Técnicas de Biotecnología

Métodos de detección, Métodos de detección, identificación y cuantificación identificación y cuantificación

de moléculas en de moléculas en Recombinación de ADNRecombinación de ADN

Objetivo

• Conocer las diversas técnicas para detección, Conocer las diversas técnicas para detección,

identificación y cuantificación de:identificación y cuantificación de:

– ADN, ADN,

– RNA y RNA y

– ProteínasProteínas

Determinación de la presencia de Determinación de la presencia de organismos modificados organismos modificados genéticamente (OGM)genéticamente (OGM)

1.1. Colecta de las muestras a analizar Colecta de las muestras a analizar • OGM OGM

2.2. Homogeneización de las muestras. Homogeneización de las muestras. • Liberación de los componentes celulares Liberación de los componentes celulares

por lisis.por lisis.

3.3. Adición de amortiguadores específicos para el Adición de amortiguadores específicos para el aislamiento de ADN, de ARN o de proteínas.aislamiento de ADN, de ARN o de proteínas.• Separar las moléculas de muestras Separar las moléculas de muestras

complejas.complejas.• Evitar la degradación de las moléculas.Evitar la degradación de las moléculas.

4.4. Detección de ADN, de ARN o de proteínas Detección de ADN, de ARN o de proteínas transgénicas:transgénicas:• ADN.ADN.

• Amplificación por PCR de secuencias blanco.Amplificación por PCR de secuencias blanco.• Detección por Southern blot de secuencias Detección por Southern blot de secuencias

blanco. blanco. • ARN.ARN.

• Amplificación por RT-PCR de secuencias Amplificación por RT-PCR de secuencias blanco.blanco.

• Detección por Northern blot de secuencias Detección por Northern blot de secuencias blanco. blanco.

• Proteínas.Proteínas.• Western BlotWestern Blot• ELISA.ELISA.

5.5. Identificación y cuantificación de la molécula Identificación y cuantificación de la molécula detectada.detectada.

6.6. Interpretación y reporte de resultados.Interpretación y reporte de resultados.

Determinación de la presencia de Determinación de la presencia de organismos modificados organismos modificados genéticamente (OGM)genéticamente (OGM)

Aspectos de la Aspectos de la CuantificaciónCuantificación

• Muestreo y preparación de la muestraMuestreo y preparación de la muestra– El procedimiento determina la representatividad del El procedimiento determina la representatividad del

resultadoresultado

– Evaluar el tamaño de la muestra, su homogeneidad y Evaluar el tamaño de la muestra, su homogeneidad y

el umbralel umbral

• Deben cumplirse requerimientos estadísticosDeben cumplirse requerimientos estadísticos

– Las matrices requeridas dependerán del tipo de Las matrices requeridas dependerán del tipo de

materialmaterial

Métodos de análisis basados en Métodos de análisis basados en la detección de proteínasla detección de proteínas

1.1. Los transgenes codifican proteínas nuevasLos transgenes codifican proteínas nuevas2.2. Las técnicas inmunológicas utilizan Las técnicas inmunológicas utilizan

anticuerposanticuerpos– Ideales para necesidades cualitativas y Ideales para necesidades cualitativas y

cuantitativascuantitativas– Detectan proteínas específicas en matrices Detectan proteínas específicas en matrices

complejascomplejas• El analito debe ser conocidoEl analito debe ser conocido• Puede haber interferencia por interacciones no específicas Puede haber interferencia por interacciones no específicas

con otras proteínas, con sulfactantes (saponinas), con con otras proteínas, con sulfactantes (saponinas), con fenoles, con ácidos grasos y con fosfatasasfenoles, con ácidos grasos y con fosfatasas

2.12.1 Anticuerpos policlonales Anticuerpos policlonales– El reconocimiento es muy sensitivo pero es menos El reconocimiento es muy sensitivo pero es menos

específicoespecífico2.2 2.2 Anticuerpos monoclonalesAnticuerpos monoclonales– El reconocimiento es altamente específico, pero es El reconocimiento es altamente específico, pero es

menos sensiblemenos sensible

La técnica de “Western Blot”La técnica de “Western Blot”

• Prueba cualitativa altamente específicaPrueba cualitativa altamente específica• Puede determinar si hay niveles por debajo o Puede determinar si hay niveles por debajo o

superiores al umbral mínimo de OGM (superiores al umbral mínimo de OGM (~0.8 – ~0.8 – 5%).5%).

