Sistemas cannabinoide y purinérgico: posibles sustratos ...

UNIVERSITAT POMPEU FABRA

Departament de Ciències Experimentals i de la Salut

Laboratori de Neurofarmacologia

TESIS DOCTORAL:

Sistemas cannabinoide y purinérgico: posibles sustratos

neurobiológicos de la drogadicción

Memoria presentada por

Guadalupe Soria Rodríguez

Para optar al grado de doctor

Barcelona 2006

Dipòsit legal: B.38441-2007 ISBN: 978-84-690-7827-3

Olga Valverde Granados, Profesora Titular de la Universitat Pompeu Fabra y Rafael

Maldonado López, Catedrático de la Universitat Pompeu Fabra

CERTIFICAN:

Que la presente Tesis Doctoral t itulada “ Sistemas cannabinoide y purinérgico: posibles

sust ratos neurobiológicos de la drogadicción” presentada por Guadalupe Soria

Rodríguez, Licenciada en Biología, para optar al grado de Doctor por la Universitat

Pompeu Fabra, ha sido realizada baj o su dirección y reúne todos los requisitos

necesarios para ser juzgada.

Y para que conste, y a efectos oportunos, firman el presente certificado a 9 de mayo de

2006.

Olga Valverde Granados Rafael Maldonado López

AGRADECIMIENTOS

Esta tesis está dedidacada a todos los que habéis compartido este camino conmigo.

A Olga y a Rafael, por darme la oportunidad de realizar esta tesis y apoyarme durante

este tiempo.

A mis compañeros de laboratorio, porque sois el mej or grupo con el que se puede

trabajar.

A mis amigos de Sant cugat, a Noe, a Laia y a Nerea, gracias por vuestra fuerza.

A mis padres y a mis hermanas por todo su amor.

A Iñigo por estos años a mi lado.

A mi padres, a mis

hermanas y a Íñigo

ÍNDICE

ABREVIATURAS

INTRODUCCIÓN 1

1. ¿A qué llamamos adicción? 3

1.1. Uso, abuso y adicción 3

1.2. Hipótesis de la vulnerabilidad 5

1.3. Hipótesis de la automedicación 7

2. Sustratos neurobiológicos comunes de la adicción 9

2.1. Sistema dopaminérgico 9

2.2. Receptores de dopamina D2 11

2.3. Modulación del sistema dopaminérgico 14

3. Teorías de la adicción 17

3.1. Teoría del proceso oponente (Solomon y Corbit, 1974; Koob y cols., 1989) 17

3.2. Teoría motivacional de la adicción: neuroadaptación y alostasis (Koob y Le Moal,

1997) 18

3.3. Teoría de la sensibilización del incentivo (Robinson y Berridge, 1993) 20

4. Modelos animales de la adicción de drogas de abuso 23

4.1. Sensibilización de los efectos locomotores inducidos por las drogas 23

4.2. Condicionamiento espacial 24

4.3. Condicionamiento operante: autoadministración intravenosa 25

5.4.1 Adquisición 27

5.4.1 Mantenimiento 28

5.4.1 Razón progresiva 29

5.4.1 Extinción 30

5.4.1 Recaída 30

4.4. Autoestimulación intracraneal 32

4.5. Tolerancia a los efectos agudos producidos por las drogas 33

4.6. Síndrome de abstinencia físico 36

5. Sistema endocannabinoide 38

5.1. Cannabinoides endógenos 38

5.4.1 Biosíntesis y metabolismo de los endocannabinoides 38

5.2. Receptores cannabinoides 40

5.4.1 Ligandos exógenos de los receptores cannabinoides 42

5.4.1 Mecanismo de transducción de señales del receptor cannabinoide CB1 42

5.3. Funciones fisiológicas del sistema endocannabinoide 43

5.4.1 Los endocannabinoides como mensajeros retrógrados 45

5.4. Participación del sistema endocannabinoide en los circuitos de recompensa 46

5.4.1 Interacción ent re los receptores cannabinoides y los receptores

dopaminérgicos 47

5.4.1 Modulación endocannabinoide de la transmisión dopaminérgica 47

5.5. Part icipación del sistema endocannabinoide en las propiedades adict ivas de

diferentes drogas de abuso 49

5.4.1 Cannabinoides 49

5.4.1 Etanol 50

5.4.1 Opioides 51

5.4.1 Nicotina 53

5.4.1 Psicoestimulantes 54

6. Sistema purinérgico 55

6.1. Adenosina 56

5.4.1 Biosíntesis y metabolismo de la adenosina 57

6.2. Receptores de adenosina 58

5.4.1 Localización de los receptores de adenosina 59

6.3. Relevancia del receptor A2A en procesos de adicción 61

5.4.1 Interacción entre los receptores adenosina A2A y el sistema dopaminérgico 61

6.4. Interacción de los receptores A2A y las propiedades adict ivas de las drogas de

abuso 62

5.4.1 Etanol 63

5.4.1 Opioides 63

5.4.1 Psicoestimulantes 64

5.4.1 Cannabinoides 65

5.4.1 Nicotina 66

Hipótesis de trabajo 67

OBJETIVOS 69

Objetivos Generales 71

Objetivos específicos 71

RESULTADOS 73

Cocaína 75

Art ículo 1: “ Soria y cols., 2005. Lack of CB1 cannabinoid receptor impairs cocaine self-

administration. Neuropsychopharmacology. 30(9): 1670-80” 79

Art ículo 2: “ Soria y cols., 2006. The Lack of A(2A) Adenosine Receptors Diminishes the

Reinforcing Efficacy of Cocaine. Neuropsychopharmacology. 31(5): 978-987” 91

9-Tetrahidrocannabinol 103

Art ículo 3: “ Soria y cols., 2004. Adenosine A2A receptors are involved in physical

dependence and place condit ioning induced by THC. European Journal of Neuroscience.

20 (8): 2203-2213”105

Nicotina 119

Art ículo 4: “ Castañé y cols., 2006. At tenuat ion of nicot ine-induced rewarding effects in

A2A knockout mice. Neuropharmacology (en prensa)” 121

Morfina 161

Art ículo 5: “ Castañé y cols., Behavioral and biochemical opioid responses related to its

addict ive propert ies are at tenuated in adenosine A2A receptor knockout mice. (En

preparción)” 163

DISCUSIÓN 171

1. Participación del sistema endocannabinoide en las propiedades adictivas de la cocaína

174

2. Part icipación del sistema purinérgico en las propiedades adict ivas de diferentes

drogas de abuso: THC, cocaína, nicotina y morfina 180

3. Posibles mecanismos implicados en las acciones del sistema purinérgico en los

procesos adictivos 187

CONCLUSIONES 193

REFERENCIAS 197

ANEXO 239

Art ículo 6: Trigo y cols., 2006. “A reliable model of int ravenous MDMA self-

administration in naive mice. Psychopharmacology. 184(2):212-20” 241

ABREVIATURAS

5-HT serotonina

∆8−THC ∆8−tetrahidrocannabinol

THC ∆9-tetrahidrocannabinol

ADP adenosina difosfato

AMPc adenosina-5-aminofosfato cíclico

ATP adenosina trifosfato

CHA N-ciclohexiladenosina

CREB proteína de unión a elementos de respuesta a AMPc

CRF factor liberador de corticotropina

DA dopamina

DARPP-32 fosfoproteína reguladora de la dopamina de peso molecular 32 KDa

DMPX 3,7-dimetil-1-propargilxantina

DSE Supresión de la excitación inducida por despolarización

DSI supresión inducida por despolarización

ERK quinasa regulada por una señal extracelular

FAAH hidrolasa de ácidos grasos

GABA ácido γ-aminobutírico

Glu glutamato

HPA eje hipotálamo-hipofisario-adrenal

ICSS autoestimulación intracraneal

LTD depresión a largo plazo

LTP potenciación a largo plazo

MAGL lipasa de monoaclglicérdos

MAP proteína activada por mitógenos

MDMA 3,4-metilendioximetanfetamina

mGlu receptor metabotrópico del glutamato

mPFC corteza prefrontal medial

mRNA ARN mensajero

NAc núcleo accumbens

nAChR receptores nicotínicos de la acetilcolina

NE norepinefrina

NECA 5´-N-etilcarboxiamida-adenosina

PFC corteza prefrontal

PKA proteína quinasa A

PKA Proteína quinasa A

rimonabant SR141716A

SNC sistema nervioso central

VTA área tegmental ventral

Introducción

3

1 ¿A qué llamamos adicción?

Adicción: (Del lat . Addictio, -onis). 1.f. Hábito de quien se dej a dominar por el uso de alguna o algunas drogas tóxicas, o por la af ición desmedida a ciertos j uegos. 2.f. desus. Asignación, ent rega, adhesión. (Real Academia de la lengua Española).

1.1 Uso, abuso y adicción

Actualmente, el consumo de drogas es uno de los mayores problemas de salud pública

que afectan a nuest ra sociedad. De acuerdo con el Informe Mundial sobre Drogas de las

Naciones Unidas para el 2004, 200 millones de personas (o el 5% de la población mundial

con edades comprendidas ent re 15 y 64 años) han consumido drogas ilícitas al menos

una vez en los últ imos 12 meses. Esta est imación no t iene en cuenta el número de

personas que consumen de manera habitual alguna droga lícita (P.D.: según los criterios

del DSMIV el 33% de la población que experimenta el consumo de tabaco desarrolla una

adicción al mismo, mient ras que en el caso del consumo de etanol el porcentaj e de

sujetos que desarrolla una adicción se sitúa en torno al 12%).

Tabla 1. Estimación de la prevalencia anual sobre el uso de drogas (2003/2004). UNODC, UE. La prevalencia anual es una medida del numero/ porcentaj e de gente que ha consumido alguna droga ilícita por lo menos una vez en los últimos 12 meses antes de la evaluación.

A pesar del gran potencial adict ivo de algunas drogas, no todas las personas que

consumen o han consumido alguna droga se vuelven adictos (O´ Brien y Anthony, 2005).

Este hecho revela que el uso de una droga no t iene porqué llevar necesariamente a un

proceso de adicción. Así, atendiendo a la frecuencia, podemos clasif icar el t ipo de

consumo de drogas en (1) ocasional, cont rolado o consumo social, (2) abusivo o

Estimulantes tipo anfetamina

Todas las

drogas ilícitas

Cannabis

Anfetamina

Éxtásis

Cocaína Opiáceos

(De los cuales) Heroína

Personas (millones) 200 169.9 26.2 7.9 13.7 15.9 10.6

% población

(edad entre 15 y 64)

5.0% 4.0% 0.6% 0.2% 0.3% 0.4% 0.23%

Introducción

4

perj udicial y (3) drogodependencia o adicción de la droga. En efecto, el proceso de

adicción empieza con un consumo ocasional que produce un refuerzo posit ivo agudo. En

ocasiones se produce un cambio en el pat rón de consumo y éste se convierte en

compulsivo, iniciándose el proceso de drogodependencia y más tarde, la falta de la

droga origina la abst inencia. Con frecuencia, t ras el periodo de abst inencia se produce

una recaída y la entrada en el proceso adictivo (Fig. 1).

Refuerzo agudo/consumo social

Uso compulsivo

Dependencia Recaída

Abstinencia

¿Recuperación?

Figura 1. Estadíos de la drogodependencia (Modificado de Koob y Le Moal, 2005)

La adicción, por tanto, es un t rastorno crónico y recidivante de la conducta

caracterizado por (1) la búsqueda y el consumo compulsivos de la droga, (2) pérdida de

cont rol para limitar el consumo, a pesar de las consecuencias negat ivas para el suj eto y

(3) aparición de un estado emocional negat ivo (p.e.: disforia, irritabilidad, ansiedad)

cuando el acceso a la droga está impedido (Koob y Le Moal, 1997). Actualmente, uno de

los obj et ivos más importantes de este campo de invest igación es ident if icar los

mecanismos neurobiológicos responsables de la t ransición desde el consumo ocasional

de la droga al proceso adictivo.

Introducción

5

1.2 Hipótesis de la vulnerabilidad

La exposición crónica a las drogas de abuso es un requerimiento para el desarrollo de la

adicción, y su expresión comprende complej as interacciones ent re factores

ambientales, genét icos y neurobiológicos (Volkow y Li, 2004). Está aceptado que la

iniciación al abuso de drogas se asocia con factores sociales y ambientales, mient ras

que el paso del abuso a la adicción está más relacionado con factores genét icos y

disfunciones neurobiológicas (Glantz y Pickens, 1992). Ciertos rasgos de la personalidad

y del temperamento (p.e.: desinhibición, búsqueda de sensaciones nuevas, desórdenes

de la conducta) se han ident if icado como factores de vulnerabilidad a padecer

drogodependencias (Glantz y cols., 1999). El riesgo de adicción en individuos con

problemas mentales es más alto que en la población general. Desde un punto de vista

de comorbilidad psiquiát rica, las asociaciones más importantes se establecen con

problemas de ansiedad, y alteraciones del humor, la personalidad y la conducta.

Ot ro factor que aporta vulnerabilidad a sufrir procesos adict ivos está relacionado con

hechos que acontecen durante la adolescencia. Así, el consumo de drogas durante la

adolescencia aumenta signif icat ivamente la vulnerabilidad al desarrollo de la adicción

en etapas adultas. Se ha hipotet izado que el inicio de la adicción empieza con el

consumo de drogas lícitas: alcohol y tabaco, y que posteriormente y de un modo

secuencial se inicia el consumo de las drogas ilícitas (Teoría de la puerta de ent rada,

Lindsay y Rainey, 1997). Aunque esta secuencia sería común en muchos adictos sólo un

porcentaj e pequeño de j óvenes progresa de una etapa a la ot ra hasta llegar al abuso de

drogas ilegales.

Sin embargo, los factores genét icos implicados en la vulnerabilidad al consumo de

drogas es uno de los campos de invest igación más estudiado en la actualidad. Los

estudios de polimorf ismos aportan información importante sobre la part icipación de un

gen específ ico en la expresión de las diferencias en cuanto a la vulnerabilidad para

sufrir drogodependencias, tales como los efectos farmacológicos agudos producidos por

la droga, el desarrollo de tolerancia y abst inencia, la farmacocinét ica de la droga y la

preferencia de una sustancia frente a ot ras. Además, el polimorf ismo genét ico también

puede favorecer la manifestación de t rastornos psiquiát ricos asociados frecuentemente

a la adicción, por ej emplo la personalidad ant isocial. El análisis y la interpretación de

los resultados de estos estudios es complicada ya que se t rata de un t rastorno en el que

están involucrados factores genéticos (poligénicos) y ambientales (Ugedo y Ruiz, 2000).

No podemos olvidar que podrían exist ir genes que protej an y ot ros que sensibilicen al

proceso de adicción. En este sent ido, estudios realizados en gemelos monocigót icos han

permit ido est imar que ent re el 40% y el 60% de la vulnerabilidad al abuso de drogas es

atribuible a factores genét icos (Uhl, 1999, Uhl y Grow, 2004). Variaciones alélicas ent re

Introducción

6

individuos podrían producir diferencias en el metabolismo de las drogas o su

biodist ribución, así como diferencias en las propiedades reforzantes de las drogas. Un

ej emplo de factor de protección heredado es la variante alélica de la enzima

acet ilaldehído deshidrogenasa que confiere protección cont ra el alcoholismo en el 50%

de la población j aponesa (Yamashita y cols., 1990). Estudios en pacientes adictos a la

cocaína han revelado una menor cant idad de receptores dopaminérgicos D2, en la

corteza orbitofrontal y el giro cingular, que en individuos normales (Volkow y col, 1999).

Estos datos sugieren que niveles baj os del receptor dopaminérgico D2 están

relacionados con una mayor vulnerabilidad a la adicción de drogas de abuso. En

paralelo, se ha encont rado un alelo del receptor D2, el Taq1A menor, que se ha

asociado est rechamente al alcoholismo y al tabaquismo. En estudios con individuos

alcohólicos y adictos a múlt iples sustancias de abuso, el gen Taq1A aparece con más

frecuencia en estos pacientes adictos que en los suj etos cont rol, sugiriendo un papel

et iológico del receptor D2 en el alcoholismo severo (Blum y cols., 1993). De manera

similar, existen dos regiones polimórf icas del gen codif icante para el receptor opioide

mu (A118G y C17T) que aparecen con alta frecuencia alélica en individuos adictos a

opioides y a ot ras drogas como la cocaína y el alcohol (Berrit ini y cols., 1997; Bond y

cols., 1998).

Los estudios con animales de varias especies (las ratas y los ratones son los más

utilizados) nos permiten averiguar la predisposición al uso de drogas de una manera más

rigurosa que en humanos. Aunque estos estudios no pueden aportar datos precisos

concernientes al polimorf ismo genét ico humano relevante en las drogodependencias, sí

aportan, ent re ot ros, datos relevantes acerca de cuáles son los parámetros de la

conducta suscept ibles de variación genét ica, qué factores ambientales pueden

modif icarla y que posibles variaciones genét icas pueden const ituir un factor de riesgo o

de protección para el desarrollo de ciertas conductas relacionadas con el consumo de

drogas o en la sensibilidad a éstas (Crabbe y cols., 1994). La invest igación en modelos

genét icos en animales ofrece varias ventaj as: (1) el experimentador cont rola el

genot ipo del animal de experimentación, (2) puede disponer de numerosos modelos de

ratas y ratones con un genot ipo estable y definido y (3) se pueden aplicar numerosas

técnicas genét icas para inducir modif icaciones. Así, se puede estudiar un gen y la

observación del fenot ipo que resulta al mutar dicho gen, o bien, part iendo de un

fenot ipo alterado se invest iga el gen, o lo genes, responsable de ese fenot ipo. Se han

estudiado numerosos genes candidatos mediante su mutación en ratones y sus

consecuencias en el comportamiento. De esta manera, se ha demost rado la importancia

del receptor opioide mu en las acciones de la morf ina (Iversen, 1996; Mat thes y cols.,

1996; Sora y cols., 1997), el transportador de la dopamina en los efectos de la cocaína y

de la anfetamina (Giros y cols., 1996; Jones y cols., 1998), el receptor CB1 en los

Introducción

7

efectos de los cannabinoides (Ledent y cols., 1999; Zimmer y cols., 1999). Ot ra muest ra

es el caso de los psicoest imulantes, ya que existen más de 40 genot ipos diferentes de

ratones mutantes que expresan respuestas alteradas a estos compuestos (Laakso y cols.,

2002). A pesar de las ventaj as descritas, la principal l imitación de los modelos animales

de la adicción es que sólo son simulaciones aproximadas de una situación complej a

como son las drogodependencias en humanos (Ugedo y Ruiz, 2000).

1.3 Hipótesis de la automedicación

Diversas observaciones en psiquiat ría sugieren que la adicción es una manifestación de

la falta incapacidad para soportar los estados afect ivos negat ivos. Las personas adictas

experimentan estados de angust ia, posiblemente asociados a ot ros t rastornos

psiquiát ricos. Desde esta perspect iva, la drogadicción se considera como un intento de

“ automedicar” ese estado afect ivo perturbado (Khantzian, 1985). Según la hipótesis de

la automedicación, gran parte de los pacientes que desarrollan t rastornos por abuso de

drogas, lo hacen porque sufren de forma previa t rastornos neurológicos asociados a

procesos fisiológicos que, directa o indirectamente, les abocan al consumo de sustancias

psicoactivas como forma de “autotratamiento”. Esta supuesta “automedicación” parece

ser droga-específ ica. Así, los individuos t ienen un uso preferencial por aquella droga

que se aj usta más al t rastorno que padecen. Se ha observado que los adictos a los

opiáceos buscan específ icamente superar ciertas defensas en cont ra a estados

emocionales intensos y negat ivos tales como la rabia, la vergüenza y la soledad. La

cocaína, entre sus efectos estimulantes, parece producir un mayor grado de autoestima,

mayor tolerancia a la frustración y menores sentimientos de aburrimiento y vacío. En tal

caso, cada t ipo de droga serviría como ant ídoto ante estados de desánimo y actuaría

como sust itut ivo en un defecto de la est ructura psicológica de tales individuos. La

hipótesis de la “ automedicación” explica el uso de la droga como alternat iva ante

problemas crónicos de la persona en cuat ro áreas de su funcionamiento vital: vida

afect iva, autoest ima, relaciones y autocuidado. Las carencias funcionales de algunos de

estos aspectos podrían explicar la posible vulnerabilidad de los individuos al efecto de

determinadas drogas. En este sent ido, la adicción de drogas se asocia a menudo al

proceso denominado Patología Dual que es la concurrencia de una conducta de abuso

dependencia de drogas y ot ro t rastorno psicopatológico como la ansiedad, las crisis de

pánico, la depresión, los trastornos de personalidad, la psicosis (Minkoff, 1989; Negrete,

2003). Las drogas podrían ofrecer un alivio farmacológico rápido frente a situaciones

emocionales ext remadamente intensas. Sin embargo, no todas las personas con

problemas psicológicos o personales se inician en el mundo de la adicción. Esta hipótesis

podría aplicarse a ciertos cuadros de drogadicción pero resulta dif ícil poder explicar el

Introducción

8

complej o proceso de la adicción de drogas basándose de manera exclusiva en la teoría

de la automedicación. Además, esta hipótesis no resuelve la gran paradoj a de que la

elección de una droga para medicar el estado mot ivacional defectuoso, a la larga,

perpetúa el problema.

Introducción

9

2 Sustrato neurobiológico común en la adicción de diferentes tipos de drogas

2.1 Sistema dopaminérgico

La invest igación en adicción, con frecuencia, se ha focalizado en la función del sistema

dopaminérgico mesolímbico cort ical. Los primeros estudios se remontan a la década de

los años 50, cuando Olds y Milner, utilizando la técnica de autoestimulación intracraneal

(ICSS), comprobaron que los animales presionaban de forma repet ida una palanca

cuando los elect rodos estaban ubicados en unas zonas determinadas de dicho sistema.

La descarga eléct rica recibida, de alguna manera, les debía producir un efecto

placentero, que convert ía la conducta en repet it iva. La colocación de los elect rodos en

distintos lugares permitió elaborar un "mapa cerebral de las vías del refuerzo", en el que

cobró especial protagonismo el haz prosencefálico medial y la vía dopaminérgica

mesolímbica cort ical. Asimismo, mediante la técnica de ICSS se ha observado un perf il

de act ivación ant icipado a la obtención del refuerzo en las neuronas dopaminérgicas

(Richardson y Gratton, 1996; revisión en Kienast y Heinz, 2006). Debido a que las drogas

de abuso est imulan la función dopaminérgica para producir efectos reforzantes, se ha

postulado la “hipótesis dopaminérgica de la adicción” (Wise y Bozarth, 1987; Di Chiara e

Imperato, 1988). Dicha hipótesis ha sido respaldada también por estudios

elect rof isiológicos que han demost rado como algunas neuronas dopaminérgicas se

act ivan en respuesta a est ímulos condicionados predict ivos de un refuerzo (Hollerman y

Schultz, 1998; Schultz, 2001).

El sistema dopaminérgico está integrado por 3 vías diferentes. (1) La vía dopaminérgica

nigroest riatal que parte de la substant ia negra y proyecta al cuerpo est riado (Koob y Le

Moal, 2001), regula la act ividad motora y coordina los diferentes grupos musculares en

los programas motores. (2) La vía dopaminérgica mesolímbica cort ical, se compone

básicamente de proyecciones que van desde el área tegmental vent ral (VTA) al núcleo

accumbens (NAc), hipocampo, tubérculo olfatorio, amígdala, corteza prefrontal (PFC) y

septum. Las proyecciones eferentes del NAc se dirigen hacia el pálido vent ral y el VTA,

formando así un bucle de cont rol recíproco. Esta vía part icipa de los procesos

reforzantes de las drogas de abuso y es conocida como el principal sistema de

recompensa común a todas las drogas de abuso. (3) La vía tuberoinfundibular que

cuenta con proyecciones desde el hipotálamo al infundíbulo y a la hipófisis anterior y

controla la liberación de prolactina.

Introducción

10

La dopamina ej erce su acción mediante la unión a 5 t ipos diferentes de receptores

dopaminérgicos. Son receptores de la superfamilia de receptores con siete dominios

t ransmembranarios acoplados a proteínas G (metabot rópicos). Según característ icas

farmacológicas y de homología de secuencia, los receptores dopaminérgicos se pueden

clasif icar en dos grandes categorías: los receptores de t ipo 1 (D1 y D5) y los receptores

de t ipo 2 (D2, D3 y D4) (Sibley y cols., 1993; Missale y cols., 1998). Los receptores D1 y

D2 son muy abundantes en el cerebro de roedor, mient ras que los receptores D3, D4 y

D5 se encuent ran menos representados en el cerebro de rata. Concretamente, se

encuent ran altas densidades de dichos receptores en regiones que reciben inervación

dopaminérgica como el est riado dorsal, el tubérculo olfatorio y el NAc. De manera

específ ica, los receptores D2 se encuent ran altamente expresados en las neuronas

est riatopalidales gabaérgicas espinosas de tamaño mediano (Gerfen, 1992). También se

encuent ran concent raciones muy altas del receptor D1 en la amígdala (Weiner y cols.,

1991; Meador-Woodruff, 1994). El receptor D3 se localiza preferentemente en el NAc y

las Islas de Callej a (Díaz y cols., 2000). El receptor D4 solamente se encuent ra en

est ructuras límbicas, incluyendo el NAc, el hipocampo, la amígdala y la PFC (Svingos y

cols., 2000), mient ras que el recetor D5 se localiza en el hipocampo, el hipotálamo y

algunos núcleos talámicos, y es muy escasa su presencia en estriado y neocórtex (Khan y

cols., 2000). Esta dist ribución tan específ ica de los receptores dopaminérgicos en

est ructuras relacionadas de un modo directo con los procesos de placer, recompensa,

memoria y aprendizaj e, ref lej an la importancia del sistema dopaminérgico en el

complejo proceso adictivo.

