Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con ... · Mecanismo de ionización basado en la...

Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o

aceptar protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI

Brian Alejandro Castro Agudelo

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

2014

Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o


Brian Alejandro Castro Agudelo

Tesis o trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias Química

Director (a):

César Augusto Sierra Ávila, Ph.D.

Línea de Investigación:

Síntesis Química

Grupo de Investigación:

Grupo de investigación en Macromoléculas

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

2014

Y vosotros, rosal florecido,

lebreles sin amo, luceros, crepúsculos,

escuchadme esta cosa tremenda: ¡He Vivido!

He vivido con alma, con sangre, con nervios, con

músculos,

y voy al olvido...

Porfirio Barba Jacob

Agradecimientos

El autor expresa su más sincero agradecimiento al departamento administrativo de

ciencia, tecnología e innovación, COLCIENCIAS por la financiación recibida a través del

proyecto No. RC0041-2013 y agradezco a la Vicerrectoría de Investigación de la

Universidad Nacional de Colombia por la financiación recibida a través de los proyectos

16060 y 16071. También agradezco a la Facultad de Ciencias de la Universidad

Nacional de Colombia por el financiamiento otorgado durante mi maestría a través de la

beca auxiliar docente.

Agradezco primeramente a mi Familia, a mis hermanos, que ha sido mi apoyo

incondicional. A mi madre Adriana Agudelo y a mi hermana Lorena Castro, porque han

sido mujeres profundamente inspiradoras en mi vida. Agradezco a la Universidad

Nacional de Colombia, que es y siempre será mi Alma Mater. Agradezco muchísimo al

profesor César Sierra, pues él me dio la oportunidad de trabajar, y siempre me depositó

su voto de confianza. Agradezco a todos mis amigos del grupo de investigación en

Macromoléculas: Melissa, Diana, Camilo y William, y todos de quienes me nutrí como

científico y ser humano. Agradezco mucho a mis amigos incondicionales que me dieron

su apoyo durante estos años de construcción, a Diana, Nicolás, Alberto, Laura, Yina,

Luisa, Nicolás, Lina, Félix, Jorge, en y en general a todo el equipo. También agradezco a

Alejandra y Lucía quienes fueron apoyo durante este proceso.

VIII Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o aceptar

protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI

Resumen y Abstract IX

Resumen

Fueron sintetizados 3 sistemas fenilenvinileno empleando la reacción de Mizoroki-Heck y

sus propiedades optoelectrónicas fueron determinadas. Pudo ser establecido que tienen

características ideales para ser probadas como matrices MALDI. Se realizaron

experimentos empleando 4 péptidos como analitos y los fenilenvinileno como matrices

MALDI de transferencia protónica. Se determinó que los péptidos no podían ser

ionizados por los fenilenvinileno, debido a que los fenilenvinileno no formaban cationes

protonados sino que formaban cationes radicales y por tanto no cumplían el objetivo de

servir como matrices de transferencia protónica. Debido a su tendencia a formar cationes

radicales, los fenilenvinileno se establecieron como potenciales matrices de transferencia

electrónica y se probaron con 4 analitos modelo de hidrocarburos policíclicos aromáticos.

Los resultados mostraron que los fenilenvinileno se comportaban como excelentes

matrices de transferencia electrónica, aumentando la señal del ion molecular y

disminuyendo la fragmentación de cada analito.

Como respuesta a la búsqueda de matrices de transferencia protónica, objetivo inicial de

esta investigación, se sintetizaron 6 derivados de ácido acrílico y se emplearon como

matrices con tres péptidos. Los resultados muestran un alto potencial como matrices de

transferencia protónica y uno de estos derivados presentó resultados comparables a la

matriz comercial más usada.

Palabras clave: Mizoroki-Heck, fenilenvinileno, ácidos acrílicos, matriz, MALDI,

Knoevenagel, hidrocarburo policíclico aromático, péptido.

X Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o aceptar

protones, y su posible aplicación como matrices para MALDI

Abstract

Three phenylenevinylene systems were synthesized using the Mizoroki-Heck cross

coupling and their optoelectronic properties were determined. It could be established that

FV have ideal properties for to be tested as MALDI matrices. Experiments were made,

using 4 peptides as analytes and FV as proton transfer MALDI matrices. It was

determined that peptides could not be ionized due FV do not form protonated ions, but

form radical cations and therefore they do not accomplished the objective of to be used

as transfer proton matrices.

Due to radical cations FV were established as potential electron transfer matrices and

they were tested with 4 polycyclic aromatic hydrocarbons model-analytes. Results

showed that FV that FV have a good behavior as electron transfer matrices, rising up

signal to noise ratio and suppressing fragmentation for analytes.

As response to quest of proton transfer matrix, that was an initial objective for this

research, 6 acrylic acid derivatives were synthesized and their absorption properties were

determined. They were used in experiments with 3 peptides and satisfactory results were

found. Then almost compound made proton transfer process and one derivative showed

results comparable to commercial matrix.

Keywords: Mizoroki-Heck, phenylenevinylene, acrylic acid, matrix, MALDI,

Knoevenagel, Polycyclic aromatic hydrocarbon, peptide.

Contenido XI

Contenido

................................................................................................................ Pág.

Resumen .................................................................................................................... IX

Lista de figuras ............................................................................................................ XIV

Lista de tablas ............................................................................................................ XVII

Lista de Símbolos y abreviaturas ............................................................................. XVIII

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Síntesis de sistemas FV ......................................................................................... 15 1.1 Materiales ...................................................................................................... 15

1.1.1 Reactivos ............................................................................................ 15 1.1.2 Equipos ............................................................................................... 15

1.2 Síntesis de estirenos precursores .................................................................. 16 1.2.1 4-Cloroestireno.................................................................................... 17 1.2.2 p-Divinilbenceno .................................................................................. 17

1.3 Yodación de compuestos aromáticos ............................................................ 18 1.3.1 1,4-Diyodo-2,5-dimetoxibenceno ......................................................... 18 1.3.2 1,4-Diyodo-2,5-dimetilbenceno ............................................................ 18

1.4 Esterificación de ácido vinilbenzóico .............................................................. 19 1.4.1 metil-4-vinilbenzoato ........................................................................... 19

1.5 Reacción de acoplamiento de Mizoroki-Heck ................................................ 19 1.5.1 E,E-2,5-Dimetoxi-1,4-bis[2-(4-cloroestiril)] benceno (FVCl) ................. 20 1.5.2 E,E-1,4-Bis[2-(4-metil carboxilatoestiril)] benceno (FVCOOMe) .......... 20 1.5.3 E,E-2,5-Dimetil-1,4-bis[2-(4-metil carboxilato estiril)] benceno (FV-COOMe-CH3) .................................................................................................... 21

1.6 Hidrólisis de ésteres FV ................................................................................. 21 1.6.1 E,E-1,4-Bis[2-(4-carboxiestiril)] benceno (FV-COOH) .......................... 21 1.6.2 E,E-2,5-Dimetil-1,4-bis[2-(4-carboxiestiril)] benceno (FV-COOH CH3) 22

1.7 Discusión de resultados para la síntesis de FV .............................................. 22 1.7.1 Síntesis de sistemas FV ...................................................................... 22

2. Caracterización optoelectrónica de los sistemas FV ........................................... 29 2.1 Materiales y métodos ..................................................................................... 29

2.1.1 Absortividad molar .............................................................................. 29 2.1.2 Rendimientos cuánticos de fluorescencia............................................ 29

2.2 Resultados de propiedades optoelectrónicas ................................................. 30

XII Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o


3. Análisis de Espectrometría de masas MALDI usando los sistemas FV como matrices. 37

3.1 Análisis de proteínas empleado sistemas FV como matrices MALDI .............37 3.1.1 Materiales y Métodos ...........................................................................37 3.1.2 Resultados y discusión ........................................................................38

3.2 Análisis de hidrocarburos policíclicos aromáticos ...........................................45 3.2.1 Materiales y métodos ...........................................................................46 3.2.2 Resultados y discusión de análisis de HPA .........................................47 3.2.2.1 Naftopireno ............................................. ¡Error! Marcador no definido. 3.2.2.2 Hexafenilbenceno ................................................................................49 3.2.2.3 Rubreno ...............................................................................................52 3.2.2.4 Porfirina de Níquel-Pireno (PNP) .........................................................54 3.2.2.5 Efectos positivos de los FV como matrices en MALDI de analitos HPA57

4. Síntesis y caracterización de derivados de Ácido acrílico ..................................62 4.1 Materiales y Reactivos ...................................................................................62

4.1.1 5-yodotiofeno-2-carboxaldehido ...........................................................63 4.1.2 Equipos................................................................................................63 4.1.3 Absortividad molar ...............................................................................63

4.2 Procedimiento estándar para síntesis de ácidos acrílicos ...............................64 4.2.1 Ácido acrílico de furano (AFu): (ácido 3-(furan-2-il)-2-propenóico) .......64 4.2.2 Ácido acrílico de tiofeno (ATio): (ácido 3-(Tiofen-2-il)-2-propenóico) ....65 4.2.3 Ácido acrílico de yodotiofeno (AItio): (ácido 3-(5-yodotiofen-2-il)-2-propenóico) ........................................................................................................65

4.3 Procedimiento estándar para síntesis de ácidos cianoacrílicos: .....................65 4.3.1 Ácido cianoacrílico de furano (AFuCN): (ácido 3-(furan-2-il)-2-cianopropenóico) ...............................................................................................66 4.3.2 Ácido cianoacrílico de tiofeno (ATioCN): (ácido 3-(Tiofen-2-il)-2-cianopropenóico) ...............................................................................................66 4.3.3 Ácido cianoacrílico de yodotiofeno (AITioCN): (ácido 3-(5-yodotiofen-2-il)-2-cianopropenóico) ........................................................................................67

4.4 Resultados y discusión ...................................................................................68 4.4.1 Síntesis ................................................................................................68 4.4.2 Caracterización de absortividad molar .................................................74

5. Derivados de ácido acrílico como matrices MALDI para procesos de transferencia protónica .................................................................................................79

5.1 Materiales y métodos .....................................................................................79 5.1.1 Experimentos de espectrometría de masas MALDI .............................79 5.1.2 Cálculos computacionales ...................................................................80

5.2 Resultados y discusión ...................................................................................80

6. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................94 6.1 Conclusiones ..................................................................................................94 6.2 Recomendaciones ..........................................................................................95

A. Espectros de Resonancia Magnética Nuclear de los compuestos .....................97

Bibliografía ................................................................................................................. 113

Contenido XIII

Contenido XIV

Lista de figuras

............................................................................................................... Pág.

Figura i-1. Esquema general del proceso de ionización, arriba métodos clásicos, abajo

MALDI. 1

Figura i-2. Micrografías tomadas con resoluciones de nanosegundos, durante un

experimento de MALDI 2

Figura i-3. Mecanismo de ionización basado en la generación de clústeres 4

Figura i-4. Proceso de transferencia de carga en forma de un protón. 5

Figura i-5. Posibles interacciones intermoleculares del ácido ciano hidroxicinámico

5

Figura i-6: Esquema de ionización por transferencia electrónica. 8

Figura i-8: Esquema general de un oligómero de fenilenvinileno 8

Figura i-9: Estructura general de un derivado de ácido acrílico heterocíclico 12

Figura 1-1: Esquema general de síntesis de sistemas FV 16

Figura 1-2: Síntesis de los estirenos 17

Figura 1-3: Esquema general de la reacción de yodación 18

Figura 1-4: Esterificación del ácido vinilbenzóico 19

Figura 1-5: Reacciones de Mizoroki-Heck para los distintos FV sintetizados 19

Figura 1-6: Espectro de 1H RMN del compuesto FVCl 23

Figura 1-7: Espectro de 13C RMN del compuesto FVCl 25

Figura 1-8: Espectro de masas LDI del compuesto FVCl 26

Figura 2-1: Espectro de absorción de los sistemas FV sintetizados 31

Figura 2-2: Espectro de emisión de los sistemas FV sintetizados 33

Contenido XV

Figura 3-1: Fotoionización y protonación del FVCOOH y la posterior transferencia del

protón al péptido. 38

Figura 3-2: Experimento MALDI para cuatro péptidos distintos empleando como matriz

CHCA 39


FVCOOH 40


FVCOOH-CH3 40

Figura 3-5: Espectro de masas LDI del FVCOOH con adición de ácido trifluoroacético

(10% vol) 41

Figura 3-6: Espectro de masas LDI del FVCOOH-CH3 con adición de ácido

trifluoroacético (10% vol)

42

Figura 3-7: Acercamiento a las señales correspondientes a los experimentos de LDI,

donde se aprecia que las intensidades encontradas. 42

Figura 3-8: Dos posibles caminos de fotoionización del FVCOOH el primero es el de

protonación y el segundo corresponde a la formación del catión radical. 43

Figura 3-9: Espectro de masas MALDI de naftopireno 47

Figura 3-10: Relación señal/ruido para distintos experimentos empleando Naftopireno y

diferentes FV 48

Figura 3-11: Espectro LDI del HFB usando el 60% de la potencia del láser 49

Figura 3-12: Comparación del espectro LDI del HFB usando el 30% de la potencia del

láser (arriba) y cuando se analiza el HFB usando FVCOOH 50

Figura 3-13: Comparación del espectro LDI del HFB usando el 30% de la potencial del

láser (arriba) y cuando se analiza el HFB usando FVCOOH-CH3 51

Figura 3-14: Relación señal/ruido para experimentos MALDI de HFB usando FV como

matriz 51

Figura 3-15: Relación señal/ruido para distintos experimentos empleando Naftopireno 52

Figura 3-16: Espectros de análisis por masas MALDI con fluencia de láser del 30% para

el Rubreno 53

Figura 3-17: Porfirina de Níquel y sus rupturas más relevantes 54

XVI Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o


Figura 3-18: Espectro de masas LDI de la Porfirina de Níquel (arriba) y espectro de

masas MALDI 55

Figura 3-19: Relación/señal ruido, para la señal 898 m/z 56

Figura 3-20: Fotoionización de la matriz FV 58

Figura 4-1: Esquema general de síntesis de los derivados de ácido acrílico 63

Figura 4-2: Esquema general de síntesis de los derivados de ácido acrílico 65

Figura 4-3: Estructuras de los derivados de ácido acrílico sintetizados. 67

Figura 4-4: Estructura de AFu y las señales esperadas para los experimentos de

resonancia protónica. 68

Figura 4-5: Espectro de resonancia protónica para AFu. 69

Figura 4-6: Estructura de AFu y asignaciones para los carbonos. 70

Figura 4-7: Espectro de resonancia magnética de carbono para AFu 71

Figura 4-8: Espectro de masas LDI para AFu. 74

Figura 4-9: Espectros de absorción para los seis derivados de ácido acrílico. 75

Figura 5-1: Espectro MALDI de tres péptidos evaluados usando CHCA como matriz 81

Figura 5-2: Espectro LDI de ATio y espectro de masas MALDI de tres péptidos 82

Figura 5-3: Acercamiento al Espectro LDI de ATio 82

Figura 5-4: Estructura del péptido bradiquinina 84

Figura 5-5: Estructuras más estables encontradas para ATio 85

Figura 5-6: Espectro LDI de AFu y espectro de masas MALDI de tres péptidos 86

Figura 5-7: Estructuras más estables encontradas para AFu y AFuCN 87

Figura 5-8: Espectro LDI de AFuCN y espectro de masas MALDI de tres péptidos 88

Figura 5-9: Estructura del péptido bombesina 89

Figura 5-10: Espectro LDI de ATioCN y espectro de masas MALDI de tres péptidos 90

Figura 5-11: Estructuras más estables encontradas para ATioCN 91

Figura 5-12: Estructura más estable encontrada para CHCA 92

Contenido XVII

Lista de tablas

................................................................................................................ Pág.

Tabla i-1: Características de los compuestos más usados como matrices de MALDI para

donación a abstracción de protones. 6

Tabla 1-1: Comparación de rendimientos de síntesis 22

Tabla 1-2: Corrimientos de 1H RMN encontrados para las señales vinílicas de los FV

21

Tabla 2-1: Coeficientes de absortividad molar a 355nm para los sistemas FV sintetizados

y los reportados para las tres matrices MALDI más comunes 32

Tabla 2-2: Eficiencias cuánticas radiativas y no radiativas para los sistemas FV

sintetizados y los reportados para dos matrices MALDI comunes. 34

Tabla 3-1: Potenciales de ionización calculados para los tres FV y valor experimental

reportado para el antraceno, matriz MALDI común 45

Tabla 4-1: Señales acrílicas encontradas en los tres derivados de ácido acrílico 69

Tabla 4-2: Señales acrílicas encontradas en los tres derivados de ácido cianoacrílico 70

Tabla 4-3: Coeficientes de absortividad molar a 355 nm para cada uno de los derivados

de ácido acrílico 74

Tabla 5-1: Energías de afinidad protónica para las matrices empleadas en los

experimentos MALDI 91

Contenido XVIII

Lista de Símbolos y abreviaturas

A continuación se presenta la lista de símbolos y abreviaturas empleadas en el presente

trabajo.