• Es utilizada principalmente en investigaciónEs utilizada principalmente en investigación

1.1. Usar electroforesis desnaturalizante SDS-PAGEUsar electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE– Solubiliza y remueve agregados y proteínas Solubiliza y remueve agregados y proteínas

adventiciasadventicias

+

La ElectroforesisLa Electroforesis

• El principio de la electroforesis de El principio de la electroforesis de proteínas (intactas) se basa en su carga proteínas (intactas) se basa en su carga neta y en su habilidad para migrar neta y en su habilidad para migrar dentro de una matriz gelatinosa dentro de una matriz gelatinosa (poliacrilamida “proteínas” o agarosa (poliacrilamida “proteínas” o agarosa “ADN o RNA”).“ADN o RNA”).

• Se aplica una corriente eléctrica a la Se aplica una corriente eléctrica a la mezcla de proteínas por un período de mezcla de proteínas por un período de tiempo hasta que las proteínas migren y tiempo hasta que las proteínas migren y se separan o fraccionen con base en su se separan o fraccionen con base en su tamaño.tamaño.

SDS - PAGESDS - PAGE

AspGlu

Ala

PheLys

Gln

Al final, las proteínas quedan Al final, las proteínas quedan separadas por su tamañoseparadas por su tamaño

Escalera de Escalera de masas molecularesmasas moleculares

2. Las proteínas fraccionadas en el gel son entonces transferidas a una soporte sólido (nitrocelulosa o PVDF)

La técnica de “Western Blot”La técnica de “Western Blot”

Adicionar anticuerpos

primarios

Enjuagar nuevamen

te

Los anticuerpos se unirán a proteínas específicas

Enjuagar con H2O bidestilada

3. Bloquear el soporte (con leche descremada)

La técnica de “Western Blot”La técnica de “Western Blot”

5. Revelar la reacción para desarrollar el color

Deben apreciarse bandas teñidas con el color de la reacción revelada por la enzima unida al anticuerpo secundario

4. Adicionar anticuerpos secundarios, dirigidos contra los anticuerpos primarios y unidos a una enzima

Anticuerpo primario Anticuerpo primario (dirigido contra una proteína específica)(dirigido contra una proteína específica)

Anticuerpo secundario Anticuerpo secundario (dirigido contra el anticuerpo primario)(dirigido contra el anticuerpo primario)

La técnica de “Western Blot”La técnica de “Western Blot”

Ensayo de ELISA en microplacaEnsayo de ELISA en microplaca(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)

El ensayo se desarrolla en microplacas cubiertas con El ensayo se desarrolla en microplacas cubiertas con anticuerpos.anticuerpos.

Es un ensayo Es un ensayo cuantitativocuantitativo, altamente sensible, , altamente sensible, económico, permite el manejo de muestras económico, permite el manejo de muestras múltiples e ideal para análisis de laboratoriomúltiples e ideal para análisis de laboratorio

Se requiere que la proteína esté Se requiere que la proteína esté desnaturalizadadesnaturalizada

Ac secundario marcado dirigido

contra el Ac primario

Respuesta colorida,

dependiente de la

concentración de OGM

pozoAntígeno

Proteína bloqueado

ra

Anticuerpo primario, específico

para el antígeno

Placa de ELISA

Ahmed, 2002

Muestra Muestra

Proteína Proteína BtBt Línea deLínea depruebaprueba

LíneaLíneacontrolcontrol

Barra 1Barra 1Anticuerpo Anticuerpo

anti anti BtBt

Barra 3Barra 3Anticuerpo Anticuerpo

no específico no específico

Barra 2Barra 2Anticuerpo Anticuerpo

anti anti BtBt

MarcadoMarcadoNo fijoNo fijo

No marcadoNo marcadoFijoFijo

No marcadoNo marcadoFijoFijo

Ensayo de tira de flujo lateralEnsayo de tira de flujo lateral

Ensayo de tira de flujo Ensayo de tira de flujo laterallateral

Ahmed, 2002

• Es una variante del método Es una variante del método de ELISA, los anticuerpos de ELISA, los anticuerpos inmovilizados, específicos inmovilizados, específicos para las proteínas GM son para las proteínas GM son acoplados a un reactivo acoplados a un reactivo colorido e incorporados en colorido e incorporados en tiritas de nitrocelulosa.tiritas de nitrocelulosa.

• Es rápido, económico, Es rápido, económico, portátil y bueno para portátil y bueno para ensayos iniciales.ensayos iniciales.