Figura 2. Esquema de las principales vías dopaminérgicas en un corte sagital de cerebro de rata.

Introducción

11

2.2 Receptores de dopamina D2 y adicción de drogas de abuso

Los receptores de dopamina t ipo 2 (D2, D3 y D4) se acoplan a proteínas G (Giα/Goα) que

inhiben la adenilato ciclasa (Sibley y cols., 1993). Como consecuencia aumenta la

conductancia de los canales de K+ y se bloquea el flujo de entrada de Ca2+ en la neurona

(Jackson y Westind-Danielsson, 1994; Missale y cols., 1998).

La administ ración repet ida de cocaína provoca una desensibilización de los

autoreceptores D2 en el VTA, que resulta en una liberación de dopamina amplificada en

el NAc (Nest ler y cols., 1990; St riplin y Kalivas, 1992). Al mismo t iempo se ha

encont rado una regulación a la baj a de receptores D2 en est riado en monos con una

historia previa de autoadministración de cocaína (Moore y cols., 1998).

Antagonistas D2-like atenúan la expresión de la sensibilización locomotora t ras un

t ratamiento crónico de cocaína (Mat t ingly y cols., 1994, Le Foll y cols., 2002) y

bloquean la preferencia de plaza inducida por cocaína, morf ina y etanol (Matsuwaza y

cols., 1999; Rezayof y cols., 2002; Nazarian y cols., 2004). En 1993, Caine y Koob

demostraron que antagonistas D3 bloqueaban la autoadministración de cocaína en ratas.

Más tarde, se comprobó que esta conducta estaba sobretodo modulada por el receptor

D2 (Caine y cols., 2002). Por ot ro lado, la act ivación del receptor D2 con quinpirole

reinstauró una conducta de búsqueda compulsiva de cocaína y heroína en ratas (De

Vries y cols., 2002). De acuerdo con esto, en animales que habían adquirido una

conducta de autoadminist racion y que posteriormente la habían ext inguido, los

antagonistas D2 fueron capaces de bloquear la recaída inducida por una inyección de

cocaína (Schenk y Git t ings, 2003), heroína (Shaham y Stewart , 1996) o por una

exposición a etanol (Liu y Weiss, 2002), por el est ímulo condicionado o por est rés (Gal y

Gyertyan, 2006; Mc Farland y cols., 2004). Asimismo, los agonistas D2 facilitan la

recaída de una conducta de búsqueda compulsiva de la droga (Khroyan y cols., 2000).

Resulta interesante observar que los animales deficientes en el receptor D2 son

incapaces de manifestar las propiedades placenteras de la morf ina en un paradigma de

condicionamiento espacial, mient ras que presentan efectos de recompensa ante

est ímulos naturales como la comida (Maldonado y cols., 1997). Sin embargo, la tasa de

autoadminist ración de cocaína fue signif icat ivamente más alta en los ratones D2

knockout que en los ratones wild-type cuando altas dosis de cocaína, pero no baj as,

fueron evaluadas (Caine y cols., 2002). Estos resultados indican que los receptores D2

no serían esenciales para la manifestación de las propiedades reforzantes de la cocaína

pero sí para la regulación que limita el consumo de altas dosis de una droga (Caine y

cols., 2002). En animales de experimentación, una conducta de autoadminist ración

prolongada con acceso a altas dosis de cocaína o heroína lleva a un consumo en

escalada de la droga (Ahmed y Koob, 1998; Ahmed y cols., 2000). El fenómeno de

Introducción

12

escalada ha sido propuesto como modelo de la transición entre el consumo de una droga

y la drogadicción (Ahmed y Koob, 1998; Koob y Le Moal, 2001). En este sent ido, es

posible que una regulación a la baj a de receptores D2 t ras un consumo repet ido de la

droga, sea una de las causas que contribuyen en el fenómeno de escalada en el consumo

de una droga, y como consecuencia en el proceso adict ivo. En la misma linea, Rougé-

Pont y cols., (2002) han demost rado que el receptor D2 cont rola la liberación de

dopamina en condiciones de altos niveles de dopamina ext racelular, como por ej emplo

los inducidos por el t ratamiento con drogas de abuso. El receptor D2 se expresa de

manera alternat iva en dos isoformas, la corta (D2S) y la larga (D2L). Ut il izando ratones

deficientes en una u ot ra isoformas del receptor D2 se ha comprobado que en

part icular, es la isoforma D2S la que regula el incremento de dopamina ext racelular

inducida por drogas de abuso como la cocaína y la morf ina (Rougé-Pont y cols., 2002),

indicando que la expresión desregulada de las diferente isoformas del receptor D2

estaría involucrada en la vulnerabilidad de un individuo al proceso adictivo.

Finalmente, estudios de neuroimagen, realizados tanto en humanos como en animales

de experimentación, respaldan la implicación de los receptores D2 en la adicción de

diversas drogas de abuso como la cocaína, la heroína, el alcohol y la metanfetamina

(Goldstein y Volkow, 2002) (Fig. 3). Individuos adictos a estas sustancias han most rado

tener una reducción significativa en los niveles de receptores D2, sobretodo en estriado,

corteza orbitofrontal y giro cingulado, respecto a los individuos control. Estos resultados

indican que los individuos adictos a la cocaína también poseen una menor liberación de

dopamina que los individuos sanos, hecho que sumado a la baj a disponibilidad de

receptores D2 podría resultar en una baj a act ivación del sistema dopaminérgico por

refuerzos f isiológicos, y así el consumo de cocaína ayudaría a compensar este déficit

(Volkow y cols, 1999). Precisamente, Nora Volkow y su grupo de invest igación han

desarrollado una teoría predict iva de la adicción por la cual se establece una relación

directa ent re los niveles de receptores D2 en el est riado y la predisposición al abuso de

droga. Individuos con baj os niveles de receptores D2 serían más propensos a desarrollar

adicción mient ras que altos niveles de D2 representarían una protección para este

fenómeno (Volkow y cols., 2002).

Introducción

13

Figura 3. Disponibilidad reducida del receptor D2 en estriado en individuos dependientes de diferentes drogas de abuso (De Goldstein y Volkow, 2002). Tasa de dist ribución del [11C]-Raclopride en el est riado de pacientes adictos a cocaína, metanfetamina y alcohol en comparación con sujetos control.

Los receptores de dopamina D3 pertencen a la subfamilia de receptores tipo 2 (Missale y

cols., 1998) y también se han relacionado de un modo específ ico con las propiedades

adict ivas de drogas como la cocaína (Pilla y cols., 1999; Di Ciano y cols., 2003). Su

localización postsinápt ica está rest ringida a áreas cerebrales como el NAc y la amígdala

(Bouthenet y cols., 1991; Landwehrmeyer y cols., 1993), donde actúan como

autoreceptores. Antagonistas del receptor D3 (BP 897 y SB-277011-A) disminuyen la

conducta de búsqueda compulsiva por cocaína inducida por el est ímulo condicionado a

la droga, en un protocolo de refuerzo de segundo orden (Pilla y cols., 1999; Di Ciano y

cols., 2003). Estos datos sugieren que el receptor de dopamina D3 está implicado de

manera crucial en la asociación entre el refuerzo y el estímulo condicionado.

Introducción

14

2.3 Modulación del sistema dopaminérgico

El sistema dopaminérgico mesolímbico cort ical ha sido el más estudiado en los

fenómenos adict ivos pero no es el único que part icipa en los procesos de placer y

refuerzo. Ot ros sistemas de neurot ransmisión en las est ructuras límbicas y ot ras áreas

cerebrales modulan la act ividad dopaminérgica mediante proyecciones de diferente

naturaleza. Así, por ej emplo, la corteza prefrontal medial (mPFC) envía proyecciones

glutamatérgicas al NAc. El NAc cont iene dos divisiones conocidas como “ shell” (sistema

límbico) y “ core” (sistema motor). El NAc envía proyecciones de naturaleza gabaérgica

al pálido vent ral y al VTA/ sustancia negra. A su vez, el pálido vent ral y el VTA envían

eferentes gabaérgicas al tálamo dorsomedial. El circuito se cierra gracias a proyecciones

glutamatérgicas desde el tálamo dorsomedial a la mPFC (Pierce y Kumaresan, 2006). Las

neuronas dopaminérgicas cuyos cuerpos celulares se encuent ran en el VTA realizan

sinapsis con neuronas espinosas medianas de t ipo gabaérgico que se encuent ran tanto

en el NAcc como en la PFC (Wise y Bozarth, 1984, 1985; Gardner, 2002).

Además de los sistemas glutamatérgico y gabaérgico, los sistemas colinérgico y

serotonérgico también t ienen un papel relevante en la neurobiología de la adicción,

porque modulan el sistema de recompensa (Kalivas y Mc Farland 2003; Laviolet te y Van

der Kooy, 2004). El papel del sistema opioide como sust rato neurobiológico común en

los procesos de refuerzo asociados a la adicción ha supuesto sin duda un gran avance en

el conocimiento de la adicción de drogas de abuso. Así, se ha demost rado que el

receptor opioide mu participa no sólo en las propiedades placenteras y reforzantes de la

morf ina (Mat thes y cols., 1996), sino también en las de ot ras drogas protot ípicas como

la nicot ina (Berrendero y cols., 2002), los cannabinoides (Ghozland y cols., 2002), el

etanol (Roberts y cols., 2000) y la cocaína (Becker y cols., 2002). Además también se ha

comprobado una implicación de los receptores opioides kappa en las propiedades

aversivas de la morf ina (Spanagel y cols., 1994) y los cannabinoides (Zimmer y cols.,

2001), así como del efecto aversivo asociado al síndrome de abst inencia de nicot ina (Ise

y cols., 2002).

Estudios recientes, también han demost rado que el sistema cannabinoide podría ser un

sistema modulador común en la adicción de drogas de abuso (Maldonado y Rodríguez de

Fonseca, 2002; Valverde y cols., 2005; Arnold, 2005; Gardner, 2005) (ver capítulo 5).

Por ot ro lado el ej e HPA está fuertemente relacionado con los procesos de respuesta al

estrés. Así, el síndrome de abst inencia de diferentes t ipos de drogas de abuso se

relaciona con una elevación importante en los niveles ext racelulares del factor

liberador de cort icot ropina (CRF) en áreas del sistema mesolímbico y especialmente en

la amígdala (Cummings y cols., 1983; Heinrichs y cols., 1995; Koob, 1996) Esta

alteración de la función del CRF límbico parece mediar los síntomas relacionados con el

Introducción

15

est rés y los efectos disfóricos que acompañan al síndrome de abst inencia y a los

procesos de recaída. Cambios similares de los niveles ext racelulares de CRF han sido

descritos durante la abst inencia de drogas de abuso como en el caso de los

cannabinoides (Rodríguez de Fonseca y cols., 1997), el etanol (Koob, 1999a) y los

psicoestimulantes (Richter y Weiss, 1999).

Del mismo modo, existen ot ras est ructuras cerebrales que t ienen un papel importante

en el desarrollo de la adicción. Es el caso de la amígala extendida, complej o que

comprende el Shell del NAc, el núcleo del lecho de la estría terminal y el núcleo central

de la amígdala, y que ha sido sugerida como punto de integración de la mayoría de

funciones del circuito de la recompensa (Leshner y Koob, 1999).

Figura 4. Sitios de acción de diferentes drogas de abuso. (Camí y Farré, 2003). El sistema dopaminérgico (DA) mesolímbico cort inal que t iene como origen el VTA incluye las proyecciones desde los cuerpos neuronales que se sitúan en el VTA hacia el NAc, amígdala y PFC; las proyecciones glutamatérgicas (GLU) desde la PFC al NAc y al VTA. Las interneuronas de t ipo opioide modulan la acción inhibitoria de las neuronas gabaérgicas en el VTA e inf luyen en la act ivación de neuronas noradrenérgicas (NE) del Locus coeruleus. Las proyecciones serotoninérgicas (5-HT) van desde el Núcleo del Rafe al VTA y al NAc. La figura muestra los sitios de acción propuestos para varias drogas dentro de estos circuitos.

Diversos estudios neuroquímicos han demost rado que las drogas de abuso aumentan los

niveles ext racelulares de dopamina en regiones límbicas, en especial en el NAc (Koob y

Bloom, 1988; Di Chiara, 2002). De manera específ ica, parece que las propiedades

reforzantes de las drogas de abuso se deben a su habilidad para superar en magnitud y

duración la elevación de los niveles de dopamina en el NAc originados por los refuerzos

Introducción

16

naturales como la comida o el sexo (Wise, 2002). Psicoest imulantes como la cocaína, la

anfetamina, la metanfetamina o el éxtasis aumentan los niveles de monoaminas

bloqueando su recaptación e incrementando la liberación de dopamina mediante la

unión a su t ransportador (Madras y cols., 1994) (Fig. 4). Ot ras drogas como la nicot ina,

el alcohol, los opiáceos y el ∆9-tet rahidrocannabinol (THC), a t ravés de diferentes

mecanismos de acción, actúan indirectamente modif icando la act ividad de neuronas

(gabaérgicas o glutamatérgicas) que a su vez modulan la act ividad de las neuronas

dopaminérgicas (Kreek y cols., 2002) (Fig. 4). El resultado f inal es un aumento en la

neurot ransmisión dopaminérgica en el NAc, que además de act ivarse ante la presencia

de drogas también se act iva ante refuerzos naturales como comida, agua, sexo o

situaciones novedosas. Si bien, existe una convergencia en el sistema dopaminérgico del

refuerzo inducido por las drogas y los refuerzos naturales, los sust ratos neuronales son

diferentes para ambos t ipos de refuerzo. Existen diferentes estudios elect rof isiológicos

que han demost rado la act ivación de diferentes t ipos de neuronas en el NAc según las

ratas se autoadminist ren comida/ agua o cocaína (Carelli y cols., 2000, Carelli y

Wondolowski, 2003). Recientemente, Baunez y cols., (2005) han most rado que lesiones

excitotóxicas en el núcleo subtalámico aumentan la mot ivación por comida al mismo

t iempo que la disminuyen por cocaína, sugiriendo así, que el núcleo subtalámico j uega

un papel importante en la adicción de cocaína y que la modulación de su act ividad

podría representar una nueva diana para el tratamiento de la adicción de cocaína.

Introducción

17

3 Teorías de la adicción

Se puede hacer una clasif icación de las diferentes teorías de la adicción según su

enfoque sea psicológico o biológico. Desde una perspect iva psicológica, podemos

destacar diferentes teorías: el modelo “ cognit ivo” (Ludwig y Wikler, 1974, Melchior y

Tabakoff, 1984), el modelo de “ expectación del resultado” (Marlat t , 1979; Goldman y

Rather, 1993), el modelo del “ doble afecto” (Baker, 1987) y el modelo del

“ procesamiento cognit ivo” (Tif fany, 1990). Estas teorías int roducen conceptos como

memoria, expectación, interpretación de los est ímulos y comportamientos automát icos

para definir el deseo o el ansia de consumir una droga. Aunque la validez de estos

modelos está aún poco explorada, representan una nueva corriente en el estudio de las

adicciones. En este capítulo únicamente se detallan t res de las principales teorías

neurobiológicas de la adicción: teoría de los procesos oponentes (Solomon y Corbit ,

1974), teoría mot ivacional de la adicción (Koob y Le Moal, 1997) y teoría de la

sensibilización del incentivo (Robinson y Berridge, 1993).

3.1 Teoría de los procesos oponentes (Solomon y Corbit, 1974; Koob y cols., 1989)

La teoría de los procesos oponentes parte de la base de que el cerebro cont iene

diferentes mecanismos de cont rol capaces de equilibrar cualquier estado afect ivo que

se alej e de la estabilidad o el equilibrio, ya sea este placentero o aversivo (Solomon y

Corbit , 1974). Con posterioridad, Koob y cols. (1989) aplicaron la teoría de los procesos

oponentes a los cuadros de adicción a drogas. Esta teoría propone dos procesos

opuestos, la suma de los cuales determina el estado afect ivo de un individuo en un

determinado momento. En primer lugar, t ras el consumo de una droga se act iva un

proceso emocional relacionado con la intensidad, la calidad y la duración del est ímulo

reforzante (proceso A) (Fig. 6). Posteriormente y como consecuencia, se dispara un

proceso negat ivo, opuesto al inicial (proceso B), normalmente de naturaleza f isiológica.

Cuando el proceso A es mayor que el proceso B el individuo se encuent ra en una

situación placentera, estado A. En caso cont rario, si el proceso B es mayor que el

proceso A el individuo siente un efecto desagradable o disfórico, estado B. El “ high”

producido por una droga (estado A) está causado directamente por el proceso A. A

medida que el consumo de la droga se repite, el “ high” va disminuyendo y el proceso B

predomina de forma progresiva, tanto en magnitud como en duración.

Introducción

18

Figura 6. Modelo de adicción del proceso oponente (de Salomón y Corbit, 1974).

Los conceptos de tolerancia y dependencia están expuestos int rínsecamente en esta

teoría (Solomon y Corbit , 1974). La intensidad del proceso A disminuye con el consumo

repet ido de la droga, al mismo t iempo que aumenta el proceso B, como un estado

aversivo de deseo (craving). Cuando el proceso de adicción se encuent ra en una fase

avanzada, el estado emocional negat ivo, o proceso B, sigue creciendo y predomina

sobre el posit ivo produciendo una completa tolerancia a los efectos eufóricos iniciales

de la droga. El desarrollo del proceso B equivale al desarrollo de un estado afect ivo

negat ivo, en oposición al efecto hedónico de la droga, y a la aparición de un cuadro

disfórico/ aversivo en el momento de la interrumpción del consumo de la droga. Por

tanto, el individuo hará todo lo posible para evitar, prevenir o acortar ese efecto

negativo (Koob y Le Moal, 2005).

3.2 Teoría motivacional de la adicción: neuroadaptación y alostasis (Koob y Le Moal, 1997)

Una de las teorías más aceptadas en la actualidad para explicar el proceso de inicio y

mantenimiento de la adicción de drogas de abuso es la teoría de la espiral de

desregulación del sistema de recompensa cerebral (Fig. 4) (Koob y Le Moal, 1997, 2001;

Koob y cols., 2004). Esta teoría propone el desarrollo de una adaptación alostát ica de

los sistemas mot ivacionales del cerebro para explicar los cambios asociados al proceso

Introducción

19

adict ivo y se encuent ra basada en la teoría de los procesos oponentes anteriormente

descrita.

Figura 7. Diagrama de la espiral de desregulación del sistema de recompensa cerebral (de Koob y Le Moal, 1997).

Según este modelo, en la espiral del proceso adictivo existen 3 componentes principales

que son: la preocupación por conseguir la droga, la intoxicación o efecto agudo de la

droga y la abst inencia asociada a un estado emocional negat ivo. El estado de

preocupación por la droga y/ o ant icipación a sus efectos se relaciona con el fenómeno

de sensibilización psicomotora. Los cambios neuroadaptat ivos que ocurren en el SNC

t ras el consumo repet ido de una droga son en mayor medida los causantes del estado

disfórico asociado a la abst inencia de la droga. Desde un punto de vista neuroquímico,

la fase de intoxicación está ref lej ada por la act ivación de los sistemas dopaminérgico y

opioide, y la fase de abstinencia y de estado emocional negativo se encuentra dominada

por la sobreactivación del eje hipotálamo-hipofisario-adrenal (HPA), el incremento de la

síntesis de CRF (Koob y Le Moal, 2001) y la disminución de la act ividad dopaminérgica.

El concepto de alostasis se define como el conj unto de procesos neuroadaptat ivos que

se desarrollan en el sistema nervioso cent ral (SNC), para mantener una situación de

equilibrio t ras alterarse la homeostasis en el sistema de recompensa cerebral, debido al

consumo de droga (Koob y Le Moal, 2001). Como consecuencia del consumo repet ido,

los circuitos cerebrales implicados en el refuerzo mant ienen alteradas sus funciones en

el t iempo (Koob y cols., 1989; Koob y Le Moal, 1997), y se produce una desviación

Introducción

20

crónica del umbral de recompensa. Estos procesos neuroadaptat ivos van creciendo con

el consumo repet ido de la droga produciendo un estado patológico que consolida el

consumo repet ido de la misma. Se produce así una exacerbación progresiva de esta

situación patológica (Koob y Le Moal, 2001; Koob y cols., 2004).

Estos procesos neuroadaptat ivos que aparecen durante la adicción no sólo han sido

relacionados con las propiedades reforzantes de las drogas, sino también con el

consumo prolongado cuyo f in no es la sensación placentera sino el evitar las

consecuencias negat ivas del síndrome de abst inencia (Maldonado, 2003). Los efectos

reforzantes agudos de las drogas de abuso parecen ser responsables del inicio y

establecimiento del fenómeno adict ivo (Koob, 1992). Por ot ra parte, los efectos

negat ivos relacionados con la abst inencia de la droga resultan cruciales para el

mantenimiento del proceso adict ivo y la tendencia a la recaída t ras periodos

prolongados de abstinencia (Koob y Le Moal, 1997). De esta manera, esta teoría propone

una visión de la adicción más real, capaz de ident if icar los factores neurobiológicos

responsables de la vulnerabilidad a la adicción y a la recaída en individuos con una

historia previa de drogodependencia.

3.3 Teoría de la sensibilización del incentivo (Robinson y Berridge, 1993)

El término “ sensibilización” es ut il izado en farmacología para expresar el aumento del

efecto de una droga t ras su administ ración repet ida. La exposición repet ida a muchas

drogas de abuso provoca un aumento progresivo y duradero del efecto est imulante de

dicha droga. Diversos estudios han demost rado este proceso evaluando los efectos

psicomotores de las drogas de abuso, tales como su capacidad de aumentar la act ividad

locomotora, el comportamiento rotacional o comportamientos de t ipo estereot ipia

(Robinson y Berridge, 1993; Stewart y Badiani, 1993). Estos hallazgos han sido

relacionados con el proceso adict ivo, ya que los sust ratos neuronales que median los

efectos psicomotores de las drogas se solapan con los sust ratos neuronales responsables

de las propiedades reforzantes de las drogas de abuso (Wise y Bozart , 1987). El sust rato

neuronal referido es el sistema dopaminérgico mesolímbico, especialmente las

proyecciones dopaminérgicas del VTA hacia el NAc.

Esta teoría separa en dos conceptos la asociación ent re el valor incent ivo de la droga

(“ want ing” ) y el efecto placentero o hedónico (“ liking” ). Durante la administ ración

repet ida de la droga, puede observarse el fenómeno de sensibilización a determinadas

acciones farmacológicas. En el animal de experimentación, este fenómeno se manifiesta

de manera principal por un incremento progresivo de los efectos hiperlocomotores de la

Introducción

21

droga (Valverde y Maldonado, 2005). La sensibilización se observa sobre todo ut il izando

un protocolo de administ ración intermitente de la droga y ha sido interpretada como

una manifestación del incremento progresivo del estado de expectación a los efectos

producidos por la droga, que ocurre t ras su administ ración repet ida en humanos

(“ want ing” ) (Robinson y Berridge, 1993). Así pues, los efectos placenteros subj et ivos

(“ liking” ) no parecen estar sensibilizados durante la adicción. Al cont rario, el

componente de la adicción suj eto a la sensibilización y mediado por la dopamina es la

mot ivación por la droga per se (“ want ing” ), también llamada “ Saliencia Incent iva” . Si

relacionamos esta teoría con la teoría de los procesos oponentes podemos observar una

analogía según la cual el componente hedónico de la adicción suj eto a tolerancia

(proceso A) equivale al “ l iking” , mient ras que el componente suj eto a sensibilización

(proceso B) equivale al “wanting”.

Figura 5. Ilustración esquemática de los cambios que ocurren durante el proceso de adicción en (A) placer producido por la droga, (B) “saliencia incentiva” atribuida a los estímulos asociados a la droga y (C) activación del sistema dopaminérgico (flechas) (Modificado de Robinson y Berridge, 1993).

El mecanismo cerebral implicado en el proceso de recompensa llega a estar

hipersensibilizado tanto a los efectos directos de la droga como a los est ímulos

asociados que no son directamente at ribuibles a la sustancia. Esta hipersensibilización

produce deseo patológico, o “ craving” , independientemente de la presencia de

síntomas de ret irada, y conduce a una búsqueda y comportamiento de consumo de la

Introducción

22

droga compulsivos. Mediante un proceso de aprendizaje pavloviano o asociativo, el valor

incent ivo del est ímulo asociado a la droga aumenta progresivamente, l levando a un

comportamiento de escalada compulsiva en la búsqueda y consumo de la droga (Fig. 5).

La cont inuada sensibilización de este sistema provoca en últ ima instancia que los

adictos sean muy vulnerables a los fenómenos de recaída.