Símbolos con letras latinas Símbolo Término Unidad SI Definición

Da Unidad de masa atómica Kg 1.66×10−27

M Concentración Molar mol/m3 n/V

cm Centímetro M

Hz Unidad de frecuencia s 1/s

ppm Corrimiento químico Hz

h Hora S

eV Energía del electrón J 1.6×10−19 J

Ha Energía atómica J 4.35×10−18 J

Kcal Energía termodinámica J 4.184 J

Símbolos con letras griegas Símbolo Término Unidad SI Definición

micro 1/1000000

Orbital pi

conductividad kg−1·m−2·s3·A2

Coeficiente de absortividad molar M.cm-1

Contenido XIX

Subíndices Subíndice Término

Em Emisión

Abs Absorción

Rad Radiativo

Nrad No radiativo

Abreviaturas Abreviatura Término

FV Fenilenvinileno

FVCOOH Fenlenvinileno con ácidos en sus extremos

FVCl Fenilenvinileno con Cloro en sus extremos

MALDI Matrix assisted laser desorption/ionization

EM Espectrometría de masas

LDI Laser desorption/ionization

RMN Resonancia Magnética Nuclear

1H Resonancia Protónica

13C Resonancia de Carbono

Pf Punto de fusión

CHCA Ácido alfa ciano hidroxicinámico

AFu Derivado de ácido acrílico-Furano

AFuCN Derivado de ácido cianoacrílico-Furano

XX Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o


Abreviatura Término

ATio Derivado de ácido acrílico-Tiofeno

ATioCN Derivado de ácido cianoacrílico-Tiofeno

AITio Derivado de ácido acrílico-yodotiofeno

AITioCN Derivado de ácido cianoacrílico-yodotiofeno

NdYAG Granate de Neodimio, itrio y aluminio

Pd(dba)2 Bis(dibenzilidenoacetona)paladio(0)

Lit. Literatura

CCD Cromatografía de capa delgada

s Singlete

d Doblete

dd Doble doblete

DCTB trans-2-[3-(4-tert-Butilfenil)-2-metil-2-

propenilideno]malononitrilo

LED Diodo de emisión de luz

DFT Teoría funcional de densidad

B3LYP Becke, 3-parametro, Lee-Yang-Parr

HPA Hidrocarburo policíclico aromático

HFB Hexafluorobenceno

PNP Porfirina de Níquel-Pireno

Contenido XXI

Introducción

Para la espectrometría de masas, se emplean mayoritariamente metodologías de

ionización clásicas, pues se basan en un haz de electrones que impacta al analito

directamente, para generar el ión molecular de interés; debe tenerse en cuenta que éste

proceso no es selectivo y puede producir distintas especies o productos de

fragmentación. Este tipo de ionización clásica, resulta ser inoficioso para moléculas de

gran tamaño, como las proteínas que al ser impactadas por los electrones generan

demasiadas rupturas no específicas,1 y dificultan la determinación de la señal

correspondiente al ión de la molécula o ion molecular.

Debido a las limitaciones de las técnicas clásicas de ionización se ha intentado

establecer un camino para encontrar una herramienta que permita el análisis de

sustancias lábiles o susceptibles a reacciones de recombinación. Desde su

descubrimiento en 19852 por Hillenkamp y Karas la técnica de MALDI (Matrix assisted

laser ionization/desorption, por sus siglas en inglés) ha tomado una gran importancia y se

ha convertido en una herramienta casi inalienable de la bioquímica analítica y en el

análisis de policiclos aromáticos,3 debido a que ésta presenta una gran ventaja pues en

esta se tiene una ionización asistida por una matriz, en la que fotones de un láser

impactan sobre el analito que se encuentra disperso en fase sólida junto con una matriz,

y esta matriz ayuda en el proceso de desorción, además de ser partícipe y protagonista

del proceso de ionización. En la Figura i-1 se muestra un esquema que resume el

mecanismo general de ionización en MALDI respecto a la mayoría de técnicas clásicas

de ionización.

2 Introducción

Figura i-1: Esquema general del proceso de ionización. Arriba métodos clásicos, abajo

MALDI, donde A, B y C representan fragmentos del analito.

Una de las principales funciones de la matriz en el proceso MALDI, es la de absorber la

energía emitida por el láser empleado en el instrumento, donde los más comunes son el

de nitrógeno (N2, em= 337nm) y el de neodimio, dopado con itrio y aluminio (NdYAG,

em= 355nm). Una vez la matriz ha absorbido la luz del haz, la mayor parte de esta

energía es convertida en calor o puede emplearse en procesos de descomposición de la

matriz en múltiples productos gaseosos como CO2, los cuales han sido caracterizados

experimentalmente,4 y que terminan siendo los causantes de la desorción de la matriz

remanente, así como del analito. La desorción de estos productos gaseosos y los

remanentes genera una nube de matriz, analito y productos de descomposición. En la

Figura i-2, se aprecia a la izquierda (a y b) una serie de micrografías tomadas con

resoluciones de nanosegundos, durante un experimento de MALDI, empleando un láser

de NdYAG, en las que se puede ver la generación de la nube de compuestos, producidos

de la desorción; causada por el impacto del láser. Se muestra la evolución de la nube a

medida que transcurre el tiempo, siendo el tiempo inicial y final del experimento; 3 y 160

ns, respectivamente; a la derecha se aprecia una representación esquemática del

proceso de desorción y las posibles especies formadas.

Introducción 3

Figura i-2: Micrografías tomadas con resoluciones de nanosegundos, durante un

experimento de MALDI (izquierda)5 y esquema general del proceso de desorción y las

especies formadas (derecha).

Por su parte, el proceso de ionización no ha sido claramente definido aún, y se han

propuesto una variedad de modelos4 para explicar la generación de las especies

cargadas que posteriormente pasan al analizador de masas. Estos modelos tienen

algunas convergencias entre sí y estipulan que el proceso MALDI consta de dos pasos,

el primero es en el que se absorbe la luz durante la irradiación con el láser, y el cual debe

tener una duración del orden de décimas de nanosegundos. El segundo es el de las

reacciones secundarias, el cual ocurre durante la expansión de la nube generada, y que

toma tiempos de microsegundos.5

En el primer paso, se ha determinado para los distintos modelos propuestos, que las

moléculas de la matriz absorben la energía del láser, cumpliendo una función de buffer

en el que almacenan la energía. Debido a la generación de moléculas de matriz en

estado excitado, se encuentra que éstas después podrán transferir dicha energía a otras

moléculas, o disiparla en procesos radiativos como la emisión de luz o en procesos no

radiativos como la generación de calor. Por tanto es importante notar que en el primer

paso se obtiene la energía para generar las especies cargadas, y por esto la importancia

de que la matriz posea un alto coeficiente de absortividad molar, así como bajas

Láser de N2

Matriz y Analito

co-cristalizados

Matriz

excitada

Analito

cargado

Electrón

Protón

Analito

4 Introducción

eficiencias cuánticas radiativas. Se han propuesto mecanismos en los que se generan

clústeres de matriz, analito, y matriz cargada, en los que por medio de procesos de

transferencia de carga dentro del clúster, se generan especies del analito cargadas, que

posteriormente son desolvatadas de dicho clúster y son haladas hacia el analizador de

masas. En la Figura i-3 se muestra un esquema de la posible ruta de generación de

iones a partir de clústeres. 5

Figura i-3: Mecanismo de ionización basado en la generación de clústeres.5

Donde A

representa al analito, m representa la matriz, R especies radicales formadas en el evento

MALDI, mH+ la matriz protonada, x(m), y(m) y z(m) representan agregados de moléculas

de matriz y protones o algunos otros metales.

A las reacciones secundarias, la mayoría de modelos atribuyen la generación de las

especies cargadas del analito. Cuando la matriz se encuentra excitada, se espera que

para que pueda retornar a su estado basal, realice una transferencia de carga, que

puede ser en forma de electrón o en forma de protón. Si la matriz realiza la transferencia

de un electrón, es entonces conocida como una matriz de transferencia electrónica,

mientras que si esta dona o recibe un protón, es conocida como una matriz de

transferencia protónica.

Para el caso de la transferencia protónica, se dará sí la matriz cuenta con los grupos

sustituyentes apropiados para recibir un protón. Ésta durante el evento MALDI se

fotoexcitará, generando la especie protonada en la nube después de la expulsión de la

superficie del sólido. Luego durante las reacciones secundarias decaerá, transfiriendo la

Transferencia

de carga

dentro del

clúster

Ablación

Expansión Clústeres en

estado gaseoso Desolvatación

Suave

Fuerte

Sólido

Matriz-Analito

Introducción 5

carga en forma de protón según se muestra en la Figura i-4 debido a que el catión

protonado de la matriz en estado excitado, es mucho más ácido que la matriz en estado

basal.6

Figura i-4: Proceso de transferencia de carga en forma de un protón. Se presenta con el

CHCA que es la matriz MALDI de transferencia protónica más común.

M-H++A M + AH

+

Este proceso podrá darse con cualquier matriz que tenga los grupos funcionales con la

acidez suficiente en estado fotoexcitado para donar un protón o la menor energía de

afinidad protónica, y además la matriz debe interaccionar con los protones del analito a

ionizar, siendo las interacciones intermoleculares facilitadoras del proceso de

transferencia. En la Figura i-5 se muestra un esquema del ácido -ciano hidroxicinámico

(la matriz MALDI más común, CHCA por sus siglas en inglés), y las posibles

interacciones con una proteína. Donde el enlace peptídico en las subunidades proteicas

es uno de los lugares en los que mejor se puede realizar dicha interacción,7 así como

sobre los distintos grupos funcionales de cadenas laterales de los aminoácidos en los

péptidos.

Figura i-5: Posibles interacciones intermoleculares del CHCA, cuando es empleado

como matriz durante el análisis de una proteína.7

6 Introducción

En la Tabla i-1 se muestran las matrices más comúnmente empleadas en los análisis por

MALDI, con sus estructuras químicas. De la tabla se puede concluir que aún no existe

una matriz universal o de uso general con un numero apreciable de analitos y que

además, la selección de la matriz esta grandemente influenciada por la naturaleza

química del analito.

Tabla i-1: Características de los compuestos más usados como matrices de MALDI para

donación o abstracción de protones.

Compuesto Solvente Estructura Longitud

de onda

(nm) de

trabajo

Aplicación

Ácido 2,5-

dihidroxi

benzoico

acetonitrilo,

agua,

metanol,

acetona,

cloroformo

337, 355,

266

péptidos,

nucleótidos,

oligonucleótidos

oligosacáridos

Ácido 3,5-

dimetoxi-4-

hidroxicinámico

acetonitrilo,

agua,

acetona,

cloroformo

337, 355,

266

péptidos,

proteínas,

lípidos

http://en.wikipedia.org/wiki/Acetonitrile

http://en.wikipedia.org/wiki/Methanol

http://en.wikipedia.org/wiki/Acetone

http://en.wikipedia.org/wiki/Chloroform

http://en.wikipedia.org/wiki/Peptide

http://en.wikipedia.org/wiki/Nucleotide

http://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide


http://en.wikipedia.org/wiki/Lipid

Introducción 7

Ácido 4-hidroxi-3-

metoxicinamico

acetonitrilo,

agua,

propanol

337, 355,

266

proteínas

Continuación Tabla i-1

Ácido α-ciano-4-

hidroxicinámico

CHCA

acetonitrilo,

agua, etanol,

acetona

337, 355 péptidos,

lípidos,

nucleótidos

Ácido picolínico etanol

266 oligonucleótidos

Ácido 3-hidroxi

picolínico

etanol

337, 355 oligonucleótidos

Si la matriz no tiene grupos funcionales capaces de realizar la donación o la recepción

del protón, pero es una molécula que cumple con los requisitos anteriormente nombrados

y además posee un alto potencial de ionización, es probable que cuando alcance el

estado excitado, al estar el electrón en un nivel de energía alto, al que los químicos se

refieren como LUMO y al que los físicos denominan banda de conducción, pueda

transferirse el electrón de este orbital a otras moléculas de matriz, a productos de

descomposición, o que termine haciendo parte de los agregados o clústeres formados,

proceso conocido como fotoionización.4 La molécula de matriz fotoionizada se convierte

en un catión radical (A*+) altamente reactivo que puede seguir al segundo paso del

proceso MALDI, debido a que al tener un mayor potencial de ionización (PI) que los


http://en.wikipedia.org/wiki/Propanol


http://en.wikipedia.org/wiki/Ethanol

http://en.wikipedia.org/wiki/Picolinic_acid

8 Introducción

analitos, reaccionará con estos para restablecer su estabilidad, por medio de la recepción

de un electrón del analito. En la Figura i-6 se esquematiza el proceso de fotoionización, y

la ionización del analito.

Figura i-6: Esquema de ionización por transferencia electrónica.

M + nhv M*+

Fotoionización

M*+

+ A M + A*+

Ionización del analito

Limbach y col.8 han sugerido que la formación del catión radical del analito sólo ocurre si

la energía de recombinación de la matriz excede a la energía de recombinación del

analito. Estas energías de recombinación pueden ser relacionadas a los PI de la matriz

(M) y el analito (A); de allí que se tenga el conocido criterio postulado por ellos

PI(M)>PI(A), es decir, el potencial de ionización de la matriz debe ser siempre superior al

del analito a ionizar, y se tiene que a mayor diferencia entre dichos potenciales se

encontrará un aumento en la señal del ión molecular.

Las matrices más convencionalmente usadas son el antraceno (para transferencia

electrónica) y el CHCA (para transferencia protónica), pero estas dos matrices, así como

las anteriormente descritas; pueden presentar problemas de compatibilidad con el tipo de

moléculas a analizar.2 Estos problemas de compatibilidad suelen relacionarse con la

estructura química, puesto que en los procesos de transferencia protónica y electrónica la

interacción del analito y la matriz es fundamental para que se dé el proceso de

transferencia de carga.3-7 Es por esto que la investigación para la generación de nuevas

matrices es urgente e importante, ya que la concepción de nuevas matrices MALDI

permitirá ampliar el espectro de posibles analitos.

Sistemas fenilenvinileno (FV)

Figura i-8: Estructura general de un oligómero de FV.

Introducción 9

Los sistemas fenilenvinileno (FV) se encuentran entre los sistemas electrónicamente

conjugados más estudiados para la construcción de polímeros y oligomeros con

potenciales y comprobadas aplicaciones optoelectrónicas.9-11 Es bien conocido que los

procesos de fotoluminiscencia y electroluminiscencia dependen de múltiples factores

fisicoquímicos, entre los que se encuentran los coeficientes de absortividad molar, los

rendimientos cuánticos de fluorescencia y las longitudes de absorción máxima en el

espectro UV-Vis, entre otros. Los FV se presentan como óptimas estructuras químicas

con alta posibilidad de ajuste fino de las propiedades antes mencionadas.11,12

Si analizamos información experimental y teórica publicada en la literatura acerca de las

propiedades de los FV, podemos encontrar que Praveen y col.13 reportan una serie

interesante de oligómeros de FV con capacidad de hacer procesos de trasferencia de

energía en estado excitado, los mismos procesos que se considera que suceden en la

“nube” enunciada anteriormente durante el proceso MALDI. Además se encuentra

evidencia experimental publicada por Samori y col.14 en la que se muestra que sistemas

electrónicos conjugados como los estilbenos producen cationes radicales al ser

irradiados con un láser NdYAG a 355 nm.

Grozema y col.15 han descrito a partir de cálculos computacionales la formación de

especies positivas cargadas (cationes radicales) derivados de FV, que en estado

excitado mantienen altos coeficientes de absortividad molar y cambios menores en su

estructura molecular.

Los FV, son sin duda compuestos muy versátiles, pues mediante procedimientos

sintéticos se pueden obtener un sinnúmero de sistemas con gran variedad de grupos

sustituyentes y arquitecturas moleculares novedosas. Haciendo uso de esta versatilidad,

se han reportado sistemas FV con ajustes predeterminados en los corrimientos de los

máximos de absorción, emisión y Band-Gap a partir de la correcta funcionalización

química.16,17

Una interesante serie de estudios estableció que los FV presentan propiedades

promisorias en estado sólido: Amrutha y col.18 han descrito la formación de agregados de

FV a través de apilamiento y el mejoramiento de las propiedades optoelectrónicas

10 Introducción

debidas a éste fenómeno. Tretiak y col.19 han modelado procesos de excitación en

cadenas de polímeros de FV intercaladas entre sí, con distintas distancias entre las

cadenas; encontrando que la eficiencia de los procesos de transferencia de carga es

altamente efectiva. También se puede apreciar en la literatura, que se ha descrito

extensivamente la capacidad de los FV para realizar procesos de transferencia de carga

intra e intermolecular fotoinducidos.17-20

Todas estas propiedades tienen un rol importante en el proceso MALDI, y por eso se

puede plantear a los FV como potenciales y novedosas matrices. En el presente estudio

se mostrará cómo algunos sistemas FV que se sintetizaron a lo largo de este trabajo,

exhibieron interesantes posibilidades de aplicación como matrices de transferencia

electrónica. Cabe destacar que hasta ahora no existe en la literatura reporte alguno en el

que se haya empleado matrices MALDI basadas en FV de 2½ unidades de conjugación o

estructuras similares, así que el presente trabajo de investigación es pionero en el

empleo de estos FV y busca generar conocimiento fundamental a través de la

implementación de este tipo de sistemas no convencionales en esta rama importante de

la espectrometría de masas.

Derivados de ácido acrílico

En el capítulo 3 del presente documento el lector podrá encontrar los resultados de los

experimentos de transferencia protónica al emplear los FV como matrices MALDI. Debido

a que estos resultados no fueron tan contundentes como se esperaba y uno de los

objetivos de este trabajo era poder realizar experimentos de transferencia protónica, los

derivados de ácido acrílico surgieron como una posible respuesta a esta parte inconclusa

del trabajo.

Como se mostró con anterioridad en este documento, la estructura molecular de las

matrices MALDI más empleadas en experimentos de transferencia protónica se

caracteriza por tener al menos un anillo aromático. Esto ya había sido establecido con

anterioridad para las matrices, pues en 1996 Krause y col.21 realizaron un estudio

comparativo entre compuestos con alto potencial como matrices MALDI y encontraron

que uno de los requisitos imprescindibles de cualquier compuesto a evaluar como matriz,

Introducción 11

era la presencia de enlaces conjugados, debido a la necesidad de procesos de absorción

de energía proveniente del láser, el cual se encuentra en la región del UV. Sí se evalúa la

literatura publicada en la última década, no es posible encontrar una cantidad importante

de moléculas postuladas como matrices MALDI que presenten nuevas estructuras, y por

el contrario, la mayoría de estos reportes se basan en estructuras análogas al CHCA. Un

claro ejemplo de esto son los artículos de Jaskolla y col.22,23 en los que se reporta como

promisorio el ácido ciano clorocinámico, difiriendo del CHCA solamente en el

sustituyente, puesto que presenta en su estructura un átomo de cloro en lugar del grupo

hidroxilo en la posición 4 del anillo.

En este aspecto, sólo se puede destacar como novedoso el aporte hecho por Francese y

col.24 en el que encontraron que la curcumina presentaba un potencial uso como matriz

MALDI con algunos tipos de proteínas. Aunque debe tenerse en cuenta que la estructura

de la curcumina es análoga a la de las matrices convencionales, ya que podría verse

como la unión de un par de derivados cinámicos y por tanto se podría decir que sigue el

patrón de la mayoría de matrices de transferencia protónica.

