas, pudiendo ser el periodo de aclimatización de 60 a 90 días; considerando 30 días más sin

filtro.

24

Cuadro 15. Longitud de frondas desde los 0 hasta los 60 días en los diferentes tratamientos (CEPROBI, 2006).

Exposición de helechos a diferentes filtros de color Macetas Transparente Rojo Azul Negro 1 1.6 1.2 0.8 Baja 2 1.5 0.6 1.4 Baja 3 1.1 0.7 1.4 Baja 4 1.1 1.1 1.0 Baja 5 0.6 1.3 1.0 Baja 6 0.6 1.2 1.1 Baja 7 1.1 1.0 0.8 Baja 8 2.0 1.1 0.7 Baja 9 2.0 1.3 0.7 Baja 10 2.0 1.0 1.0 Baja 11 1.0 1.4 0.6 Baja 12 2.4 1.4 1.1 Baja Prom. 1.4 1.1 1.0 Baja Des. Est. 0.7 0.3 0.3 Baja

Las plántulas fueron medidas al inicio, por lo que se clasificaron como: chicas, medianas y

grandes). A los 60 días, de acuerdo a los datos numéricos se observó que las plantas que

presentaron una longitud de entre 1.0 a 2.3 cm al transplante fueron las que acumularon una

longitud de 3.0 a 3.3 cm a los 60 días.

En el Cuadro 16, se muestra el promedio de la intensidad luminosa durante los 60 días de

observación, alcanzada de acuerdo a cada tratamiento. Mostrando que las charolas que tuvieron

mayor intensidad luminosa fueron las de filtro blanco, debido a que por el filtro (transparente)

absorbieron mayor luz, obteniendo el promedio más alto de 39.96 µmol.m2.seg-1, siguiéndole el

tratamiento el rojo y azul con 7.4, y al final el tratamiento negro con un promedio de 1.8

µmol.m2.seg-1 (tomando en cuenta que solo se evaluó una vez, ya que se dieron de baja antes de

los 15 días después de su aclimatización) de intensidad luminosa.

Cuadro 16. Promedio de la intensidad luminosa (µmol.m2.seg-1) alcanzada en el cuarto de incubación de acuerdo a cada tratamiento (CEPROBI, 2006). Tratamiento Muestreos cada 15 días dentro de cada charola (µmol.m2.seg-1) Color de filtro 0 15 30 45 60 Promedio Blanco 40.7 39.7 42.7 38.7 38 39.96 Rojo 6.7 6.3 9 8 7.3 7.46 Azul 10.8 5 7.7 7.7 6 7.44 Negro 2 2 2 1 2 1.8

µmol.m2.seg-1: Micro moles por metro al cuadrado por segundo a la menos uno (cantidad de fotones que llega a la superficie que se mide)

Las charolas expuestas a mayor intensidad luminosa presentaron un mejor desarrollo debido

posiblemente a que con la presencia de luz, se realizan las funciones de fotosíntesis,

25

incrementándose la longitud de las células; mientras que en la oscuridad se incrementa el número

de células, reflejándose en el aumento en el número de frondas.

.- Las plántulas de helecho cuerno de alce expuestas, alcanzaron promedios de:

- Filtro transparente 2.3 frondas y una longitud de 1.4 cm a los 60 días.

- Filtro rojo 2.0 frondas y una longitud de 1.1 cm a los 60 días.

- Filtro azul 2.6 frondas y una longitud de 1.0 cm a los 60 días.

2.- Las plántulas de 1.0 a 2.3 cm al transplante fueron las que acumularon una longitud de 3.0 a

3.3 cm a los 60 días en los tres tratamientos.

3.- El número de estomas en la región adaxial (envés) de las fronda fue semejante en todos los

tratamientos.

4.- Las plántulas provenientes de in vitro, y en los tratamientos de los filtros de color no

presentaron estomas en la región axial (haz); no así las plantas ex vitro, presentaron estomas

altamente nítidos en las dos regiones (axial y adaxial).

Se amplia información e imágenes en los escritos de la tesis sustentadas de licenciatura.

Evaluación de calidad de plantas y flores de cempazúchil

Exposición de semillas para inducir la germinación en diferentes calidades de luz. En laboratorio

(lámparas) y bajo malla policromática (azul, roja, negra y gris) Evaluación del desarrollo de plantas,

intensidad de floración y contenido de carotenoides.