Introducción

23

4 Modelos animales de la adicción de drogas de abuso

La mayor parte del progreso realizado en el estudio de la adicción, y sus bases

neurobiológicas, proviene de t rabaj os desarrollados en modelos animales. A pesar de

que no existe ningún modelo animal completo del proceso adict ivo tal y como se

desarrolla en humanos, los modelos animales nos permiten invest igar elementos

específicos que forman parte del proceso adictivo (Koob y Le Moal, 2005).

En este capítulo se resume la teoría de algunos de los modelos animales más ut il izados

para estudiar la adicción.

4.1 Sensibilización de los efectos locomotores inducidos por las drogas

En humanos y en animales, diversas drogas de abuso aumentan la atención y la actividad

motora, produciendo un incremento de la locomoción, la exploración y la ej ecución de

tareas. Estos efectos act ivadores de la locomoción son fácilmente percept ibles y t ienen

un sust rato neurobiológico que en parte es común con el responsable de los efectos de

recompensa (Wise y Bozarth, 1987). En este sent ido, se ha descrito que en el animal de

experimentación, la act ividad locomotora expresada frente a una situación novedosa es

directamente proporcional a la habilidad de desarrollar una conducta de

autoadminist ración de anfetamina (Piazza y cols., 1990a), lo que supone la existencia

de una correlación ent re la act ividad locomotora ante la novedad y la vulnerabilidad

para sufrir una adicción.

Tras la exposición repetida a drogas como la morfina, la nicotina y los psicoestimulantes

(anfetamina y cocaína), su efecto act ivador de la locomoción aumenta

persistentemente, fenómeno conocido como “ sensibilización psicomotora”

(Vanderschuren y cols., 2001; Schoffelmeer y cols., 2002; Robinson y Berridge, 2003).

Del mismo modo, la administración repetida de estas drogas produce una sensibilización

sobre la liberación de dopamina en el NAc (Robinson y cols., 1988). Además, los efectos

de recompensa y placenteros de las drogas de abuso también se encuentran aumentados

en animales sensibilizados (De Vries y cols., 1998). Así pues, dado el carácter

persistente de estos fenómenos, se plantea un paralelismo interesante ent re la

sensibilización comportamental, los cambios neuroadaptat ivos en el sistema

mesolímbico dopaminérgico tras la interrupción del consumo y el gran deseo (“craving”)

que se desarrolla durante la abst inencia y que perdura incluso durante años t ras la

abst inencia (Vanderschuren y cols., 1999). La capacidad de las drogas de aumentar su

Introducción

24

efecto sobre la liberación de dopamina a largo plazo t iene un interés especial para

poder explicar la escalada en el consumo que se produce con ciertas drogas y que es

característ ico de la t ransición ent re el uso ocasional al abuso y dependencia (Vezina,

2004). De acuerdo con la teoría propuesta por Robinson y Berridge (1993), la

sensibilización neuroquímica aumenta de manera exclusiva la búsqueda de la droga o

“ want ing” , sugiriendo que la sensibilización es el paso fundamental hacia la adicción y

la recaída.

En conj unto, según esta teoría, la capacidad de las drogas de reinstaurar una conducta

asociada a su consumo está directamente relacionada con su habilidad de provocar una

sensibilización neuroquímica y comportamental (Stewart y Vezina, 1988; Robinson y

Berridge, 1993, De Vries y cols., 1998; Vanderschuren y cols., 1999). En tal caso y

hablando en términos generales, con un modelo animal de sensibilización locomotora

seríamos capaces de predecir la capacidad de la droga para producir abuso y recaída

t ras un período de abst inencia. Este modelo es limitado ya que parte de una teoría

rest rict iva, y además evaluando la locomoción sólo se mide un componente indirecto

del proceso adictivo.

4.2 Condicionamiento espacial

El modelo de condicionamiento espacial es un procedimiento basado en el

condicionamiento clásico que sirve para invest igar el efecto de recompensa que

producen las drogas de abuso (Katz y Gormezano, 1979). Brevemente, los animales

exploran dos compart imentos neut ros, pero diferentes ent re si. Uno de ellos estará

asociado a los efectos de la droga. Tras el condicionamiento, al animal se le ofrece la

oportunidad de elegir ent re los dos compart imentos, el t iempo que el animal pasa en el

compart imento asociado a la droga es un índice indirecto del valor reforzante de dicha

droga. El animal expresará preferencia por aquel contexto donde ha experimentado un

refuerzo posit ivo (preferencia de plaza condicionada) y evitará aquel contexto que le

induzca un estado aversivo (aversión de plaza condicionada).

Introducción

25

Figura 8. Paradigma del condicionamiento espacial (Modificado de Castañé y cols., 2005).

Sin embargo, este modelo t iene diversas limitaciones. Por ej emplo, el animal recibe la

droga pasivamente administ rada por el experimentador. Esto representa una rest ricción

para estudiar el proceso adict ivo, en tanto en cuanto el obj et ivo de la invest igación es

ident if icar el consumo de la droga. Además, existe cont roversia sobre la validación de

este modelo como medida de placer inducido por una droga en humanos y en primates

no-humanos (Bardo y Bevins, 2000). Por ot ro lado, el modelo de condicionamiento

espacial es una manera sencilla, rápida y económica de evaluar las propiedades

placenteras de las drogas. Así, este modelo nos proporciona una herramienta única para

comprobar el condicionamiento que puede ej ercer una droga reforzante y nos da

información indirecta sobre sus posibles efectos placenteros o disfóricos (Carboni y

Vacca, 2003; Roux y cols., 2003).

4.3 Condicionamiento operante o instrumental: autoadministración intravenosa

El condicionamiento operante o inst rumental nace de la teoría psicológica del

aprendizaj e desarrollada por Skinner. La base fundamental de este paradigma es la

noción de cont ingencia ent re la respuesta que se solicita al animal y el refuerzo que

recibe como consecuencia de la misma. De este modo, cuando una situación reforzante

(los efectos de la droga) es cont ingente con una respuesta (accionar una palanca,

int roducir el hocico en un aguj ero) la probabilidad de que aparezca dicha conducta

aumenta (Skinner, 1938). El condicionamiento operante, es sin duda uno de los modelos

más ut il izados y de mayor capacidad predict iva para el estudio de los procesos

neurobiológicos implicados en la adicción. El método de autoadminist ración más

ut il izado es por vía int ravenosa, pero también se ut il izan ot ras rutas de

autoadminist ración, como la oral y la int racerebral. El método de condicionamiento

Introducción

26

operante también se ut il iza para estudiar la mot ivación por los refuerzos naturales

como el agua o la comida.

El condicionamiento operante ha permit ido explicar de una manera fundamenta la

conducta de autoadminist ración de las drogas de abuso. Self y Nest ler (1995) señalaban

que las drogas son clasif icadas como refuerzos si la probabilidad de una respuesta de

búsqueda se incrementa cuando es asociada con la exposición de la droga. Además, las

drogas que los animales de experimentación se autoadminist ran corresponden con las

drogas con potencial de abuso en humanos (Collins y col, 1984). Así, la

autoadminist ración int ravenosa de una droga es el modelo animal por excelencia que

predice el potencial de abuso (Collins y cols., 1984).

Figura 9. Modelo de condicionamiento operante reforzado por la autoadministración intravenosa de una droga. (Modificado de Camí y Farré, 2003; Le Foll y Goldberg, 2005).

Este modelo es una variación de la original “ caj a de Skinner” donde hay dos

manipulandos (p.e.: palanca), la respuesta en el manipulando act ivo conduce

directamente a la liberación de una infusión intravenosa (refuerzo), y la respuesta en el

manipulando inact ivo no t iene ninguna consecuencia (Fig. 9). Con frecuencia, se usan

protocolos de t ipo “ razón f ij a” en los que el número de respuestas rqueridas para

obtener el refuerzo es f ij o durante cada sesión. Por ej emplo, en razón f ij a 1, el animal

debe apretar una vez la palanca para obtener una infusión de droga. Existen ot ros

protocolos como el de razón variable, intervalo f ij o, intervalo variable, pat rones de

segundo orden, etc. En los programas de intervalo, el refuerzo ocurre tras un periodo de

t iempo f ij o o variable, a part ir de la últ ima respuesta reforzada. Los protocolos de

segundo orden son más complej os, ya que incluyen a la vez dos programas diferentes:

uno de los protocolos es intervalo f ij o (FI) y el ot ro razón f ij a (FR). Por ej emplo, en un

Introducción

27

programa de FI5min-(FR1:S), la primera respuesta t ras la f inalización del intervalo de 5

min produce el refuerzo.

El paradigma de autoadminist ración, modelo nos permite evaluar de forma directa la

ef icacia reforzante de la droga, así como diferentes procesos implicados en la conducta

adictiva como son la adquisición, el mantenimiento, la extinción o la recaída.

4.3.1 Adquisición

En la fase de adquisición los animales se enfrentan por primera vez a la droga y a sus

propiedades reforzantes. En esta etapa, se inicia el proceso en el que los animales

aprenden a discriminar ent re el manipulando act ivo y el inact ivo para obtener el

refuerzo. De forma habitual, se establece un criterio de adquisición que requiere cierta

estabilidad en el número de infusiones recibido en cada sesión, una clara discriminación

entre manipulandos y un mínimo de refuerzos por sesión.

Existen diferentes factores que inf luencian la conducta de autoadminist ración y, en

part icular, en su adquisición. En primer lugar, los estudios de adquisición de una

conducta de autoadministración int ravenosa muest ran que las diferencias individuales

j uegan un papel muy importante en el desarrollo de dicha conducta (Piazza y cols.,

1989). También, existen evidencias de una correlación posit iva ent re el nivel de

act ividad locomotora desarrollado por un animal en un ambiente novedoso y su

capacidad para desarrollar un comportamiento de autoadministración intravenosa

(Piazza y cols., 1990a). Un modelo muy sensible para determinar esta vulnerabilidad es

exponer a los animales a dosis muy baj as de la droga obj eto de estudio, en las que

solamente los animales más sensibles desarrollarían una conducta de autoadministración

(Piazza y Le Moal, 1996, Piazza y cols., 2000). Las investigaciones sobre la influencia del

est rés en el consumo de drogas han most rado que el estado emocional del individuo

t iene una gran importancia en el desarrollo de una conducta de autoadminist ración. De

este modo, en animales adultos un est rés de t ipo f ísico como un pinzamiento en la cola

o un choque eléct rico facilita la adquisición de un comportamiento de

autoadminist ración de cocaína y anfetamina (Piazza y cols., 1990b, Goeders y Guerin,

1994; revisión en Goeders, 2002). También la deprivación de comida facilita la

adquisición de autoadminist ración de psicoest imulantes, opiáceos y alcohol (Carrol y

Meisch, 1984; Kanarek y Marks-Kaufman, 1988). De manera similar, la adquisición de

autoadminist ración oral de morf ina y alcohol, así como de heroína por vía int ravenosa,

se encuent ra facilitada por el aislamiento social, lo cual supone un est rés de t ipo

psicológico (Revisión en Piazza y Le Moal, 1998).

Introducción

28

Como hemos comentado en apartado 1.3, los factores genét icos también inf luyen en la

vulnerabilidad a desarrollar una adicción. Así, existen diferentes cepas de ratas y de

ratones que presentan suscept ibil idades muy diferentes a los efectos reforzantes de las

drogas de abuso. Es el caso de las ratas Lewis que poseen una apetencia natural

altamente superior por la cocaína y la morf ina que las ratas Fisher (Crabbe y cols.,

1994). Igualmente, los ratones C57Bl/ 6 consumen más etanol, cocaína y morf ina que la

cepa DBA/ 2 (Risinger y cols., 1998; Kuzmin y Johansson, 2000; Ferraro y cols., 2005).

Comparando las diferentes cepas de animales, se pueden observar modif icaciones sobre

el sistema de la recompensa que ayudan a explicar la predisposición al consumo de

drogas (Deroche y cols., 1997).

4.3.2 Mantenimiento

Durante la etapa de mantenimiento, el animal ya ha aprendido que la droga t iene

efectos reforzantes y cual es la respuesta requerida para su presentación. Si

aumentamos el valor de razón f ij a requerida para la obtención de un refuerzo,

estaremos incrementando el esfuerzo que el animal debe realizar para obtener una

infusión de droga, y eliminaremos posibles sesgos de comportamiento inespecíf ico. La

autoadministración intravenosa en roedores de determinados prototipos de drogas como

pueden ser la cocaína o la heroína produce un pat rón comportamental característ ico

que puede ser estudiado desde un punto de vista farmacológico (Fig. 10). Entre el rango

de dosis que mantiene una respuesta estable, los animales son capaces de compensar su

tasa de autoadministración en función de la dosis, produciendo más respuestas ante

dosis baj as que ante las altas. Cuando se realiza un t ratamiento farmacológico para

observar un alteración en la conducta de autoadministración, un incremento de la tasa

de repuesta se corresponde con una disminución de la dosis de la droga, lo cual se

interpreta como una disminución de la potencia reforzante de la droga que se está

estudiando. Existen numerosos estudios farmacológicos que demuest ran que un

desplazamiento de la curva dosis respuesta hacia la izquierda indica un aumento en la

sensibilidad del animal a la droga, mient ras que al cont rario, un desplazamiento hacia

la derecha representa una reducción de dicha sensibilidad (Koob y cols., 1986;

Deminiere y cols., 1989; Wise, 1996). Se ha demost rado que también existen

desplazamientos vert icales de la curva dosis respuesta que ref lej an cambios en la

ef icacia reforzante de la droga y que ayudan a representar un fenot ipo de

vulnerabilidad (Piazza y cols., 2000). Los animales que t iene un desplazamiento por

encima de la curva dosis-respuesta presentan un número de respuestas más elevado a la

misma dosis y consumen mayor cant idad de droga. En consecuencia, estos animales

serían más vulnerables al desarrollo de la adicción, mientras que un desplazamiento por

Introducción

29

debaj o de la curva dosis-respuesta representa una menor vulnerabilidad al proceso

adictivo.

En general, el estudio del mantenimiento de un comportamiento de autoadministración

de una droga es una evaluación indirecta de la conducta adict iva del animal. Sin

embargo, este modelo no permite distinguir si dicho comportamiento es mantenido para

volver a experimentar los efectos hedónicos de la droga o para evitar sus efectos

aversivos.

Figura 10. Patrones de respuesta representativos de dos ratones (A y B) en diferentes etapas de autoadministración de cocaína. Cada barra vert ical representa una infusión en una duración máxima de dos horas.

4.3.3 Razón progresiva

Los protocolos de razón progresiva se ut il izan para cuant if icar el valor reforzante de la

droga que se autoadminist ra y consisten en aumentar progresivamente, en una misma

sesión, el número de respuestas requeridas para la obtención de cada refuerzo. El

llamado “ Breaking Point ” (o punto de corte) determina el punto donde el animal

alcanza el máximo de respuestas posibles, dej a de ej ecutar respuestas, ref lej ando el

esfuerzo máximo que el animal es capaz de realizar para obtener una infusión de droga.

Un aumento de la dosis de droga autoadminist rada suele producir un aumento en el

“ Breaking Point ” (Roberts y cols., 1989). Así, este t ipo de estudios nos proporcionan

información directa sobre la motivación que el animal manifiesta por la droga.

mantenimiento FR1

1er día de extinción

último día de extinción

recaída

Introducción

30

4.3.4 Extinción

La resistencia a la ext inción de un comportamiento de autoadminist ración puede

representar un modelo propio para estudiar las propiedades mot ivacionales de las

drogas. Sin embargo, este proceso de extinción puede ser simplemente una etapa previa

requerida para los estudios de recaída.

La etapa de ext inción consiste en la pérdida de aprendizaj e de la conducta asociada al

consumo de droga. Para ello, es necesario que los animales hayan adquirido

previamente una conducta de autoadminist ración. Después, la droga es subst ituida por

vehículo. Las sesiones de ext inción se llevan a cabo en las mismas condiciones que las

sesiones de ent renamiento, excepto que después de la respuesta requerida no se libera

ninguna infusión de droga. Durante la sesión en la que el animal experimenta esta

situación por primera vez y como resultado de esa búsqueda compulsiva, se observa un

incremento muy signif icat ivo en el número de respuestas tanto en el manipulando

act ivo como en el inact ivo. De manera progresiva, el animal dej ará de responder, ya

que habrá ext inguido su comportamiento de autoadminist ración (Fig. 10). Mediante la

valoración de la persistencia de un comportamiento de búsqueda por la droga en

ausencia de la misma, los protocolos de extinción nos proporcionan también una medida

de las propiedades motivacionales de las drogas.

4.3.5 Recaída

Los fenómenos de recaída han sido invest igados de forma extensa en los últ imos años.

La reinstauración de una conducta (ext inguida previamente) asociada al consumo de

droga ref lej a la cronicidad del fenómeno adict ivo. Los modelos animales de recaída

ut il izan t res est ímulos clásicos: recaída provocada por una inyección de droga, recaída

provocada por la presentación de un est ímulo asociado a la droga (Fig. 10) y la recaída

provocada por est rés. Est ímulos ambientales asociados repet idamente con refuerzos

primarios (p.e.: comida, droga) adquieren propiedades reforzantes mediante un proceso

de condicionamiento clásico (Mc Farland y Et temberg, 1997, Arroyo y cols., 1998, See y

cols., 1999, Weiss y cols., 2000; Deroche-Gamonet y cols., 2004). Se ha postulado que

estos refuerzos condicionados t ienen la capacidad de inducir un estado subj et ivo que

cont ribuyen al deseo por la droga y a la recaída. Un est ímulo predict ivo de la droga

puede ser una señal de disponibilidad de la misma, y por tanto proporciona una

mot ivación especial para empezar un comportamiento que lleve al individuo en

contacto directo con la droga (Meyer y Mirin, 1979).

Los estudios que usan este modelo sugieren que las vías neuronales que median los t res

t ipos diferentes de recaída en la conducta de búsqueda compulsiva no son idént icos.

Introducción

31

Además, los mecanismos que median la recaída inducida por una exposición a la droga

son diferentes de los que median el placer producido por la misma. Por ej emplo, la

recaída en la conducta de autoadminist ración de cocaína, inducida por est ímulos

condicionados a la droga, se encuent ra atenuada t ras la inact ivación de est ructuras

cerebrales tales como la PFC, la amígdala basolateral y el hipocampo dorsal (Fuchs y

cols., 2005). Estudios recientes han demost rado que la recaída inducida por una

exposición de cocaína está modulada por la neurot ransmisión dopaminérgica y

glutamatérgica en el NAc y en ot ras áreas mesocort icolímbicas (para revisión véase

Bossert y cols., 2005). Por ot ra parte, la recaída provocada en respuesta al est rés t iene

su sust rato neurobiológico en las neuronas glutamatérgicas y dopaminérgicas del VTA

sobreact ivadas por efecto del incremento de CRF (Wang y cols., 2005). Ot ras

est ructuras cerebrales también son de gran importancia en la recaída inducida por

est rés, como el lecho del núcleo de la est ría terminal, la PFC dorsal, NAc, VTA,

amígdala basolateral y tálamo mediodorsal (Capriles y cols., 2003; Mc Farland y cols.,

2004; Xi y cols., 2004).

Uno de los factores que pueden inf luir en la recaída es el t ipo de consumo que se ha

experimentado anteriormente. Así, un acceso a la droga moderado conduce al animal a

desarrollar un consumo estable. Por el cont rario, un acceso excesivo durante la fase de

intoxicación modif ica el umbral hedónico de percepción de la droga, favorece el

fenómeno de recaída después de un período de abst inencia y el reinicio de la conducta

de autoadministración se hará en forma de un consumo excesivo y en forma de escalada

(Ahmed y Koob, 1998; 1999; 2005; Ahmed y cols., 1999, 2002). Por ot ra parte, la

duración del período de abst inencia t ras la autoadminist ración t iene un gran efecto

sobre la recaída inducida por est rés o por el est ímulo asociado a la droga (Shaham y

cols., 2002).

El modelo de autoadminist ración int ravenosa de drogas de abuso en animales de

experimentación posee una gran f iabilidad y validez predict iva. Ut il izando los

protocolos adecuados, la mot ivación y la ef icacia reforzante se modif ica en función de

la droga, de la dosis, y del estado de dependencia de los animales. La conducta de

autoadminist ración de drogas es estable ent re sesiones y puede ser alterada por

antagonistas de estas drogas.

La relación ent re la conducta operante en animales y los efectos eufóricos alcanzados

en humanos no puede ser ext rapolada directamente. Sin embargo, debido a la alta

concordancia ent re la capacidad de una droga para mantener un comportamiento

operante, cuyo obj et ivo es recibir una infusión int ravenosa, y su abuso en humanos, el

Introducción

32

paradigma de autoadminist ración se ut il iza de un modo ef icaz como modelo predict ivo

del potencial de abuso de una droga en humanos (Collins y cols., 1984).

4.4 Autoestimulación intracranial (ICSS)

La ICSS es una técnica que consiste en observar la conducta derivada de aplicar una

est imulación eléct rica en determinadas áreas cerebrales. Para ello, se procede a la

implantación de elect rodos en est ructuras cerebrales específ icas. El animal realiza una

conducta operante para recibir la est imulación eléct rica allí donde el elect rodo ha sido

implantado (Fig. 11). Así, cuando dicha est imulación provoca un efecto posit ivo o

placentero, los animales son capaces de autoadminist rarse est imulaciones eléct ricas en

ciertas est ructuras cerebrales. Estudios en humanos también han descrito efectos

placenteros tras la estimulación de algunas de estas áreas (Olds y Milner, 1954).

Figura 11. Autoestimulación intracraneal. Modelo descrito por Athina Markou y cols. para evaluar los efectos disfóricos del síndrome de abst inencia a nicot ina (Kenny y cols., 2003).

Introducción

33

La est ructura para la que se han encont rado niveles más altos de ICSS es el haz

prosencefálico medial (Gallistel, 1986). El efecto placentero de la ICSS es muy elevado,

y esto ha llevado a la hipótesis de que la ICSS act iva directamente circuitos neurales

que se act ivan ante refuerzos naturales (p.e.: comida, agua, sexo) y drogas. El

t ratamiento con drogas de abuso induce un estado hedónico posit ivo en el animal de

experimentación, y como consecuencia el animal reduce el nivel de autoestimulación. Si

el t ratamiento es crónico el umbral de placer se modif ica y desciende de manera

progresiva, indicando tolerancia. Así pues, los estudios de ICSS ref lej an un cambio en el

punto de equilibrio hedónico (Ahmed y Koob, 1998). Por otro lado, la abstinencia de una

droga en animales dependientes eleva los umbrales de ICSS, lo que corresponde una

disminución del umbral hedónico del animal (Markou y Koob, 1991; 1992; Gardner y

Vorel, 1998; Paterson y cols., 2000).

Del mismo modo que ocurre para la técnica de autoadministración, se ha descrito una

clara correlación ent re la capacidad de una droga de disminuir el umbral de

autoest imulación y el potencial de abuso de dicha droga (Kornetsky y Esposito, 1979;

Kornetsky y Bain, 1992).

4.5 Tolerancia a los efectos agudos producidos por las drogas

La tolerancia es una disminución de la respuesta farmacológica t ras la administ ración

repet ida de la misma dosis, o la necesidad de ir aumentando la dosis para producir un

mismo efecto. La tolerancia se debe a la administ ración repet ida o prolongada de

algunos fármacos, y ocurre cuando el organismo se adapta a la cont inua presencia del

fármaco. Por lo general, son dos los mecanismos que pueden part icipar en el desarrollo

de la tolerancia: (1) el metabolismo del fármaco se acelera, habitualmente porque

aumenta la act ividad de las enzimas hepát icas que metabolizan el fármaco (tolerancia

farmacocinét ica), y (2) disminuye la cant idad de receptores, la sensibilidad de los

mismos o se act ivan sistemas biológicos que se oponen a sus acciones farmacológicas

(tolerancia farmacodinámica).

En relación con el proceso de adicción, se considera que la tolerancia es una

consecuencia directa de los intentos del organismo para compensar la inusual condición

de intoxicación por la droga. La droga altera los mecanismos homeostát icos normales

del cerebro y estos producen efectos cont rarios a los de la droga. Estos mecanismos

explican por qué se necesita tomar cada vez más droga para conseguir los mismos

efectos que se produj eron cuando el individuo se inició en el consumo. También

contribuyen a explicar la sintomatología del síndrome de abstinencia (ver punto 4.6), ya

que al cesar la administ ración de la droga, los mecanismos compensatorios se hacen

evidentes sin ser cont rarrestados por la acción de la droga. La evaluación de la

Introducción

34

tolerancia a los efectos agudos producidos por las drogas no es un modelo de adicción

en sí mismo, pero nos permiten aproximarnos a este fenómeno en el animal de

experimentación.