Anteriormente en los trabajos de Jaskolla y col.23 se encontró que la modulación del

máximo de absorción de las moléculas análogas al CHCA por funcionalización química

del anillo bencénico fue poco eficiente, y en todas las moléculas sintetizadas generó

resultados de absorción inferiores al CHCA. Por tanto es importante establecer si el uso

de otro tipo de anillo aromático en lugar del anillo bencénico en la estructura molecular

del CHCA puede llevar a mejorías en las propiedades de absortividad molar, así mismo

como en las energías de afinidad protónica y por ende aumentar su eficiencia como

matriz MALDI.

Un buen indicio de que el cambio en el anillo aromático es un excelente camino a seguir

es el hecho de que ácidos acrílicos con estructura análoga al CHCA, pero con anillos de

tiofeno o furano en lugar del anillo bencénico han exhibido propiedades interesantes de

absortividad.25 Adicionalmente Paizs y col.25 encontraron que los derivados acrílicos con

tiofeno y furano presentaban interacciones moleculares con la fenilalanina de una serie

de péptidos. Así mismo Sharma y col. 26 determinaron la afinidad que presentan este tipo

de derivados de ácido acrílico con lipasas porcinas. Todas estas posibles interacciones

postulan a los derivados de ácido acrílico como moléculas con potencial de establecer

12 Introducción

interacciones moleculares que son necesarias durante el proceso de protonación de

péptidos y proteínas durante el proceso MALDI.

Por todo lo anterior, este trabajo busca establecer si los derivados de ácido acrílico que

tengan en su estructura anillo aromático con heteroátomos pueden ser matrices MALDI

de transferencia protónica eficientes.

Figura i-9: Estructura general de un derivado de ácido acrílico heterocíclico.

Alcance esperado del trabajo

Actualmente las matrices MALDI disponibles en el mercado (mostradas anteriormente en

la Tabla i-1) presentan limitaciones respecto a la estructura química del analito con las

cuales se pueden utilizar, principalmente debido a parámetros de solubilidad y a la

metodología de ionización a la que sea susceptible el analito. Por lo tanto, el presente

trabajo busca establecer la relación de la estructura química de las moléculas diseñadas

con sus propiedades y su capacidad de realizar procesos de transferencia electrónica o

protónica en procesos MALDI.

En el campo de las matrices de transferencia protónica, este tipo de investigación es

importante en nuestro país, puesto que el desarrollo de nuevas matrices MALDI que

puedan realizar transferencia protónica podría dotar a los investigadores en biotecnología

y ciencias biológicas del país con una matriz accesible y producible en nuestro territorio.

Además puede generar como aporte nuevas estructuras químicas que permitan a la

Introducción 13

comunidad científica en general aumentar el espectro de analitos que sean susceptibles

a ser evaluados por estas metodologías analíticas.

El desarrollo de esta investigación también llevo a aportar en otra área muy importante

para el país: el análisis de crudos pesados del petróleo. En esta área se usan matrices

de transferencia electrónica, pero las tres matrices más utilizadas en esta técnica

también presentan grandes limitaciones en cuanto a la cantidad de analitos que pueden

identificar.

Según el informe de 2013 de la agencia nacional de hidrocarburos la producción de

crudo pesado representa cerca del 40% del volumen total de crudo producido en

Colombia.26 Esto es sin duda un problema porque este tipo de crudos es rico en

compuestos policíclicos aromáticos, de los cuales en su mayoría se desconoce su

estructura química y su masa molecular. Dotar al país con una matriz que permita

desarrollar análisis de perfiles de masa molecular de los componentes presentes en este

tipo de crudos significaría un avance tecnológico muy importante, a razón de que el

procesamiento de este tipo de crudos por métodos de hidrogenación es más eficiente si

se conoce el perfil de masas moleculares del crudo.

Se espera que con los resultados de la presente investigación se pueda generar

conocimiento que lleve al desarrollo de nuevas matrices MALDI que puedan ser

implementadas para el análisis de distintos tipos de analitos de importancia para el país,

así como al desarrollo universal del campo.

14 Introducción

1. Síntesis de sistemas FV

En el presente capítulo se presentan los procesos de síntesis y caracterización

estructural para los FV, realizados a lo largo del presente trabajo de investigación. Se

describen además los procesos para la obtención de los distintos precursores

empleados.

1.1 Materiales

1.1.1 Reactivos

Los compuestos necesarios para la síntesis de los distintos precursores y productos

fueron adquiridos como se describe a continuación: p-xileno, tereftalaldehido,

dimetoxibenceno, tert-butóxido de potasio, cloroformo, hexano, acetato de etilo y

metanol fueron adquiridos de Merck (Darmstadt, Alemania). Paladio tipo Pd(dba)2, trifenil

fosfito y ácido 4-vinil benzóico fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Nueva Jersey,

EEUU). El bromuro de metil trifenilfosfonio, 4-yodo benzoato de metilo, peryodato de

sodio y tetrahidrofurano fueron adquiridos de Panreac (Barcelona, España).

1.1.2 Equipos

Los puntos de fusión (P.f) fueron medidos en un fusiómetro Stuart SMP10. Los espectros

de resonancia magnética nuclear (RMN) fueron tomados en un espectrómetro Bruker

Avance 400 usando TMS como estándar interno. Para las pruebas de espectrometría de

masas MALDI se empleó un espectrómetro de masas Bruker UltraFlex con analizador de

tiempo de vuelo. Se realizó un barrido entre 180-2000Da, usando el analizador en modo

reflectrón y el detector en modo positivo. La intensidad del láser fue del 5% por encima

del umbral de ionización para cada muestra, con el fin de reducir la fragmentación y

aumentar la resolución. Para determinar el peso molecular de los FV se usó la técnica

LDI (laser desorption/ionization) puesto que no se usó matriz, sino que ellos cumplieron

también esta función.

16 Síntesis de sistemas basados en fenilenvinileno con potencial de donar o


Figura 1-1: Esquema general de síntesis de sistemas FV.

Se realizó la síntesis de tres sistemas FV, partiendo de los aldehídos correspondientes

para la síntesis de los estirenos necesarios en la reacción de acoplamiento.

Paralelamente, se sintetizaron dos compuestos yodo aromáticos necesarios a través de

una reacción de sustitución electrofílica aromática. Una vez caracterizados las dos series

de precursores necesarios se procedió a la realización de la reacción de acoplamiento

carbono-carbono a través de la reacción de Mizoroki-Heck y así se obtuvieron los

sistemas FV objetivo.

1.2 Síntesis de estirenos precursores

Procedimiento general:

Bajo una atmósfera de N2 a temperatura ambiente, 1 equivalente de bromuro de metil

trifenilfosfonio fue agregado lentamente a una solución de 2 equivalentes de tert-

butóxido de potasio en THF. La mezcla de reacción fue agitada durante 15 minutos antes

de la adición de 1 equivalente del respectivo aldehído 4-sustituido. La mezcla resultante

se agitó a 60°C durante 18 horas, al cabo de ese tiempo se dejó enfriar a temperatura

ambiente. La mezcla de reacción resultante se filtró, y el sólido obtenido se lavó 3 veces

con n-hexano. El filtrado y los lavados con hexano fueron combinados. Empleando

destilación a presión reducida el solvente se retiró, obteniendo un sólido blanco-crema.

Finalmente, una purificación por cromatografía en columna con el eluyente descrito para

Capítulo 1 17

cada uno, y la posterior concentración de las fracciones permitió obtener el respectivo

estireno.

Figura 1-2: Síntesis de los estirenos.

1.2.1 4-Cloroestireno

Se partió de un equivalente de 4-clorobenzaldehido y uno de bromuro de metil

trifenilfosfonio. Este estireno se obtuvo como un aceite incoloro. Eluyente: acetato de

etilo:n-hexano (2:9). Rendimiento: 78%. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, : ppm): 5.29 (d, 1H

J=10.6 Hz), 5.75 (d, 1H J=17.2 Hz), 6.69 (dd, 1H J=17.2 Hz), 7.29 (d, 2H), 7.31 (d, 2H).

RMN 13C (CDCl3, 100 MHz, : ppm): 114.4, 127.4, 128.4, 133.4, 135.7, 136.0. FTIR (cm-

1): 3098-3012 (C-H), 1641 (C=C), 743 (C-Cl).

1.2.2 p-Divinilbenceno

Se partió de 1 equivalente de tereftalaldehido y 2 equivalentes de bromuro de metil

trifenilfosfonio. Este estireno se obtuvo como un sólido blanco de bajo punto de fusión

(aprox. 30°C). Eluyente: n-hexano. Rendimiento: 68%. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, :

ppm): 5.28 (d, 2H), 5.79 (d, 2H J=17.6 Hz), 6.75 (dd, 2H J=17.6 Hz), 7.41 (s, 4H). RMN

13C (CDCl3, 100 MHz, : ppm): 113.7, 126.4, 136.5, 137.1. FTIR (cm-1): 3025-2980 (C-

H), 1612 (C=C).



1.3 Yodación de compuestos aromáticos


En un balón de tres bocas, una mezcla de 2 equivalentes de yodo, 1 equivalente de

peryodato de potasio y 1 equivalente del respectivo dialquil o dialcoxi benceno, se agitó

en una solución de ácido acético glacial, agua y ácido sulfúrico (10:1:0.1). La mezcla se

llevó a reflujo durante 12 horas. Luego fue enfriada hasta temperatura ambiente y una

solución del bisulfito de sodio (10%) fue adicionada. El producto fue aislado por filtración,

y posteriormente se lavó tres veces con agua destilada. La recristalización usando el

solvente descrito permitió obtener el producto esperado.

Figura 1-3: Esquema general de la reacción de yodación.

1.3.1 1,4-Diyodo-2,5-dimetoxibenceno

Se partió de 1,4-dimetoxibenceno. Recristalización en etanol-cloroformo (1:1) dio el

compuesto en forma de sólido blanco crema. Rendimiento: 75%. P.f. 174-176 °C Lit. 102-

103 °C27. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, : ppm): 3.81 (s, 6H), 7.67 (s, 2H). RMN 13C

(CDCl3, 100 MHz, : ppm): 26.9, 100.7, 139.3, 140.6. FTIR (cm-1): 3012-3085 (C-H arom),

2948-2896 (C-H alq), 1498 (C=C), 1060 (C-O), 812 (C-I)

1.3.2 1,4-Diyodo-2,5-dimetilbenceno

Se partió de 4-dimetilbenceno. Recristalización en ciclohexano dio el compuesto como un

sólido en forma de agujas blancas. Rendimiento: 78%. P.f. 103-104 °C. Lit. 102-103 °C27

RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, : ppm): 2.36 (s, 6H), 7,67 (s, 2H). RMN 13C (CDCl3, 100

Capítulo 1 19

MHz, : ppm): 26.9, 100.7, 139.3, 140.6. FTIR (cm-1): 3052-2890 (C-H), 1468 (C=C), 842

(C-I)

1.4 Esterificación de ácido vinilbenzóico

1.4.1 Metil-4-vinilbenzoato

Una mezcla de ácido 4-vinilbenzoico y ácido sulfúrico (1% mol) en metanol fue puesta en

reflujo durante 12 h. Después de enfriarse, la mezcla resultante fue extraída con

diclorometano, y la fase orgánica lavada con bicarbonato de sodio (10%, 3x10mL) y

secada con sulfato de sodio anhidro, para posteriormente remover el solvente por

destilación a presión reducida, para dar el éster como un sólido blanco de bajo punto de

fusión y aroma a anís. P.f. 30°C. Lit. 29-30ºC.28 RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, : ppm): 3.91

(s, 3H), 5.40 (dd, 2H), 5.86 (dd, 2H), 6.74 (dd, 1H), 7.46–7.44 (m, H), 8.03–7.98 (m, H).

RMN 13C (CDCl3, 100 MHz, : ppm): 52.2, 116.6, 126.2, 129.4, 130.0, 136.1, 142.0,

167.0.

Figura 1-4: Esterificación del ácido vinilbenzóico.

1.5 Reacción de acoplamiento de Mizoroki-Heck


A una mezcla de Pd(dba)2 (1% mol), trifenilfosfito (10% mol) y trietilamina (5

equivalentes) en DMF seco bajo atmósfera de N2, fueron adicionados el estireno

apropiado y el respectivo derivado yodoaromático en las relaciones molares establecidas

en cada caso. La mezcla se agitó a 120ºC hasta la desaparición de los precursores

según seguimiento por cromatografía en capa delgada (CCD). La mezcla de reacción se



dejó enfriar a temperatura ambiente, y luego fue vertida en HCl (5%), para dar un

precipitado, el cual fue colectado, lavado, secado y resolubilizado. La solución obtenida

se filtró sobre celita y el solvente se retiró por destilación a presión reducida.

Figura 1-5: Reacciones de Mizoroki-Heck para los distintos ésteres de FV sintetizados

1.5.1 E,E-2,5-Dimetoxi-1,4-bis[2-(4-cloroestiril)] benceno (FVCl)

Se partió de 2 equivalentes de 4-cloroestireno y 1 equivalente de 1,4-diyodo-2,5-

dimetoxibenceno. Tiempo de reacción: 32 h. Sólido verde brillante, recristalizado en

metanol. Rendimiento: 95%. P.f. 220-223ºC, Lit. 212ºC.29 RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, :

ppm): 3,95 (s, 6H), 7,09 (d, 2H, J= 16,4Hz), 7,12 (s, 2H), 7,34 (d, 4H), 7.48 (m, 6H). RMN

13C (CDCl3, 100 MHz, : ppm): 56.2, 109.7, 123.7, 126.3, 127.8, 128.8, 132.9, 136.0,

151.5. Peso Molecular (MALDI-TOF): Calculado: 410.081 Encontrado: 410.087. FTIR

(cm-1): 3030-2912(C-H), 1501(C=C), 976 (trans alqueno), 756 (C-Cl).

1.5.2 E,E-1,4-Bis[2-(4-metil carboxilatoestiril)] benceno (FVCOOMe)

Se partió de 1 equivalente de 1,4-diyodo-2,5-dimetilbenceno y 2 equivalentes de metil-4-

vinilbenzoato. Tiempo de reacción: 48 h. Sólido amarillo claro recristalizado en tolueno.

Rendimiento: 91%. P.f. 232-234ºC. Lit. 236-237°C.30 RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, :

ppm): 4.33 (s, 6H), 7.32 (d, 2H J=16.8 Hz), 7.41 (d, 2H J=16.8 Hz), 7,68 (s, 4H), 7,97 (d,

4H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, : ppm): 20.13, 61.5, 126.9, 128.06, 128.96, 129.3,

129.89, 130.6, 134.55, 136.11, 142.62, 166.98. Peso Molecular (MALDI-TOF): Calculado:

398.152. Encontrado: 398.156.

Capítulo 1 21

1.5.3 E,E-2,5-Dimetil-1,4-bis[2-(metil-4-carboxilato estiril)] benceno (FVCOOMe-CH3)

Se partió de 1 equivalente de divinilbenceno y 2 equivalentes de metil-4-yodobenzoato.

Tiempo de reacción: 46 h. Sólido azul recristalizado en tolueno. Rendimiento: 88%. P.f.

243-245ºC. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 2.45 (S, 6H), 4,39 (s, 6H), 7,28 (d,

2H J=16.2 Hz) 7,52 (d, 2H J=16.2 Hz), 7.62 (s, 2H), 7.76 (d, 4H), 7.93 (d, 4H). RMN 13C

(DMSO-d6, 100 MHz, : ppm): 20.11, 60.83, 125.93, 127.32, 127.93, 129.40, 130.18,

130.68, 136.55, 141.89, 167.86. Peso Molecular (MALDI-TOF): Calculado: 426.183

Encontrado: 426.191.

1.6 Hidrólisis de ésteres FV

Puesto que con la reacción de Mizoroki-Heck se obtuvieron dos ésteres FV precursores,

se realizó la hidrólisis de cada uno de estos para obtener lo respectivos ácidos FV de

interés.


A una solución de un equivalente del respectivo FV éster en THF:H2O:MeOH (1:1:1) se

agregaron 5 equivalentes de KOH. La mezcla resultante se agitó a reflujo durante la

noche; luego se neutralizó con HCl (10% vol). El precipitado fue colectado y purificado

por recristalización en tolueno.

1.6.1 E,E-1,4-Bis[2-(4-carboxiestiril)] benceno (FV-COOH)

Se partió de FVCOOMe, después de 14h de fuerte agitación se evidenció la aparición de

un sólido azul claro, el cual fue recristalizado en tolueno. Rendimiento: 97%. P.f. 271-273

Lit 270-272 °C.53 RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 7.38 (d, 2H J=16.8 Hz), 7,45 (d,

2H J=16.8 Hz), 7,69 (S, 4H), 7,74 (d, 4H), 7,95 (d, 4H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, :

ppm): 126.7, 127.5, 127.9, 129.8, 130.0, 130.8, 136.7, 141.7, 167.3. FTIR (KBr, cm-1):

3253 (O-H), 3073 (C-H arom.), 2919 (C-H alquil), 1673 (C=O), 1035 (C-O), 952 (C=C

trans). Peso Molecular (MALDI-TOF): Calculado: 370.121, Encontrado: 370.156.



1.6.2 E,E-2,5-Dimetil-1,4-bis[2-(4-carboxiestiril)] benceno (FV-COOH-CH3)

Se partió de FVCOOMe-CH3, después de 16 h de fuerte agitación se pudo apreciar la

aparición de un sólido verde claro. Recristalizado en tolueno. Rendimiento: 98%. P.f. 258-

260. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 2,45 (s, 6H), 7,26 (d, 2H J=16.2 Hz), 7.53 (d,

2H J=16.2 Hz), 7,61 (s, 2H), 7,76 (d, 4H), 7,94 (d, 4H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, :

ppm): 19.0, 126.5, 127.2, 127.9, 129.7, 133.7, 167.1. FTIR (KBr, cm-1): 3233 (O-H), 3018

(C-H arom.), 2943 (C-H alquil), 1678 (C=O), 1072 (C-O), 953 (C=C trans). Peso

Molecular (MALDI-TOF): Calculado: 398.152, encontrado: 398.114.

