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Método cinético UV para la determinación de urea ensuero o plasma

SIGNIFICACION CLINICALa urea constituye la fracción de nitrógeno no proteico másimportante en la mayoría de los líquidos biológicos. En elhombre es el principal producto final del metabolismo protei-co. Se produce en el hígado y es excretada por la orina através de los riñones.Una elevación de la concentración sérica de urea, se inter-preta generalmente como una posible disfunción renal. Sinembargo, no debe dejarse de lado el hecho de que los valoresséricos de urea se encuentran íntimamente relacionados conla dieta y el metabolismo proteico, por lo que cualquier altera-ción en estas variables se traducirá en un cambio de la con-centración de urea en suero.

FUNDAMENTOS DEL METODOBasado en el siguiente esquema reaccionante:

ureasaurea + H2O > 2 NH3 + CO2

GlDHNH3 + NADH + H+ + 2-oxoglutarato > l-glutamato +

NAD+ + H2O

REACTIVOS PROVISTOSStandard: solución de urea 0,60 g/l.Buffer: solución de buffer Goods pH 7,9.Enzimas: viales conteniendo 2-oxoglutarato, NADH, ureasay glutamato deshidrogenasa (GlDH).

Concentraciones finales2-Oxoglutarato .................................................... 7,5 mmol/lNADH .............................................................. 0,28 mmol/lUreasa ................................................................. ≥ 4000 U/lGlDH ...................................................................... ≥ 400 U/lGoods ................................................................. 100 mmol/l

INSTRUCCIONES PARA SU USOStandard : listo para usar.Reactivo de Trabajo:- 4 x 50 ml: disolver el contenido de un vial de Enzimas en unfrasco de Buffer. Enjuagar varias veces el vial con Buffer. Mez-clar suavemente por inversión hasta disolución completa, evi-tando la formación de espuma. Fechar.- 10 x 20 ml: disolver el contenido de un vial de Enzimas con20 ml de Buffer. Mezclar suavemente por inversión hasta di-solución completa, evitando la formación de espuma. Fechar.

PRECAUCIONESLos Reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOReactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC)hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Reactivo de Trabajo: en refrigerador (2-10oC) es estable 30días a partir del momento de su preparación.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOSREACTIVOSCuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua,lecturas de Absorbancia del Reactivo de Trabajo inferiores a1,000 D.O. (a 340 nm) son indicio de deterioro del mismo, porlo que debe descartarse.

MUESTRASuero o plasmaa) Recolección: obtener suero de la manera usual o plasma.b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plas-ma, se recomienda el uso de heparina o Anticoagulante W deWiener lab. para su obtención.c) Sustancias interferentes conocidas:- Los anticoagulantes que contienen fluoruros inhiben la ac-

ción de la ureasa.- Los vapores amoniacales contaminan la muestra, produ-

ciendo valores falsamente aumentados.Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de lasdrogas en el presente método.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la ureaen suero es estable varios días en refrigerador o 6 meses encongelador, sin agregado de conservadores.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Espectrofotómetro- Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.- Cubetas espectrofotométricas- Cronómetro

CONDICIONES DE REACCION(disminución de la absorbancia)- Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 ó 366)- Temperatura de reacción: 37oC- Tiempo de reacción: 2 minutos- Volumen de muestra: 10 ul- Volumen de Reactivo de Trabajo: 1 ml- Volumen final de la reacción: 1,01 mlSe pueden alterar proporcionalmente los volúmenes de mues-tra y de reactivo a fin de acomodarlo a los requerimientos delos distintos espectrofotómetros.

cinética AA

Urea

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d) Recuperación: agregando cantidades conocidas de urea adistintos sueros, se obtuvo una recuperación entre 96 y 102 %para todo nivel de urea estudiado.

PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOSLongitud de onda primaria ....................................... 340 nmLongitud de onda secundaria (bicromática) ............. 380 nmTipo de reacción ...................................................... cinéticaDirección de la reacción ...................................... disminuyeTemperatura de reacción .............................................. 37oCRelación muestra/reactivo .......................................... 1:100Tiempo de equilibrio ........................................... 3 segundosTiempo de retardo ............................................ 60 segundosTiempo de lectura ............................................ 60 segundosAbsorbancia de Blanco ................................... > 1,200 D.O.Límite de Absorbancia ..................................... ≥ 0,800 D.O.Linealidad ..................................................................... 3 g/lPara las instrucciones de programación consulte el manualdel usuario del analizador en uso.

PRESENTACION- 10 x 20 ml (Cód. 1810322).- 4 x 50 ml (Cód. 1810323).

BIBLIOGRAFIA- Searcy, R.L. - "Diagnostic Biochemistry" McGraw-Hill, New

York, NY 1969.- Talke, H.; Schubert, G.E. - Klin Wochschr 43:174, 1965..- Tiffany, T.O.; Jansen, J.M.; Burtis, C.A.; Overton, J.B.; Scott,

C.D. - Clin. Chem. 18:829, 1972.- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests",

AACC Press, 4th ed., 2001.- Faulkner, W.R.; King, J.W. - "Fundamentals of Clinical

Chemistry". Tietz NW (Ed) W.B. Saunders Co. PhiladelphiaChap 12:718, 1970.

PROCEDIMIENTOEquilibrar los reactivos a la temperatura de trabajo antesde agregar la muestra.Llevar a cero el espectrofotómetro con agua destilada. Enuna cubeta mantenida a la temperatura de trabajo, colocar:

Reactivo de Trabajo 1 ml

Muestra o Standard 10 ul

Mezclar inmediatamente (sin invertir) y disparar simultá-neamente un cronómetro. A los 60 segundos exactos me-dir la absorbancia (D1 o S1 ) y continuar la incubación. Me-dir nuevamente la absorbancia (D2 o S2 ) a los 120 segun-dos (60 segundos después de la 1° lectura). Determinar ladiferencia de absorbancia (ΔA). Utilizar esta diferencia paralos cálculos.

CALCULO DE LOS RESULTADOS

0,60 g/lUrea (g/l) = f x (D1 - D2 ) f =

(S1 - S2)

METODO DE CONTROL DE CALIDADStandatrol S-E 2 niveles.

VALORES DE REFERENCIASuero o plasma: 0,10 - 0,50 g/l

Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propiosvalores de referencia.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.- Para preservar la integridad de los reactivos debe emplearse

material volumétrico perfectamente limpio y seco.- Evitar contaminaciones con amoníaco provenientes del am-

biente (ej.: humo de cigarrillo, vapores de amoníaco).- No mezclar por inversión, dado que el sudor contiene urea.

PERFORMANCEa) Reproducibilidad: procesando simultáneamente 20 re-plicados de una misma muestra, se obtiene:

Nivel D.S. C.V.0,50 g/l ± 0,011 g/l 2,32 %1,83 g/l ± 0,024 g/l 1,33 %

b) Límite de detección: depende del fotómetro empleado yde la longitud de onda. De acuerdo con la sensibilidad reque-rida, en espectrofotómetro a 340 nm (con cubetas de carasparalelas de 1 cm de espesor, reproducibilidad ± 2 nm, luzespuria ≤ 0,5 %, semiancho de banda ≤ 8 nm) para 0,001D.O. el mínimo cambio de concentración detectable será de0,01 g/l.c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 3 g/l de urea. Paravalores superiores, diluir la muestra original 1:2 con agua des-tilada y repetir la determinación. Corregir los cálculos multi-plicando el resultado por el factor de dilución empleado.

Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Inscripto M.S.Disp. Nº: 450/97Cert. Nº: 1864/97

Wiener lab.2000 Rosario - Argentina