Para un mismo fármaco o droga, no existe un desarrollo idént ico de la tolerancia para

todos los efectos inducidos por dicho fármaco. La tolerancia producida por los opioides

ha sido estudiada de manera extensa y se desarrolla con relat iva rapidez para las

acciones depresoras, como la analgesia, la depresión respiratoria, la euforia, la

sedación y la hipotensión y mucho menos, para ot ras como la miosis y la acción

gast rointest inal. Una de las teorías más reconocidas para explicar el fenómenos de

tolerancia opioide es la de regulación al alza del AMPc en determinadas células como las

neuronas noradrenérgicas del locus coeruleus (Camí y Farre, 2003; Nest ler, 2004). Así,

la administ ración aguda de opiáceos, inhibe la act ividad de las neuronas

noradrenérgicas del locus coeruleus mediante su unión a los receptores opioides mu, los

cuales están acoplados a proteínas G. Ent re los mecanismos int racelulares que se

act ivan t ras la est imulación de la proteína G acoplada al receptor opioide mu, la

disminución de la concent ración del AMPc y la act ividad de la proteína quinasa A (PKA),

son las más relevantes. Esto, j unto con la inhibición de canales cat iónicos de K+,

provoca una disminución de la excitabilidad neuronal en el locus coeruleus (Monteggia y

Nest ler, 2003). Tras la administ ración repet ida o crónica, la act ividad de la adenilato

ciclasa y de la PKA se incrementa de forma progresiva de manera compensatoria y,

como consecuencia, las concent raciones de AMPc en las neuronas del locus coeruleus

aumentan poco a poco. Así, se necesitan cada vez dosis mayores de opioides para

mantener la disminución de AMPc (tolerancia). Al cesar el consumo del opiáceo, o al

administ rar un antagonista como la naloxona, se produce un aumento de AMPc, que

manif iesta el efecto compensatorio que sobre dicho sistema ha producido la

administ ración crónica del opiáceo. Este incremento del AMPc aumenta la excitabilidad

de las neuronas noradrenérgicas del locus coeruleus y es una de las principales bases

moleculares de los síntomas físicos de la abst inencia. La regulación al alza de la vía del

AMPc también ha sido demost rada en las neuronas gabaérgicas del NAc, est ructura

t ípicamente relacionada con las propiedades reforzantes de las drogas de abuso. Así,

infusiones de inhibidores o act ivadores de la vía del AMPc en el NAc, disminuyen o

aumetan respect ivamente las propiedades reforzantes de la cocaína y los opiáceos (Self

y Nest ler, 1995; Self y cols., 1998). En este sent ido, ciertos estudios han demost rado el

fenómeno de tolerancia a los efectos reforzantes de psicoest imulantes como la cocaína

(Emmett-Oglesby y cols., 1993; Negus y Mello, 2003) y de opioides (Winger y Woods,

2001). Mediante el uso del paradigma de autoadminist ración int ravenosa, se ha

obervado que una exposición crónica a la droga induce un desplazamiento horizontal

hacia la derecha de la curva dosis-respuesta de autoadminist ración, indicando

Introducción

35

tolerancia al refuerzo inducido por dicha droga (Emmet t -Oglesby y cols., 1993).

Además, un t ratamiento crónico de cocaína poduce un incremento de la act ividad de la

PKA y de los niveles de AMPc (Terwill iger y cols., 1991), así como una reducción de las

proteínas G inhibitorias (Nest ler y cols., 1990) en el NAc. Por lo tanto, aumentos en la

act ividad de la PKA inducen una conducta de autoadminist ración de cocaína

acrecentada (Self y cols., 1998). Estos autores proponen la posibilidad de que, t ras la

repet ida exposición a cocaína, la regulación tónica al alza del AMPc en el NAc

representa el mecanismo int racelular responsable de la tolerancia a los efectos

reforzantes de la cocaína (Self y cols., 1998). De manera similar, este fenómeno ha sido

demostrado en el VTA, la amígdala y el núcleo dorsal del rafe (Terwilliger y cols., 1991;

Bonci y Will iams, 1997; Jolas y cols., 2000), indicando una relación ent re el sistema

gabaérgico y serotonérgico con los síntomas somát icos y emocionales asociados al

síndrome de abst inencia. La inhibición de la vía del AMPc también induce una

disminución de la fosforilación de diferentes proteínas, como es el caso del factor de

t ranscripción CREB. Tras un t ratamiento crónico con opiáceos aumenta la expresión de

CREB. El aumento de CREB induce un incremento de la síntesis de dinorf ina, sustancia

que act iva los receptores opioides kappa en las neuronas del VTA, que a su vez produce

una disminución de la liberación de dopamina en el NAc. Esta reducción contribuye a las

manifestaciones somát icas de la abst inencia f ísica y al estado emocional negat ivo

(disforia y anhedonia) característ ico de dicha abst inencia (Maldonado y cols., 1996;

Nestler, 2004).

Ot ros fármacos como por ej emplo el THC también producen tolerancia a varios de sus

efectos farmacológicos. Diferentes estudios han demost rado tolerancia a los efectos de

los cannabinoides en nocicepción, locomoción, hipotermia, catalepsia, movilidad

gast rointest inal y respuestas cardiovasculares (revisión en Maldonado y Valverde, 2003).

En el animal de experimentación, la aparición de tolerancia es especialmente rápida, y

se puede observar un importante descenso de las respuestas agudas después de la

segunda administración de un agonista cannabinoide (Abood y Martin, 1992; Hutcheson y

cols., 1998). Se ha demostrado que durante el t ratamiento crónico con THC se produce

una disminución de la densidad de receptores CB1 (Rodríguez de Fonseca y cols., 1994),

así como del mRNA que codif ica para este receptor en diversas áreas cerebrales

(Romero y cols., 1998). También se ha observado un descenso generalizado de los

niveles cerebrales de mRNA que codif ica para diferentes subunidades de las proteínas G

(Rubino y cols., 1997), y estos cambios están relacionados con una desensibilización de

los receptores cannabinoides CB1 (Sim y cols., 1996). Por ot ra parte, se ha demost rado

la existencia de tolerancia cruzada ent re compuestos cannabinoides y opioides lo que

sugiere la existencia de una interacción funcional ent re ambos sistemas (Bloom y

Dewey, 1978; Thorat y Bhargava, 1994; Castañé y cols., 2005).

Introducción

36

Otra droga de abuso que provoca tolerancia t ras su consumo repet it ivo es la nicot ina.

Ratones t ratados crónicamente con nicot ina desarrollan una regulación al alza de los

receptores nicot ínicos (Collins y cols., 1989). También existe tolerancia cruzada ent re

compuestos nicot ínicos y opioides a nivel de ant inocicepción (Biala y Weglinska, 2006).

De manera similar, el consumo crónico de alcohol produce cambios adaptat ivos en la

t ransmisión gabaérgica y glutamatérgica que cont ribuyen en el desarrollo de la

tolerancia a sus efectos farmacológicos (Heinz y cols., 2003), y en la tolerancia cruzada

con opioides (Khanna y Mayer, 1982).

4.6 Síndrome de abstinencia físico

El síndrome de abstinencia es el conjunto de manifestaciones somáticas que aparecen al

ret irar el consumo de una determinada droga con la que se ha generado un cuadro de

dependencia f ísica. Estos síntomas se alivian al volver a usar la droga cuyo consumo se

dej ó de forma abrupta. Sin embargo, no todas las drogas son capaces de desarrollar un

cuadro de dependencia f ísica. Así, la interrupción repent ina del consumo de algunas

drogas no produce síndrome de abst inencia f ísico. Es el caso de la cocaína, que a pesar

de provocar una síndrome de naturaleza psísica muy importante, su abst inencia no

induce la expresión de signos somát icos f ísicos. No obstante, ot ras sustancias dan lugar

a un síndrome de abst inencia, con signos característ icos y de diferente gravedad. El

síndrome de abst inencia de opiáceos y alcohol es muy destacado, mient ras que las

manifestaciones físicas de la abstinencia de nicotina y THC son más leves.

En el animal de experimentación, este modelo permite evaluar el componente f ísico de

la dependencia desarrollada por algunas drogas como la morf ina, los cannabinoides, el

alcohol o la nicot ina. La interrupción de un t ratamiento crónico de la droga produce el

síndrome de abst inencia, que se caracteriza por presentar respuestas opuestas a las

acciones iniciales agudas de la droga. De este modo, el animal expresa signos

comportamentales que pueden ser fácilmente cuant if icados y que ref lej an los síntomas

físicos de dicha abst inencia. Para estudiar el síndrome de abst inencia en el animal de

experimentación, se realiza en primer lugar un t ratamiento crónico para inducir la

dependencia. Posteriormente, se puede observar el síndrome de abst inencia de una

manera espontánea, o precipitarlo con un antagonista específico de la droga que se esté

estudiando. La precipitación del síndrome de abst inencia con un antagonista específ ico,

nos permite evaluar los signos somát icos característ icos de la abst inencia, al mismo

t iempo en todos los animales. Existen escalas de puntuación para la cuant if icación de

los síndromes de abst inencia de opiáceos (Gellert y Holtzman, 1978), nicot ina (Malin y

cols., 1992), alcohol (Macey y cols., 1996) y cannabinoides (Hutchenson y cols., 1998).

Debido a sus manifestaciones severas, los signos físicos asociados al síndrome de

Introducción

37

abst inencia de opiáceos han sido estudiados de forma extensa (Aghaj anian, 1978;

Maldonado y cols., 1992; Maldonado y Koob, 1993). La expresión de la abst inencia f ísica

de opioides se correlaciona con una gran hiperact ividad neuronal directamente

relacionada con las manifestaciones somát icas de dicho síndrome (Rasmussen y cols.,

1990). Ent re las est ructuras cerebrales más implicadas en la expresión de dicha

abstinencia se encuent ran el locus coeruleus y la sustancia gris periacueductal

(Maldonado y cols., 1993; Maldonado y cols., 1995). En el caso del síndrome de

abst inencia cannabinoide una est ructura cerebral implicada de forma directa es el

cerebelo (Tzavara y cols., 2000; Castañé y cols., 2004). Hay que destacar que el

síndrome de abst inencia de todas las drogas de abuso se encuent ra también

acompañado por un componente emocional negat ivo que caracteriza la parte psíquica

de dicha abst inencia. Una manera de evaluar el componente emocional de la

abstinencia es utilizando el modelo de condicionamiento espacial (ver punto 4.1 de este

capítulo).

Introducción

38

5 Sistema endocannabinoide

Aunque las referencia históricas del uso del Cannabis Sat iva con f ines médicos data de

hace más de 4000 años (Adams y Mart in, 1996), la est ructura química de sus principales

compuestos act ivos tales como el ∆9-tet rahidrocannabinol (THC) no fue ident if icada

hasta pasada la mitad del siglo XX (Mechoulam y Gaoni, 1965). Durante la década de los

80, diversos estudios sugerían la presencia de receptores cannabinoides en el SNC

(Razdan, 1986; Devane y cols., 1988), pero no fue hasta 1990 cuando se clonó el primer

receptor cannabinoide (receptor CB1) (Matsuda y cols., 1990). Más tarde, en 1993, el

grupo de Munro y cols., clonó el receptor cannabinoide CB2. Más tarde, la anandamida y

el 2-araquidonil glicerol fueron identificados como ligandos endógenos de los receptores

cannabinoides (Devane y cols., 1992; Mechoulam y cols., 1995; Sugiura y cols., 1995).

Desde entonces el conocimiento sobre el sistema endocannabinoide y su importancia

fisiológica se ha expandido en gran manera (Fowler, 2005).

5.1 Cannabinoides endógenos

Los ligandos endógenos de los receptores cannabinoides son compuestos derivados de

ácidos grasos poliinsaturados, siendo los más representat ivos la etanolamida del ácido

araquidónico, también llamada anandamida (Devane y cols., 1992) y el 2-araquidonil

glicerol (Mechoulam y cols., 1995, Sugiura y cols., 1995). La palmitoiletanolamida es

ot ro miembro de esta familia de lípidos, comparte diversos efectos f isiológicos con los

cannabinoides endógenos, pero es incapaz de unirse a ninguno de los dos subt ipos de

receptores cannabinoides descritos hasta el momento (Sugiura y cols., 2000). Ot ros

cannabinoides endógenos han sido ident if icados recientemente como el 2-araquidonil

gliceril éter (Hanus y cols., 2001), la virodamina (Porter y cols., 2002) y la N-

araquidonildopamina (Huang y cols., 2002). Todos los cannabinoides endógenos son

compuestos de naturaleza lipídica y derivados de la degradación de fosfolípidos de

membrana (Piomelli, 2003).

5.1.1 Biosíntesis y metabolismo de los endocannabinoides

Los endocannabinoides cumplen algunas de las característ icas necesarias de los

neurot ransmisores clásicos: se sintet izan y liberan a part ir de neuronas, son capaces de

unirse y act ivar receptores de membranas y son inact ivados por recaptación y

degradación enzimát ica en el interior de la célula. Sin embargo, los endocannabinoides

no se acumulan en el interior de vesículas sinápticas como otros neurotransmisores. Así,

los endocannabinoides son mediadores que se sintet izan según la demanda (Di Marzo y

Introducción

39

cols., 1994), actúan en las proximidades del lugar donde se han liberado y una vez han

actuado son rápidamente inact ivados por la acción de enzimas específ icas de

degradación (Piomelli, 2003). La anandamida es el cannabinoide endógeno más

estudiado y es sintet izada a part ir de la fosfat idiletanolamina presente en la membrana

celular. En su síntesis confluyen la acción sucesiva de 2 enzimas que catalizan la

formación de anandamida, la N-acet ilt ransferasa y la fosfolipasa D (Di Marzo y cols.,

1994). La anandamida se sintet iza y se liberada en el momento en que existe una

necesidad de la misma. La acción de los endocannabinoides está limitada por dos

procesos que incluyen el t ransporte enzimát ico desde la hendidura sinápt ica hacia el

interior de la célula, y la hidrólisis provocada por dos sistemas enzimát icos, la hidrolasa

de ácidos grasos (FAAH) (Cravat t y cols., 1996) y la lipasa de monoacilglicéridos (MAGL)

(Dinh y cols., 2002). Estos dos procesos ej ercen un cont rol sobre los niveles de

endocannabinoides presentes en los tej idos, eliminándolos rápidamente t ras su acción

(Rodríguez de Fonseca y cols., 2005).

Figura 12. Mecanismo de formación e inactivación de la anandamida en neuronas (Piomelli, 2003)

El 2-araquidonil glicerol es el cannabinoide endógeno más abundante en el cerebro y su

concent ración es aproximadamente 200 veces superior a la de la anandamida (Stella y

cols., 1997; Bisogno y cols., 1999). El proceso de formación del 2-araquidonil glicerol y

ot ros 2-monoacilglicéridos está mediado de manera mayoritaria por la fosfolipasa C

(Piomelli, 2003). Su eliminación, como la anandamida, se realiza a t ravés de un proceso

que consta de dos pasos sucesivos, recaptación y degradación enzimát ica. La

recaptación del 2-araquidonil glicerol t iene lugar a t ravés del mismo sistema de

t ransporte que la anandamida (Piomelli y cols., 1999). Por ot ro lado, aunque el 2-

Introducción

40

araquidonil glicerol es también sust rato de la FAAH (Goparaj u y cols., 1998), se ha

sugerido la existencia de ot ros enzimas implicados en su degradación tales como la

MAGL (Dinh y cols., 2002).

5.2 Receptores cannabinoides

Los cannabinoides ej ercen su acción farmacológica mediante la act ivación de dos t ipos

de receptores acoplados a proteínas G con siete dominios transmembranarios, y hasta el

momento se han ident if icado y clonado dos t ipos diferentes, el receptor cannabinoide

CB1 (Matsuda y cols., 1990) y el receptor cannabinoide CB2 (Munro y cols., 1993). El

receptor CB1 esta ampliamente dist ribuido en el SNC, se considera que es el receptor

acoplado a proteína G más abundante en el cerebro de mamíferos.

Figura 13. Expresión del receptor CB1 en un corte sagital de cerebro de rata (Herkenham y cols., 1990).

Mediante la aplicación de diferentes técnicas de autoradiografía y de estudios

inmunohistoquímicos se ha descrito de forma detallada la dist ribución de este receptor

en el cerebro de rata (Herkenham y cols., 1990; Mailleux y Vanderhaeghen, 1992) (Fig.

13). Así, los receptores CB1 se expresan en áreas del SNC que contribuyen al control del

movimiento (caudado-putamen, globo pálido, núcleo entopeduncular, sustancia negra y

cerebelo), cognición y memoria (formación hipocampal, corteza cingulada, PFC),

procesamiento de emociones y respuestas mot ivacionales (complej o amigdalino, NAc,

corteza olfatoria), percepción dolorosa (sustancia gris periacueductal, asta dorsal de la

médula espinal), e integración neuroendocrina (núcleos del hipotálamo como el

paravent ricular, el arcuato, el supraópt ico y el vent romedial), (Mailleux y

Vanderhaeghen, 1992; Matsuda y cols., 1993) (Fig. 14). Además, el receptor CB1 se

encuent ra en órganos y tej idos periféricos como el bazo, pulmón, endotelio vascular,

Introducción

41

músculo liso, adipocitos hígado y páncreas ent re ot ros (Galiegue y cols., 1995; Pertwee,

2001). El receptor CB1 es responsable de los efectos psicot rópicos de los cannabinoides

(Ledent y cols., 1999), y su dist ribución se encuent ra est rechamente relacionada con

sus efectos farmacológicos.

Resulta interesante comprobar que el receptor CB1 ha sido muy preservado a lo largo de

la evolución, este hecho sumado a su alta y organizada dist ribución en las neuronas

gabaérgicas y glutamatérgicas le confieren al receptor CB1 un papel muy importante

como modulador en la sinapsis (Rodríguez de Fonseca y cols., 2005). El receptor CB2 se

localiza fundamentalmente a nivel periférico, en células del sistema inmunitario

(Galiegue y cols., 1995). Los receptores CB2 han sido relacionados con las propiedades

inmunosupresoras de la marihuana (Klein y cols., 1998). Recientemente, se ha

demost rado su presencia en el SNC y su part icipación en funciones clásicamente

atribuidas al receptor CB1, como es el efecto antiemético (Van Sickle y cols., 2005).

Diversos estudios han sugerido la existencia de un tercer receptor cannabinoide que se

podría expresar a nivel cerebral (Di Marzo y cols., 2000; Haller y cols., 2002). Así, en

ratones deficientes en el receptor cannabinoide CB1, la anandamida es capaz de

modif icar la act ividad espontánea y el umbral nocicept ivo (Di Marzo y cols., 2000).

Mediante estudios bioquímicos, se ha demost rado que la anandamida es capaz de

est imular la unión de 35S-GTPγS en preparaciones de cerebro de ratones deficientes en

los receptores CB1 sin que este efecto sea inhibido por antagonistas de los receptores

CB1 o CB2 (Di Marzo y cols., 2000). Asimismo, se ha observado que el antagonista del

receptor CB1 rimonabant es capaz de producir un efecto ansiolít ico tanto en ratones

normales como en ratones CB1 knockout (Haller y cols., 2002). Muy recientemente, se

ha asociado el receptor CB3 con el receptor huérfano conocido como GPR55 (Baker y

cols., 2006), recientemente clonado (Brown y cols., 2005). Si bien cont inúa siendo un

punto controvertido y no totalmente aceptado en la actualidad.

Los cannabinoides endógenos poseen diferentes propiedades de unión y de act ividad a

los receptores CB1 y CB2. La anandamida es un agonista parcial y se une a ambos

receptores aunque posee mayor af inidad por el receptor CB1. Del mismo modo, la

act ividad int rínseca de la anandamida al unirse al receptor CB1 es superior que cuando

se une al receptor CB2. El ácido 2-araquidonil glicerol también se une a ambos

receptores pero, a pesar de ser un agonista completo, se une al receptor CB1 con menos

afinidad que la anandamida (Stella y cols., 1997; Howlett y cols., 2002).

Introducción

42

5.2.1 Ligandos exógenos de los receptores cannabinoides

Entre los cannabinoides naturales destacamos el ∆9-tet rahidrocannabinol (THC),

principal responsable de las propiedades psicoact ivas de la planta Cannabis sat iva.

Además, ot ros cannabinoides como el ∆8−tetrahidrocannabinol (∆8−THC), el cannabinol y

el cannabidiol también están presentes en esta planta. Los agonistas cannabinoides han

sido clasif icados en función de su est ructura química en t res clases: (1) los

“ cannabinoides clásicos” son aquellos que presentan una est ructura de dibenzopirano,

ent re ellos están los cannabinoides derivados de la cannabis sat iva como el THC, el ?8-

THC, el cannabinol o el cannabidiol, y los análogos sintéticos del ?9THC como el HU-210,

el HU-243 y la babilona. (2) Los “ cannabinoides no-clásicos” son compuestos análogos

bicíclicos y t ricíclicos del THC, pero con modif icaciones sustanciales. A esta clase

pertenece el CP-55,940 empleado para la caracterización del receptor CB1 (Devane y

cols., 1988), y ot ros agonistas cannabinoides como el CP-55,244; CP-50,556 o

levonant radol y el desacet ilevonant radol. Finalmente (3), los aminoalquilindoles

const ituyen la tercera clase de agonistas de receptor cannabinoide, t ienen una

est ructura que no está relacionada con la de los cannabinoides clásicos, y deriva de la

pravadolina. Su principal representante es el WIN55,212-2.

También se han desarrollado antagonistas select ivos para los receptores cannabinoides.

Así, el SR141716A (rimonabant ) (Rinaldi-Carmona y cols., 1994) y el SR144528 (Rinaldi-

Carmona y cols., 1998) son los primeros compuestos antagonistas select ivos para los

receptores CB1 y CB2 respectivamente.

5.2.2 Mecanismo de transducción de señales del receptor cannabinoide CB1

Como se puede observar en la f igura 14, la est imulación de los receptores CB1 y CB2

produce una inhibición de la vía de la adenilato ciclasa que como consecuencia, da lugar

a un descenso de los niveles int racelulares de AMPc. De esta manera se ve afectada la

capacidad de fosforilación de proteína quinasas dependientes de AMPc, involucradas en

procesos metabólicos y de expresión génica (Howlet t y cols., 1990; Felder y cols.,

1995). Al mismo t iempo, se produce una act ivación de la vía de las MAP quinasas

(Bouaboula y cols., 1995). Ot ra consecuencia de la act ivación de los receptores CB1 es

la inhibición de los canales de Ca2+ voltaj e dependientes y el aumento de la

conductancia del K+. Este mecanismo combinado parece ser el responsable del efecto

inhibitorio de los cannabinoides sobre la liberación de neurot ransmisores (Howlet t ,

1998, Bouaboula y cols., 1995).

Introducción

43

Figura 14. Mecanismo de transducción de señales de los receptores CB1 (Ameri, 1999).

5.3 Funciones fisiológicas del sistema endocannabinoide

La dist ribución de los receptores cannabinoides, sumada a los resultados de diversas

invest igaciones básicas sugieren que el sistema endocannabinoide part iciparía en la

regulación de diversas funciones del SNC y periférico (Ameri, 1999, Porter y Felder,

2001), el equilibrio metabólico (Ducobu, 2005) el sistema inmunológico (Berdyshev,

2000; Klein, 1998) y el aparato cardiovascular (Kunos y cols., 2000), ent re ot ros. En

general, el sistema endocannabinoide actúa de forma silenciosa y se sobreact iva como

sistema de recuperación en respuesta a situaciones de estrés.

Uno de los efectos mej or caracterizados de los cannabinoides es su efecto

ant inocicept ivo. El mecanismo de acción de los endocannabinoides como inhibidores de

la t ransmisión dolorosa incluye acciones a nivel cent ral y periférico (Lichtman y Mart in,

1991; Pertwee, 2001). De este modo, los agonistas cannabinoides modulan tanto las vías

ascendentes y descendentes del dolor, así como la interpretación emocional del mismo

por est ructuras supraespinales. En el SNC, el sistema endocannabinoide también

part icipa en la coordinación y el cont rol del movimiento (Giuffrida y Piomelli, 2000) ya

que la act ivación del sistema endocannabinoide induce una disminución de la act ividad

locomotora. Los efectos hipolocomotores inducidos por los cannabinoides parecen ser

mediados por sus acciones inhibitorias a nivel del cerebelo, de la sustancia negra y de

los ganglios basales, est ructuras donde se encuentra una alta densidad de receptores

CB1 (Herkenham y cols., 1990). El sistema endocannabinoide también part icipa en

funciones cognit ivas superiores, como por ej emplo las relacionadas con el aprendizaj e y

Introducción

44

la memoria (Lichtman, 2000). Los cannabinoides provocan una disminución importante

en la retención de la memoria a corto plazo (Miller y Branconnier, 1983; Chait y Pierri,

1992). Asimismo, este sistema está involucrado en la respuesta al est rés (Pertwee,

1999). Ante una situación est resante y/ o t raumát ica, el sistema endocannabinoide

favorece la ext inción de la memoria aversiva (Marsicano y cols., 2002). Sobre la

regulación del metabolismo, la act ivación del receptor CB1 presente en los hepatocitos

est imula la síntesis de ácidos grasos y cont ribuye a la obesidad inducida por dieta en

ratones (Osei-Hyiaman y cols., 2005). En ratas obesas (fa/ fa), el rimonabant fue capaz

de inducir un aumento de la síntesis de mRNA de adiponectina, una proteína sintetizada

por los adipocitos y que, ent re ot ros efectos, induce la eliminación de ácidos grasos,

disminuye la resistencia periférica a insulina y protege el endotelio vascular (Bensaid y

cols., 2003). Recientemente, también se ha demost rado la existencia de receptores

cannabinoides CB1 y CB2 en el páncreas, donde parece ser que los endocannabinoides

t ienen un efecto orexigénico, regulando así el balance energét ico (Juan-Pico y cols.,

2006). Igualmente, el sistema endocannabinoide part icipa en la regulación del sueño

(Cravat t y cols., 1995; Mechoulam y cols., 1997) y los mecanismos de recompensa

(Maldonado y Rodríguez de Fonseca, 2002; Valverde y cols., 2005; Arnold, 2005;

Gardner, 2005), como veremos en los siguientes apartados. De manera similar, se ha

demost rado un part icipación del sistema cannabinoide endógeno en la regulación de la

temperatura corporal, de la ingesta de comida (Di Marzo y cols., 2001; Kirkham y

Will iams, 2001) y en los mecanismos que determinan el ref lej o de succión, el

crecimiento y el desarrollo de los recién nacidos (Fride y cols., 2001). Los efectos sobre

el sistema inmunológico no están bien establecidos. Estudios experimentales muest ran

que la anandamida y el ácido 2-arquidonil glicerol t ienen efectos inmunomoduladores,

de manera que pueden incrementar ciertas respuestas humorales y celulares

(proliferación de los linfocitos B, linfocitos T y liberación de citoquinas) según el modelo

experimental y el t ipo de células inmunitarias. El efecto inmunomodulador está

mediado sobre todo por los receptores CB2. En el sistema cardiovascular, el sistema

endocannabinoide part icipa en la regulación de la presión arterial, ya que los

endocannabinodies se comportan como vasodilatadores sistémicos y vasoconst rictores

pulmonares (Kunos y cols., 2000). En el sistema reproductor part iciparía en mecanismos

de fert il idad durante el período de preimplantación embrionaria (Paria y Dey, 2000;

Wang y cols., 2003).