1.7 Discusión de resultados para la síntesis de FV

Todos los precursores sintetizados fueron caracterizados y los que ya habían sido

reportados fueron comparados respecto a la literatura. Todas las reacciones fueron

realizadas con precursores de identidad comprobada, como se describe en cada uno de

ellos. Los espectros resultantes de las caracterizaciones, en aras de la brevedad, pueden

ser encontrados en el anexo 1 de este documento.

1.7.1 Síntesis de sistemas FV

Para la síntesis de los sistemas FV se partió de condiciones experimentales previamente

evaluadas en el grupo de investigación en macromoléculas de la Universidad Nacional de

Colombia.31 Para la reacción de acoplamiento de Mizoroki-Heck, se encontró que bajo las

condiciones empleadas el producto presentaba poca solubilidad, permitiendo separar un

producto de alta pureza que no requería purificación por procedimientos engorrosos

como la cromatografía en columna, sólo una simple recristalización fue necesaria para

cada compuesto. Por lo anterior, los rendimientos que se obtuvieron fueron altos y

superiores a los reportados en literatura, como se evidencia en la Tabla 1-1.

Capítulo 1 23

Tabla 1-1: Comparación de rendimientos de síntesis

FV Rendimiento Obtenido (%) Rendimiento Reportado (%)

FVCl 95 4029

FVCOOH 91 5330

FVCOOH-CH3 88 No se ha reportado

Los resultados de síntesis obtenidos fueron satisfactorios, y aunque se realizó evaluación

espectroscópica de todos los sistemas FV obtenidos, se presentan y discuten a

continuación solamente los resultados para el compuesto FVCl, por similitud con los otros

FVs y sencillez del texto. Los análisis estructurales para los otros sistemas hacen parte

del anexo 1 del presente trabajo.

Para el compuesto FVCl se encontraron todas las señales esperadas en el análisis por

resonancia magnética nuclear de hidrógeno (RMN 1H), los cuales son mostrados en la

Figura 1-6. En estos se aprecia la aparición de una señal tipo singlete a 3.95 ppm

correspondiente a los tres hidrógenos del metoxilo sustituyente del anillo central del

sistema FV. La primera señal vinílica se aprecia como un doblete a 7.09 ppm con

constante de acoplamiento de 16.4 Hz, que da clara muestra de que el producto tiene los

dobles enlaces en configuración trans como se espera debido a la estereoselectividad de

la reacción de Mizoroki-Heck usada en la síntesis. La segunda señal vinílica F del

compuesto FVCl aparece a 7.46 ppm solapada con la señal correspondiente a los

hidrógenos orto respecto al cloro en los anillos de los extremos de la molécula que en la

Figura 1-6 aparece como la señal E (7.48 ppm). Finalmente, las otras dos señales

aromáticas; una correspondiente a los hidrógenos en orto al grupo metoxilo del anillo

central, aparece a campo más bajo debido a la influencia del grupo electrodonor metoxilo

que activa en orto y por eso aparece a 7.12 ppm como un singlete; mientras que la

segunda señal correspondiente a los hidrógenos en meta respecto al cloro de los anillos

de los extremos de la molécula, aparece como un doblete a 7.34 ppm.



Para los otros dos sistemas FV sintetizados en este trabajo (FVCOOH y FVCOOH-CH3)

se presenta en la Tabla 1-2 los valores de las señales vinílicas y sus respectivas

constantes de acoplamiento, permitiendo comprobar la conformación trans de los

sistemas sintetizados.

Figura 1-6: Espectro de RMN 1H del compuesto FVCl

.

Tabla 1-2: Corrimientos de 1H RMN encontrados para las señales vinílicas de los FV

FV Señal vinílica (ppm)

Constante acoplamiento (Hz)

FVCl 7.09, 7.46 16.4

FVCOOH 7.38, 7.45 16.8

FVCOOH-CH3 7.26, 7.56 16.2

El análisis de resonancia magnética de carbono (RMN 13C) para la molécula FVCl

(Figura 1-7), permitió corroborar la estructura molecular del compuesto, pues en primer

lugar se evidencia la señal a 56 ppm correspondiente a los carbonos de los grupos

metoxilos del anillo central de la molécula y la señal de 151.5 ppm correspondiente al

A

C

B

D

F

E

Capítulo 1 25

carbono en el que se encuentra el grupo metoxilo en el anillo aromático central. La señal

correspondiente al carbono del anillo aromático unido al cloro fue asignada siguiendo los

valores reportados en literatura para moléculas análogas,30 correspondiendo a la señal de

136.0 ppm. Otra señal importante es la del carbono H, que es el carbono en posición orto

a los sustituyentes metoxilo que presenta un corrimiento a 109 ppm debido al efecto de

estos grupos, que son electrodonores y realizan efecto en posición orto, y por tanto

aumentan la densidad electrónica de dicho carbono, haciendo que la señal se desplace a

campos más bajos. Las demás señales correspondientes a los corrimientos a 123.7,

126.3, 127.8, 128.8 y 132.9 ppm, son corrimientos típicos para carbonos que hacen parte

de sistemas conjugados; destacándose la aparición de señales muy similares y cercanas

correspondientes a los carbonos vinílicos en 126.3 y 127.8 ppm.

Estas caracterizaciones espectroscópicas permitieron determinar la formación del enlace

carbono-carbono a través de la reacción de acoplamiento de Mizoroki-Heck y por tanto

permitieron demostrar el éxito de las síntesis realizadas en la primera parte del presente

trabajo de investigación. El análisis por espectrometría de masas permitió además

comprobar el doble acoplamiento durante la reacción para obtener un producto de peso

molecular correspondiente a 410,051 m/z y con una distribución isotópica como se

esperaría para un producto con dos cloros sustituyentes con una intensidad de 100%

para el ion molecular de los isotopos más comunes y la presencia de las señales a

410.051 m/z (100%) y 412.049 m/z (63%), permitiendo identificar la molécula sintetizada

como se aprecia en la Figura 1-8.



Figura 1-7: Espectro de 13C RMN del compuesto FVCl

Es importante tener en cuenta que este análisis se realizó por la técnica LDI empleando

un equipo de espectrometría de masas MALDI, en el que la muestra se prepara sin el

uso de matriz, pues se espera un proceso de autoionización,4 es decir, la misma

molécula funciona como matriz, ionizándose y permitiendo ver el ión molecular de sí

misma. Igual procedimiento se llevó a cabo para identificar los otros dos FV. En el tercer

capítulo del presente trabajo se abordarán en detalle los resultados para los análisis por

espectrometría de masas MALDI cuando estos FV actúan como matrices, así como los

novedosos resultados encontrados en esta investigación.

I

A

B

C

G H F

E

H

Capítulo 1 27

Figura 1-8: Espectro de masas LDI del compuesto FVCl

En la Tabla 1-3 se muestran los valores m/z de la señal esperada y encontrada para el

ión molecular de los tres FV. Todos corresponden adecuadamente a los valores

esperados. Como se pudo demostrar en este capítulo haciendo uso de las herramientas

de caracterización estructural, la síntesis de los tres sistemas FV fue exitosa y permitió

seguir adelante con los objetivos de esta investigación.

Tabla 1-3: Señales del ion molecular encontradas para los FV

FV Señal m/z encontrada Señal m/z esperada

FVCl 410.051 410.084

FVCOOH 370.156 370.121

FVCOOH-CH3 398.114 398.152

410.051

412.049

682.097512.093578.063

0

2

4

6

8

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

200 300 400 500 600 700 800 900m/z

Capitulo 2 29

2. Caracterización optoelectrónica de los sistemas FV

En este capítulo se detallan los resultados correspondientes a las pruebas de

caracterización optoelectrónica que permitieron determinar los coeficientes de

absortividad molar a 355 nm; así como los resultados de la determinación de las

eficiencias cuánticas radiactivas para los sistemas FV sintetizados en este trabajo.

2.1 Materiales y métodos

2.1.1 Absortividad molar

Se preparó una serie de diluciones de cada FV en dimetilsulfóxido (DMSO, grado

analítico, Merck) en el rango de 10-4000μM. La absorbancia de cada una de las

soluciones se midió a 355 nm, en un espectrofotómetro Shimadzu UV-2401C de doble

canal. Se emplearon celdas de cuarzo de 10mm de camino óptico. Se usó DMSO en la

celda de referencia como blanco.

La determinación del coeficiente de absortividad molar se realizó partiendo de la ley de

Beer-Lambert, construyendo la curva de absorbancia en función de la concentración en

un rango entre 0.01 y 0.8 unidades de absorbancia donde se cumple la linealidad de

dicha ley permitiendo a partir de la pendiente de la recta de regresión, determinar el

coeficiente de absortividad molar a una longitud de onda determinada.

2.1.2 Rendimientos cuánticos de fluorescencia

Se prepararon soluciones diluidas de las moléculas en dimetilsulfóxido (DMSO, grado

analítico, Merck) entre 2–20 μM. Como fluoróforo de referencia se usó sulfato de quinina

debido a que se realiza la determinación empleando un método comparativo.32 Las



soluciones de antraceno se prepararon en etanol (grado analítico, Merck), a su vez, las

soluciones de sulfato de quinina se prepararon en H2SO4 0.1M (agua desionizada, tipo I,

18.2 Ωcm).

Los rendimientos cuánticos de fluorescencia o radiativos para los sistemas FV

sintetizados fueron estimados por el método descrito por Williams y col.32 usando la

siguiente ecuación.

Donde es el rendimiento cuántico radiativo, es la pendiente de la curva construida al

graficar el área bajo la curva del espectro de emisión en función de la absorbancia a la

longitud de onda de excitación para el sistema FV así como la sustancia de referencia.

es el valor de rendimiento cuántico de la referencia. Los valores para construir la

curva se obtienen a partir de la medición de soluciones del FV en un rango de

concentración determinado, así como para la sustancia de referencia. El término es el

índice de refracción del disolvente en el que se hace la medida para los sistemas y la

sustancia de referencia. La eficiencia cuántica no radiativa es asumida como:

Donde representa la eficiencia cuántica radiativa, obtenida por el método de

Williams, como se describió anteriormente.

2.2 Resultados de propiedades optoelectrónicas

Como se describió en la introducción de este trabajo, aunque no se ha encontrado una

estructura ideal definida para la matriz a emplear en MALDI, se tiene conocimiento de

que debe contar con ciertas propiedades optoelectrónicas,2 entre las que se destaca

poseer altos coeficientes de absortividad molar a la longitud de onda del láser empleado

en el equipo (en el caso presente láser NdYAG de 355 nm) para así poder realizar de

forma eficiente el proceso de fotoionización, para luego a través de las reacciones

secundarias, ionizar el analito a evaluar.

Capitulo 2 31

Aunque los altos coeficientes de absortividad molar son comunes en sistemas

conjugados similares a los FV,11 es importante corroborarlo para poder establecer con

certeza su potencialidad como matrices MALDI.

Figura 2-1: Espectro de absorción de los sistemas FV sintetizados en el presente trabajo

Los espectros de absorción en el UV-Vis (Figura 2-1) permitieron apreciar que los tres

sistemas presentaban máximos de absorción en zonas cercanas a la longitud de onda

del láser empleado en los experimentos MALDI (línea punteada en la Figura 2-1). El

compuesto FVCl presentó un máximo de absorción a 398 nm, el compuesto FVCOOH a

378 nm y el compuesto FVCOOH-CH3 a 362 nm. Debe destacarse que aunque el

máximo de las moléculas sintetizadas en este trabajo no se situó exactamente en los 355

nm, todas ellas presentan absorciones altas a esta longitud de onda.

Los coeficientes de absortividad a 355 nm determinados para los compuestos FV son

presentados en la Tabla 2-1 junto con los valores de los coeficientes de absortividad

molar para tres de las matrices MALDI más comunes. Se aprecia que las moléculas

sintetizadas en esta investigación presentan valores de absortividad molar similares

(caso FVCl y FVCOOH) o superior por casi el doble del valor del DCTB para el caso del



FVCOOH-CH3; Proponiéndolas como candidatas interesantes para su uso como

matrices MALDI.

Tabla 2-1: Coeficientes de absortividad molar ( ) a 355nm para los sistemas FV

sintetizados y los reportados para las tres matrices MALDI más comunes.

Compuesto [M-1cm-1]

FVCOOH-CH3 4,25X104

FVCOOH 2,80x104

FVCl 2,27x104

Antraceno33 4,98x103

DCTB 2.63x104

CHCA34 1.78x104

La eficiencia cuántica de fluorescencia es una medida directa de la relación entre

los fotones absorbidos por la molécula respecto a la cantidad de fotones que emite la

molécula al relajarse en procesos de corto tiempo y pasar del estado excitado al basal.

Los valores de eficiencia cuántica son igualmente importantes a los coeficientes de

absortividad molar para una matriz MALDI de transferencia electrónica, puesto que

dependiendo de lo que suceda con la matriz MALDI en estado excitado, se evaluará su

correcto desempeño. Si la matriz tiene un alto valor de se tiene que la mayoría de

fotones absorbidos son emitidos como fotones de longitud de onda mayor. Este caso es

el ideal para un dispositivo electrónico como un LED,35 puesto que asegura buenas

propiedades para su función como emisor. En el evento MALDI al tenerse un proceso de

fotoionización se desea que la molécula que funciona como matriz no emita la energía

que absorbió, sino que pueda emplearla para realizar la reacción bimolecular de

Capitulo 2 33

ionización del analito;6 es decir si la molécula presenta una alta eficiencia cuántica

radiativa, es una candidata pobre como matriz MALDI, mientras que sí su rendimiento

cuántico radiativo es bajo; se espera que la mayor parte de la energía absorbida se

emplee en el proceso de ionización.

Figura 2-2: Espectro de emisión de los sistemas FV sintetizados en el presente trabajo

Los espectros de emisión de los sistemas FV que se aprecian en la Figura 2-2 muestran

emisiones centradas en el azul (cerca de 450nm). Los rendimientos cuánticos radiativos

y no radiativos, obtenidos son presentados en la Tabla 2-2 y se aprecia que los valores

para las eficiencias cuánticas no radiativas son altos y superiores a los radiativos;

además son similares a los reportados para el antraceno que es una matriz de

transferencia electrónica muy empleada. El valor de eficiencia cuántica radiativa para el

trans-2-[3-(4-tert-butilfenil)-2-metil-2-propenilideno] malononitrilo (DCTB, por sus siglas en

inglés) que es otra de las matrices más comúnmente empleadas; es significativamente

más bajo que los valores para los FV, pero es consistente con la naturaleza de la

molécula que es menos conjugada que los sistemas FV empleados en el presente

trabajo. Adicionalmente la presencia de un grupo sustituyente nitrilo como se ha

mostrado en literatura reciente sirve para disminuir el rendimiento cuántico radiativo.36



Los valores experimentales de los parámetros optoelectrónicos establecidos para los FV

en este capítulo, permiten establecer el potencial de los mismos para ser empleados en

experimentos como matrices MALDI.

Tabla 2-2: Eficiencias cuánticas radiativas y no radiativas para los sistemas FV

sintetizados y los reportados para dos matrices MALDI comunes.

Compuesto

FVCOOH 0.29 0.71

FVCOOH-CH3 0.38 0.62

FVCl 0.52 0.48

Antraceno33 0.28 0.72

DCTB 0.01 0.99

Capitulo 2 35

Capítulo 3 37

3. Análisis de espectrometría de masas MALDI usando los sistemas FV como matrices.

En el presente capítulo se presentan los resultados obtenidos en experimentos de

espectrometría de masas MALDI en los que se emplearon los sistemas FV sintetizados

como matrices.

3.1 Análisis de proteínas empleando sistemas FV como matrices MALDI

3.1.1 Materiales y Métodos

Se prepararon soluciones de 1000ppm de los FV en acetonitrilo:agua (2:1) con adición de

ácido trifluoroacético (0.1% vol). Dried droplet fue la técnica usada para la preparación de

las muestras. Se aplicaron cinco spots (lugar en el equipo donde la muestra es aplicada)

de cada muestra, para cada técnica de preparación de muestra. Fue desarrollado un

método de autoejecución en el software FlexControl para la adquisición automática de los

espectros de masas. La fluencia de láser fue constante a 30% y movimiento aleatorio

(random walk) en el área del spot. Se tomaron los espectros de masas en el rango de

100 a 4000Da. El programa de autoejecución diseñado realiza la adquisición de las

señales con relación señal-ruido mayor a 100 y resolución mayor a 1000. Cada

evaluación exitosa corresponde a 500 espectros individuales y requirió 2000 espectros

individuales para guardar el espectro acumulado final. Si al cabo de 30 intentos no se

adquieren 2000 espectros con la mínima calidad, el programa aborta la adquisición en

ese spot. Fue empleada como analitos de referencia una mezcla de cuatro péptidos

disueltos en solución buffer de pH: 7.0; leu-encefalina m/z: 556.27, bombensina m/z:



Título de la tesis o trabajo de investigación

1619.82, bradiquidina m/z: 1060.57 y renina sustrato m/z: 1758.93. Los experimentos se

realizaron con relaciones molares matriz:analito de 100:1. Se empleó como matriz de

referencia el CHCA.

3.1.2 Resultados y discusión

Después de establecer las propiedades optoelectrónicas como óptimas para implementar

los FV como matrices MALDI; se decidió realizar una primera serie de experimentos

empleando los FVCOOH y FVCOOH-CH3 como matrices de transferencia protónica,

debido a la presencia de los grupos carboxilo en su estructura. Siguiendo lo establecido

por evidencia experimental reportada por los grupos de Zenobi37 y Kinsel.38 Se esperaba

que al estar en medio ácido se diera la protonación del FV en el estado fotoexcitado,

para sí formar una especie protonada altamente reactiva que realizará el proceso de

donación de protón al analito, y así formar la especie del analito protonado. Este proceso

se ilustra en la Figura 3-1, en la que se muestra como un FV ácido en estado

fotoexcitado produce la protonación de la proteína en los sitios básicos.

Figura 3-1: Fotoionización y protonación del FVCOOH y la posterior transferencia del

protón al péptido.

H+

hv

Transferencia protón

H

+

39

Los experimentos realizados con los cuatro péptidos y la matriz de referencia el CHCA

mostraron que esta matriz permitió ionizar todos los péptidos, pero algunos de ellos con

intensidades relativamente bajas para el pico correspondiente a la molécula protonada,

como se aprecia en la Figura 3-2.