LíneaLíneacontrolcontrol

Línea Línea de de

pruebaprueba

Resultado Resultado negativonegativo

Resultado Resultado positivopositivo

Métodos basados en el ADNMétodos basados en el ADN

• Se basa en la complementariedad Se basa en la complementariedad de las hebras del ADN, que hibridan de las hebras del ADN, que hibridan en una manera dependiente de la en una manera dependiente de la secuenciasecuencia

• El ADN transgénico posee diversos El ADN transgénico posee diversos elementos únicos en los cultivoselementos únicos en los cultivos

promotor 35S Gen Gen codificantecodificante

terminador NOSCaMV Agrobacterium tumefaciens

•Los elementos típicamente presentes en el ADN transgénico Los elementos típicamente presentes en el ADN transgénico son: una secuencia promotora (35S), un gen estructural y una son: una secuencia promotora (35S), un gen estructural y una señal de terminación de la transcripción (NOS)señal de terminación de la transcripción (NOS)

Componentes básicos de genes

transferidos- El ADN transferido por métodos

biotecnológicos consiste básicamente en tres componentes.- Una secuencia que regula la transcripción del gen codificante (promotor).

- El gen codificante.- Una secuencia que marca el fin de la transcripción.

ADN, preparación de la ADN, preparación de la muestramuestra

Requerimientos para la extracción de ADNRequerimientos para la extracción de ADN

– La muestra de laboratorio debe ser representativa de la La muestra de laboratorio debe ser representativa de la

muestra del campo o de la muestra alimentariamuestra del campo o de la muestra alimentaria

– Tener entre 100 y 350 mgTener entre 100 y 350 mg

– Debe tener una alta calidadDebe tener una alta calidad

• El tamaño completo y libre de daños en la secuenciaEl tamaño completo y libre de daños en la secuencia

– Efectos adversos por el calor, bajo pH, nucleasas, despurinización, Efectos adversos por el calor, bajo pH, nucleasas, despurinización,

degradación enzimática, etc.degradación enzimática, etc.

– ADN de alta purezaADN de alta pureza

• Se afecta por contaminación de las matrices alimentariasSe afecta por contaminación de las matrices alimentarias

– Polisacáridos, lípidos, polifenoles y químicos de la extracción del Polisacáridos, lípidos, polifenoles y químicos de la extracción del

ADNADN

Requerimientos para la extracción de ADN

• Ruptura de las paredes celulares– Con hielo seco o con nitrógeno líquido

• Desintegración de las membranas celulares– Con detergentes como el CTAB o el SDS

• Inactivación de nucleasas– Adicionar EDTA (une Mg2+) y proteasas

• Separación de polisacáridos inhibitorios• Separación de componentes celulares hidrofóbicos

– E.g.. Lípido y polifenoles

• Separación del ADN del detergente, por medio de precipitación con alcohol

Southern BlotSouthern Blot

1. Comienza con el corte del ADN GM por medio de

enzimas de restricción.

2. El DNA cortado se fracciona por electroforesis en

un gel de agarosa.

3. El DNA fraccionado se transfiere a un soporte

sólido.

4. El DNA fraccionado se hibrida en el soporte con una

sonda marcada.• Radiactividad.• Digoxigenina.

5. La membrana hibridada se expone a una película

La técnica de la hibridación del DNA, o Southern blot, se basa en el hecho de que dos cadenas complementarias se alinearán y formarán un híbrido.

1. Corte del DNA con enzimas de restricción.

Las enzimas de restricción cortan al DNA en sitios específicos, de tal manera que se generan segmentos de DNA de tamaños definidos

Cátodo

Solución amortiguadora

Gel de agarosa

Ánodo

+

2. El DNA cortado se fracciona por electroforesis en un gel de agarosa.

Herbert Boyer inventó una técnica para fragmentar al DNA, la electroforesis Herbert Boyer inventó una técnica para fragmentar al DNA, la electroforesis en gel. En esta técnica, sen gel. En esta técnica, se aplica corriente eléctrica en los extremos de un e aplica corriente eléctrica en los extremos de un gel en donde se han depositado muestras de DNA, de tal manera que las gel en donde se han depositado muestras de DNA, de tal manera que las moléculas de DNA cargadas negativamente se desplazan hacia el electrodo moléculas de DNA cargadas negativamente se desplazan hacia el electrodo positivo (ánodo) y pueden separarse en función de su tamaño.positivo (ánodo) y pueden separarse en función de su tamaño.

3. El DNA cortado se fraccionado se transfiere a un soporte sólido.

• Por capilaridad.• Por aplicación de corriente eléctrica

Soporte sólidoSoporte sólido(nylon)(nylon)

GelGel SoluciónSolución

PesaPesa

Papel Papel absorbenteabsorbente

Papel Papel WhatmanWhatman

Sonda marcada con fósforo radiactivo [-

32P]dCTP

4. El DNA fraccionado se hibrida en el soporte con una sonda marcada

5. La membrana hibridada se expone a una película.

Principios de la Principios de la PCR• Permite la amplificación exponencial

de una secuencia blanco de ADN.