Introducción

45

Proceso cerebral Función atribuida a los endocannabinoides

Control de la actividad motora Los cannabinoides producen inhibición motora

Control del dolor Los cannabinoides tienen efectos analgésicos

Memoria y aprendizaje Los cannabinoides producen alteraciones de la memoria a corto plazo

Motivación y emocionalidad Los cannabinoides producen efectos reforzantes

Regulación neuroendocrina Los cannabinoides modifican la secreción de hormonas adenohipofisarias

Procesos neurovegetativos Los cannabinoides actúan, entre otros, a nivel de los centros nerviosos reguladores de la émesis, de la temperatura y del apetito

Desarrollo cerebral

Los cannabinoides, actuando como factores epigenéticos, podrían tener efectos sobre la proliferación de neuronas y/o células gliales, sobre la migración y elongación axonal, sobre la sinaptogénesis y/o sobre la mielinogénesis

Metabolismo Los cannabinoides inducen la acumulación de energía y disminuyen el consumo de glucosa

Tabla 2. Procesos cerebrales en los que se ha propuesto una función para los cannabinoides (endógenos y exógenos) a través de sus receptores de membrana.

5.3.1 Los endocannabinoides como mensajeros retrógrados

Una de las característ icas más destacadas y más estudiadas de los endocannabinoides,

en cont raste con ot ros neurot ransmisores, es que actúan como mensaj eros ret rógrados

de muchas sinapsis cent rales. Su liberación desde las neuronas postsinápt icas est imula

los receptores CB1 situados a nivel presinápt ico inhibiendo la liberación de diferentes

neurot ransmisores (Alger, 2002; Wilson y Nicoll, 2002). Mediante esta señalización

ret rógrada, los endocannabinoides son capaces de part icipar en la regulación a corto

plazo de sinapsis inhibitorias (neuronas gabaérgicas) y excitatorias (neuronas

glutamatérgicas). Como en la f igura 15, la act ivación postsinápt ica del receptor

metabot rópico de glutamato t ipo 5 (mGlu5) induce un aumento del Ca2+ int racelular en

la neurona postsináptica y activa la síntesis de endocannabinoides, que hiperpolarizan la

neurona presinápt ica, disminuyendo así la liberación del neurot ransmisor (Freund y

cols., 2003; Howlet t y cols., 2004). Este proceso se denomina supresión inducida por la

despolarización (DS); si se desarrolla sobre neuronas que liberan neurot ransmisores

inhibidores, como el GABA, se considera una DS de la inhibición (DSI), proceso

dependiente de receptores CB1; si el neurot ransmisor es excitador, como el glutamato,

será una DS de la excitación (DSE), proceso que también puede verif icarse en ausencia

de receptores CB1 (Wilson y Nicoll, 2002). El papel del endocannabinoide como inductor

de DSE o DSI depende por tanto del t ipo de neurona, pero también parece influido por

ciertas condiciones basales, especialmente en relación con la concent ración de Ca2+. La

Introducción

46

DSE y la DSI son de crucial importancia en procesos de plast icidad sinápt ica y de

reafirmación de circuitos y redes neuronales determinados, ya que forman la base de los

procesos de aprendizaje y memoria (Freund y cols., 2003).

Además, parece que los endocannabinoides son necesarios para el desarrollo de ciertas

formas de plast icidad sinápt ica a largo plazo, como por ej emplo la depresión a largo

plazo (LTD) de la liberación de glutamato que ocurre en áreas como el NAc y el estriado

dorsal (Robbe y cols., 2002; Hoffman y cols., 2003; Lupica y cols., 2004). Dado el

importante papel que j uegan estas est ructuras en la mediación de los efectos

mot ivacionales y reforzantes de las drogas de abuso, se ha propuesto que la función de

los endocannabinoides en los procesos de LTD existentes en el NAc puede representar

un t ipo de adaptación molecular que part icipa en el desarrollo del proceso adict ivo

(Gerdeman y cols., 2003; Hoffman y cols., 2003).

Figura 15. Representación esquemática de la vía retrógrada de señalización de los endocannabinoides. La act ivación postsináptca de los receptores mGlu1/ 5 y/ o la elevación de Ca2+ int racelular inducen la producción de endocannabinoides y la act ivación presinápt ica de los receptores CB1 inhibiendo la liberación de neurotransmisores (Venance y cols., 2004).

5.4 Participación del sistema endocannabinoide en los circuitos de recompensa

En este capítulo se presentan diferentes evidencias que sugieren que el sistema

endocannabinoide participa en los proceso de adicción de algunas drogas de abuso como

un sistema modulador de los circuitos de recompensa.

Introducción

47

5.4.1 Interacción entre los receptores cannabinoides y los receptores

dopaminérgicos

Una de las evidencias que nos permiten postular un papel modulador del sistema

endocannabinoide sobre la t ransmisión dopaminérgica es el hecho de que se haya

demost rado una colocalización, en terminales gabaérgicos del est riado, de los

receptores CB1 con los receptores de dopamina D1 y D2, y con los de serotonina 5-HT1B

(Hermann y cols., 2002). Esta colocalización implica una interacción bilateral a nivel de

t ransducción de señales ent re los receptores cannabinoides y los receptores

monoaminérgicos. Apoyando estos datos, Glass y Felder (1997) demost raron que la

est imulación del receptor CB1 o D2 induce un descenso en la acumulación de AMPc

int racelular. Sin embargo, al est imular ambos receptores a la vez se produce un

aumento de los niveles de AMPc (Arnold, 2005). Además, estudios recientes han

demost rado que el receptor de dopamina D2 modula de manera posit iva la subunidad α de la proteína G acoplada al receptor CB1 (Jarrahian y cols., 2004), indicando que las

interacciones ent re los receptores D2 y CB1 j uegan un papel crucial en la señalización

del sistema dopaminérgico, y como consecuencia podrían part icipar en enfermedades

del SNC como son la esquizofrenia o la adicción. La act ivación de los receptores D2 por

la dopamina también j uega un papel importante en las alteraciones de la memoria

causadas por el THC (Nava y cols., 2000). Asimismo, el incremento de la expresión del

gen Fos que ocurre t ras el bloqueo del receptor CB1 con rimonabant está regulada por

la función de los receptores D2 (Alonso y cols., 1999). En la misma línea, Valjent y cols.,

(2001) demost raron que los receptores D2 y D1 part icipan en la act ivación de la vía de

las MAP/ERK quinasas inducida por THC.

También existen evidencias de una interacción funcional ent re los sistemas

cannabinoide y dopaminérgico. Así, experimentos de microdiálisis in vivo en ratas han

demost rado que la est imulación de los receptores D2 induce un aumento de los niveles

ext racelulares de anandamida. Por el cont rario, un t ratamiento crónico de antagonistas

D2 produce una regulación al alza de los receptores CB1 en el estriado (Giuffrida y cols.,

1999). Estos datos sugieren que el sistema endocannabinoide podría actuar como

mecanismo de ret roinhibición, y modular los efectos inducidos por la dopamina sobre la

actividad locomotora.

5.4.2 Modulacion endocannabinoide de la transmisión dopaminergica

La mayor parte de los efectos de los endocannabinoides ocurren a nivel presinápt ico

sobre las neuronas int rínsecas y aferentes del NAc y el VTA. En efecto, el receptor CB1

modula la t ransmisión gabaérgica y glutamatérgica en el mismo NAc (Hoffman y Lupica,

2001; Manzoni y Bockaert , 2001; Robbe y cols., 2001; 2002). Se ha demost rado que los

Introducción

48

receptores cannabinoides CB1 están presentes en las sinapsis glutamatérgicas en el NAc,

las cuales contactan con el bucle inhibidor de las neuronas gabaérgicas espinosas de

tamaño medio (Robbe y cols., 2001). Los terminales glutamatérgicos del NAc,

procedentes de la PFC, cont rolan la act ivación de dichas neuronas gabaérgicas

espinosas, que a su vez, inhiben las neuronas dopaminérgicas del VTA. Se ha

demost rado que la act ivación de los receptores CB1 presentes en las aferencias

glutamatérgicas de la corteza reduce fuertemente la t ransmisión glutamatérgica (Pist is

y cols., 2002; Robbe y cols., 2001; 2002). Por ot ra parte, Hoffman y Lupica (2001)

most raron que también existe una reducción de la t ransmisión excitatoria t ras la

activación postsináptica del receptor CB1 en el NAc. La activación de los receptores CB1

desinhibe las neuronas dopaminérgicas, aumentando su act ivación y la liberación de

dopamina mediante la reducción de la t ransmisión glutamatérgica en el NAc y la

subsecuente inhibición de la señalización gabaérgica procedente de las neuronas

gabaérgicas espinosas de tamaño medio (Van der Stelt y Di Marzo, 2003).

Los receptores cannabinoides CB1 también se encuent ran expresados en ot ras áreas que

proyectan al sistema límbico como la amígdala y el hipocampo. Estas est ructuras han

sido relacionadas con procesos de cognición y memoria muy relacionados con el

desarrollo de la adicción. De este modo, el tono dopaminérgico de las neuronas cuyos

cuerpos celulares se encuent ran en el VTA está regulado por receptores cannabinoides

CB1 que se encuent ran en 3 localizaciones dist intas: (1) en los terminales de las

neuronas gabaérgicas int rínsecas del VTA, (2) en los terminales de las neuronas

medianas espinosas gabaérgicas que proyectan desde el NAc y (3) en los terminales de

las neuronas glutamatérgicas que proceden de fuera del VTA (PFC, hipocampo y

amígdala) (Fig. 16) (Lupica y cols., 2004). Según este modelo, los endocannabinoides

son liberados desde los cuerpos celulares de las neuronas dopaminérgicas en el VTA y

viaj an por t ransporte ret rógrado a los terminales de las neuronas gabaérgicas y

glutamatérgicas que forman sinapsis en dicha est ructura (VTA). De este modo, esta

acción ret rógrada de los endocannabinoides regula las ent radas excitatorias e

inhibitorias que reciben las neuronas dopaminérgicas en el VTA, cont ribuyendo a la

modulación de la t ransmisión dopaminérgica vía VTA-NAc que resulta tan importante en

los fenómenos de recompensa.

Introducción

49

Figura 16. Esquema de los posibles interacciones sinápticas entre neuronas que expresan receptores CB1, en áreas límbicas implicadas en el refuerzo (Maldonado y cols., 2006).

5.5 Participación del sistema endocannabinoide en las propiedades adictivas de diferentes drogas de abuso

El desarrollo farmacológico de antagonistas CB1 como el rimonabant (SR141716A)

(Rinaldi-Carmona y cols., 1994) o el AM121, y la existencia de ratones modif icados

genét icamente deficientes en el receptor CB1 (Ledent y cols., 1999, Zimmer y cols.,

1999) y CB2 (Buckley y cols., 2000) nos permiten disponer de importantes herramientas

para expandir el conocimiento sobre el sistema endocannabinoide, en especial acerca

del papel de los receptores CB1 en los fenómenos de adicción. Como se describe en este

capítulo, se ha demost rado claramente la part icipación del sistema endocannabinoide

en las propiedades adict ivas de los cannabinoides, el etanol, los opioides y la nicot ina,

mient ras que en el caso de los psicoest imulantes, como la cocaína, los resultados no

parecen concluyentes.

5.5.1 Cannabinoides

Gracias al gran avance de las técnicas genét icas, y al desarrollo de animales

modif icados genét icamente, los efectos comportamentales del THC han podido ser

evaluados en animales deficientes en el receptor cannabinoide CB1 (Ledent y cols.,

NAc

Introducción

50

1999, Zimmer y cols., 1999) y CB2 (Buckely y cols., 2000). Tras la inact ivación del

receptor CB1, los ratones knockout muest ran una ausencia de efectos ant inocicept ivos,

hipotérmicos e hipolocomotores inducidos por el THC. Además, los animales deficientes

en el receptor CB1 no se autoadminist ran el agonista cannabinoide WIN55,212-2 en un

paradigma de autoadminist ración int ravenosa aguda (Ledent y cols., 1999). La

dependencia inducida por una administ ración crónica de THC también fue explorada en

este estudio. De este modo, el antagonista CB1 rimonabant precipitó un síndrome de

abst inencia en los animales wild-type pero no en los animales mutantes, que habían

recibido un t ratamiento crónico con THC. Estos resultados demost raron de forma muy

clara que tanto las principales respuestas farmacológicas inducidas por el THC como las

propiedades adict ivas de los cannabinoides están mediadas por el receptor CB1 (Ledent

y cols., 1999).

Estudios farmacológicos también han demost rado que el THC, ot ros cannabinoides

sintéticos y endocannabinoides actúan sobre los mecanismos de recompensa a través del

receptor CB1. Así, diversos trabajos reflejan que monos saimiri (“squirrel monkeys”) son

capaces de aprender una conducta operante mantenida por infusiones de THC (Tanda y

cols., 2000), anandamida y su análogo sintét ico, la R(+)-metanandamida (Just inova y

cols., 2005). El antagonista CB1 rimonabant produce un bloqueo de la

autoadminist ración de THC y anandamida en monos ent renados baj o un protocolo de

razón f ij a 10 (Tanda y cols., 2000, Just inova y cols., 2005), lo cual demuest ra el papel

crucial del receptor CB1 en las propiedades reforzantes de los cannabinoides. Además,

se ha podido demost rar que cannabinoides sintét icos como el WIN55-212,2 y el CP-

55,940 originan una conducta de autoadminist ración en ratas (Fat tore y cols., 2001;

Braida y cols., 2001) y ratones (Martellot ta y cols., 1998), que también se suprime t ras

el tratamiento con rimonabant.

5.5.2 Etanol

Estudios recientes muest ran que algunos efectos comportamentales y farmacológicos

del etanol podrían estar mediados por el sistema endocannabinoide (Hungund y cols.,

2002). El bloqueo farmacológico del receptor CB1 reduce la preferencia de plaza

(Houchi y cols., 2004) y el consumo voluntario de etanol (Arnone y cols., 1997; Colombo

y cols., 1998; Rodríguez de Fonseca y cols., 1999; Freedland y cols., 2001; Rinaldi-

Carmona y cols., 2004). La motivación por el consumo oral de cerveza, estudiado con un

protocolo de razón progresiva, disminuye t ras el bloqueo farmacológico con rimonabant

(Gallate y McGregor, 1999; Gallate y cols., 2004). Al cont rario, se observó un aumento

en la mot ivación de las ratas por la cerveza al est imular dicho receptor con el agonista

CB1 CP-55,940 (Gallate y cols., 1999). La supresión genét ica del receptor CB1 produce

Introducción

51

un menor consumo de etanol en los animales CB1 knockout que en sus hermanos wild-

type (Hungund y cols., 2003; Poncelet y cols., 2003, Naassila y cols., 2004, Thanos y

cols., 2005). Recientemente se ha demost rado que estos ratones deficientes en el

receptor CB1 son incapaces de most rar una preferencia de plaza inducida por etanol

(Thanos y cols., 2005). Asimismo, la exposición a un est rés de t ipo choque eléct rico no

modificó la preferencia producida por etanol en animales CB1 knockout mientras que en

los animales wild-type el choque eléct rico aumentó dicha preferencia de plaza

(Poncelet y cols., 2003)

En relación a la participación de los receptores CB1 en los efectos de dependencia física

del etanol, Naassila y cols., (2004) han evaluado las manifestaciones somát icas del

síndrome de abst inencia espontáneo en ratones dependientes a alcohol a los que se les

interrumpió su consumo de forma abrupta. Mientras que los ratones wild-type mostraron

signos físicos asociados al síndrome de abst inencia, los ratones deficientes en el

receptor CB1 revelaron una total ausencia de las manifestaciones somát icas del

síndrome de abst inencia de alcohol, indicando la implicación del receptor CB1 en dicha

dependencia física.

5.5.3 Opioides

Los sistemas cannabinoide y opioide interaccionan en diferentes funciones. La primera

interacción descrita ent re estos dos sistemas fue demost rada sobre las respuestas

ant inocicept ivas inducidas por los cannabinoides y los opioides (revisión en Maldonado y

Valverde, 2003). También se han demost rado interacciones de t ipo funcional ent re los

sistemas cannabinoide y opioide a nivel de la regulación de la temperatura corporal, la

respuesta al est rés (revisión en Viveros y cols., 2005) y de los procesos adictivos

(Ghozland y cols., 2002; Valverde y cols., 2000; 2005).

En este apartado tan sólo se detallarán las interacciones de t ipo funcional ent re los

sistemas cannabinoide y opioide en respuestas relacionadas con los procesos adict ivos

(Manzanares y cols., 1999; Navarro y cols., 2001; De Vries y cols., 2003; Solinas y cols.,

2003). Los efectos discriminatorios, placenteros y reforzantes del THC pueden ser

revert idos con antagonistas de los receptores opioides como la naloxona y la nalt rexona

(Chen y cols., 1990, Solinas y Goldberg, 2005; Just inova y cols., 2004). La invalidación

select iva del receptor opioide mu en ratones reduj o las propiedades placenteras del

THC en el paradigma de preferencia de plaza condicionada (Ghozland y cols., 2002). De

acuerdo con estos resultados, Just inova y cols., (2004) most raron que la

autoadministración intravenosa de THC disminuye tras el tratamiento con el antagonista

opioide naloxona. Por ot ro lado, los efectos disfóricos producidos por el THC se

Introducción

52

encuent ran anulados en animales deficientes en el receptor opioide kappa (Ghozland y

cols., 2002). Existen numerosas evidencias demostrando que la interacción funcional

ent re los dos sistemas es recíproca. De este modo, diferentes estudios han evaluado el

papel del sistema cannabinoide en la modulación de las propiedades adict ivas de los

opioides. El bloqueo farmacológico de los receptores CB1 con rimonabant bloquea el

desarrollo de la preferencia de plaza inducida por morf ina (Chaperon y cols., 1998) y

revierte parcialmente la autoadminist ración int racerebrovent ricular de heroína (Braida

y cols., 2001). De acuerdo con estos resultados, el t ratamiento con rimonabant produce

una reducción signif icat iva en el número de respuestas tanto en animales que se

autoadminist ran morf ina en un protocolo de razón f ij a 5, como en animales que están

baj o un protocolo de razón progresiva (De Vries y cols., 2003; Solinas y cols., 2003).

Además, el rimonabant atenúa de forma dosis-dependiente el efecto de recaída

provocado por la presentación de un est ímulo lumínico-sonoro asociado a la infusión de

heroína (De Vries y cols., 2003). Del mismo modo, los ratones knockout deficientes en el

receptor CB1 no se autoadminist ran morf ina (Cossu y cols., 2001), ni muest ran la

preferencia de plaza inducida por dicha droga (Mart ín y cols., 2000). Sin embargo, la

administ ración aguda de rimonabant no modif ica el aumento de los niveles

ext racelulares de dopamina en el NAc t ras una inyección de heroína (Tanda y cols.,

1997; Caillé y Parsons, 2003).

Por ot ro lado, se ha demost rado la existencia de una interacción bidireccional ent re el

sistema opioide y cannabinoide en relación a los fenómenos de tolerancia y dependencia

f ísica. Así, numerosos estudios farmacológicos muest ran un fenómeno de tolerancia

cruzada ent re compuestos cannabinoides y opioides a nivel de la respuesta

ant inocicept iva en el animal de experimentación (Bloom y Dewey, 1978; Smith y cols.,

1994; Thorat y Bhargava, 1994). Además, el bloqueo del receptor CB1 con rimonabant

es capaz de precipitar manifestaciones físicas y bioquímicas características del síndrome

de abst inencia en animales dependientes de morf ina (Navarro y cols., 1998). De forma

recíproca, el antagonista opioide naloxona precipita el síndrome de abst inencia de

cannabinoides en ratas t ratadas de forma crónica con cannabinoides (Kaymakcalan y

cols., 1977; Navarro y cols., 1998). Sin embargo, este efecto no se ha podido demost rar

en el caso de los ratones (Lichtman y cols., 2001). Al mismo t iempo, la administ ración

aguda o crónica de THC o anandamida atenúa la severidad del síndrome de abst inencia

de morfina (Hine y cols., 1975; Litchman y cols., 2001; Valverde y cols., 2001).

Estudios realizados en ratones knockout han permit ido esclarecer el papel del sistema

opioide en los diferentes componentes de la abst inencia de cannabinoides (Maldonado y

Rodríguez de Fonseca, 2002). Así, la severidad del síndrome de abst inencia

cannabinoide está disminuída de forma signif icat iva en animales deficientes en el gen

de pre-proencefalina (Valverde y cols., 2000), prodinorf ina (Zimmer y cols., 2001) y en

Introducción

53

ratones dobles mutantes deficientes en los receptores opioides mu y delta (Castañé y

cols., 2003). De nuevo, esta interacción resultó ser bidireccional ya que se observó una

disminución en la severidad del síndrome de abst inencia de morf ina en animales

deficientes en el receptor cannabinoide CB1 (Ledent y cols., 1999).

5.5.4 Nicotina

En humanos, el consumo de nicot ina y THC se asocia con frecuencia (Schorling y cols.,

1994; Degenhardt y cols., 2001). En este sent ido, resulta interesante estudiar las

posibles interacciones que pueden desarrollarse ent re ambas drogas de abuso. Así, la

coadministración de dosis subefectivas de THC y nicotina produce una facilitación de los

efectos placenteros de estas dos drogas, evaluados en el paradigma de

condicionamiento espacial (Valj ent y cols., 2002). Además, el antagonista del receptor

CB1 rimonabant disminuye la autoadminist ración de nicot ina en ratas (Cohen y cols.,

2002). De acuerdo con estos resultados, la administ ración de nicot ina no induce efectos

grat if icantes en animales deficientes en el receptor CB1 en un paradigma de

condicionamiento espacial (Castañé y cols., 2002; Le Foll y Goldberg, 2004). Sin

embargo, ot ro estudio ha most rado que los ratones CB1 knockout aprenden a

autoadminist rarse nicot ina (Cossu y cols., 2001). Hay que señalar que en este últ imo

t rabaj o se ut il izó un paradigma de autoadminist ración aguda con movilidad rest ringida.

Este procedimiento no permite evaluar el mantenimiento de una conducta operante

mantenida por infusiones de nicot ina y además, los efectos ansiolít icos de la nicot ina

pueden interferir en los resultados ya que los animales están baj o una situación de

est rés causado por la inmovilización. Aunque el bloqueo farmacológico del receptor CB1

con rimonabant no altera los efectos discriminatorios de la nicot ina sí que disminuye la

autoadminist t ración de nicot ina en ratas (Cohen y cols., 2002; Le Foll y Goldberg,

2004). Además, el aumento de los niveles extracelulares de dopamina en el NAc tras una

inyección de nicot ina es bloqueado por el rimonabant de una manera dosis-dependiente

(Cohen y cols., 2002). Asimismo, el rimonabant atenúa el efecto de recaída provocado

por la presentación de un estímulo lumínico-sonoro asociado a la infusión de nicotina en

ratas (Cohen y cols., 2005; De Vries y cols., 2005). En conj unto, estos datos sugieren un

papel importante del receptor CB1 en las propiedades placenteras y reforzantes de la

nicot ina (Le Foll y Goldberg, 2005). El papel importante que desempeñan los receptores

CB1 en los efectos reforzantes y las propiedades adict ivas de la nicot ina se ha

confirmando también en el humano. Así, datos procedentes del estudio clínico en fase

III STRATUS-US (“ Smoking cessat ion in smokers mot ivated to quit ” ) han demost rado que

el t ratamiento crónico con el antagonista rimonabant aumenta de una manera

Introducción

54

signif icat iva la probabilidad de abandono de la adicción del tabaco (Anthenelli y

Despres, 2004).