CHCA

Los resultados de los experimentos empleando los FVCOOH y FVCOOH-CH3 como

matrices de transferencia protónica con los cuatro péptidos, mostraron la ausencia de

ionización de los péptidos; es decir, a pesar de las excelentes propiedades

optoelectrónicas encontradas para estos sistemas, no se pudo encontrar la generación

de señales correspondientes a los péptidos protonados, y menos aún la señal

correspondiente a la matriz protonada que comúnmente se puede encontrar en este tipo

de experimentos.

Debe destacarse que los espectros obtenidos durante estos análisis permitieron observar

principalmente la señal correspondiente al catión radical de los FV empleados en los

experimentos, como se evidencia en la Figura 3-3 y la Figura 3-4.

1758.932

379.090

578.253

335.094

1060.568

1583.361

1945.961

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500m/z

Leu-Encefalina 556.27

Bombensina 1619.82

Bradiquidina 1060.57

Renina Sustrato 1758.93





FVCOOH


FVCOOH-CH3

370.129

397.150

607.515

500.401

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Inte

ns.

[a.u

.]

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500m/z

398.194

381.189

632.255

0

1

2

3

4

5

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500m/z

Catión radical

Catión radical

No hay señales de péptidos en esta zona

No hay señales de péptidos en esta zona

41

Para evaluar sí era posible o no, la formación del ion molecular protonado de los FV, se

decidió realizar una serie de experimentos sin analito, empleando como matriz y muestra

cada uno de los FV ácidos, (método LDI, porque no hay asistencia de una matriz distinta

a la misma molécula durante la ionización); se realizaron distintas adiciones de ácido

trifluoroacético (5, 7 y 10% vol.) buscando acidificar en exceso el medio para así poder

favorecer la aparición del pico correspondiente a la molécula de FV protonada (señal

M+H+), sin embargo no se pudo verificar la presencia de la misma, sólo se evidenció la

presencia del catión radical; como se puede observar en la Figura 3-5 y en la Figura 3-6.

Figura 3-5: Espectro de masas LDI del FVCOOH con adición de ácido trifluoroacético

(10% vol).

Las señales en las zonas de (M+1) m/z para cada FV (señales 371 y 372 m/z para

FVCOOH y señal 399 y 400 m/z para FVCOOH-CH3, Figura 3-6) que se encontraron en

los experimentos y que erróneamente se podrían asignar al ion M+H+ de cada molécula

analizada, corresponden al patrón isotópico esperado para cada una de ellas como se

detalla en la Figura 3-7 (26% intensidad para FVCOOH y 28% intensidad para FVCOOH-

CH3), y por tanto se puede sugerir a partir de los datos experimentales encontrados, que

la formación del ion correspondiente a la molécula de FV protonada es poco probable, y

de allí que se puedan explicar los pobres resultados de los FV como matrices de

transferencia protónica.

370.156

353.158

0

2000

4000

6000

Inte

ns. [

a.u.

]

175 200 225 250 275 300 325 350 375m/z




Figura 3-6: Espectro de masas LDI del FVCOOH-CH3 con adición de ácido

trifluoroacético (10% vol.)

Figura 3-7: Acercamiento a las señales correspondientes a los experimentos de LDI,

donde se aprecia que las intensidades encontradas, son las esperadas para la

distribución isotópica.

Entonces, se decidió usar herramientas computacionales para entender por qué no se

había evidenciado la protonación de los FV ácidos estudiados aquí durante la serie de

experimentos y por tanto no se había podido apreciar el catión protonado de estos FV

ácidos en los experimentos de MALDI. Se partió del reporte de Bourcier y col.39 en el que

398.165

381.174

354.201276.162252.158 371.441298.419219.206

0

2

4

6

4x10In

ten

s. [

a.u

.]

200 225 250 275 300 325 350 375 400m/z

Esperado: 26% Intensidad

Esperado: 28% Intensidad

399 m/z

400 m/z

371 m/z

372 m/z

43

se detallan cálculos de afinidad protónica (AP) para posibles matrices MALDI. Se usó la

metodología DFT con el funcional B3LYP, y usando como base 6-311++(2d,2p) para

optimizar la estructura del FVCOOH y del FVCOOH-H+, se calcularon las energías

electrónicas (Eelec) y las termoquímicas (Eterm) para ambas moléculas, a partir de:

AP= E(FVCOOH)−E(FVCOOH-H+)

E(FVCOOH)=Eelec +Eterm

A partir de los cálculos se determinó que la AP del FVCOOH es de 213 Kcal/mol, mucho

mayor a la del CHCA que es de 198 Kcal/mol, por lo que se puede sugerir que la especie

protonada del es poco probable bajo condiciones MALDI.40

Figura 3-8: Estructuras optimizadas para el FVCOOH y el ion quasimolecular

FVCOOHH+

Debe tenerse en cuenta que este tipo de cálculos se asemeja al proceso MALDI, porque

la ionización ocurre en el vacío y las correcciones térmicas aseguran una temperatura

similar.

Los resultados para esta primera serie de experimentos no fueron considerados como

malos, puesto que permitieron comprobar un interesante fenómeno para los FV al

emplearse en experimentos MALDI, en las que se determinó bajo distintas condiciones,

la prevalencia en la formación del catión radical, es decir que los experimentos tratando

213 Kcal/mol




de realizar la fotoionización por medio de la protonación, permitieron encontrar que este

no es el camino que usan los FV estudiados, sino que sí hay un proceso de

fotoionización y corresponde a la pérdida de un electrón, como se detalla en la Figura 3-

8.

Los cationes radicales son especies altamente reactivas y de amplio interés para la

espectrometría de masas MALDI, y al haberlos evidenciado en alta proporción durante el

trabajo, además del conocimiento previo de las propiedades óptimas de las moléculas

sintetizadas; permitió replantear el tipo de analitos a ionizar durante los experimentos de

espectrometría de masas con estos FV, cambiándolos de analitos susceptibles a

transferencia protónica, por analitos de gran interés y muy poco investigados como lo son

los hidrocarburos policíclicos aromáticos que son susceptibles a ser ionizados a través de

transferencia electrónica.

Figura 3-9: Dos posibles caminos de fotoionización del FVCOOH. El primero es el de

protonación y el segundo corresponde a la formación del catión radical.

+H+

-e-

e-

45

3.2 Análisis de hidrocarburos policíclicos aromáticos

Como se mencionó con anterioridad, la evidencia experimental demostró la generación

de cationes radicales en las condiciones MALDI por parte de los FV sintetizados durante

este trabajo. Grozema y col.15 ya habían evaluado la aparición de cationes radicales en

estilbenos (FV de una unidad y media de conjugación) al ser impactados con un láser a

temperatura ambiente. Así que tratando de aprovechar este comportamiento y partiendo

de los múltiples estudios que reportan la transferencia electrónica como método de

ionización,4 se decidió realizar un análisis computacional para determinar los potenciales

de ionización de los FV sintetizados, y evaluar la posibilidad de usarlos como matrices de

transferencia electrónica.

Los cálculos fueron realizados por el grupo de fisicoquímica teórica y experimental de la

Universidad Industrial de Santander, empleando la metodología Hartree-Fock, usando la

base 6-311G++. Las condiciones del cálculo que representan el vacío y a la molécula en

fase gaseosa son muy próximas a las condiciones MALDI, por lo que el cálculo

representa una muy buena aproximación. Se espera que una buena matriz MALDI tenga

un potencial de ionización cercano a los 8 eV para así asegurar una amplia ventana de

potencial y por tanto poder reaccionar con el analito. En la Tabla 3-1 se muestran los

resultados para dichos cálculos, con los que se encontró que los tres FV presentan

potenciales de ionización altos y prometedores para ser empleados en los experimentos

MALDI.

Tabla 3-1: Potenciales de ionización calculados para los tres FV y valor experimental

reportado para el antraceno, matriz MALDI común, así como para los analitos a usar.

Molécula Potencial Ionización (eV)

FVCOOH 7.61

FVCOOH-CH3 7.59

FVCl 7.39

Antraceno 7.43*

Naftopireno 6.82




Continuación tabla 3-1

Rubreno 6.71

Tiofeno-pireno 7.26

Hexafenilbenceno 6.91

* Reporte experimental41

Los resultados permiten sugerir que una vez fotoionizados los FV, forman el catión

radical y debido a su alto potencial de ionización, este podría realizar la transferencia

electrónica durante las reacciones secundarias con el analito debido a que todos

presentan menores potenciales de ionización respecto a los FV.

Con base en todos los argumentos encontrados, se realizaron pruebas empleando 4

analitos modelo de hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA) que simulan algunos de

los compuestos más característicos presentes en los crudos pesados y que representan

un gran potencial investigativo y económico para nuestro país.

3.2.1 Materiales y métodos

Se prepararon soluciones de los FVs en cloroformo. Fueron empleados analitos modelo,

provistos por el profesor Gray Murray de la Universidad de Alberta, Canadá. Las técnicas

thin layer y dried droplet fueron empleadas para la preparación de muestras. Fueron

usados cinco spots de cada muestra, para cada técnica de preparación. Un método de

autoejecución fue desarrollado en el FlexControl para la adquisición automática de los

espectros de masas. Se empleó distintas fluencias de láser entre 5 y 40%, y movimiento

aleatorio (random walk) en el área del spot. Se tomaron los espectros de masas en el

rango de 100 a 2000Da. El programa de autoejecución diseñado realiza la adquisición de

las señales con relación señal-ruido mayor a 100 y resolución mayor a 1000. Cada

evaluación exitosa corresponde a 500 espectros individuales y se requirieron 2000

espectros individuales para guardar el espectro acumulado final. Si al cabo de 30 intentos

no se adquieren 2000 espectros con la mínima calidad, el programa aborta la adquisición

en ese spot.

En esta serie de experimentos fueron empleadas altas relaciones matriz:analito. Se

preparó inicialmente una solución 2.5mM de cada uno de los FVs en cloroformo, que son

aproximadamente 1000ppm y fueron puestos en contacto con soluciones 0,25 mM;

47

0,025mM; 2,5 y 0,25 M de los HPA, para así obtener relaciones molares de 10:1, 100:1,

1.000:1, 10.000:1, respectivamente. En cada caso fue usada una solución 2.5mM de la

matriz que corresponde a la máxima solubilidad posible para las moléculas FVCl, FV-

COOH y FV-COOH-CH3, y fue modificándose la cantidad de analito agregado en las

concentraciones enumeradas anteriormente.

3.2.2 Resultados y discusión de análisis de HPA

3.2.2.1 Naftopireno

Se realizaron experimentos con naftopireno como analito modelo, empleando cuatro

relaciones distintas de matriz/analito o analito/solvente para el caso del LDI (1:10, 1:100,

1:1000 y 1:10000). Y así poder evaluar la evolución de la señal del ión molecular del

naftopireno (302 m/z) al ser ionizado por metodología LDI (sin matriz) o cuando la

ionización era asistida por los FV como matrices (MALDI) y encontrar posibles efectos

positivos al emplear como matriz MALDI los FV sintetizados en este trabajo de

investigación.

Los resultados muestran que los FV tienen alto potencial como matrices de transferencia

electrónica, puesto que los análisis realizados revelaron que la señal del ion molecular

del naftopireno aumentaba significativamente al emplear los FV como matrices, en

condiciones experimentales suaves, pues se empleaban bajas fluencias o potencias de

láser respecto a otro tipo de matrices. En la Figura 3-9 se puede apreciar mejor el

aumento en la señal conseguido por los FV, esa figura corresponde a un espectro LDI

del naftopireno en una solución 0.025 mM y la señal al emplear el FVCOOH-CH3 como

matriz en una relación 1:100.




Figura 3-9: Espectro de masas MALDI de naftopireno empleando a) LDI y b) usando FV-

COOH-CH3 como matriz MALDI en una proporción molar 1:100.

Se evidenció claramente que el uso del FV como matriz aumentó la señal del ión

molecular del naftopireno desde una intensidad de 8000 (LDI) hasta 1x105 (MALDI)

mostrando un efecto positivo de aumento en la señal de casi el 1000%. Teniendo en

cuenta que este resultado es para una relación molar en la que se evidencia una alta

presencia de analito. Al disminuir en uno o dos órdenes de magnitud las relaciones

analito:matriz (experimentos con relaciones molares 1:1000 y 1:10000) se encontró que

el aumento en la relación señal/ruido para el naftopireno llegó a ser de hasta 2500 veces

al emplear FVCOOH-CH3 como matriz y de casi 1000 veces al emplear FVCl como

matriz. En la Figura 3-10 se presenta el aumento de la señal al emplear distintas

concentraciones de naftopireno, en experimentos con ionización LDI o MALDI con FV

como matrices en cuatro relaciones molares distintas.

Figura 3-10: Relación señal/ruido para distintos experimentos empleando naftopireno y

diferentes FV como matrices en cuatro distintas proporciones analito:matriz.

302.112 NP_100_01 0:F2 MS Raw

0

2000

4000

6000

8000

Inte

ns. [

a.u.

]

398.133

302.090

NPM5_100_02 0:O14 MS Raw

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.505x10

Inte

ns. [

a.u.

]

200 400 600 800 1000 1200 1400m/z

49

Los resultados obtenidos permiten demostrar que los FV sintetizados se comportaron

como matrices de transferencia electrónica de alta fiabilidad con incrementos

significativos en la relación seña/ruido para el pico correspondiente al ión molecular y por

tanto establecerse como potenciales matrices para el análisis de HPA.

3.2.2.2 Hexafenilbenceno

Con los resultados positivos obtenidos en los análisis de naftopireno se decidió probar un

nuevo analito modelo. El hexafenilbenceno (HFB) es otro excelente modelo para todas

aquellas moléculas conjugadas poliaromáticas presentes en el crudo pesado. Los

experimentos de LDI mostraron que el HFB no presenta señales correspondientes al ión

molecular a potencias de láser entre 5 y 30%. Sólo se pudo evidenciar distintas señales

correspondientes a las fragmentos de la molécula. El ión molecular (534 m/z) sólo pudo

ser visualizado cuando se empleó una potencia de láser del 60%, pero con una

intensidad pobre (cerca de las 25 a.u.) como se presenta en la Figura 3-11. El hecho de




encontrar una pobre presencia del ión molecular se debe a la naturaleza misma del HFB,

que a pesar de estar compuesto por múltiples anillos aromáticos, su estructura no es

planar, y por tanto los estados fotoexcitados son menos estables,42 llevando a la

fragmentación. Además, el uso de altas potencias de láser lleva intrínsecamente a una

excesiva fragmentación, puesto que el exceso de energía del láser que sobrepasa la

capacidad de absorción del conjunto matriz-analito, termina siendo empleada en

procesos de desintegración de la molécula. 42

Figura 3-11: Espectro LDI del HFB usando el 60% de la potencia del láser.

Teniendo en cuenta estos resultados de transferencia electrónica con el HFB se buscó

evaluar si los FV estudiados al ser usados como matrices podían generar efectos de

protección durante la ionización, evitando la fragmentación del ión molecular.del HFB Por

lo tanto, se realizaron experimentos, en los que se determinó como óptimo, usar una

fluencia de láser del 30%. En la Figura 3-12 y en la Figura 3-13 se realiza una

comparación entre un espectro LDI tomado para el HFB, en la que se empleó una

fluencia de láser del 30%. No se ve la presencia de la señal del ión molecular del HFB

(ubicado arriba en cada figura), mientras que para los espectros MALDI en los que se

usó como matrices el FVCOOH y el FVCOOH-CH3 (abajo en cada figura) se aprecia

como los FV permiten preservar la señal correspondiente al ión molecular (534 m/z), es

decir que se pudo observar la presencia de la señal de ión molecular, en proporciones

muy altas y también se aprecia para ambos experimentos que la intensidad de la señal

está en el orden de magnitud de 104. Además se pudo apreciar la disminución en el

número de señales correspondientes a rupturas producto del proceso de fragmentación

del analito.

H1_1 0:L1 MS Raw

0

5

10

15

20

25

30

Inte

ns. [

a.u.

]

268.212

211.138

586.171331.232 449.367183.103 380.332 534.241

H1(60)_10_04 0:K10 MS Raw

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

200 300 400 500 600 700m/z

534.22m/z

51


láser (arriba) y cuando se analiza el HFB usando FVCOOH como matriz en proporción

1:100 con la misma potencia de láser.


láser (arriba) y cuando se analiza el HFB usando FVCOOH-CH3 como matriz en

proporción 1:100 con la misma potencia de láser.

Los dos FV ácidos, presentaron efectos muy positivos en el aumento de la relación

señal/ruido para la señal 534 m/z, algunos de hasta 1500 veces, como se muestra en la

H2_1 0:N1 MS Raw

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

Inte

ns.

[a

.u.]

398.208

381.204

534.315350.057 426.251 487.256 706.416 751.430617.357 791.345576.168

HM2_10_05 0:D15 MS Raw

0

1

2

3

4

5x10

Inte

ns.

[a

.u.]

400 500 600 700 800m/z

534.315

533.472

0

1

2

3

4

4x10

Inte

ns.

[a

.u.]

534 536 538 540 542m/z

534m/z

FVCOOH 1:100

LDI

H2_1 0:N1 MS Raw

0

1

2

3

4

5

6

Inte

ns. [

a.u.

]

534.315

528.300 576.168

HM2_10_05 0:D15 MS Raw

0

1

2

3

4

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

530 540 550 560 570 580m/z

LDI

FVCOOHCH3




Figura 3-14, en la que se puede apreciar dicho aumento usando dos relaciones molares

distintas analito:matriz.

Figura 3-14: Relación señal/ruido para experimentos MALDI de HFB usando FV como

matriz y potencia de láser del 30% en dos distintas relaciones molares.

3.2.2.3 Rubreno

Posteriormente se realizó una serie de análisis empleando al rubreno como analito

modelo de HPA. Se realizaron experimentos empleando ionización LDI, en los que se

encontró a fluencias de láser entre el 30 y 40% y concentraciones relativamente altas

(0.25 mM) una buena señal correspondiente al ion molecular del rubreno (532 m/z) pero

también se pudo evidenciar una señal significativa a 459 m/z correspondiente al proceso

de fragmentación del ion molecular del rubreno, probablemente debido a la pérdida de

un fenilo. En la Figura 3-15 se aprecia como la relación señal ruido para el ión molecular

disminuyó drásticamente en los experimentos de LDI para el rubreno, al disminuir la

concentración de la muestra.