En las condiciones ensayadas de acuerdo a la prueba estadística no se detectó un efecto

significativo de la iluminación sobre el poder germinativo de T. erecta ni sobre el crecimiento de las

plántulas, con las lámparas de color, pues se observó que en los tratamientos con luz: roja, azul,

amarilla y blanca, se obtuvo un porcentaje de germinación que fue homogéneo durante las

primeras 48 h posteriormente, se observan ligeras variaciones en la velocidad de germinación.

Se encontró el efecto positivo de la luz en la germinación de las semillas de T. erecta ya que los

porcentajes de germinación e IVG de los tratamientos con luz, de todos los lotes, superaron a los

tratamientos de oscuridad. Los dos tratamientos que generaron los porcentajes de germinación

más altos fueron los que contaban con luz roja y azul, mientras que en oscuridad presentó el valor

más bajo y fue diferente al resto de los tratamientos (Figura 9).

Figura 9. Prueba de germinación en caja Petri con las semillas de T. erecta.

26

Efecto de la malla sombra de color sobre la fenología de Tagetes erecta

I. Las plantas terminada (listas para la venta) fueron: • Malla Roja = 77% • Malla Gris = 19% • Malla Azul = 13% • Malla Negra = 21 %

II. El porcentaje de flores abiertas contra cerradas (en botón) para esta fecha y desde un punto de vista como atractivo comercial: • Malla Roja = 70% • Malla Gris = 67% • Malla Azul = 64% • Malla Negra = 44%

III. La carga total de flores (abiertas y cerradas) por planta fue: • Malla Roja = 20 • Malla Gris = 15 • Malla Azul = 14 • Malla Negra = 9

Bajo malla roja se consiguió el mejor porte de planta, mayor precocidad, mejor uniformidad en

crecimiento y el más alto porcentaje coincidente para venta. Logró el mayor número de flores,

notoriamente de mayor tamaño y el menor nivel de infestación de mosca blanca

Para el analisis de carotenoides se definieron cuatro etapas de desarrollo de la flor (Figura 10)

Figura 10. Establecimiento de las cuatro etapas de las inflorescencias de cempaxúchil I. Pedúnculo corto, II. Pedúnculo largo, III. 25 % de lígulas expuestas (flor semiabierta), IV. 100% de lígulas expuestas (flor abierta) para el análisis de la cuantificación de xantofilas totales. Extracción y cuantificación del contenido de xantofilas totales por espectrofotometría uv/vis

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 Etapa 4

Etapas de Desarrollo

Xan

tofil

as T

otal

es (g

/Kg)

IntemperieMalla Roja Malla Azul Malla Gris Malla Negra

Figura 10. Contenido de xantofilas totales en las cuatro etapas de desarrollo.

27

El contenido de xantofilas, en la etapa 1 (botón cerrado) en los diferentes tratamientos no

mostraron diferencias significativas, en la etapa 2 se empieza a observar un ligero aumento con las

plantas que estuvieron expuestas con la malla roja (mr) y por debajo de éste la malla azul (ma). Sin

embargo, se puede apreciar que es aquí cuando se observa una tendencia clara a aumentar los

niveles de xantofilas con las mr y ma, pero en mayor proporción la mr. Posteriormente en las

etapas 3 y 4 los niveles de xantofilas totales con mr se obtienen valores de 3.65, con la ma de 3.27

que son significativamente diferentes (etapa 4) con respecto a las plantas que estuvieron a la

intemperie en donde se obtiene un valor de 2.48 y por debajo de este contenido las demás mallas

(gris, y negra). En la Figura 1 se muestra la relación del contenido de xantofilas totales para cada

tratamiento. Estos resultados muestran que bajo estas condiciones de cultivo podemos obtener

ventajas significativas que cuando se cultiva de forma tradicional. Esto puede representar menores

costos pues se pueden obtener altos rendimientos de pigmentos en un área menor, modificar el

ritmo crecimiento vegetativo, ya que este cultivo es anual.

Identificación y cuantificación de pigmentos mediante hplc en fase reversa y en gradiente

Para saber las cantidades que se acumulan durante las cuatro etapas de desarrollo de las

inflorescencias, se llevo a cabo la extracción y cuantificación de cis-luteína, luteína y zeaxantina.

El cromatograma típico obtenido de las cuatro etapas de las inflorescencias que corresponde al

perfil cromatográfico de un extracto de cempaxúchil completamente saponificado de acuerdo a lo

reportado por Delgado-Vargas y Paredes-López (1996), ya que es importante hacer la

saponificación total, porque los pigmentos de forma natural se encuentran esterificados. En los

cromatogramas se observó tres picos principales con un tiempo de retención de 7.56 m que

correspondió a luteína, el tiempo de retención de zaexantina fue de 8.02 min. Posteriormente

cuando el tiempo de corrida aumentó de 15 a 30 min se observaron picos adyacentes que

correspondieron a los epóxidos de luteína. De manera general aumentó el contenido de luteína

aumentó gradualmente durante el proceso de desarrollo de las inflorescencias. Se observó que el

tratamiento con la malla roja fue la que presentó el nivel más alto de pigmentos, seguida de la

malla azul y por debajo de estas las plantas que estuvieron expuestas a la intemperie (Figura 24).