Del mismo modo que en el caso de los opioides y el etanol, la interacción cannabinoide-

nicot ina también se observa a nivel de la dependencia f ísica. Así, ratones cot ratados de

forma crónica con nicot ina y THC muest ran un incremento en las manifestaciones

somát icas asociadas al síndrome de abst inencia de THC precipitado por rimonabant

(Valj ent y cols., 2002). Además, el pret ratamiento con THC es capaz de atenuar la

intensidad de las manifestaciones somát icas del síndrome de abst inencia de nicot ina

(Balerio y cols., 2004). Por ot ro lado, existen estudios realizados en animales knockout

deficientes en el receptor CB1 que muest ran la misma severidad del síndrome de

abst inencia de nicot ina tanto en animales knockout como en los wild-type (Castañé y

cols., 2002).

5.5.5 Psicoestimulantes

Hasta hace pocos años, diversos estudios habían propuesto que el sistema

endocannabinoide no part icipa, o t iene un papel muy limitado, en las propiedades

adict ivas de los psicoest imulantes. Así, la preferencia de plaza inducida por cocaína

resultó ser igual en ratones wild-type y en ratones deficientes en el receptor CB1

(Mart ín y cols., 2000). Del mismo modo, la autoadminsit ración de cocaína y anfetamina

en un paradigma de autoadminist ración aguda con movilidad rest ringida es similar en

ambos genot ipos (Cossu y cols., 2001). Por ot ro lado, estudios farmacológicos muest ran

que la administ ración de rimonabant no interf iriere en la conducta de

autoadminist ración de cocaína en ratas (De Vries y cols., 2001), ni en monos (Tanda y

cols., 2000), ent renados con un protocolo de razón f ij a. Sin embargo, estos últ imos

autores han podido demost rar que el rimonabant es capaz de atenuar la conducta de

recaída provocada por una inyección de cocaína o por los estímulos asociados a esta (De

Vries y cols., 2001). Además, la est imulación del receptor CB1 con el agonista

WIN55,212-2 disminuye los efectos placenteros de la cocaína evaluados en un paradigma

de autoest imulación int racraneal (Vlachou y cols., 2003). Ot ros estudios de t ipo

neuroquímico y neurof isiológico muest ran liberación de anandamida en el est riado t ras

una administración de cocaína (Centonze y cols., 2004), apoyando la posible implicación

del sistema endocannabinoide en los efectos de la cocaína. Con esta cont roversia en

relación a los psicoest imulantes, el papel del sistema endocannabinoide como sust rato

común en la neurobiología de la adicción de diferentes drogas de abuso queda aún por

ser esclarecido, y ha constituído uno de los objetivos del presente estudio.

Introducción

55

6 Sistema purinérgico

En 1963, Berne, incluye la idea de modulación de la t ransmisión purinérgica, cuando

sugiere que la adenosina puede actuar como regulador f isiológico del f luj o sanguíneo.

Más tarde, el concepto de neurot ransimisón purinérgica fue propuesto por Burnstock en

1972. Esta hipótesis generó una fuerte resistencia debido a que el ATP es un

contituyente esencial de todas las células vivas y está muy relacionado con el

metabolismo energét ico, de modo que resultaba ext raño pensar que una molécula tan

ubicua pudiera actuar como un neurot ransmisor. Más tarde se desarrolla ot ro concepto

de inf luencia signif icat iva en el desarrollo de la comunicación purinérgica, la idea de

cont ransmisión (Burnstock, 1976). Dos años más tarde, el mismo autor provee las bases

farmacológicas para distinguir entre dos tipos principales de receptores purinérgicos: los

llamados receptores P1 select ivos para adenosina, que actúan a t ravés de la adenilato

ciclasa y son antagonizados por bajas concentraciones de metilxantinas, y los receptores

P2 select ivos para nucleót idos que muest ran poca inhibición con met ilxant inas

(Burnstock, 1978).

Así, el sistema purinérgico es un sistema endógeno del cual forman parte, las purinas y

los nucleót idos purinérgicos, ambos como ligandos endógenos de los receptores

purinérgicos. Las purinas, especialmente la adenosina, y los nucleót idos purinérgicos, el

ATP y el ADP, son const ituyentes esenciales de todas las células vivas. Dada su

naturaleza tan general, las purinas han resultado ser importantes moléculas para la

señalización int ra y ext racelular, además de su act ividad relacionada con el

metabolismo energét ico y la t ransmisión genét ica de información (Dunwiddie y Masino,

2001). Este capítulo se cent ra en la adenosina como neurot ransmisor y en el papel del

receptor A2A en los procesos de recompensa involucrados en la adicción de drogas de

abuso.

Introducción

56

6.1 Adenosina

Dada su ubicuidad la adenosina part icipa en un gran número de funciones f isiológicas y

por eso Engler en 1991 la llamó “ la señal de la vida” . La adenosina se ha relacionado

con la modulación de sistemas de señalización de segundos mensaj eros, de

neurot ransmisores, del metabolismo energét ico y del sistema inmunitario. Asimismo,

part icipa en la maduración neuronal, en procesos de apoptosis y neuroprotección

(Abbracchio y Cat tabeni, 1999; Stone, 2002). La adenosina regula diferentes conductas

como la act ividad locomotora, el comportamiento agresivo, la interacción social y t iene

un papel muy importante en la inducción del sueño (Machado-Vieira y cols., 2002).

Además, la adenosina está involucrada de una manera importante en los procesos de

memoria y aprendizaj e (Zarrindast y Shafaghi, 1994; Ohno y Watanabe, 1996) regulando

la t ransmisión sinápt ica, la excitabilidad neuronal y los fenómenos de neuroplast icidad

incluyendo procesos de LTP y LTD en el hipocampo (de Mendonca y Ribeiro, 1994;

Sebast iao y Ribeiro, 2000; Kaplan y Abel, 2003). A su vez, las alteraciones de la

neurotransmisión purinérgica han sido implicadas en diferentes procesos fisiopatológicos

como el dolor, el asma y neuropatologías de tipo epiléptico, enfermedad de Hungtinton,

Parkinson, Alzheimer y fenómenos de adicción (Ribeiro y cols., 2003).

Como en el caso de los endocannabinoides, la adenosina no se comporta como un

neurotransmisor clásico ya que no se libera vía exocitosis vesicular, al no acumularse en

vesículas sinápt icas aunque se libera desde el citoplasma al espacio ext racelular a

t ravés de t ransportadores de nucleósidos (Hack y Christ ie, 2003). La adenosina cumple

una doble función actuando a la vez como un mensaj ero t ranscelular de t ipo

homeostát ico y como neuromodulador, cont rolando la liberación de ot ros

neurot ransmisores y la excitabilidad neuronal (Fredholm y cols., 2005). Igualmente, se

La adenosina es un nucleósido formado de

la unión de la adenina con un anillo

de ribosa. La adenosina const ituye un

elemento est ructural de los ácidos

nucleicos y part icipa en el metabolismo

energét ico de todos los seres vivos.

Además, const ituye el l igando endógeno de

los receptores purinérgicos P1. Los efectos

fisiológicos de la adenosina fueron descritos

inicialmente en el sistema cardiovascular y

en el tracto gastrointest inal (Drury y Sent.-

Gyorgy, 1929), pero existe un extenso

espectro de funciones neuromoduladoras

de la adenosina descritas hasta ahora.

Introducción

57

ha postulado un papel de la adenosina como mensaj ero sinápt ico de t ipo ret rógrado

(Brundege y Dunwiddie, 1996).

6.1.1 Biosíntesis y metabolismo de la adenosina

Dada la alta concent ración de adenosina en el SNC y la alta af inidad que presenta por

los receptores t ipo P1 (A1, A2A, A2B, A3), se ha sugerido la existencia de un tono basal

de adenosina en algunas sinapsis cent rales (Brundej e y Will iams, 2002). La

disponibilidad de adenosina extracelular se ve aumentada tras (1) la excitación neuronal

como la est imulación sinápt ica; (2) situaciones de hipoxia; (3) la inhibición del

metabolismo por la adenosina quinasa o adenosina desaminasa; y (4) alteraciones de los

mecanismos mediados por ot ros receptores (Lat ini y Pedata, 2001; Dunwiddie y Masino,

2001). La formación de adenosina puede tener origen int ra y/ o ext racelular. Cuando la

procedencia es int racelular, la adenosina se puede formar a part ir del AMPc o de la S-

adenosil homocisteína. En el exterior de la célula, la adenosina puede proceder de los

mismos t ransportadores de nucleósidos como del metabolismo del AMPc ext racelular

(Fig. 17).

Figura 17. Biosíntesis (línea continua) e inactivación (línea discontinua) de la adenosina Abreviaciones: ENT (t ransportador de nucleósidos equilibrat ivo), CNT (t ransportador de nucleósidos concentrativo).

La inact ivación de adenosina ext racelular ocurre principalmente mediante la acción de

los t ransportadores de nucleósidos, cuya act ividad puede estar regulada por la

Introducción

58

act ivación de receptores de adenosina (Delicado y cols., 1994). La efect ividad del

sistema de recaptación de la adenosina está garant izada por el posterior metabolismo

intracelular de la adenosina. Así, la adenosina se puede reconvertir en inosina mediante

la adenosina desaminasa o fosforilarse y convert irse en AMP mediante la adenosina

quinasa (Fredholm y cols., 2005).

6.2 Receptores de adenosina

La adenosina efectúa su papel neuromodulador a t ravés de la unión a 4 t ipos de

receptores dist intos, que fueron clonados a principio de los años 90: A1, A2A, A2B, A3

(Libert y cols., 1991; Maenhaut y cols., 1990; Stehle y cols., 1992; Zhou y cols, 1992).

Estos 4 receptores forman el subt ipo P1 de receptores purinérgicos, están codif icados

por genes independientes y poseen diferente af inidad por el nucleósido purinérgico

adenosina. Los receptores A1, A2A y A3 se consideran de alta af inidad, mient ras que los

receptores A2B presentan baj a af inidad por la adenosina (Klinger y cols., 2002). Los

receptores purinérgicos pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a

proteínas G, con siete dominios t ransmembranarios. En su origen, se clasif icaron según

la af inidad que muest ran por ellos los análogos de la adenosina y los antagonistas de las

met ilxant inas (Fredholm y cols., 1994). Posteriormente se estableció una clasif icación

en base a su mecanismo de t ransducción de señales: los receptores A1 y A3 son

inhibidores de la adenilato ciclasa, mient ras que los receptores A2A y A2B la est imulan.

De este modo los receptores A1 y A3 disminuyen los niveles int racelulares de AMPc y los

receptores A2 los aumentan.

Introducción

59

Figura 18. Receptores de adenosina. Los receptores A1 y A3, acoplados a proteinas Gi inhiben la adenilaton ciclasa. Los receptores A2A y A2B, acoplados a proteínas G , estimulan la adenilato ciclasa.

Diferentes canales iónicos de t ipo K+ y de Ca2+ se encuent ran baj o el cont rol directo o

indirecto (vía mensaj eros secundarios) de los receptores de adenosina. Por ej emplo, los

receptores A1 inhiben los canales de Ca2+ mient ras que los receptores A2 aumentan los

niveles de Ca2+ int racelular (Park y cols., 2001; Gubitz y cols., 1996; Gonçalves y cols.,

1997). Además, los receptores A2A pueden actuar también est imulando la vía de las

MAP quinasas y en el caso de los receptores A1, A2B y A3 act ivando la fosfolipasa C

(Hack y Christie, 2003).

6.2.1 Localización de los receptores de adenosina

Dada la cantidad de procesos que están modulados por la adenosina, la expresión de sus

receptores es muy general a nivel del SNC (Fredholm y cols., 1994; Klinger y cols.,

2002). En el cerebro de roedor, existe una alta densidad de receptores A1 en el SNC, en

áreas como la corteza, el cerebelo, el hipocampo y en el asta dorsal de la médula

espinal (Fig. 19). El receptor A2A se encuentra expresado en altas concentraciones en el

est riado, el NAc y el tubérculo olfatorio. También se encuent ra en ot ras est ructuras

cerebrales pero con menor densidad, como el tálamo o el hipocampo (Sebast iao y

Ribeiro, 1996). El receptor A2B posee un nivel de expresión baj o en el cerebro (Dixon y

cols., 1996), mient ras que el receptor A3 t iene niveles de expresión intermedios en el

cerebelo e hipocampo, y niveles muy baj os en el resto de cerebro (Fredholm y cols.,

2001) (Tabla 3).

Introducción

60

Tabla 3. Resumen de la distribución de los receptores de adenosina (Modificado de Fredholm y cols., 2001).

También se encuent ran altas densidades de receptores purinérgicos en la periferia

(p.e.: corazón, pulmón, hígado, riñón) y tienen un papel importante en el control de las

funciones cardiovascular, gast rointest inal y respiratoria. En la tabla 3 se resume su

distribución central y periférica según sus niveles de expresión.

Figura 19. Distribución de los receptores de adenosina en un corte sagital de cerebro de rata (Ribeiro y cols., 2002)

Receptor A1 Receptor A2A Receptor A2B Receptor A3

Alta expresión

Cerebro (córtex, cerebelo e hipocampo), asta dorsal de la médula espinal, ojo, glándula adrenal, atrio

Alta expresión

bazo, leucocitos, plaquetas. Neuronas gabaérgicas (en caudado-putámen, NAc, tubérculo olfatorio), bulbo olfatorio

Alta expresión

Ciego, colon, bufeta

Alta expresión

Testículo, mastocitos (en ratas)

Niveles intermedios

Otras estructuras cerebrales, músculo, hígado, riñón, tejido adiposo, glándulas salivarias, esófago, colon, antrum, testículo

Niveles intermedios

Tálamo, hipocampo, corazón, pulmón, vasos sanguíneos

Niveles intermedios

Pulmón, vasos sanguíneos, ojo, median eminente, mastocitos

Niveles intermedios

Cerebelo, hipocampo, pulmón, bazo, glándula pineal (en ovejas)

Niveles bajos

Pulmón, páncreas

Niveles bajos

Otras estructuras cerebrales

Niveles bajos

Tejido adiposo, glándula adrenal, riñón, hígado, ovarios, glándula pituitaria

Niveles bajos

Tiroides, glándula adrenal, bazo, hígado, riñón, intestino, testículos (en humanos)

Introducción

61

6.3 Relevancia del receptor A2A en procesos de adicción

La elevada densidad de los receptores A2A en est ructuras relacionadas con el sust rato

neuroanatómico de la adicción nos hace pensar que el sistema purinérgico podría

modular también los procesos adict ivos. En este capítulo se presentan diferentes

evidencias que sugieren que el sistema purinérgico, concretamente el receptor A2A,

participa en el fenómeno de la adicción.

6.3.1 Interacción entre los receptores adenosina A2A y los receptores dopaminergicos D2

El est riado vent ral, en el que se integra el NAc, representa el punto de contacto ent re

el sistema límbico y el sistema motor y está involucrado en el cont rol del movimiento

espontáneo y la act ividad dirigida hacia la búsqueda de la droga (Pennartz y cols.,

1994). Desde un punto de vista neuroquímico, el est riado (caudado-putamen, NAc y

tubérculo olfatorio) recibe sinapsis glutamatérgicas de zonas cort icales y talámicas

(Ferré y cols., 1992). Más del 90% de neuronas est riatales son de t ipo gabaérgico

espinosas de tamaño medio. Así, encont ramos dos t ipos de neuronas eferentes

gabaérgicas en el est riado: las neuronas est riatopalidales, que expresan encefalinas y

const ituyen la vía directa de conexión con la sustancia negra, y las neuronas

estriatonigrales y est riato-entopedunculares, que cont ienen dinorf ina y sustancia P y

que también conectan con la sustancia negra, const ituyendo la vía indirecta. Como

hemos visto en el apartado anterior, los receptores A2A se encuent ran altamente

expresados en el est riado (Fredholm y cols., 2001), en concreto en las neuronas

gabaérgicas est riatopalidales donde se colocalizan con los receptores de dopamina D2

(Fink y cols., 1992). Fuxe y Ungerstedt (1974), en un estudio farmacológico sobre la

act ivación motora, proporcionaron evidencias de las interacciones antagoníst icas ent re

la adenosina y la dopamina. Los primeros estudios realizados en preparaciones de

membranas est riatales indicaban que el mecanismo de esta interacción podía implicar

interacciones antagoníst icas de t ipo intermembrana ent re los receptores A2A y D2. En

estos t rabaj os se most raba que el antagonista A2A CGS21680 puede reducir de manera

sustancial la af inidad de la dopamina por el receptor D2 (Ferré y cols., 1991). Al mismo

t iempo, mediante técnicas de hibridación “ in situ” , se pudo demost rar que los

receptores A2A están coexpresados con los receptores D2 en las neuronas gabaérgicas

est riatopalidales (Schif fmann y cols., 1991; Fink y cols., 1992). Con posterioridad, se

sugirió que la base molecular de esta interacción receptor-receptor es la formación de

heterodímeros t ipo A2A-D2 (Zoli y cols., 1993). Ut il izando técnicas de análisis

est ructural, se observó que los receptores A2A y D2 se colocalizaban en zonas

perisinápt icas que rodean botones dopaminérgicos y glutamatérgicos localizados en las

Introducción

62

mismas espinas dendrít icas de las neuronas est riatales eferentes de tamaño mediano

(Hettinger y cols., 2001; Agnati y cols., 2003). Sin embargo, no todos los receptores A2A

t ienen una interacción física con los receptores D2, sino que existe una proporción de

receptores A2A que interaccionan con receptores de glutamato mGlu5 (Ferré y cols.,

2002; Fuxe y cols., 2003).

Los receptores de adenosina A2A y los receptores dopaminérgicos D2 también

interaccionan de manera indirecta a nivel de los sistemas de señalización int racelular.

La fosfoproteína reguladora de la dopamina de peso molecular 32 KDa (DARPP-32) es

una molécula efectora de la dopamina que actúa t ras la act ivación de los receptores D2

y se ha demost rado que t iene un papel fundamental en los efectos farmacológicos de

diferentes drogas de abuso (Nairn y cols., 2004). La act ivación de DARPP-32 también

está regulada directamente por los receptores de adenosina A2A (Svenningsson y cols.,

2004). En este sent ido, estudios recientes han revelado la existencia de un mecanismo

sinérgico ent re los receptores D2 y A2A sobre la señalización de la PKA, mediada por

dímeros βγ de las proteínas G acopladas los receptores A2A (Yao y cols., 2002; 2003).

6.4 Interacción de los receptores A2A y las propiedades adictivas de las drogas de abuso

Los estudios farmacológicos con agonistas y antagonistas de los receptores purinérgicos

t ienen una importante limitación relacionada con la inespecif icidad de la mayoría de

estos ligandos. Por este mot ivo, el desarrollo de ratones knockout deficientes en el

receptor A2A (Ledent y cols., 1997; Chen y cols., 1999) ha permit ido progresar en el

conocimiento sobre el sistema purinérgico y su función moduladora del SNC. Sin

embargo, la implicación de los receptores de adenosina A2A en la neurot ransmisión

implicada en el cont rol de los procesos de placer y refuerzo no ha sido invest igada en

profundidad. Así, el agonista inespecíf ico de los receptores de adenosina NECA induce

una preferencia de plaza condicionada en ratones, que se puede bloquear con teofil ina,

antagonista inespecíf ico de dichos mismos receptores (Zarrindast y Moghadamnia,

1997). Sin embargo, el agonista A2A CGS21680 no produce preferencia de plaza,

mient ras que el antagonista CGS15943A sí que induce condicionamiento espacial en

ratas (Brockwell y Beninger, 1986). Por ot ro lado, la cafeína posee unas propiedades

reforzantes bastante débiles, que parecen ser debidas al bloqueo de los receptores A2A

que est imulan las neuronas gabaérgicas de las vías inhibitorias del sistema

dopaminérgico, en el est riado (Daly y Fredholm, 1998). Se ha demost rado que dosis

moderadas de cafeína y de aminofil ina son capaces de producir de manera dosis-

dependiente comportamientos reforzados posit ivamente en dos modelos diferentes, la

est imulación int racraneal y el condicionamiento operante (Valdes y cols., 1982). Por

Introducción

63

otra parte, el agonista A2A CGS21680 elevó el umbral de placer en la ICSS, mientras que

antagonistas select ivos como el DMPX no alteraron dicho umbral (Baldo y cols., 1999).

Estos resultados sugieren una implicación de los receptores A2A en la modulación de los

procesos de recompensa y confirman, a su vez, la ausencia de potencial de abuso de los

ligandos del receptor A2A (Moreau y Huber, 1999).

6.4.1 Etanol

El etanol interacciona de forma directa con el sistema de la adenosina, además de sus

acciones a nivel de ot ros sistemas de neurot ransmisión. Así, el etanol bloquea uno de

los t ransportadores de nucleósidos, provocando un aumento de los niveles de adenosina

endógena (Hack y Christ ie, 2003). Existen evidencias de que la adenosina modula los

efectos sobre el consumo de etanol. En concreto, la adenosina t iene un papel

importante en el desarrollo de la tolerancia a los efectos del etanol (Nagy y cols., 1991;

Sapru y cols., 1994; Coe y cols., 1996). En 1994, Daly y cols., observaron que los efectos

est imulantes del etanol sobre la locomoción están reducidos de manera importante en

animales t ratados crónicamente con cafeína. También se ha observado un aumento en

el consumo de alcohol en ratas t ras un t ratamiento con teofilina, antagonista A2A

(Gatch y Selvig, 2002). Este mismo t ratamiento (teof il ina) reduce la hiperalgesia

inducida por el síndrome de abst inencia en ratas dependientes de etanol (Gatch y

Selvig, 2002). Además, los ratones deficientes en el receptor A2A son menos sensibles a

los efectos agudos del etanol y consumen más etanol que sus hermanos wild-type

(Naassila y cols., 2002). Para la correcta interpretación de estos resultados hay que

destacar que los ratones A2A knockout demost raron un reducción del 50% de la

expresión de sustancia P, la cual cont ribuye de manera importante en el consumo de

alcohol (Slawecki y cols., 2001; Nicolaev y cols., 2002). Dicho resultado sugiere que esta

adaptación pueden inf luir sobre la act ividad de ot ros mecanismos de neurot ransmisión

que participan en los efectos inducidos por el etanol.

6.4.2 Opioides

Se ha sugerido que la adenosina regula diferentes respuestas inducidas por los opioides.

En la médula espinal, los efectos ant inocicept ivos de la morf ina están en parte

mediados por la liberación de adenosina y la posterior act ivación de receptores A1 y A2

(Sweeney y cols., 1987, 1991). Estos resultados sugieren que la adenosina ext racelular

cont ribuye de manera signif icat iva en la ant inocicepción inducida por morf ina. En la

misma línea, ratones deficientes en el receptor A2A muestran una reducción de la unión

de la [3H]deltorfina-I a los receptores opioides delta y un aumento en la unión de [3H]CI-

Introducción

64

977 a los receptores opioides kappa, ambos en el est riado (Bailey y cols., 2002), lo cual

sugiere un cambio compensatorio en los receptores opioides debido a la ausencia del

receptor A2A. Además, los receptores de adenosina A2A presentes en el estriado regulan

la expresión del gen de la proencefalina (Fink y cols., 1992; Schif fmann y

Vanderhaeghen, 1993). De este modo no resulta ext raño que la adenosina module

algunos aspectos de la dependecia de opioides. En este sent ido, el bloqueo del

metabolismo de la adenosina mediante inhibidores de la adenosina quinasa disminuye la

severidad del síndrome de abst inencia de morf ina (Kaplan y Coyle, 1998). También se

ha demostrado que la cafeína aumenta la sintomatología del síndrome de abstinencia de

morf ina (Capasso, 2000; Khalil i y cols., 2001). De acuerdo con estos resultados, el

agonista del receptor de adenosina CGS21680 inhibe la expresión del síndrome de

abst inencia de morf ina, mient ras que antagonistas como el DMPX aumentan la

incidencia de los signos somát icos expresados durante la abst inencia (Kaplan y Sears,

1996; Salem y Hope, 1997). Asimismo, estudios previos de nuest ro grupo de

invest igación demost raron que la severidad del síndrome de abst inencia de morf ina,

provocado por una inyección de naloxona, resultaba aumentada en los animales A2A

knockout (Berrendero y cols, 2003). Sin embargo todavía no existen estudios

comportamentales que permitan conocer el papel de los receptores A2A en las

propiedades motivacionales y reforzantes de los opioides.

6.4.3. Psicoestimulantes

La cafeína, derivado de las xant inas, es la droga psicoact iva más consumida en todo el

mundo. Aunque se considera un psicoest imulante no representa una droga de abuso

protot ípica (Daly y Fredholm, 1998). Así, la administ ración sistémica de cafeína

aumenta los niveles de dopamina y glutamato ext racelular en el Nac, indicando que la

cafeína puede antagonizar los efectos endógenos de la adenosina, y facilitar de esta

manera la transmisión dopaminérgica (Ferré y cols., 1997; Solinas y cols., 2002).