53

Figura 3-15: Relación señal/ruido para distintos experimentos empleando rubreno, el

primero a la derecha es LDI, mientras que los otros corresponden a diferentes FV como

matrices en tres distintas proporciones analito:matriz.

Con los resultados superiores que se encontraron con el uso de nuestros FV como

matrices de transferencia, permitía aumentar la relación señal ruido para el ion molecular

(532 m/z) aún a bajas concentraciones. Adicionalmente se evidenció en los

experimentos en los que se empleó el Rubreno como analito, y FV como matrices, que la

fragmentación se veía disminuida, así como se vio el aumento de la señal del ión

molecular en algunos casos hasta en casi 3000 veces la relación señal/ruido. En la

Figura 3-16 se aprecia la intensidad de la señal del ión molecular al emplear los FV

ácidos como matrices, así mismo la baja presencia de la señal derivada de la

fragmentación que aparece en 459 m/z.




Figura 3-16: Espectros de análisis por masas MALDI con fluencia de láser del 30% para

el Rubreno usando como matriz MALDI el FVCOOH (arriba) y el FVCOOH-CH3 (abajo).

3.2.2.4 Porfirina de Níquel-Pireno (PNP)

Numerosos reportes de espectrometría de masas de porfirinas metálicas individuales y

conectadas a otros sistemas aromáticos,43 muestran que este tipo de compuestos tienen

una significativa tendencia a la fragmentación durante los análisis por espectrometría de

masas, evitando la visualización de su ión molecular con buena intensidad, pudiendo

llegar hasta la supresión completa de la señal. El principal interés en el análisis de este

tipo de compuestos, radica en que son análogos de las petroporfirinas encontradas en la

mayoría de crudos pesados del mundo,43 y que representan una fracción compleja y de

difícil tratamiento, puesto que no se conoce bien la naturaleza de su estructura, ni su

masa molecular. Por lo tanto se empleó una porfirina de níquel conectada por dos

carbonos tetraédricos a una molécula de pireno (Porfirina de Níquel-Pireno, PNP), de la

que se había determinado, usando una potencia de láser de 20%, que presentaba en su

532.095

370.008

470.252

RM1_10_01 0:I6 MS Raw

0

1

2

3

5x10

Inte

ns.

[a.

u.]

532.189

398.114

470.332

378.093

361.041

RM2_10_02 0:L7 MS Raw

0

2

4

6

8

5x10

Inte

ns.

[a.

u.]

100 200 300 400 500 600 700 800 900m/z

55

espectro de masas LDI una señal del ión molecular con baja intensidad en 898 m/z; y

como ión base presentaba una señal con alta intensidad a 683 m/z, correspondiente a la

metaloporfirina después de perder el fragmento de 215 m/z propio del pireno. En la

Figura 3-17 se ilustra la estructura molecular de PNP y las rupturas características

encontradas durante su análisis.

Figura 3-17: Porfirina de Níquel y sus rupturas más relevantes.

El uso de FV como matrices MALDI para el análisis de este tipo de analitos permitió

encontrar un efecto positivo en la ionización. Ya que se apreció un efecto de protección al

ión molecular donde su señal del ion molecular a 898 m/z aumentó en casi dos órdenes

de magnitud, así como se disminuyó la señal del fragmento que aparecía en 683 m/z,

como se puede observar en la Figura 3-18.




Figura 3-18: Espectro de masas LDI de la porfirina de níquel (arriba) y espectro de

masas MALDI de la porfirina de níquel empleando como matriz FVCl (abajo).

Diferentes análisis en los que se emplearon distintas fluencias de láser, además en los

que se usó DCTB como matriz de referencia, permitieron determinar que los FV

representan una matriz potencial para este tipo de análisis. Como se observa en la

Figura 3-19, el DCTB presenta altas relaciones señal/ruido para el pico en 898 m/z sólo

cuando se emplean fluencias de láser relativamente altas (más de 40%), que pueden

significar un aumento inmediato en la fragmentación del analito, además en ningún caso

superan los valores de la relación señal/ruido obtenidas para los FVCl y FVCOOH-CH3.

Los FV muestran un comportamiento óptimo en los análisis, pues permitieron obtener

buenas relaciones señal/ruido para el analito a fluencias de láser bajas, siendo la fluencia

óptima del 20%.

683.169

215.091 607.147

898.125

1134.942 1793.804

PN_200_01 0:A7 MS Raw

0

1

2

3

4

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

410.090

898.138

683.163277.126 512.145 1131.973 1308.523

PNM1_200_01 0:E7 MS Raw

0

1

2

3

4

5

5x10

Inte

ns. [

a.u.

]

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800m/z

Fragmento

metaloporfirina

PNP

Fragmento

pireno

PNP

Fragmento

metaloporfirina

FVCl

57

Figura 3-19: Relación/señal ruido, para la señal 898 m/z resultante de los análisis en los

que se empleó distintas fluencias de láser y como matrices los tres FV más DCTB como

matriz de referencia.

3.2.2.5 Efectos positivos de los FV como matrices en MALDI de analitos HPA

Los sistemas FV sintetizados durante esta investigación, mostraron resultados bastante

prometedores al ser empleados como matrices de transferencia electrónica en los

análisis por espectrometría de masas MALDI de los cuatro distintos analitos modelo de

hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA). Es importante examinar las posibles

características y propiedades que permitieron que se consiguieran estos resultados

experimentales.




El proceso MALDI como se ha mostrado en la introducción de este documento, es un

proceso muy complejo en el que se cree que interviene más de un mecanismo de

ionización, además de los procesos de desorción y de dinámica molecular inherentes a

este tipo de ionización asistida. A pesar de esto, es importante evaluar las posibles

propiedades que permiten que una matriz MALDI ofrezca buenas propiedades de

absortividad molar, eficiencia cuántica no radiativa, supresión de señales secundarias y

aumento en la señal del ión molecular, entre otras, para su futura implementación en el

análisis de otros analitos, así como el futuro mejoramiento de sus estructuras

moleculares a través de diseño racional.

Sabiendo que el impacto del haz de fotones provenientes del láser a la muestra genera

una alta descomposición de matriz y de analito,5 y teniendo en cuenta también que entre

mayor sea la fluencia del láser mayor será la energía disponible para que el analito tenga

una absorción directa llegando a estados fotoexcitados, en los que la formación de

especies radicalarias del analito que podrán sufrir de procesos de desintegración o

reacciones de recombinación entre los radicales para obtener moléculas de mayor

tamaño, haciendo que la observación del ion molecular del analito sea más difícil o poco

probable.4,6 Bajo estas condiciones la absortividad molar cumple un papel importante, es

más, ésta propiedad ha sido descrita extensivamente por Knochenmuss y col.37 como

una de las más relevantes; puesto que si una matriz tiene una alta absorción de energía

podrá ser más efectiva en la ionización y en la preservación del ión molecular, debido a

que la mayor parte de la energía del láser será absorbida por la matriz, primero por una

razón estadística, puesto que la población de la matriz es mayor que la del analito

(relaciones molares usadas en las muestras son mayoritarias para la matriz respecto el

analito), además la matriz al presentar una alta absortividad molar asegura que sea ésta

y no el analito quien absorba la mayor parte de la energía. Por lo tanto no haya

necesidad de trabajar con altas fluencias de láser como fue evidenciado con los distintos

analitos que se emplearon en los análisis de esta investigación, principalmente en el caso

de la porfirina de níquel-pireno (PNP) en la que se pudo comprobar la fragmentación en

los análisis LDI y como el uso de matrices con altos coeficientes de absortividad molar

como los FV evitaban significativamente la fragmentación del ion molecular, asegurando

a bajas fluencias de láser relaciones señal/ruido más altas respecto a la matriz

convencional DCTB y a los experimentos LDI. Finalmente los mejores resultados fueron

59

obtenidos con FVCOOH-CH3 para la mayoría de analitos, siendo éste el FV sintetizado

en este trabajo que presentó mayor absortividad molar.

Figura 3-20: Se ilustra primero a la izquierda la co-cristalización del analito con el FV

como matriz y la irradiación con el láser. Segundo en el centro, se muestran los cationes

radicales formados después de la irradiación y su reacción con el analito. Tercero a la

derecha, la reacción entre el analito y la matriz ionizada produce el respectivo analito

ionizadio.

Otro parámetro importante en la ionización del analito es el potencial de ionización de la

matriz, puesto que una vez se ha formado el catión radical de la matriz, está será una

especie altamente reactiva8 e intentará estabilizarse a través de la recepción de un

electrón proveniente del analito. Este proceso hace parte de las reacciones secundarias y

puede observarse como una reacción bimolecular, que sucede en la escala de los

nanosegundos.6 Si el potencial de ionización es alto (para matrices MALDI es ideal, igual

o superior a 7.5 eV) el proceso de transferencia electrónica se verá beneficiado. Como se

mostró al inicio de este capítulo los FV sintetizados presentan potenciales de ionización

altos (entre 7.4 y 7.7 eV) que aseguran una mayor ventana de potencial, y por tanto una

mayor posible reactividad frente a los analitos. Los FV con grupos sustituyentes tipo

ácido carboxílico en sus extremos presentaron en la mayoría de los experimentos los

mejores resultados no sólo debido a sus mayores absortividades molares, sino también

en parte porque presentan un mayor potencial de ionización respecto al FVCl (7.59 y

7.61 eV respecto a 7.39eV para FVCl ).

PI matriz> PI analito

hv




El último parámetro que nos permite relacionar el éxito de los FV como matrices de

transferencia electrónica y que los postula como matrices de interés para el análisis de

HPA; es la estructura molecular de los sistemas FV y su capacidad comprobada de

generación de agregados por apilamiento .12 Esta propiedad resulta sumamente

importante y ventajosa respecto a otras matrices, puesto el proceso MALDI inicia en

estado sólido, pues la muestra se deja secar lentamente empleando solventes volátiles,

buscando asegurar la co-cristalización de la matriz con el analito, para asegurar que el

proceso de desorción sea óptimo, además buscando que haya formación de clústeres

que permanecerán en la nube después de la desorción, con lo cual se facilitan las

reacciones bimoleculares.4 La posibilidad de formar una fase en la que haya

interacciones en estado sólido producto de la co-cristalización entre los FV y los HPA

hace que sea probable el proceso de ionización del analito por parte del FV. Debe

tenerse en cuenta que a excepción del naftopireno, ninguno de los otros analitos tenía

estructura completamente planar, como sucede con la mayoría de HPA presentes en los

crudos pesado; pero todos presentan zonas de la molécula con planaridad en las que se

pueden establecer interacciones tipo y por tanto la formación de los clústeres esperada

en el proceso MALDI.

Los sistemas FV demostraron buenas propiedades que permiten por medio de la

presente investigación postularlos como potenciales matrices de transferencia electrónica

que pueden usarse para analizar HPA en crudos, y que posiblemente permitirían

identificar a muchos otros compuestos policíclicos aromáticos que están presentes en

bajas proporciones en el crudo, pues los experimentos que se realizaron con bajas

relaciones de analito respecto a la matriz mostraron relaciones señal/ruido

significativamente altas para las moléculas analizadas.




4. Síntesis y caracterización de derivados de Ácido acrílico

Parte de los propósitos de este trabajo era poder sintetizar matrices de transferencia

protónica y los primeros sistemas sintetizados resultaron ser exitosas matrices de

transferencia electrónica. Debido a esto, se decidió realizar un análisis de promisorios

derivados de ácido acrílico como matrices de transferencia protónica. Se espera que la

información obtenida con estos experimentos, sirva como base para sintetizar en trabajos

posteriores moléculas objetivo y que quizás puedan presentar unidades FV en su

estructura. Se espera que dichas moléculas presenten las características ideales

obtenidas de la información conseguida.

Los ácidos acrílicos y cianoacrílicos fueron sintetizados empleando la reacción de

Knoevenagel, en el presente capítulo se detallan los procedimientos experimentales de

síntesis y purificación de dichos compuestos, así como la caracterización de su

absortividad molar.

4.1 Materiales y Reactivos

Todos los reactivos eran grado analítico y se usaron como se recibieron. Tiofeno 2-

carboxaldehido, furfural, ácido malónico y ácido cianoacetico fueron comprados a Sigma-

Aldrich (Nueva Jersey, EEUU). Metanol, etanol, yodo, piperidina, acetato de amonio y

tolueno fueron adquiridos de Merck (Darmstadt, Alemania).

El único precursor sintetizado para la obtención de compuestos mencionados en el

presente capítulo fue el 5-yodotiofeno-2-carboxaldehido, y su síntesis fue adaptada de un

reporte previo44 y es descrita a continuación con su respectiva caracterización:

63

4.1.1 5-Yodotiofeno-2-carboxaldehido

A una solución en reflujo de peryodato de sodio (1 equivalente) en metanol, mientras se

agitaba se agregó por goteo a través de un embudo de adición una mezcla de yodo (1

equivalente) y tiofeno-2-carboxaldehido (1 equivalente) durante una hora. Cuando

terminó la adición, se dejó la mezcla en reflujo por 45 minutos más; luego se adicionó

una solución de bisulfito de sodio (10%) y se dejó enfriar. La mezcla resultante fue

extraída con diclorometano. La fase orgánica se lavó tres veces con bicarbonato de sodio

(10%), tres veces con salmuera y tres veces con agua. Posteriormente se secó con

sulfato de sodio anhidro. El solvente se retiró por destilación a presión reducida dejando

un sólido café. La recristalización en ciclohexano, permitió obtener un sólido con forma

de agujas de color amarillo pálido. Rendimiento 82%. P.f. 52-54°C. Lit. 57-58°C.44 RMN

1H (CDCl3, 400 MHz, : ppm): 7.41 (m, 2H), 9.79 (s, 1H). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz, :

ppm): 87.79, 137.0, 138.3, 149.7, 181.1.

4.1.2 Equipos

Los puntos de fusión fueron medidos en un fusiómetro Stuart SMP10. Los espectros de

resonancia magnética nuclear fueron tomados en un espectrómetro Bruker Avance 400

usando (TMS) como estándar interno. Para las pruebas de espectrometría de masas

MALDI se empleó un espectrómetro de masas Bruker UltraFlex con analizador de tiempo

de vuelo. Se realizó un barrido entre 180-2000Da, usando el analizador en modo

reflectrón y el detector en modo positivo. La intensidad del láser se usó 5% por encima

del umbral de ionización para cada muestra, con el fin de reducir la fragmentación y

aumentar la resolución.

4.1.3 Absortividad molar

Se preparó para cada derivado de ácido acrílico una serie de soluciones en metanol

(grado analítico, Merck) en el rango de 1–5μM, La absorbancia de cada una de las

soluciones se midió a 355 nm, en un espectrofotómetro Shimadzu UV-2401C de doble

canal. Se emplearon celdas de cuarzo de 10 mm de camino óptico. Se usó metanol en la

celda de referencia como blanco.




4.2 Procedimiento estándar para síntesis de ácidos

acrílicos

Figura 4-1: Esquema general de síntesis de los derivados de ácido acrílico.


En un balón de fondo redondo de 10 mL equipado con un condensador, una mezcla del

respectivo aldehído (1 equivalente), ácido malónico (1 equivalente) y piperidina (0.1

equivalentes); fue puesta en reflujo en 5 mL de piridina durante 5 horas. Posteriormente

se permitió a la reacción alcanzar temperatura ambiente y se agregó por goteo una

solución de HCl (5% vol.), formándose un precipitado. El precipitado fue colectado por

filtración. La recristalización del producto en metanol, dio el respectivo ácido acrílico con

rendimientos entre 71 y 88%.

4.2.1 Ácido acrílico de furano (AFu): (ácido 3-(furan-2-il)-2-

propenóico)

Se partió de furfural y ácido malónico. Tiempo de reacción 5 h. Sólido amarillo pálido.

Recristalizado en metanol. Rendimiento: 85%. P.f. 140-142°C. Lit. 138-139°C.45 RMN 1H

(DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 6.17 (d, 1H J=15.8 Hz), 6.63 (d, 1H), 6.93 (dd, 1H), 7,40

(d, 1H J=15.8 Hz), 7.84 (d, 1H), 12.40 (s, 1H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, :

ppm):113.1, 115.7, 116.5, 131.3, 146.2, 150.9, 167.8. Peso Molecular: Calculado:

138.032. Encontrado: 138.033 (MALDI-TOF).

65

4.2.2 Ácido acrílico de tiofeno (ATio): (ácido 3-(Tiofen-2-il)-2-

propenóico)

Se partió de tiofeno-2-carboxaldehido y ácido malónico Tiempo de reacción 5 h. Sólido

blanco crema. Recristalizado en metanol. Rendimiento: 71%. P.f. 147-149. Lit. 145-

147ºC.46 RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 6.27 (d, 1H J= 14.2 Hz), 7,10 (dd, 1H),

7,33 (d, 1H), 7,45 (d, 1H), 7.91 (d, 1H J=14.2 Hz). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, :

ppm):115.9, 128.2, 129.3, 131.7, 139.2, 139.4, 172.32. Peso Molecular: Calculado:


4.2.3 Ácido acrílico de yodotiofeno (AItio): (ácido 3-(5-yodotiofen-

2-il)-2-propenóico)

Se partió de tiofeno-5-yodo-2-carboxaldehido y ácido malónico Tiempo de reacción 5 h.

Sólido polvoroso blanco. Recristalizado en metanol. Rendimiento 84%. P.f. 180-182°C.

Lit. 181-183°C.47 RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 6.13 (d, 1H J= 15.3 Hz), 7,20 (d,

1H, J: 16,1Hz), 7,38 (d, 1H), 7,69 (d, 1H J= 15.3 Hz). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz,

ppm): 81.7, 118.7, 133.7, 136.0, 138.6, 145.2, 167.3. Peso Molecular: Calculado:


4.3 Procedimiento estándar para síntesis de ácidos

cianoacrílicos:

Figura 4-2: Esquema general de síntesis de los derivados de ácido acrílico.