• La ADN polimerasa hace copias exactas del templado.

• Se requieren cebadores sintéticos que:– Se localizan en los bordes de la

secuencia deseada.– Son complementarios a la

secuencia del ADN transgénico.

• El número de copias de la secuencia blanco crece exponencialmente.– En teoría…

Cycles DNA molecules formed

1 - 2 1 3 2 4 4 5 8 6 16 7 32 8 64 9 128 10 256 11 512 12 1,024 13 2,048 14 4,096 15 8,192 16 16,384 17 32,768 18 65,536

Construcción Génica

Promotor(señal de inicio)

Terminador(señal de terminación)

Gen codificante de unanueva característica

A A A A A A A A

En la tanscripción se produce un ARN mensajero, copia fiel

del gen original

En la traducción se produce una cadena de aminoácidos o

proteína

P T

Construcción Génica

Promotor(señal de inicio)

Terminador(señal de terminación)

Gen codificante de unanueva característica

Las secuencias blanco para la detección por PCR de secuencias de ADN de OGM en plantas, tienen el siguiente orden de especificidades:

1 = baja especificidad; 4 = evento específico de la transformación

Confirmación de la identidad Confirmación de la identidad del ADN que se ha del ADN que se ha

sintetizado por medio de sintetizado por medio de PCRPCR

(+) (+) (+)

(–) (–) (–)

•Verificación del tamaño por electroforesis en gel de agarosa.

Problema: Artefactos Problema: Artefactos del mismo tamaño del mismo tamaño darían lugar a falsos darían lugar a falsos positivos.positivos.

Transferencia de los fragmentos de

restricción a un filtro de nylon

•Verificación del tamaño por medio de ensayos de Southern Blot.

Problema: Ensayo apropiado pero un poco Problema: Ensayo apropiado pero un poco tardado.tardado.

Exposición del filtro a una película de

rayos X

Fragmentos de DNA. Hay tantos que se ve una sola banda

Fragmentos de DNA que

ya se transfirieron al filtro de

nylon

La sonda radiactiva hibrida con

el DNA complementario, pero no

es visible todavía.

Las bandas visible en la película de

rayos X significan

que la sonda hibridó

Hibridación del filtro con la

sonda radiactiva

Filtro

Gel

Verificación del tamaño por medio de PCR anidadoPCR anidado, con un segundo par de cebadores

La primera PCR se hace con cebadores externos (La primera PCR se hace con cebadores externos (azulazul))

La segunda PCR se hace con cebadores internos (La segunda PCR se hace con cebadores internos (rojorojo))

5’

5’5’

5’

3’

3’

3’

3’Primer amplicón

5’

3’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

Segundo amplicón

Verificación del tamaño por medio de PCR anidadoPCR anidado, con un segundo par de cebadores

•Secuenciación. Es el único método que no da lugar a dudas.

C G T A C G T A C G T A C G T AG T A

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCGTCCGGA

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCGTCCGG

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCGTCCG

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCGTCC

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCGTC

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCGT

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCG

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCC

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGC

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGG

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCG

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGC

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAG

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGA

• La amplificación exponencial por PCR se La amplificación exponencial por PCR se

incrementa hasta que se alcanza una meseta, incrementa hasta que se alcanza una meseta,

esto ocurre entre 30 y 40 ciclos.esto ocurre entre 30 y 40 ciclos.

– Porque se limitan los componentes de la reacción.Porque se limitan los componentes de la reacción.

– En esas etapas hay una pérdida de la precisión en la En esas etapas hay una pérdida de la precisión en la

cuantificación.cuantificación.

• Los ensayos de RT-PCR (para detectar ARN) son Los ensayos de RT-PCR (para detectar ARN) son

proporcionales al número de ciclos.proporcionales al número de ciclos.

– Durante la fase exponencial del PCR.Durante la fase exponencial del PCR.

– Se determina el número de ciclos en donde el producto Se determina el número de ciclos en donde el producto

sea igual en cantidad al producto de la muestra OGM.sea igual en cantidad al producto de la muestra OGM.

PCR en tiempo real (Cuantitativo)PCR en tiempo real (Cuantitativo)

PCR en tiempo real (Cuantitativo)PCR en tiempo real (Cuantitativo)

RT-PCRRT-PCR• El ARN es transcrito a ADN complementario

por medio de una transcriptasa reversa aislada o clonada de un virus como el del HIV.