Existen algunos resultados cont rovert idos sobre la part icipación de los receptores A2A

en las propiedades adict ivas de los psicoest imulantes. En primer lugar, un t rabaj o

realizado en animales deficientes en el receptor A2A most ró que los efectos agudos de

los psicoestimulantes se encuentran atenuados en estos animales, sin que exista ninguna

alteración aparente del sistema dopaminérgico (Chen y cols., 2000). En relación a los

efectos placenteros de los psicoest imulantes, se ha demost rado que antagonistas del

receptor A2A, como el DMPX y la cafeína, reducen la preferencia de plaza inducida por

cocaína (Poleszak y Malec, 2003). Sin embargo, estudios recientes demuestran que tanto

la cafeína como el CGS15943, otro antagonista A2A, pueden reinstaurar una conducta de

búsqueda compulsiva de cocaína (Weerts y Griffiths, 2003). Por otro lado, agonistas A2A

Introducción

65

como el CGS21680 y NECA inhiben la iniciación de una conducta de autoadminist ración

mantenida por infusiones de cocaína (Knapp y cols., 2001) demost rando un papel

inhibidor de estos receptores en los efectos de recompensa producidos por la cocaína.

En estudios de ICSS, se observó que el antagonista DMPX puede revert ir los efectos

sobre el umbral de placer producidos por un período de abst inencia de cocaína (Baldo y

cols., 1999). Al cont rario, se ha obervado que el antagonista A2A MSX3 potencia los

efectos discriminatorios de la cocaína y de la metamfetamina en ratas ent renadas a

discriminar ent re inyecciones de metanfetamina, cocaína o vehículo para

autoadminist rarse comida baj o un protocolo de razón f ij a 10 (Just inova y cols., 2003).

Por ot ro lado, la cafeína previene la ext inción de la autoadminist ración de cocaína en

roedores (Worley y cols., 1994; Schenk y cols., 1996; Kuzmin y cols., 1999). Teniendo en

cuenta este conj unto de resultados, se puede considerar que el papel específ ico del

receptor A2A en las propiedades adict ivas de los psicoest imulantes todavía permanece

sin esclarecer.

6.4.4 Cannabinoides

Existe muy poca literatura sobre una posible interacción ent re los sistemas

cannabinoide y purinérgico. Los escasos estudios existentes se cent ran en los efectos de

descoordinación motora producida por el THC. En este sentido, dos estudios demuestran

que la infusión int racerebelar del agonista del receptor de adenosina A1 CHA aumenta

la descoordinación motora inducida por THC, indicando una comodulación ent re el

receptor cannabinoide CB1 y el receptor de adenosina A1 en la discapacidad motora

producida por dicho cannabinoide (Dar, 2000; De Santy y Dar, 2001). Un estudio previo

realizado de nuest ro laboratorio, invest igó la posible interacción ent re los receptores

A2A y CB1 en el síndrome de abst inencia de morf ina mediante el uso de ratones dobles

mutantes A2A/ CB1 (Berrendero y cols., 2003). Sin embargo, no se encont ró ninguna

diferencia signif icat iva en la expresión somát ica de la abst inencia morfínica ent re los

animales A2A/ CB1 knockout y los wild-type. Hasta el momento no se han realizado más

experimentos que permitan conocer si la adenosina endógena, a t ravés de sus

receptores A2A, j uega un papel importante en las propiedades adict ivas de los

cannabinoides.

A nivel de los sistemas de señalización int racelular, evidencias recientes sugieren una

posible interacción ent re el sistema purinérgico y cannabinoide. De este modo, se ha

encont rado un mecanismo sinérgico ent re el receptor cannabinoide CB1 y el de

dopamina D2, sobre la señalización de la PKA, que estaría mediado por la activación del

receptor A2A (Yao y cols., 2003). Por ot ra parte, se ha demost rado que los efectos

psicomotores de los cannabinoides dependen de la cascada de señalización int racelular

Introducción

66

de activación de la PKA, la cual está regulada por la fosforilación de DARPP-32, que a su

vez está modulada por los receptores de dopamina D2 y los de adenosina A2A

(Andersson y cols., 2005).

6.4.5 Nicotina

Estudios epidemiológicos han relacionado el consumo de cafeína y nicot ina. En este

sent ido, los fumadores parecen consumir más nicot ina si a la vez consumen cafeína

(Brown y Benowitz, 1989), y al mismo t iempo, consumen más cafeína que los no

fumadores (Swanson y cols., 1994). También existen datos experimentales most rando

que la inhibición de los receptores A2A por la administ ración de cafeína aumenta los

efectos est imulantes de la nicot ina sobre la locomoción (Sudakov y cols., 2003).

Asimismo, un t ratamiento crónico de cafeína facilita la adquisición de una conducta

operante mantenida por infusiones de nicot ina en ratas (Shoaib y cols, 1999). Este t ipo

de t ratamiento aumenta también los efectos discriminat ivos de la nicot ina en un

paradigma de autoadminist ración int ravenosa (Gasior y cols., 2000). Pese a estos

resultados, existen pocas evidencias que ref lej en la posible implicación del receptor

A2A en el fenómeno de adicción a nicotina.

Introducción

67

Hipótesis de trabajo

Según lo expuesto hasta ahora, es evidente que el sistema cannabinoide j uega un papel

importante en la regulación de las propiedades adict ivas mediando los efectos de

recompensa de drogas de abuso prototípicas como el cannabis, el etanol, la morfina y la

nicot ina. Teniendo en cuenta la part icipación del sistema endocannabinoide en los

procesos de modulación del sistema dopaminérgico y otros sistemas de neurotransmisión

relacionados con el proceso adict ivo, podríamos considerar que el sistema cannabinoide

representa un sust rato común de la adicción de diferentes protot ipos de drogas de

abuso, incluídos los psicoest imulantes, cuya interacción con el sistema

endocannabinoide nos proponemos demostrar.

Por ot ra parte, el sistema purinérgico modula numerosos sistemas de neurotransmisión

en el SNC. La est recha relación a nivel celular y funcional ent re los receptores de

adenosina y los receptores dopaminérgicos proporciona evidencias de que el sistema

purinérgico podría modular los sistemas de recompensa. Hasta el momento pocos

estudios han abordado la part icipación del receptor de adenosina A2A en los fenómenos

adict ivos. Nosot ros proponemos evaluar la posible part icipación de dichos receptores en

las propiedades reforzantes y adict ivas de diferentes drogas de abuso, lo que podría

suponer la existencia de un nuevo sistema de modulación común de los procesos

adictivos.

Objetivos

71

Objetivos Generales

Evaluar la part icipación del sistema endocannabinoide en las propiedades

adict ivas de la cocaína, mediante la ut il ización de ratones knockout deficientes

en el receptor CB1.

Evaluar la part icipación del sistema purinérgico en los fenómenos de

dependencia de diferentes drogas de abuso como la cocaína, el THC, la nicot ina

y la morf ina, mediante la ut il ización de ratones knockout deficientes en el

receptor A2A.

Objetivos específicos

Evaluaremos el componente mot ivacional de la adicción de cocaína en animales

deficientes en el receptor CB1 ut il izando la técnica de autoadminist ración

int ravenosa y el uso de diferente protocolos de refuerzo. También

invest igaremos en animales deficientes en el receptor CB1 los efectos de la

cocaína sobre el sistema dopaminérgico mendiante la técnica de microdiálisis in

vivo para determinar los niveles ext racelulares de dopamina en el NAc. (Artículo

1)

Evaluaremos los efectos agudos y crónicos de la exposición a cocaína en animales

A2A knockout . Además, estudiaremos el papel del receptor A2A en las

propiedades reforzantes de la cocaína mediante el uso de dos procedimientos

diferentes: el paradigma de condiconamiento espacial y la técnica

autoadministración intravenosa. (Artículo 2)

Invest igaremos la part icipación del receptor purinérgico A2A en los efectos

farmacológicos del THC en animales A2A knockout . Además, estudiaremos las

propiedades motivacionales del THC en estos animales mediante el paradigma de

condicionamiento espacial. Asimismo, evaluaremos la implicación del receptor

A2A en los fenómenos de dependencia física y tolerancia al THC. (Artículo 3)

Invest igaremos la part icipación del receptor purinérgico A2A en los efectos

farmacológicos de la nicot ina en animales A2A knockout . Además, estudiaremos

las propiedades placenteras de diferentes dosis de nicot ina en estos animales

mediante el paradigma de condicionamiento espacial. Asimismo, investigaremos

las propiedades discriminativas de la nicotina en los ratones A2A knockout, en un

Objetivos

72

paradigma de aversión condicionada al gusto. También evaluaremos la

implicación del receptor A2A en los efectos de la nicot ina sobre el sistema

dopaminérgico mediante la técnica de microdiálisis in vivo para determinar los

niveles ext racelulares de dopamina en el NAc. Igualmente estudiaremos el papel

del receptor A2A en los fenómenos de dependencia f ísica de nicot ina. (Artículo

4)

Profundizaremos sobre la part icipación del receptor A2A en las propiedades

mot ivacionales de la morf ina y sus efectos farmacológicos ut il izando ratones

deficientes en el receptor A2A. (Artículo 5 en preparación)

Resultados

75

Cocaína Dice la leyenda que Pacha Mama (la madre tierra) regaló la hoja de coca al pueblo andino para que soport ase la t rist eza, el hambre y el dolor en t iempos de esclavit ud. “ La hoj a de coca da al pueblo andino la luz para la ment e, el al iment o para el cuerpo y el consuelo para el dolor. Pero ay del moment o en que el conquist ador blanco t oque la sagrada hoj a de coca porque solo encont rará en el la veneno para su cuerpo y locura para su ment e y cuando la coca int ent e luego ablandar su corazón, sólo lograra romperlo como los cristales de hielo demuelen montañas”.

Leyenda anónima

La cocaína, met iléster de benzoilecgonina, es un alcaloide que se ext rae de la hoj a de

coca (Erythroxylon Coca). Su uso como estimulante data del año 3000 a.C. y su consumo

ha permanecido hasta nuest ros días. Fue importada a Europa en 1580 y su principio

act ivo fue aislado en 1862 por Wöhler y Nieman (Karch, 199). Las propiedades

farmacológicas de la cocaína fueron invest igadas incluso por Sigmund Freud, quien

defendía sus propiedades curat ivas. Poco después, gracias a Louis Lewin, se puso de

manif iesto el potencial adict ivo de la cocaína. Sin embargo, tanto en Europa como en

Norteamérica se generalizó su uso como tónico y hasta 1902 la cocaína era un

compuesto de la conocida “ Coca-Cola” , así como lo había sido anteriormente del “ Vino

Mariani”.

La cocaína es un psicoest imulante con efectos euforizantes y sus efectos farmacológicos

son muy diversos. A dosis moderadas la cocaína incrementa la atención, provoca

sensación de bienestar y euforia, aumenta la energía y la act ividad motora y la

sensación de vigor. Además de sus propiedades como anestésico local, la cocaína puede

provocar vasoconstricción local y puede llegar a causar hipertensión, arritmias cardíacas

y convulsiones. La euforia provocada por la cocaína disminuye a medida que su consumo

se repite. En cont rapart ida aumenta la disforia provocada por la abst inencia. Este ciclo

se repite constantemente y provoca que el abuso potencial de la cocaína sea muy

elevado (Gawin y Ellinwood, 1998).

La cocaína actúa principalmente bloqueando el t ransportador de dopamina (DAT),

aunque también presenta af inidad por los t ransportadores de serotonina (SERT) y de

norepinefrina (NERT). Al bloquear la recaptación de monoaminas, sus niveles aumentan

en el SNC. Se ha demost rado que las propiedades reforzantes y la mot ivación por la

búsqueda compulsiva de los psicoest imulantes se deben sobre todo al aumento de

dopamina en áreas límbicas, en especial en las terminaciones localizadas en el NAc y

PFC (Chang y cols., 1994; Di Chiara e Imperato, 1988). Este aumento de dopamina se ha

relacionado t ípicamente con la sensación de euforia. Según el modelo alostát ico de la

adicción desarrollador por Koob y Le Moal (2001), tras el uso crónico de cocaína ocurren

cambios neuroadaptat ivos en el SNC para contarrestar los efectos producidos por dicha

droga. Estos cambios van creciendo con el consumo repet ido de la droga, modif icando

Resultados

76

el umbral de recompensa y produciendo un estado que consolida la cont inuidad del

consumo.

Resultados

77

Artículo 1

Lack of CB1 cannabinoid receptor impairs cocaine self-administration. Soria G,

Mendizábal V, Touriño C, Robledo P, Ledent C, Parmentier M, Maldonado R,

Valverde O. 2005 Neuropsychopharmacology. 30(9):1670-80.

OBJETIVOS

Estudiar la participación de los receptores cannabinoides CB1 en diferentes aspectos

del componente mot ivacional de la cocaína como la adquisición de una conducta

operante mantenida por infusiones int ravenosas de cocaína, su mantenimiento y la

mot ivación por la búsqueda de cocaína. Para ello se ut il izó la técnica de

autoadminist ración int ravenosa y el uso de diferente protocolos de refuerzo en

animales deficientes en el receptor CB1 y wild-type.

Invest igar los efectos de la cocaína sobre el sistema dopaminérgico mendiante la

técnica de microdiálisis in vivo para determinar los niveles ext racelulares de

dopamina en el NAc.

RESULTADOS

El 75% de los animales wild-type adquirió una conducta operante para la

autoadminist ración int ravenosa de cocaína (1 mg/ kg/ infusión), mient ras que en el

caso de los los animales deficientes en el receptor CB1 sólo un 25% adquirió dicha

conducta.

El máximo esfuerzo para obtener una infusión de cocaína realizado por los animales

CB1 knockout fue signif icat ivamente menor cuando se comparó con el grupo wild-

type.

El bloqueo farmacológico del receptor CB1 con rimonabant disminuyó el máximo

esfuerzo para obtener una infusión de cocaína

Se observó un aplanamiento de la curva dosis-respuesta de cocaína en el paradigma

de autoadministración en el grupo de ratones deficientes en el receptor CB1.

La administ ración aguda de cocaína induj o incrementos similares en los niveles

extracelulares de dopamina en el NAc de los animales de ambos genotipos.

http://www.nature.com/npp/journal/v30/n9/abs/1300707a.html;jsessionid=D9DD5D217D03CBA99BDC58979E52A458

Resultados

78

CONCLUSIÓN

Los receptores cannabinoides CB1 desempeñan un papel fundamental en los

procesos de consolidación de la mot ivación por la cocaína. Sin embargo, los

receptores cannabinoides CB1 no son requeridos para los efectos agudos de la

cocaína sobre la transmisión dopaminérgica en el NAc.

Olga Valverde

1

Lack of CB1 cannabinoid receptor impairs cocaine self-administration

Guadalupe Soria1, Victoria Mendizábal1, Clara Touriño1, Patricia Robledo1,2, Catherine

Ledent3, Marc Parmentier3, Rafael Maldonado1 and Olga Valverde1#

# To whom correspondence should be addressed: [email protected]

1 Laboratori de Neurofarmacologia, Departament de Ciències Experimentals i de la Salut,

Universitat Pompeu Fabra, C/Doctor Aiguader 80, 08003 Barcelona, Spain, Tel. 34935422831,

Fax. 34935422802

2 IMIM, Institut Municipal d´Investigacions Mèdiques, C/Doctor Aiguader 80, 08003

Barcelona, Spain

3 IRIBHM, Université Libre de Bruxelles, N-1070 Bruxelles, Belgium

Olga Valverde

2

Abstract

Acute rewarding properties are essential for the establishment of cocaine

addiction and multiple neurochemical processes participate in this complex behavior. In

the present study, we used the self-administration paradigm to evaluate the role of CB1

cannabinoid receptors in several aspects of cocaine reward, including acquisition,

maintenance and motivation to seek the drug. For this purpose, both CB1 receptor

knockout mice and wild-type littermates were trained to intravenously self-administer

cocaine under different schedules. Several cocaine training doses (0.32, 1 and 3.2

mg/kg/infusion) were used in the acquisition studies. Only 25% of CB1 knockout mice

versus 75% of their wild-type littermates acquired a reliable operant responding to self-

administer the most effective dose of cocaine (1 mg/kg/infusion), and the number of

sessions required to attain this behavior was increased in knockout mice. Animals

reaching the acquisition criteria were evaluated for the motivational strength of cocaine

as a reinforcer under a progressive ratio schedule. The maximal effort to obtain a

cocaine infusion was significantly reduced after the genetic ablation of CB1

receptors. A similar result was obtained after the pharmacological blockade of

CB1 receptors with SR141716A in wild-type mice. Moreover, the cocaine dose-

response curve was flattened in the knockout group suggesting that the differences

observed between genotypes were related to changes in the reinforcing efficacy of the

training dose of cocaine. Self-administration for water and food was not altered in CB1

knockout mice in any of the reinforcement schedules used, which emphasizes the

selective impairment of drug reinforcement in these knockout mice. Finally, cocaine

effects on mesolimbic dopaminergic transmission were evaluated by in vivo

microdialysis in these mice. Acute cocaine administration induced a similar

enhancement in the extracellular levels of dopamine in the nucleus accumbens of both

Olga Valverde

3

CB1 knockout and wild-type mice. This work clearly demonstrates that CB1 receptors

play an important role in the consolidation of cocaine reinforcement, although are not

required for its acute effects on mesolimbic dopaminergic transmission.

Keywords: CB1 cannabinoid receptor, self-administration, reinforcement, cocaine,

motivation, knockout, reward, in vivo microdialysis, dopamine, SR141716A.

Olga Valverde

4

Introduction

Adaptive changes occurring in different brain areas within the mesocorticolimbic

system during repeated drug exposure have been reported to play a crucial role in the

consolidation of an addictive behavior (Koob and LeMoal 2001; Nestler 2004). Among

these structures, the nucleus accumbens (NAc) and its dopaminergic input are

considered a common feature mediating the primary reinforcing effects of most drugs of

abuse (Di Chiara 1998). CB1 cannabinoid receptors are important modulators of

dopaminergic activity in the mesocorticolimbic system, suggesting that the endogenous

cannabinoid system may contribute to the addictive properties of different drugs of

abuse such as opioids, ethanol and nicotine. Thus, the pharmacological blockade of CB1

receptors with SR141716A attenuates morphine, heroin and nicotine self-administration

(Cohen et al. 2002; Caillé and Parsons 2003; Solinas et al. 2003) and inhibits ethanol

intake in rodents (Arnone et al. 1997; Freedland et al. 2001). Knockout mice lacking

CB1 cannabinoid receptor were generated and characterized (Ledent et al. 1999;

Zimmer et al. 1999). The prototypical effects of CB1 cannabinoid agonists such as

antinociception, reinforcement, hypothermia and hypolocomotion were absent in these

mice. Moreover, the rewarding properties of nicotine and morphine measured in the

conditioned place preference (CPP) and the self-administration paradigm are absent in

mice lacking CB1 receptors (Ledent et al. 1999; Martin et al. 2000; Cossu et al. 2001;

Castañé et al. 2002). The deletion of CB1 receptors not only abolishes WIN 55,212-2

self-administration (Ledent et al. 1999) but also attenuates oral ethanol self-

administration and acute alcohol- and morphine-induced dopamine (DA) release in the

NAc (Hungund et al. 2003; Mascia et al. 1999). However, several studies suggest that

CB1 cannabinoid receptors do not participate in the acute rewarding properties of

psychostimulants. Both acute cocaine self-administration performed during a single 30-

Olga Valverde

5

min session and cocaine-induced CPP were preserved in mice lacking CB1 receptors

(Martin et al. 2000; Cossu et al. 2001). On the other hand, CB1 cannabinoid receptor

stimulation by WIN 55,212-2 has been reported to decrease the rewarding effects of

cocaine in the brain self-stimulation paradigm in mice (Vlachou et al. 2003), whereas

the blockade of CB1 receptors by SR141716A decreased the reinforcing value of

intracranial self-stimulation in rats (Deroche-Gamonet et al. 2001), suggesting that the

endogenous cannabinoid system could modulate motivational states involved in reward

processes.

Although acute reinforcing properties are essential for the establishment of drug

addiction, other complex behavioral processes are crucial for the consolidation of this

chronic relapsing disorder (Koob and LeMoal 2001). Intravenous drug self-

administration is probably the most complete and reliable approach to investigate in

animals the abuse potential of drugs in humans. Different aspects of drug addiction can

be studied using this paradigm, including acquisition and maintenance of an operant

response to obtain a drug, extinction, reinstatement and relapse. In this sense, an

important role of the endocannabinoid system in the neuronal processes underlying

cocaine seeking behavior has been recently demonstrated. Thus, SR141716A attenuates

cocaine relapse induced by re-exposure to cocaine-associated cues or cocaine itself (De

Vries et al, 2001).

In view of these data, we used the operant self-administration procedure to

evaluate the role of CB1 receptors in different responses related to cocaine reinforcing

effects including acquisition and maintenance of self-administration behavior, and

motivation to seek the drug. For this purpose, both CB1 receptor knockout mice and

their wild-type littermates were trained to self-administer different doses of cocaine

(0.32, 1 and 3.2 mg/kg/infusion) using two schedules of reinforcement, namely fixed

Olga Valverde

6

ratio 1 (FR1) and progressive ratio (PR). These results were compared to the acquisition

of an operant behavior to obtain two natural rewarding stimuli, food and water. We also

used wild-type mice to examine the effect of the CB1 receptor antagonist,

SR141716A on cocaine self-administration under a PR schedule of reinforcement.

In addition, in vivo microdialysis studies were performed to assess if the acute effects of

cocaine on the extracellular levels of DA in the NAc were modified in these knockout

animals.

Olga Valverde

7

Materials and Methods

Animals

Male CB1 knockout mice and their wild-type littermates were used in all the

experiments. The generation of mice lacking CB1 cannabinoid receptor was described

previously by Ledent et al. (1999). In order to homogenize the genetic background of

the mice, the first generation heterozygotes were bred for 15 generations on a CD1

background (Charles River, France) with selection for the mutant CB1 gene at each

generation. The CB1 receptor knockout mice derived from the backcrossing of

chimeric CD1-CB1 receptor knockout mice developed by Ledent et al. (1999) with

wild-type CD1 females (Charles River, France). Beginning with the 15th generation

of backcrossed mice, heterozygote-heterozygote matings of CB1 knockout mice

produced wild-type and knockout littermates for subsequent experiments.

Breeding couples were periodically renovated by crossing heterozygote mice with

wild-type CD1 females (Charles River, France) in order to maintain a genetically

diverse outbred background. All mice used in the experiment were originated from

the same breeding and were matched for age and weight. Male wild-type CD1 mice

used in the SR141716A experiment were purchased from Charles River (France).

Mice weighed 25-30 g at the beginning of the experiment, and were housed

individually in a temperature (21 ± 1 ºC) and humidity (55 ± 10 %) controlled room. For

self-administration studies, mice were exposed to a 12 hours light:dark reversed cycle

(light on between 20:00 and 8:00h), and the experiments took place during the dark

phase. For microdialysis studies the light:dark cycle was light on between 8:00h and

20:00h, and the experiments took place during the light phase. Food and water were

available ad libitum during the cocaine self-administration and microdialysis

experiments, excepting during the exposure to the self-administration sessions. All

Olga Valverde

8

animal care and experimental procedures were conducted according to the guidelines of

the European Communities Directive 86/609/EEC regulating animal research and

approved by the local ethical committee (CEEA-IMAS-UPF).

Drugs

Cocaine hydrochloride was obtained from Ministerio Sanidad y Consumo

(Spain) and dissolved in sterile 0.9 % physiological saline. Ketamine hydrochloride

(100 mg/kg) (Imalgène 1000®, Rhône Mérieux, Lyon, France) and xylazine

hydrochloride (20 mg/kg) (Sigma Chemical Co., Madrid, Spain) were mixed and

dissolved in absolute ethanol and distilled water (1:9). The anesthetic mixture was

administered in an injection volume of 20 ml/kg body weight (i.p.). The selective CB1

receptor antagonist SR141716A (generously provided by Sanofi Recherche,

Montpellier, France) was dissolved in a solution of 10% ethanol, 10% cremophor

EL and 80% distilled water, and administered i.p. in a volume of 10 ml⁄ kg. All the

other substances employed were obtained from Sigma Chemical Co, Madrid, Spain.

Operant self-administration

Apparatus. The self-administration experiments were conducted in mouse operant

chambers (Model ENV-307A-CT, Medical Associates, Georgia, VT, USA) equipped

with two holes, one was selected as active hole for delivering the reinforcer and the

other as inactive hole. Nose-poking on the active hole resulted in a reinforcer (food

pellet, water or cocaine infusion) while nose-poking on the inactive hole had no

consequences. The chambers were housed in sound- and light-attenuated boxes

equipped with fans to provide ventilation and ambient noise. A removable food and

liquid dispenser equidistant between the two nose-pokes permitted delivery of food

Olga Valverde

9

pellets or water when required. A stimulus light, located above the active hole, was

paired contingently with the delivery of the reinforcer. The same operant chambers were

used for drug self-administration, except that drinking and food dippers were removed.

Food maintained behavior. Mice were deprived of food (3.5 g of food were provided

daily) during four days, in order to obtain 95 % of their initial weight. The same food

deprivation regime was maintained during the whole evaluation of food-maintained

operant behavior. Water was available ad libitum during this experimental phase. Four

days after starting food deprivation, mice were trained in the operant chambers to nose-

poke for food pellets (Noyes Precision Pellets, Research Diets. Inc., USA). One hour

daily self-administration sessions were conducted 6 days per week. The house light was

on at the beginning of the session for 3 sec and off during all the session. First, mice

were trained under a FR1 schedule of reinforcement. A 10 sec time-out period was

established after each reinforcement. During this 10 sec period, the cue light was off and

no reward was provided on the active hole. Responses on the inactive hole and all the

responses during the 10 sec time-out period were also recorded. The session was

terminated after 100 reinforcers were delivered or after 1 hour, whichever occurred first.