En un balón de fondo redondo de 10 mL equipado con un condensador una mezcla del

respectivo aldehído (1 equivalente), ácido cianoacetico (1 equivalente) y acetato de

amonio (0.15 equivalentes); en 5 mL de tolueno, fue puesta en reflujo durante 8 horas. La

reacción fue enfriada en un baño de hielo y se formó lentamente un precipitado. El

precipitado se colectó por filtración, y su recristalización en etanol permitió aislar el

respectivo ácido cianoacrílico puro. Los rendimientos de las reacciones estuvieron entre

69 y 83%.

4.3.1 Ácido cianoacrílico de furano (AFuCN): (ácido 3-(furan-2-il)-

2-cianopropenóico)

Se partió de furfural y ácido cianoacético. Tiempo de reacción de 8 h. Sólido café pálido.

Recristalizado en metanol. Rendimiento: 83%. P.f. 210-212°C. Lit. 215ºC.48 RMN 1H

(DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 6.86 (dd, 1H), 7,47 (d, 1H), 8.08 (s, 1H), 8.20 (s, 1H),

13.39 (s, 1H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, : ppm): 56.5, 98.8, 114.6, 116.2, 124.1,

139.2, 148.7, 150.1, 164.0. Peso Molecular: Calculado: 163.027. Encontrado: 163.031

(MALDI-TOF).

4.3.2 Ácido cianoacrílico de tiofeno (ATioCN): (ácido 3-(Tiofen-2-

il)-2-cianopropenóico)

Se partió de tiofeno-2-carboxaldehido y ácido cianoacético. Tiempo de reacción 8 h.

Sólido amarillo oscuro. Recristalizado en etanol. Rendimiento: 80%. P.f. 230-231°C. Lit.

232-234.5ºC49 RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 7.25 (dd, 1H), 7,81 (d, 1H), 7,85

(d, 1H), 8.36 (s, 1H). RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz, : ppm): 99.3, 115.6, 128.6, 135.1,

136.1, 137.1, 146.6, 162.8.

67

4.3.3 Ácido cianoacrílico de yodotiofeno (AITioCN): (ácido 3-(5-

yodotiofen-2-il)-2-cianopropenóico)

Se partió de 5-yodo-2-tiofenocarboxaldehido y ácido cianoacético. Tiempo de reacción 8

h. Sólido amarillo. Recristalizado en etanol. Rendimiento: 69%. P.f. 267-269°C. RMN 1H

(DMSO-d6, 400 MHz, : ppm): 7.42 (d, 1H), 7.61 (d, 1H), 8.45 (s, 1H) RMN 13C (DMSO-

d6, 100 MHz, : ppm): 99.3, 115.6, 128.6, 135.1, 136.1, 137.1, 146.6, 162.8.




4.4 Resultados y discusión

4.4.1 Síntesis

Se sintetizaron y caracterizaron con éxito los 6 derivados de ácido acrílico con

rendimientos entre el 70 y el 85%, comparable a los encontrados en la literatura45-49

acorde a las condiciones experimentales empleadas.

En la Figura 4-3 se aprecian las estructuras de cada uno de los derivados de ácido

acrílico y cianoacrílico sintetizados. A continuación sólo se realizará la discusión del

análisis estructural del AFu (ácido-3-(furan-2-il)-2-propenóico), debido a la similitud de los

otros compuestos no se entrará en detalles para cada uno. Para los otros derivados de

ácido acrílico y cianoacrílico, sus correspondientes análisis estructurales pueden ser

encontrados en el anexo 1 de este trabajo de investigación.

Figura 4-3: Estructuras de los derivados de ácido acrílico sintetizados.

69

El ácido acrílico de furano (Afu), presenta un espectro de resonancia magnética nuclear

protónica característico de este tipo de compuestos. Primero se analiza la presencia de

las señales acrílicas (notadas en la Figura 4-4 como A y D) que aparecen a 6.63 y 7.40

ppm (espectro protónico, Figura 4-5), en forma de doblete como se esperaban. Algo que

resulta muy interesante de este resultado es que la constante de acoplamiento es de

15.8 Hz, mostrando que el compuesto presenta mayoritariamente una conformación

entgegen, por lo que se puede indicar que la reacción de Knoevenagel presenta

estereoselectividad hacia el isómero E, bajo las condiciones empleadas, conocidas como

modificación de Doebner por la presencia de la piridina para generar la descarboxilación

para el tipo de compuestos sintetizados en este trabajo. Este resultado no es nuevo para

este tipo de reacción, pues en la síntesis de distintos tipos de sistemas insaturados ya se

ha indicado este tipo de estereoselectividad;50 pero incluso así es destacable, pues se

presentó para los tres ácidos acrílicos, como lo indica las constantes de acoplamiento

que presentaron las señales acrílicas entre 14 y 16 Hz, como se puede observar en la

Tabla 4-1.

Figura 4-4: Estructura de AFu y las señales esperadas para los experimentos de

resonancia protónica.

Para el caso de los derivados de ácido cianoacrílico, la sustitución de uno de los

hidrógenos acrílicos en posición al carbonilo, por el grupo ciano, hace que el hidrógeno

no sustituido (en posición ) se presente como una señal tipo singlete, bastante corrida a

campo bajo como se muestra en la Tabla 4-2; para cada uno de los tres ácidos

cianoacrílicos sintetizados en esta investigación. Dicho corrimiento es debido a la




presencia del grupo ciano que por ser electroatractor, atrae la nube electrónica de la

insaturación, aumentando la desprotección del hidrógeno beta.

Figura 4-5: Espectro de resonancia protónica para AFu.

Tabla 4-1: Señales acrílicas encontradas en los tres derivados de ácido acrílico.

Molécula Señales acrílicas (ppm) Constante (Hz)

AFu 6.17 y 7.40 15.8

ATio 6.27 y 7.91 14.2

AITio 6.13 y 7.69 15.3

Continuando con la asignación de señales para la estructura del AFu, tenemos las

señales propias de los hidrógenos del anillo furánico. Primero se asignó como 7.84 ppm

la señal correspondiente a la posición 5 del anillo (señal E) puesto que el efecto de la

71

sustitución del anillo recae en esta posición, haciendo que esté más desprotegida. La

señal del hidrógeno de la posición 4 (señal C) aparece como un doble doblete en 6.93,

pues en este tipo de anillos experimentalmente se observa en distintas moléculas que

ese hidrógeno acopla individualmente con cada uno de los otros dos hidrógenos del

anillo. El hidrógeno restante (Hidrógeno B) aparece en 6.63 ppm como un doblete con un

corrimiento típico para un hidrógeno furánico.51 El hidrógeno ácido se aprecia en este

compuesto como una señal ancha centrada en 12.40 ppm. En la mayoría de ácidos

sintetizados en este trabajo, dicho hidrógeno no pudo ser observado plenamente.

Tabla 4-2: Señales acrílicas encontradas en los tres derivados de ácido cianoacrílico.

Molécula Señal acrílica

(ppm)

AFuCN 8.08

ATioCN 8.36

AITioCN 8.45

El espectro de resonancia magnética nuclear de carbono permitió corroborar la

información obtenida para la estructura a través de la resonancia magnética de 1H. El

carbono de ácido carboxílico se evidencia (carbono A de la Figura 4-6) en 167.95 ppm

como se aprecia en la Figura 4-7. El carbono B del anillo furánico al estar sustituido se

asignó como la señal a 150.88 ppm. El carbono C correspondiente a la posición 5 del

anillo de furano, por estar enlazado al heteroátomo aparece como la señal a 146.18 ppm.

Figura 4-6: Estructura de AFu y asignaciones para los carbonos.




Figura 4-7: Espectro de resonancia magnética de carbono para AFu.

El carbono D corresponde al carbono alfa al carbonilo del derivado de ácido acrílico y

aparece en 131.27 ppm. Para los derivados de ácido cianoacrílico este carbono por la

presencia del grupo ciano aparece entre 98 y 99 ppm. El carbono de la posición beta

(carbono E) y los de las posiciones 3 y 4 del anillo aromático presentan corrimientos

similares entre 113 y 116 ppm y fueron asignados como se aprecia en la Figura 4-7.

Con la caracterización estructural por RMN terminada, se realizaron los espectros de

masas LDI para las moléculas en las que se pudo encontrar señales con intensidades

relativamente bajas, correspondientes al ión molecular de cada una de ellas. El espectro

de masas de AFu se aprecia en la Figura 4-8. Debe tenerse en cuenta que el mismo

fenómeno de baja intensidad del ión molecular se evidencia para el ácido CHCA52

impidiendo ver claramente su ión molecular, puesto que hay una alta generación de

aductos y de especies, de las que se hablará en el capítulo 5 de este documento.

73

Figura 4-8: Espectro de masas LDI para AFu.

Una vez verificada la identidad de las moléculas sintetizadas se procedió a establecer

sus propiedades de absortividad molar para evaluar su posible aplicación como matrices

de transferencia protónica para espectrometría de masas MALDI. Aunque para los FV se

realizó todo un capítulo sobre las determinaciones de las propiedades optoelectrónicas,

para los derivados de ácido acrílico se presenta como una sección de este capítulo,

debido a que sólo se realizó evaluación de las propiedades de absortividad; puesto que

la determinación de las propiedades de eficiencia cuántica no es importante en procesos

de transferencia protónica debido a que las propiedades de la molécula excitada no son

necesariamente las mismas del estado fotoexcitado de la molécula protonada.

138.0330.00

0

2

4

6

Inte

ns. [a

.u.]

130 132 134 136 138 140 142 144m/z




4.4.2 Caracterización de absortividad molar

La mayoría de ácidos acrílicos ya han sido reportados en literatura como se observó en

la sección anterior, pero ninguno ha sido empleado antes como matriz en experimentos

MALDI. Para evaluar el potencial uso en espectrometría de masas MALDI de los

compuestos sintetizados se realizó la respectiva caracterización de las propiedades de

absortividad molar. Para el CHCA se ha encontrado que las propiedades de emisión por

fluorescencia son bastante bajas y por tanto se decidió no determinar esta propiedad

para los ácidos acrílicos sintetizados.29

Se realizaron barridos del espectro UV-Vis y se determinaron los coeficientes de

absortividad molar a 355 nm, puesto que esta es la longitud de onda de trabajo del láser

de NdYAG que se emplea en el equipo en el que se realizaron los análisis de

espectrometría de masas. Los espectros de absorción resultantes se observan en la

Figura 4-9.

Figura 4-9: Espectros de absorción para los seis derivados de ácido acrílico.

355 nm

75

Los espectros de absorción permitieron notar algunos comportamientos interesantes en

los compuestos sintetizados, como por ejemplo que la sustitución en el carbono del

hidrógeno por el grupo nitrilo genera un efecto batocrómico, puesto que todos los ácidos

derivados de acrílico presentaron un aumento en la ubicación de su máximo de absorción

de cerca de 30 nm, como se aprecia en la Figura 4-9, para la pareja Furano-Furanociano

(espectro rojo y fucsia, respectivamente) el máximo cambió de 302 a 331nm. Este efecto

es conocido para este tipo de grupos y ha sido previamente reportado, teniendo en

cuenta que el grupo ciano es un cromóforo por su triple enlace (por sus enlaces )

además por su efecto electroatractor modificando la densidad electrónica de los otros

enlaces. Los ácidos derivados de ácido acrílico demostraron que sus máximos de

absorción se encontraban lejanos de 355 nm.

Tabla 4-3: Coeficientes de absortividad molar a 355 nm para cada uno de los derivados

de ácido acrílico

Molécula

Coeficiente

absortividad molar

ε[M-1cm-1]

AFu 1.3x102

ATio 3.6x102

AITio 6.9x103

AFuCN 3.0x104

ATioCN 4.0x104

AITioCN 4.1x104

CHCA34 1.78x104

Los valores de absortividad molar se presentan en la Tabla 4-3 y se puede notar que

todos los ácidos acrílicos sin grupo ciano tienen una menor absortividad que la matriz de

referencia el CHCA, debido a que sus máximos de absorción están muy corridos hacia el




azul. Por otro lado se evidencia que el grupo ciano que generó el corrimiento de los

máximos de absorción hacia el rojo, hizo posible que las moléculas presenten un máximo

de absorción más cercano a 355 nm. Adicionalmente, se encontró que todos los

derivados de ácido cianoacrílico presentan un coeficiente de absortividad molar más alto

que el CHCA, en casi el doble de su valor y por tanto representan moléculas con alto

potencial como matrices de transferencia protónica MALDI.

El conocimiento obtenido a partir de estos resultados permite sugerir que el desarrollo de

nuevas moléculas basadas en derivados de ácido acrílico que sean potencialmente

aplicables como matrices en espectrometría de masas MALD,I deben tener en su

estructura el grupo nitrilo, puesto que éste permite tener mejores propiedades de

absortividad molar.

Capítulo 5 79

5. Derivados de ácido acrílico como matrices MALDI para procesos de transferencia protónica

En este capítulo se detallan los resultados de las pruebas realizadas, en las que se

emplearon los derivados de ácido acrílico y ácido cianoacrílico como matrices de

transferencia protónica. Se describe el alcance y el potencial de dichas moléculas en su

uso en espectrometría de masas MALDI.

5.1 Materiales y métodos

5.1.1 Experimentos de espectrometría de masas MALDI

Se preparó una solución saturada de las 6 matrices y del CHCA como matriz de

referencia en ACN:H2O (2:1, v/v, 0.1% TFA). Como analito se usó una mezcla equimolar

de tres péptidos sintéticos, en concentraciones de 63μmol/L en H2O adicionando 0.1%

de ácido fórmico para ayudar en el proceso de protonación. Los péptidos usados

corresponden a los siguientes (se específica la masa).

Bombensina 1618.8Da

Bradiquinina 1059.5Da

Renina sustrato 1759.9Da

Se aplicó 1.0μL de mezcla de matriz y analitos en el target y se dejó secar en la cabina

de extracción. Fue empleado un espectrómetro de masas Bruker UltraFlex con

analizador de tiempo de vuelo. El barrido fue hecho entre 180-2000Da, usando el

analizador en modo reflectrón y el detector en modo positivo. La intensidad del láser se

usó 5% por encima del umbral de ionización para cada muestra, con el fin de reducir la

fragmentación y aumentar la resolución. Fue empleada una relación Analito:Matriz de




1:100. Cada evaluación exitosa corresponde a 500 espectros individuales y se

requirieron 2000 espectros individuales para guardar el espectro acumulado final.

5.1.2 Cálculos computacionales

Se emplearon herramientas computacionales para explicar y analizar la protonación de

las distintas moléculas usadas durante la serie de experimentos de espectrometría de

masas MALDI. Partiendo del reporte de Bourcier y col.39 en el que se detallan cálculos de

afinidad protónica para potenciales matrices MALDI. Se usó la metodología DFT, como

funcional B3LYP, y como base 6-311++(2d,2p) para optimizar la estructura de los

distintos ácidos acrílicos y cianoacrílicos; también se calcularon las energías y las

propiedades termoquímicas para el ácido antes de la protonación y para el ácido con un

protón adicional en su grupo ácido. Para los ácidos acrílicos AITio y AITioCN, no se

pudieron realizar este tipo de cálculos puesto que esta metodología presenta

restricciones para átomos de número atómico muy grande.39 Todos los cálculos se

implementaron en el programa Gaussian 09W.

El cálculo se realizó a partir de:

AP= E(M)−E(M-H+)

E(M)=Eelec M +Eterm M

E(M-H+)=Eelec M-H+ +Eterm M-H+

Donde AP es la afinidad protónica, Eelec es la energía electrónica de la matriz y de la

matriz en estado fotoexcitado, Eterm es la energía térmica que se obtiene al calcular las

propiedades termodinámicas de la matriz y la matriz en estado fotoexcitado.

5.2 Resultados y discusión

Para establecer el potencial uso de los derivados de ácido acrílico y de ácido

cianoacrílico, se realizaron experimentos comparativos con el CHCA que es la matriz

más común y más empleada en el análisis de proteínas. La tres proteínas que se

emplearon están en el rango de 1000 y 2000 Da. En la Figura 5-1, que corresponde al

Capítulo 5 81

espectro de masas MALDI de la mezcla de las tres proteínas al ser ionizadas con CHCA,

se aprecia como el CHCA permite la ionización de los tres péptidos con intensidades

distintas, la bombesina presenta una intensidad de 6.8x104 mientras que los otros dos

péptidos presentan intensidades similares cercanas a 4.0x104 u.a.

Este resultado para el CHCA es bastante bueno, puesto que se empleó una relación

molar de 1:100, teniéndose en cuenta que en el análisis de proteínas y péptidos se busca

siempre emplear la menor cantidad de muestra, ya que como es muy bien conocido la

obtención de muchas de estas muestras es difícil y dispendiosa, y en muchos casos no

permite la consecución de cantidades altas de proteína para analizar y caracterizar

completamente. Debido a esto, una excelente matriz MALDI será aquella que genere las

más altas intensidades de señal para el ión molecular empleando las menores relaciones

analito:matriz.

Figura 5-1: Espectro MALDI de tres péptidos evaluados usando CHCA como matriz

En la zona entre 100 y 600 Da, se aprecia una cantidad significativa de señales

correspondientes al uso de CHCA, las cuales ya han sido ampliamente estudiadas52 y

que representan aductos de molécula con metales alcalinos distintos y también algunos

productos de reacciones de entrecruzamiento que se pueden dar en el CHCA debido a la

generación de estados altamente energéticos durante el fenómeno MALDI.4

379.094

1619.823

228.012

1060.565 1758.937

568.136

484.995

304.301

934.980666.021

0

2

4

6

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800m/z

Bombensina

Bradiquinina

Renina sustrato




Los ensayos realizados empleando el ATio como matriz MALDI fueron los primeros que

en ser realizados y permitieron encontrar el primer gran resultado, puesto que a pesar de

que se había observado una muy baja absortividad para esta molécula (cercana a 360 M-

1cm-1) se pudo observar la ionización de los péptidos en intensidades cercanas a 3.0x104

como se ve en la Figura 5-2, en la que se puede apreciar el espectro LDI del ATio y el

resultado al usarlo como matriz.

Figura 5-2: Espectro LDI de ATio (arriba) y espectro de masas MALDI de tres péptidos

evaluados usando ácido ATio como matriz (abajo).