• Se cuantifica por la presencia de pigmentos, por medio de sondas fluorescentes y por la hidrólisis de sondas– Permite diferenciar los artefactos y los productos

verdaderos.

• Se requiere de una cantidad mínima de ARN como sustrato.– Es independiente del tamaño del genoma y del

número de copias del gen• Se necesitan al menos 36 copias para detectar un

transgen en una muestra OGM. Brodman et al., 2002

Métodos basados en el ARN:Métodos basados en el ARN:

Resumen de los Métodos de detección de Resumen de los Métodos de detección de moléculas transgénicasmoléculas transgénicas

Ahmed, 2002

Parameter Western blot ELISA Lateral flow strip Southern blot Qualitative PCR QC-PCR RT-PCR

Ease of use Difficult moderate Simple Difficult Difficult Difficult Difficult

Special equipment needed

Yes Yes No Yes Yes Yes Yes

Sensitivity High High High Moderate Very High High High

Duration 2d 30 - 90 min 10 min 6h 1.5d 2d 1d

Cost/sample 150 5 2 150 250 350 450

Quantitative No Yes No No No Yes Yes

Field application No Yes Yes No No No No

Where applied Academic lab Test facility Field Testing Academic lab Test facility Test facility Test facility

ProteínaProteína ADNADN ARNARN

Ejemplos de métodos publicados para la determinación Ejemplos de métodos publicados para la determinación de grupos derivados de OGM, agrupados de acuerdo de grupos derivados de OGM, agrupados de acuerdo

con su especificidad en plantas.con su especificidad en plantas.

Target sequenceTarget sequence ReferenceReference

Method to detect plant derived DNAMethod to detect plant derived DNA

ChloroplastChloroplast tRNA tRNALeuLeu gene gene (trnL) intron(trnL) intron Taberlet & al., 1991Taberlet & al., 1991

Methods to detect specific plant speciesMethods to detect specific plant species

Corn/maizeCorn/maize single copy invertase gene single copy invertase gene Ehlers & al., 1997Ehlers & al., 1997

SoybeanSoybean single copy lectin gene single copy lectin gene Meyer & al., 1996Meyer & al., 1996

TomatoTomato single copy polygalacturonase gene single copy polygalacturonase gene Busch & al., 1999Busch & al., 1999

Screening methods (category 1)Screening methods (category 1)

Cauliflower mosaic virus promoter (Cauliflower mosaic virus promoter (P-35SP-35S)) Pietsch & al., 1997Pietsch & al., 1997

Nopaline synthase terminator (Nopaline synthase terminator (T-NosT-Nos)) Pietsch & al., 1997Pietsch & al., 1997

Gene specific methods (category 2)Gene specific methods (category 2)

barbar (phosphinotricin acetyltransferase) (phosphinotricin acetyltransferase) genegene Ehlers & al., 1997Ehlers & al., 1997

CryIA(b) geneCryIA(b) gene (synthetic) (synthetic) Ehlers & al., 1997; Vaïtilingom & Ehlers & al., 1997; Vaïtilingom & al., 1999al., 1999

Construct specific methods (category 3)

Bt11 maize: junction alcohol dehydrogenase 1S intron IVS6 (enhancer) - CryIA(b) gene

Matsuoka & al., 2001

Bt176 maize: junction CDPK (calcium dependent protein-kinase) promoter - synthetic CryIA(b) gene

Hupfer & al., 1998

GA21 maize: OTP (enhancer) - epsps gene (RoundupReady tolerance) Matsuoka & al., 2001

Mon810 maize: junction P-35S - heat shock protein (hsp) 70 intron I (enhancer)

Zimmermann & al., 1998

Mon810 maize: junction hsp 70 intron - CryIA(b) gene Matsuoka & al., 2001

RoundupReady®: junction P-35S - Petunia hybrida CTP (chloroplast transit peptide)

Wurz & Willmund, 1997

T25 maize: junction pat (phospinotricin acetyltransferase) gene - T-35S Matsuoka & al., 2001

Zeneca tomato: junction T-Nos - truncated tomato polygalacturonase gene

Busch & al., 1999

Event specific methods (category 4)

Bt11 maize: junction host plant genome - integrated recombinant DNA  Zimmermann & al., 2000

RoundupReady® soybean: junction host plant genome - integrated recombinant DNA

Berdal & Holst-Jensen, in press; Taverniers & al., in press; Terry & Harris, in press

Ejemplos de métodos publicados para la determinación Ejemplos de métodos publicados para la determinación de grupos derivados de OGM, agrupados de acuerdo de grupos derivados de OGM, agrupados de acuerdo

con su especificidad.con su especificidad.