De manera general, el contenido de las xantofilas aumentó gradualmente durante el desarrollo de

las inflorescencias analizadas. Se observó que las planas que estuvieron expuestas a la malla roja

el nivel de pigmentos fue más alto en comparación con las demás.

Las inflorescencias de las plantas mostraron diferencias en la intensidad de color en los pétalos

aunque todas fueron de la misma variedad; sin embargo se observaron perfiles cromatográficos

similares. Se observaron diferencias muy marcadas en cuanto al contenido de pigmentos en cada

una de las etapas de desarrollo analizadas.

vinculación con productores

28

Recorridos en viveros, entrevistas con productores sobre Impartición de conferencias, tallares y

transferencia de tecnología de ornamentales. Se trabajo con productores del Estado de Guerrero,

con Fundación produce de Guerrero. Con la vinculación de productores se iniciaron estudios con el gladiolo, el cual fue propagado en

dos módulos con productores.

Esto dio lugar a la impartición de un taller de 20 horas, para productores en el Municipio de

Alpoyeca, Guerrero.

Se anexa en este reporte final de proyecto la productividad como es la presentación de trabajos en

congresos nacionales e internacionales, conferencias, cursos, convenios y formación de alumnos.

De Tres alumnos de la Maestría en Desarrollo de Productos Bióticos del CEPROBI, se anexan las

cartas de aprobación de comité de de revisión de escrito de la tesis.

Se espera que en el mes de marzo presenten la tesis terminada.

Por la productividad y generación de resurso humanos, se considera un proyecto de impacto.

29

Bibliografía Ammirato, P.V., D.R. Evans, W.R. Sharp and Y.P.S. Bajaj (eds.). 1990. Handbook of plant cell

culture. Vol. 5. Ornamental Species. McGraw-Hill Publishing Company. N. Y. USA. pp. 599 Evangelista Lozano, Aldana Lllanos L., Valdés Estada Ma. Elena. 1998. Germinación de Annona

cherimola. Proc. ISTH. Vol. 43. 231-234. Evangelista, L. y col., 2004, “Lanza el CEPROBI Tecnología para la Producción de cuerno de alce”

ed. Nueva época núm. 29. Órgano informativo de Divulgación Tecnológica de la Fundación Produce Morelos A.C. p.p. 7-11

Evangelista, L., Escobar A., Del Villar M., Jiménez A.,”Propagación in vitro” en forma apospórica de Platycerium bifurcatum” octubre, 2004. Pros. ISTH.. Vol 47. p.p. 7-9

Knudson C. 1946. A new nutrient solution for orchid seed germination. American Orchid Society Bulletin, 15, 214-17Klekowski, 1969

Luna, 2002 Mendoza-Ruiz A. C. 2001. Morfogénesis de la fase sexual de pteridofitas mexicanas. Familia

Dryopteridacea. Tesis de Maestría. UAM-I. Mickel J. T. y Smith A. R. 2004. The Pteridophytes of México. The New York Botanical Garden,

U.S.A Montoya-Casimiro M. del C., Álvarez-Varela R., Pérez-Hernández S. y Arreguín-Sánchez Ma. de la

L. 2000. Ciclos biológicos de Blechnum occidentale L. var. occidentale (Blechnaceae-Pteridophyta) y Thelypteris resinifera (Desv.) Proctor (Thelypteridaceae-Pteridophyta). An. Esc. Nac. Cienc. Biól.. México. 46:317-339.

Murashige, T. and Skoog, F.1962. A revised medium for rapid growth bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 28:pp.167-173.

Rodríguez-Serrano. 2006, Aclimatización de Helechos Cuerno de Alce (Platycerium alcicorne (cav) C.CHR.) tesis en trámite. Universidad Tecnológica de Tecamac

Salvo, E. 1998. Helechos. Cáp. 12. En: Botánica. Izco, J.; Barreno, E.; Burgués, M.; Devesa, J.; Fernández, F.; Gallardo, T.; Llimona, X.; Salvo, E.; Talavera, S.; Valdés, B. ed. Mc Graw Hill. Interamericana. México p.p. 353-363.

www.inegi.gob.mx www.nps.gov.

30