Figura 5-3: Acercamiento al Espectro LDI de ATio.

398.091

476.135

274.137

629.218193.056

130730_M3_02 0:C12 MS Raw

2

4

6

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

1060.592

398.040

1619.859476.085

1758.985594.235

192.988

724.095

258.127

205.028

130730_M4_03 0:C13 MS, BaselineSubtracted

1

2

3

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800m/z

398.040274.086

346.999

331.023

309.045

382.088

368.979

291.038352.994

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

280 300 320 340 360 380 400m/z

[2M+H]+

[2M+Na]+

[2M+K]+

Bombensina

Bradiquinina

Renina

sustrato

Capítulo 5 83

Resulta muy interesante considerar el hecho de que el ATio debió presentar alguna

afinidad ligeramente mayor por la bradiquinina respecto a los otros péptidos, puesto que

ésta es la que exhibe las mayores intensidades en los experimentos realizados. Para

tratar de entender por qué ATio había generado estos buenos resultados lo primero que

se realizó fue el análisis de la zona entre 250 y 400 m/z (Figura 5-3) para encontrar la

posible formación de aductos con iones, encontrados siempre en las moléculas que

presentan buenos resultados como matrices MALDI.29 Se pudo apreciar una señal a

309.045 m/z que fue asociada la presencia de un aducto de dos moléculas de ATio y un

protón, también se encontró una señal a 331.023 m/z correspondiente a un aducto entre

un ión sodio y dos moléculas de ATio y una señal a 346.999 m/z que fue asignada como

el aducto formado por el ión potasio y dos moléculas de ATio. Este tipo de aductos son

comunes cuando se usa CHCA y se asocian con una buena capacidad de realizar

interacciones con el péptido.7 Cabe anotar que los iones metálicos provienen de las

soluciones origen de las proteínas, pues es normal que estas estén guardadas en

soluciones amortiguadoras de pH en las que hay presencia de estos elementos.

También se recurrió al uso de herramientas computacionales para intentar explicar los

resultados obtenidos, el cálculo de energías de afinidad protónica es muy común para las

matrices nuevas que se han desarrollado.39 Se espera que la energía de afinidad

protónica no sea demasiado alta pues esto indica que la formación de la especie matriz-

protón está desfavorecida termodinámicamente. El valor de afinidad protónica para el

CHCA calculado experimentalmente es 199 Kcal/mol, así que se espera que una buena

matriz tenga un valor cercano a este.

Se modelaron estructuras con distintas conformaciones para el ATio y la optimización

permitió encontrar que las 4 estructuras presentaban menor energía (Figura 5-5).

Partiendo de éstas; se modelaron las respectivas estructuras protonadas en el carbonilo

del ácido carboxílico y se hallaron las energías de afinidad protónica. Se encontró para el

caso del ATio que las moléculas de conformación Z presentaban mayores energías de

afinidad protónica, con valores de 209 Kcal/mol que son ligeramente altos. Para la

estructura de conformación E se obtuvo 205 Kcal/mol, que es mucho más bajo y que se

puede relacionar con el fenómeno de transferencia protónica que se evidenció. Aunque

realmente los resultados del uso de ATio como matriz MALDI son mejores de lo esperado

de acuerdo a los parámetros estudiados. Adicionalmente se tiene que funcionó mejor

con la bradiquinina, y esto se puede asociar a su estructura, a razón de que este péptido




presenta zonas ligeramente hidrofóbicas pertenecientes a los fenilos de la fenilalanina,

que podrían haber presentado fenómenos sinérgicos con la insaturación y el anillo

tiofénico, a diferencia del CHCA que es de mayor carácter hidrofílico a lo largo de su

estructura.

Figura 5-4: Estructura del péptido bradiquinina.

Capítulo 5 85

Figura 5-5: Estructuras más estables encontradas para ATio, arriba de cada una se

muestran los valores correspondientes de la energía de la molécula y se puede apreciar

el valor de energía de afinidad protónica.

En los experimentos en los que se usó AFu, también se pudo realizar completamente la

ionización de los tres péptidos analizados, siendo la bombesina la que presentó mayor

intensidad en su señal, probablemente debido a que éste péptido presenta bastantes

sustituyentes polares. Lastimosamente ésta matriz presentó un problema significativo de

205 Kcal/mol

209 Kcal/mol

209 Kcal/mol

209 Kcal/mol

E: -819.145 Ha E: -819.484 Ha

E: -819.144 Ha E: -819.491 Ha

E: -819.152 Ha E: -819.500 Ha

E: -819.154 Ha E: -819.494 Ha




señales no deseadas; tanto en el espectro LDI como en el MALDI con los péptidos

(Figura 5-5) se aprecia una cantidad significativa de señales en la zona entre 100 y 700

Da. Se pudo determinar que algunas señales pertenecían a aductos de moléculas de la

matriz asociadas a protones o iones metálicos, pero la mayoría de estas no tiene una

asignación clara y una posible explicación es que se deba a la recombinación de la

matriz en productos de mayor peso molecular no deseables durante el análisis, asi

mismo de presentar una intensidad mayor para dichas señales a la que se presenta en el

CHCA.

Figura 5-6: Espectro LDI de AFu (arriba) y espectro de masas MALDI de tres péptidos

evaluados usando ácido AFu como matriz (abajo).

Para AFu se había determinado un coeficiente de absortividad molar cercano a 130 M-

1cm-1 que es considerablemente bajo, además la energía de afinidad protónica para las

estructuras de menor energía (Figura 5-7) dieron como mínimo un valor de afinidad

protónica de 206 Kcal/mol, que no es muy bueno en comparación con la matriz de

referencia. Debe tenerse en cuenta que a pesar de las limitaciones encontradas para el

uso de esta molécula como matriz MALDI se pudo comprobar la ionización de los

617.139

248.307

M2_60 0:A8 MS Raw

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

5x10

Inte

ns. [

a.u.

]

1667.873

1060.609

1619.87

M2P_60 0:I8 MS, BaselineSubtracted, Smoothed

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

500 1000 1500 2000 2500 3000m/z

Bombensina

Bradiquinina

Renina

sustrato

Capítulo 5 87

péptidos, y la señal fue relativamente alta, así que este tipo de molécula puede servir

como base para el diseño de otras en las que se puedan mejorar estas propiedades.

Figura 5-7: Estructuras más estables encontradas para AFu (arriba) y AFuCN (abajo),

arriba de cada una se muestran los valores correspondientes de la energía de la

molécula y se puede apreciar el valor de energía de afinidad protónica

207 Kcal/mol

206 Kcal/mol

197 Kcal/mol

E: -496.060 Ha E: -496.513 Ha

E: -496.156 Ha E: -496.502 Ha

197 Kcal/mol

E: -588.432 Ha E: -588.756 Ha

E: -588.421 Ha E: -588.747 Ha




Los experimentos en los que se usó AFuCN como matriz MALDI de transferencia

protónica fueron sumamente satisfactorios (Figura 5-8), pues los resultados conseguidos

mostraron que AFuCN presentó para la señal de la bombesina una intensidad de 8.9x104

y por tanto tuvo un mejor desempeño que el CHCA al ionizar este péptido. Para el caso

de los otros dos péptidos se tuvieron intensidades de señal entre 3.0 y 4.0x104,

haciéndolas comparables con las obtenidas en los experimentos en los que se usó como

matriz CHCA. Los magníficos resultados son atribuidos a dos factores importantes, el

primero es que el coeficiente de absortividad molar de esta molécula fue determinado

como 3.0x104 M-1cm-1 representando casi el doble del CHCA, además los cálculos

computacionales de las estructuras con conformaciones de menor energía (Figura 5-7),

permitieron estimar el valor de la energía de afinidad protónica en 197 Kcal/mol, muy

similar al reportado para el CHCA, permitiendo establecer a AFuCN como una potencial

matriz de transferencia protónica. Se considera que el alto incremento en la señal para la

bombesina puede estar relacionado con la presencia de distintos grupos polares a lo

largo de la estructura de AFuCN, y por ello puede realizar más interacciones

intermoleculares de la matriz con los sustituyentes polares de los aminoácidos que

componen la bombesina.

Figura 5-8: Espectro LDI de AFuCN (arriba) y espectro de masas MALDI de tres

péptidos evaluados usando ácido AFuCN como matriz (abajo).

269.104

721.087

514.105

1744.147

M5_25 0:D8 MS Raw

0

1

2

3

4

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

1620.090

412.430

578.382

269.176

1060.767

M5P_25 0:D11 MS Raw

0

2

4

6

8

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

500 1000 1500 2000 2500 3000m/z

Bombensina

Bradiquinina

Renina

sustrato

Capítulo 5 89

El hecho de que se presente una alta intensidad en el péptido que presenta mayor

cantidad de grupos polares, también permite establecer la potencialidad para emplear

AFuCN en el análisis de distintos péptidos de este tipo; que podrían presentar resultados

alentadores.

Para el caso en el que se usó ATioCN como matriz MALDI de transferencia protónica se

encontró que los resultados no fueron tan satisfactorios como se esperaban. Aunque, el

coeficiente de absortividad molar fue determinado como 4.0x104 M-1cm-1 siendo superior

al doble del coeficiente del CHCA, y la energía de afinidad protónica fue estimada con

base en las estructuras de menor energía como 199 Kcal/mol, un valor bastante similar al

que posee el CHCA; pero esto no significó que se encontraran buenos resultados (Figura

5-10) ya que la intensidad máxima observada fue de 1.5x104 para la bombesina que a

pesar de no ser baja, en comparación con el CHCA y con AFuCN es bastante discreta.

Para el caso de la bradiquinina la intensidad de la señal es del orden de 102, siendo muy

inferior respecto a todas las otras moléculas.

La disminución en la intensidad en la señal de bradiquinina; que en los experimentos

para ATio había sido la más alta, permite darle fundamento a la teoría de la interacción

intermolecular de la insaturación de ATio con los sustituyentes aromáticos de los

aminoácidos de la bombesina, pues sabiendo que al introducir el grupo ciano cambia la

polaridad de esta zona de la molécula, así como la disponibilidad de la insaturación para

interaccionar, se espera una disminución en la posibilidad de interaccionar con el péptido

y por tanto la disminución en la capacidad de ionizarlo.

Figura 5-9: Estructura del péptido bombesina.




Otra de las razones a las que se atribuye el bajo desempeño de ATioCN, a pesar de sus

buenas propiedades, se relaciona con la estabilidad del derivado de ácido acrílico, pues

la muestra presentó un ligero cambio en la coloración después de su proceso de síntesis

hasta su posterior uso como matriz. La presencia de señales en el espectro LDI (Figura

5-10) en zonas superiores a 1800 Da, también pueden sugerir algún proceso de

polimerización de la muestra antes de ser usada como matriz y debido a esto la molécula

no estuvo integra al ser empleada en los experimentos y debido a limitaciones de tiempo,

estos experimentos no pudieron ser repetidos con la muestra purificada.

Figura 5-10: Espectro LDI de ATioCN (arriba) y espectro de masas MALDI de tres

péptidos evaluados usando ácido ATioCN como matriz (abajo).

317.026

1164.955

466.085 1887.9021365.947784.960 2227.923

M8_25 0:G8 MS, BaselineSubtracted, Smoothed

0

1

2

3

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

315.041

1619.931

578.284

538.058

1164.9811887.936

M8P_25 0:G11 MS, BaselineSubtracted, Smoothed

0.0

0.5

1.0

1.5

2.04x10

Inte

ns. [

a.u.

]

500 1000 1500 2000 2500 3000m/z

Bombensina

Bradiquinina

Renina

sustrato

Capítulo 5 91

Figura 5-11: Estructuras más estables encontradas para ATioCN, arriba de cada una se



Los experimentos realizados con las moléculas AITio y AITioCN no produjeron resultados

positivos o apreciables al ser empleados como matrices de transferencia protónica, a

pesar de que exhibieran propiedades estimables como óptimas para su potencial uso

como matrices de transferencia protónica. Principalmente se atribuyen estos malos

resultados a la presencia del sustituyente yodo, pues como ha sido ampliamente

documentado en espectrometría de masas, este elemento tiende a ser retirado de la

estructura molecular, generando especies o subproductos indeseables que no fueron

percibidos debido a la ausencia de la relación masa/carga o a tener cargas negativas. El

uso de estas matrices con yodo se hizo para tener un sitio susceptible a posteriores

transformaciones sintéticas; y probar que estas matrices servían como base para el

desarrollo de posteriores moléculas con otro tipo de sustituyentes que permitieran

mejorar las propiedades de las matrices obtenidas durante esta investigación. A pesar de

estos resultados, se considera que estas moléculas pueden servir de base para la

198 Kcal/mol

203 Kcal/mol

E: -911.416 Ha E: -911.742 Ha

E: -588.421 Ha E: -588.747 Ha




síntesis de nuevas matrices, pues se parte de los resultados obtenidos con las otras

moléculas, que fueron bastante satisfactorios y prometedores.

Figura 5-12: Estructura más estable encontrada para CHCA, arriba de cada una se



Para establecer que tan buena aproximación representaban los valores de afinidad

protónica de los ácidos acrílicos, se realizó el modelamiento del CHCA (Figura 5-12) para

determinar su energía de afinidad protónica y compararla respecto al valor experimental

de 199 Kcal/mol. El resultado del modelamiento dio una estructura de baja energía que al

emplear la metodología descrita permitió determinar un valor de energía de afinidad

protónica de 199 Kcal/mol, como ya lo había demostrado Bourcier.39

Este resultado permite pensar que las energías de afinidad protónica calculadas en este

trabajo para los derivados de ácido acrílico y cianoacrílico, están bastante cercanas a las

experimentales y por tanto sirven para la argumentación del presente trabajo

experimental. En la Tabla 5-1 se muestran las energías de afinidad protónica

determinadas para las estructuras de menor energía del CHCA y de los derivados

acrílicos.

199 Kcal/mol

E: -665.902 Ha E: -666.232 Ha

Capítulo 5 93

Tabla 5-1: Energías de afinidad protónica calculadas para las matrices empleadas en los

experimentos MALDI.

Estructura más

estable

Afinidad

protónica

(Kcal/mol)

ATio 205

ATioCN 198

AFu 206

AFuCN 197

CHCA calculado 199

Todos los resultados encontrados nos permiten sugerir que AFuCN puede tener una

aplicación posterior como matriz de transferencia protónica, y se hace necesario

someterla a pruebas adicionales para establecer una posible explotación comercial

futura.




6. Conclusiones y recomendaciones

6.1 Conclusiones

Se sintetizaron tres sistemas FV con altos rendimientos empleando la reacción de

acoplamiento carbono-carbono de Mizoroki-Heck. Dichos sistemas presentaron

excelentes propiedades optoelectrónicas; altos coeficientes de absortividad molar y bajas

eficiencias cuánticas radiativas. Su implementación como matrices de transferencia

protónica fue infructuosa debido a la imposibilidad de formar el ión molecular protonado

del FV ácido Se encontró que los FV se ionizaban empleando un camino de transferencia

electrónica y no protónica y por ello al ser probados como matrices de transferencia

electrónica, usando como analitos hidrocarburos policíclicos aromáticos dieron

excelentes resultados. Los mejores resultados en la mayoría de los experimentos fueron

obtenidos con el FVCOOH-CH3.

Los derivados de ácido acrílico fueron sintetizados exitosamente por medio de la

reacción de Knoevenagel. Se encontró que poseían propiedades de absortividad molar

interesantes, sobre todo aquellos con el grupo ciano en posición al carbonilo. La

implementación de estos ácidos como matrices de transferencia protónica permitió

encontrar que aquellos que no poseían yodo en su estructura podían hacer trasferencia

protónica. El derivado de furano y ácido cianoacrílico mostró mejores resultados que la

matriz de referencia CHCA. Se calcularon las energías de afinidad protónica y se pudo

establecer que algunas de las moléculas sintetizadas son candidatas para su

implementación como matrices MALDI y que también pueden servir como base para el

diseño de matrices nuevas. Los mejores resultados de transferencia protónica se

consiguieron con el ácido cianoacrílico de furano.

Capítulo 5 95

6.2 Recomendaciones

Se recomienda para una futura implementación de matrices MALDI basadas en FV

realizar antes de la síntesis un estudio computacional de las estructuras, para evaluar la

posible formación de cationes radicales. Además sería bueno que para las próximas

potenciales estructuras a sintetizar se tuvieran en cuenta las posibles interacciones que

habrá entre el analito y la matriz, pues esto puede determinar el tipo de analito a ionizar.

Se recomienda partir de la estructuras con anillo de furano y preferiblemente con la

presencia del grupo ciano, debido a la importancia demostrada para estos en este

trabajo, al desarrollar posibles matrices con potencial uso como matrices de transferencia

protónica.

A. Espectros de Resonancia Magnética Nuclear de los compuestos

Precursores:

Cloroestireno:

1H RMN




13C RMN

Divinilbenceno

1H RMN

Anexo A. Nombrar el anexo A de acuerdo con su contenido 99

13C RMN

1,4-Diyodo-2,5-dimetoxibenceno

1H RMN




13C RMN

1,4-Diyodo-2,5-dimetilbenceno

1H RMN


13C RMN

Metil-4-vinilbenzoato

1H RMN




13C RMN

E,E-1,4-Bis[2-(4-carboxiestiril)] benceno (FV-COOH)

1H RMN


13C RMN

E,E-2,5-Dimetil-1,4-bis[2-(4-carboxiestiril)] benceno (FV-COOH CH3)

1H RMN




13C RMN

5-yodotiofeno-2-carboxaldehido

1H RMN


13C RMN

Ácido acrílico de furano (ácido 3-(furan-2-il)-2-propenóico)

1H RMN




13C RMN

Ácido acrílico de tiofeno: (ácido 3-(Tiofen-2-il)-2-propenóico)

1H RMN


13C RMN

Ácido acrílico de yodotiofeno: (ácido 3-(5-yodotiofen-2-il)-2-propenóico)

1H RMN




13C RMN

Ácido cianoacrílico de furano: (ácido 3-(furan-2-il)-2-cianopropenóico)

1H RMN


13C RMN

Ácido cianoacrílico de tiofeno: (ácido 3-(Tiofen-2-il)-2-cianopropenóico)

1H RMN

13C RMN

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