The criteria for the acquisition was achieved when mice maintained a stable responding

with less than 20 % deviation from the mean of the total number of reinforcers earned in

three consecutive sessions (80 % of stability), with at least 75% responding on the

active hole, and a minimum of 10 reinforcers per session. Once achieved the acquisition

criteria, the reinforcement schedule was changed to FR3 (data not shown). The same

criteria as above was used to move mice from FR3 to PR in which the response

requirement to earn an injection escalate according to the following serie: 1 - 2 - 3 - 5 -

12 - 18 - 27 - 40 - 60 - 90 - 135 - 200 - 300 - 450 - 675 - 1000. The PR session lasted for

Olga Valverde

10

2 hours or until mice did not complete the ratio for delivery of one reinforcer within 1

hour, and was performed only once. The breaking point to extinguish self-

administration behavior was determined in each animal. After each session, mice were

returned to their home-cages.

Water maintained behavior. Mice were first deprived of water (20 min of free water

were provided daily) during two days and this same water deprivation regime was

maintained during the whole evaluation of water-maintained operant behavior. Food

was available ad libitum during this experimental phase. Two days after starting water

deprivation, mice were trained in the operant chambers to nose-poke for water. Water

self-administration sessions were conducted as described above for food-maintained

responding, except that the food dispenser was changed for a liquid dipper and

responses were maintained by water delivered in 10 µl over 10 sec. First, mice were

trained under a FR1 schedule of reinforcement. A 20 sec time-out period was

established after each reinforcement. The session was terminated after 100 reinforcers

were delivered or after 1 hour whichever occurred first. When mice achieved the

acquisition criteria (see food maintained behavior), the reinforcement schedule was

changed to FR3 (data not shown). The same criteria as above was used to move mice

from FR3 to PR, as described above.

Surgery for drug self-administration study. Mice were anaesthetized under isoflurane

anaesthesia (1.5- 2.0 %) and then, implanted with indwelling i.v. Silastic catheters as

previously described (Caine et al. 1999) with minor modifications. Briefly, a 6 cm

length of silastic tubing (0.3 mm inner diameter, 0.6 mm outer diameter) (Silastic®,

Dow Corning, Houdeng-Goegnies, Belgium) was fitted to a 22 gauge steel cannula

Olga Valverde

11

(Semat, Herts, England) that was bent at a right angle and then embedded in a cement

disk (Dentalon Plus, Heraeus Kulzer, Germany) with an underlying nylon mesh. The

catheter tubing was inserted 1.3 cm into the right jugular vein and anchored with suture.

The remaining tubing run subcutaneously to the cannula, which exited at the

midscapular region. All incisions were sutured and coated with antibiotic ointment

(Bactroban, GlaxoSmithKline, Spain). After surgery, animals were allowed to recover

for 3 days prior to initiation of self-administration sessions. The catheter was flushed

daily with a saline solution containing heparin (30 UI/mL) in order to maintain its

patency. The patency of intravenous catheters was evaluated periodically

(approximately every 6 days) and whenever drug self-administration behavior appeared

to deviate dramatically from that observed previously, by the infusion of 0.1 ml of

tiobarbital (5mg/ml) through the catheter. If prominent signs of anesthesia were not

apparent within 3 sec of the infusion, the catheter was surgically removed, and a new

catheter was implanted in the opposite jugular vein using the surgical procedure

described above.

Drug self-administration procedure. Cocaine self-administration sessions were

conducted 3 days after surgery using the schedule described above for food and water

self-administration with the following exceptions. Responding was maintained by

cocaine (0.32, 1 and 3.2 mg/kg per injection) delivered in 23.5 µl over 2 sec. Cocaine

was infused via a syringe that was mounted on a microinfusion pump (PHM-100A,

Med-Associates, Georgia, VT, USA) and connected, via Tygon tubing (0.96 mm o.d.,

Portex Fine Bore Polythene Tubing, Portex Limited, Kent, England) to a single channel

liquid swivel (375/25, Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA, USA) and to the

mouse intravenous catheters. The swivel was mounted on a counter-balanced arm above

Olga Valverde

12

the operant chamber. Mice were trained to nose-poke in order to receive a cocaine

injection under a FR1 schedule of reinforcement. One hour daily self-administration

sessions started with a priming injection of the drug. The number of reinforcers was

limited to 50 infusions per session and each reinforcer was followed by a 30 sec time-

out period where active nose-poking had no consequences. The stimulus light signaled

delivery of the reinforcer. After mice achieved the acquisition criteria (80 % of stability

in three consecutive sessions, with at least 75% responding on the active hole, and a

minimum of 3 reinforcers per session), the reinforcement schedule was changed to PR,

as described above. For the dose response curve, new animals were operated and trained

to self-administer cocaine (1 mg/kg/infusion) under a FR1 schedule of reinforcement on

the same conditions as described before. After acquisition (same criteria as above), self-

administration of various doses of cocaine (0.032, 0.1, 0.32, 1, 3.2 mg/kg/infusion) was

tested during 2 hours using a Latin square design: a single dose was presented each

session, and the order of presentation was counterbalanced between mice.

In a second experiment, the effects of the CB1 receptor antagonist,

SR141716A on the motivational strength of cocaine as a reinforcer were evaluated

in wild-type mice by using a PR schedule. Mice were trained to self-administer

cocaine (1 mg/kg/inf) using the same acquisition criteria as above. After

acquisition, animals were pretreated with either vehicle or different doses of

SR141716A (0.3, 1 or 3 mg/kg, i.p.) 30 min before starting the different PR

sessions, performed as reported in the first experiment. A Latin square design was

used to evaluate the effect of the different doses of SR141716A in each animal. PR

sessions were performed once daily on subsequent days. The doses of SR141716A

were chosen considering the behavioral results previously reported with this

antagonist on cocaine self-administration in rats (De Vries et al. 2001).

Olga Valverde

13

Microdialysis procedure

Surgery and sample recollection. Mice were anesthetized with a ketamine/xylazine

mixture (0.2 ml/10g body weight i.p) and placed in a stereotaxic apparatus with a flat

skull (Paxinos and Franklin 1997). A small hole was drilled on the right side of the skull

and the cannula guide (CMA/7, CMA Microdialysis, Stockholm, Sweden) was

implanted vertically 1 mm above the NAc (AP: + 1.5 mm; ML: - 0.9 mm; DV: - 4.0 mm

from the bregma), and then fixed to the skull with dental cement. Three days after the

surgery, the analytical probe (CMA/7/1mm, CMA Microdialysis, Stockholm, Sweden)

was inserted into the guide cannula. Forty-eight hours after probe implantation, animals

were habituated to the experimental environment overnight. The following morning, a

ringer solution (147 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.3 CaCl2) was pumped through the dialysis

probe at a constant rate of 1 µl/min. Four consecutive 15-min dialysis samples were

then collected for determination of baseline DA levels. Animals then received an i.p.

injection of cocaine (20 mg/kg) and 12 samples were collected every 15 min and

analyzed by HPLC.

Dopamine determination. Dialysate samples (15 µl) were injected without any

purification into a HPLC apparatus that consisted of a pump linked to an automatic

injector (Agilent 1100, Barcelona, Spain), a reverse-phase column (Zorbax SB C18, 3.5

µm, 150 x 4.6 mm, Agilent Technologies, Barcelona, Spain) and a coulometric detector

(Coulochem II, ESA Inc., Chelmsford, USA) with a 5011 analytical cell to quantify

DA. The first electrode was fixed at -100 mV and the second electrode at + 300 mV.

The composition of the mobile phase was 50 mM NaH2PO4, 0.1 mM Na2EDTA, 0.65

mM octyl sodium sulfate and 14 % (vol / vol) methanol, pH 3.5.

Olga Valverde

14

Histology. At the end of the experiments, animals were sacrificed and brains were

quickly removed and stored at - 80 ºC. In order to check the position of the probe,

brains were cut using a cryostat in 20 µm serial sections, which were then processed

with Cresyl Violet and observed under a microscope. Only those animals that had been

implanted correctly were used in the study.

Statistical analysis

Two-way ANOVA, with hole (active or inactive) and genotype (knockout or

wild-type) as factors of variation, was calculated on the mean of nose-pokes performed

during the last 3 days required to reach the acquisition criteria. This statistical analysis

was performed for FR1 in food, water and cocaine self-administration experiments.

Subsequent one-way ANOVA were performed when required. The breaking point

values obtained on the PR schedule for food, water and cocaine self-administration were

compared between genotypes by calculating one-way ANOVA. Three-way ANOVA,

with hole (active or inactive) and genotype (knockout or wild-type) as between factors,

and time as within factor, was used to analyze the acquisition of cocaine self-

administration at different training doses. For the cocaine dose-response curve, the

number of infusions was compared by repeated measures two-way ANOVA (dose as

within subject factor and genotype as between subject factor). Subsequent one-way

ANOVA were made to calculate differences between genotypes in each dose. One-way

ANOVA repeated measures and subsequent Fisher post-hoc analysis were

performed to determine the effects of SR141716A on breaking point values.

Additionally, one-way ANOVA within subjects was performed to discard a day effect

in the two experiments using a Latin square design.

Olga Valverde

15

The microdialysis data were analyzed using three-way ANOVA with treatment

(saline and cocaine) and genotype (wild-type and knockouts) as between subject factors

and time after cocaine injection as within subject factor. Subsequent two-way ANOVA

were performed when required. Unpaired student t-test was employed to compare DA

basal level values between genotypes.

Olga Valverde

16

RESULTS

Food and water maintained behavior in wild-type and CB1 knockout mice

As shown in Figure 1a, nose-poke behavior maintained by food pellets was

acquired by both wild-type and CB1 knockout mice. All the wild-type and CB1

knockout mice reached the FR1 acquisition criteria in 6.5 ± 0.81 days and 10.33 ± 1.91

days respectively (F [1.10] = 3.422; n.s.). Both genotypes maintained active nose-poke

discrimination. Thus, two-way ANOVA showed in FR1 a main effect of nose-poke

discrimination (F [1.20] = 24.157; p < 0.01), and no effect of genotype (F [1.20] =

0.410; n.s) nor interaction between genotype and nose-poke (F [1.20] = 0.268; n.s).

Subsequent one-way ANOVA showed a significant nose-poke discrimination in wild-

type (F [1.10] = 18.370; p < 0.01) and knockout mice (F [1.10] = 8.080; p < 0.01). In

the case of PR schedule, one-way ANOVA did not reveal differences between the

breaking points obtained in wild-type and CB1 knockout groups (F [1.10] = 0.000; n.s.)

(Fig. 1b).

In order to have further information about operant responding for natural reward,

we also tested nose-poke behavior maintained by water delivery in water-deprived mice

(Fig 2). All the wild-type and knockout mice achieved the FR1 acquisition criteria in

6.14 ± 0.99 days and 5.00 ± 0.71 days respectively (F [1.10] = 0.749; n.s.). Both

genotypes maintained active nose-poke discrimination. Thus, two-way ANOVA

showed in FR1 a main effect of nose-poke discrimination (F [1.20] = 58.220; p < 0.01),

a main effect of genotype (F [1.20] = 7.022; p < 0.05) but no interaction between

genotype and nose-poke (F [1.20] = 1.401; n.s). Subsequent one-way ANOVA showed

a significant nose-poke discrimination in wild-type (F [1.12] = 31.241; p < 0.01) and

knockout mice (F [1.8] = 25.560; p < 0.01). In the PR schedule experiment, no

Olga Valverde

17

differences were found between the breaking points obtained for the wild-type and

knockout groups (F [1.10] = 0.032; n.s.) (Fig 2b).

Cocaine self-administration in CB1 wild-type and knockout mice

The effects of the CB1 receptor mutation on the reinforcing properties of

cocaine were evaluated by using the operant self-administration procedure. First, both

wild-type and knockout mice were trained to self-administer cocaine (0.32, 1 and 3.2

mg/kg/infusion) during 10 days under a FR1 schedule of reinforcement (Fig 3). At the

dose of 0.32 mg/kg/infusion, no reliable cocaine self-administration was observed since

the two groups of mice did not discriminate between the active and the inactive holes

(See table 1 for three-way ANOVA) (Fig 3a). The percentage of mice that reached the

acquisition criteria was 11% for wild-type and 13% for knockout mice. At the dose of 1

mg/kg/infusion, only the wild-type mice were able to significantly maintain a reliable

cocaine self-administration during the whole period (See table 1 for three-way

ANOVA) (Fig 3b). The percentage of mice that reached the acquisition criteria was

75% for wild-type and 25% for knockout mice. Subsequent one-way ANOVA revealed

that only wild-type mice discriminated between the active and the inactive holes after

the second day. At the dose of 3.2 mg/kg/infusion, mice significantly maintained a

reliable cocaine self-administration. However, in the case of knockout mice cocaine

consumption was under a mean of 3 infusions per hour, being this the reason to fail

the achievement of the acquisition criteria (See table 1 for three-way ANOVA).

Subsequent one-way ANOVA revealed that wild-type mice discriminated between the

active and the inactive holes after the third day and knockout mice after the eighth day

(Fig 3c). The percentage of mice that reached the acquisition criteria was 87.5% for

wild-type mice and 0% for knockout mice.

Olga Valverde

18

The dose of 1 mg/kg/infusion of cocaine was the most effective to enhance the

number of nose-pokes in the active hole in wild-type mice. The highest percentage of

knockout mice reaching the acquisition criteria was also obtained with this dose.

Therefore, 1 mg/kg/infusion of cocaine was chosen to train mice for the PR and the

dose-response curve experiments. At this dose, wild-type mice achieved the FR1

stability criteria in 6.11 ± 0.94 days, while knockout mice spent 10.22 ± 1.53 days for

reaching this criteria (F [1.17] = 6.043; p < 0.05). As shown in Fig. 4a, cocaine intake

during the three days reaching the stability criteria was similar in knockout mice and

wild-type littermates. Thus, two-way ANOVA revealed a main effect of nose-poke (F

[1.320] = 37.464; p < 0.01), no effect of genotype (F [1.32] = 3.135; n.s.), nor

interaction between these two factors (F [1.32] = 4.055; n.s.). Subsequent one-way

ANOVA showed a significant nose-poke discrimination in wild-type (F [1.16] =

23.899; p < 0.01) and knockout mice (F [1.16] = 13.699; p < 0.01). In the case of PR

schedule, the breaking point values were significantly reduced in mice lacking the CB1

cannabinoid receptor when compared to wild-type littermates (F [1.14] = 8.675; p <

0.05) (Fig. 4b).

As shown in Figure 5, a bell shaped dose-response curve was obtained when

different doses of cocaine were tested in wild-type mice, while a flattening of this dose-

response curve was observed in the knockout group. Two-way ANOVA with repeated

measures revealed a main effect of the treatment (F [4.52] = 9.139; p < 0.01), genotype

(F [1.13] = 22.405; p < 0.01) and interaction between these two factors (F [4.52] =

4.938; p < 0.01). One-way ANOVA for treatment revealed a significant dose-response

effect in wild-type (F [4.34] = 4.131; p < 0.01) but not in knockout mice (F [4.39] =

0.818; n.s.). One-way ANOVA for genotype revealed significant differences at the

doses of 0.032 (F [1.14] = 22.932; p < 0.01), 0.1 (F [1.14] = 15.729; p < 0.01), 0.32 (F

Olga Valverde

19

[1.14] = 10.123; p < 0.01), 1 (F [1.14] = 11.994; p < 0.01) and 3.2 mg/kg/infusion (F

[1.14] = 7.034; p < 0.05). One-way ANOVA revealed no effect of the day in the Latin

square design (F [4.56] = 0.399; n.s.).

Effect of SR141716A on breaking points achieved under PR schedule

A new group of wild-type mice was trained to self-administer cocaine under

a FR 1 schedule of reinforcement using the previously described acquisition

criteria. Thus, mice that reached the acquisition criteria (9.17 ± 0.65 days) clearly

discriminated between the active and the inactive holes (F [1.11] = 92.898; p <

0.01), and had 16.56 ± 1.62 as average of responses in the three days required to

achieve this criteria. As shown in Figure 6, the maximal effort to obtain a cocaine

infusion under a PR schedule of reinforcement was decreased when mice were

previously treated with SR141716A. Thus, one way-ANOVA with repeated

measures revealed a dose-dependent effect of SR141716A (F [3.15] = 5.303; p <

0.01). Subsequent post-hoc comparisons showed differences with the doses of 1 (p <

0.05) and 3 mg/kg (p < 0.05) were compared with vehicle.

Dopamine levels in the nucleus accumbens in CB1 wild-type and knockout mice

Figure 7 shows a representative coronal section of the mouse brain with the

placement of the microdialysis probe through the NAc. Most of the probes were located

medial to the anterior commissure, between 1.78 and 1.34 mm from bregma, and dorsal

to the olfactory tubercule.

Basal levels of DA in NAc dialysates were similar in wild-type (5.63 ± 0.89

pg/15µl) and CB1 cannabinoid receptor knockout mice (3.93 ± 0.61 pg/15µl) (t = 0.124;

n.s.). As shown in Fig. 8, cocaine administration (20 mg/kg, i.p.) increased DA in NAc

Olga Valverde

20

dialysates of both wild-type and CΒ1 knockout mice. The maximal increase of DA

elicited by cocaine in the NAc of CB1 knockout mice (260%) did not differ

significantly from that of wild-type mice (240%), and occurred in both groups from 15

to 30 min after cocaine administration. Three-way ANOVA revealed a significant main

effect of time following cocaine injection (F [11, 176] = 10.907; p < 0.01), treatment (F

[1, 16] = 238.256; p < 0.01) and no effect of genotype (F [1, 16] = 0.029; n.s.). An

interaction between time following cocaine injection and treatment was observed (F [11,

176] = 5.226; p < 0.01). No other significant two- or three-way interactions among

factors were observed.

Olga Valverde

21

Discussion

This work demonstrates for the first time that CB1 cannabinoid receptors play an

important role in the acquisition and maintenance of cocaine self-administration. The

present findings suggest a lack of motivation to seek the drug in CB1 knockout mice

since, first, only 25% of CB1 knockout mice acquired a reliable operant responding to

self-administer cocaine (1 mg/kg/infusion), second, the time required for reaching the

acquisition criteria was significantly increased in knockout mice, third, the maximal

effort required to obtain a cocaine infusion was significantly reduced after the genetic

ablation of CB1 receptors. A similar result was obtained after the pharmacological

blockade of these receptors with SR141716A in wild-type mice. However, acute

cocaine administration induced a similar enhancement of the DA extracellular levels in

the NAc in wild-type and CB1 knockout mice.

CB1 receptors have been involved in learning and memory processes (Reibaud

et al. 1999; Martin et al. 2002; Varvel and Litchman 2002). However, the impairment to

self-administer cocaine in these knockout mice does not seem to be the consequence of

a learning and memory alteration. Indeed, self-administration for natural rewarding

stimuli, such as water and food, was not altered in any of the reinforcement schedules

used. This result shows first, that CB1 knockout mice are able to learn an operant self-

administration behavior and, second, that CB1 receptors do not control the acquisition

and maintenance of an operant responding for natural rewards. These findings are in

line with recent studies showing that separate neuronal circuits exist in the NAc that

encode information related to cocaine versus natural (food/water) reinforcement.

(Carelli et al. 2003).

When mice were trained to self-administer different doses of cocaine, a low

percentage of CB1 knockout mice (25%) achieved the acquisition criteria only at the

Olga Valverde

22

dose of 1 mg/kg/infusion, whereas wild-type mice efficiently reached the acquisition

criteria at the dose of 1 mg/kg/infusion (75%) and 3.2 mg/kg/infusion (87.5%).

Additionally, knockout mice required a longer training period than their wild-type

littermates to reach this criteria. These results are in contrast with a previous study

showing that cocaine self-administration was not impaired in CB1 knockout mice under

an acute reinforcing paradigm (Cossu et al. 2001). More likely, this apparent

disagreement could be due to the different experimental conditions employed. In the

previous work, mice with restrained mobility received cocaine (0.1 mg/kg/infusion)

when a nose-poke response was performed during a single 30-min session. Our

conditions consisted of freely moving animals chronically receiving 1 hour self-

administration sessions of cocaine at different training doses (0.32, 1 and 3.2

mg/kg/infusion) during several days. Interestingly, those wild-type and knockout mice

that achieved the acquisition criteria (wild-type: 75%; knockout: 25%) showed similar

cocaine intake during the first self-administration session (wild-type: 8.88 ± 1.39;

knockout: 6.33 ± 1.49) and also during the first 30 min of this session (wild-type: 4.63 ±

0.98; knockout: 4.00 ± 0.90). However, the knockout group showed a lower cocaine

intake than wild-type in the first self-administration session mice when considering all

the animals exposed to this paradigm. The present methodological approach allows to

evaluate a complex behavioral response in which the acute reinforcing effects of the

drug are only the first step for the acquisition of a stable operant self-administration

responding. Under these conditions, our results suggest that CB1 receptors are largely

involved in the acquisition of cocaine self-administration. In agreement, a recent study

using the intracranial self-stimulation paradigm showed that CB1 receptor stimulation

decreases the rewarding effects of cocaine (Deroche-Gamonet et al. 2001).

Olga Valverde

23

Only the animals that did acquire cocaine self-administration were tested in the

PR schedule. Both the breaking points achieved and, consequently, the cocaine intake in

this schedule were lower in CB1 knockout mice in comparison with wild-type animals.

Accordingly, the cocaine dose-response curve was flattened in the knockout group. The

possibility that these differences could be due to changes in sensitivity and/or tolerance

to the reinforcing effects of cocaine can be ruled out since knockout mice were unable

to self-administer cocaine either at a lower (0.32 mg/kg/infusion) or higher (3.2

mg/kg/infusion) training dose of cocaine. These findings agree with the recent proposal

that CB1 receptors could play a major role in the determination of the hedonic value of

sucrose and saccharine, two palatable reinforcers (Sanchís-Segura et al. 2004). In order

to discard the possible influence of compensatory changes in CB1 knockout mice in

the impairment observed in cocaine self-administration, we evaluated the effects

induced by the CB1 receptor antagonist SR141716A on cocaine self-administration

in wild-type mice. Mice pretreated with SR141716A (1 and 3 mg/kg) showed a

clear decrease on the breaking points to obtain cocaine under a PR schedule. This

result confirms the findings obtained on CB1 knockout mice and suggests that the

behavioral alterations observed in these animals were a direct consequence of CB1

receptors deletion. Previous studies have demonstrated that SR141716A attenuates

relapse induced by re-exposure to cocaine-associated cues or cocaine itself in rats,

in spite of the absence of effects of this CB1 antagonist on the acquisition of cocaine

self-administration (De Vries et al, 2001). Hence, the impairment in cocaine self-

administration found in these knockout mice could be explained as a lower motivation

for maintaining a constant cocaine intake, suggesting a role for CB1 cannabinoid

receptors in the consolidation of an addictive process to this psychostimulant drug.

Olga Valverde

24

Increases in DA extracellular levels in the NAc have been related to the primary

reinforcing effects of prototypical drugs of abuse, including psychostimulants (Di

Chiara 1998). The present in vivo microdialysis data indicating that cocaine effects in

DA extracellular levels in the NAc were not modified in CB1 knockout mice discard the

possibility that the decrease of cocaine self-administration in mutants was due to an

impaired dopamine release in the NAc, as reported with other drugs of abuse in CB1

knockout mice (Hungund et al. 2003). In addition, these results are in agreement with

our previous behavioral results showing the capability of cocaine to induce CPP in CB1

receptor knockout mice (Martin et al. 2000). Moreover, neuroanatomical data reported

the absence of CB1 receptor mRNA and protein in dopaminergic neurons in the ventral

tegmental area, suggesting that cannabinoids do not exert a direct control on DA release

in the NAc (Herkenham et al. 1991; Matsuda et al. 1993). Instead, post-synaptic

interactions between DA D2 receptors and anandamide have been proposed as the

basis for endocannabinoid modulation of dopaminergic transmission (Giuffrida et

al. 1999). Accordingly, there is increasing evidence supporting that cannabinoids may

release DA by disinhibiting dopaminergic cells via inhibition of GABAergic signaling

from medium spiny neurons (Van der Stelt and Di Marzo 2003). Accordingly, the

ability of cocaine to increase anandamide and to inhibit, via D2-like receptors,

GABA transmission was partially prevented following blockade of CB1

cannabinoid receptors (Centonze et al. 2004). Therefore, as observed in the present

study, the acute effects of cocaine on DA release, which are mainly produced through

inhibition of the DA transporter at the level of the NAc (Giros et al. 1996), would not be

expected to change in CB1 cannabinoid receptor knockout mice. The fact that cocaine

produced similar increases in DA concentrations in both genotypes is difficult to

reconcile with the claim that cocaine functions as a less efficacious reinforcer in the

Olga Valverde

25

knockout group. However, there are other examples in the literature showing that either

genetic or pharmacological approaches can induce profound differences in the self

administration behavior without modifying extracellular levels of DA in the Nac

(Chiamulera et al. 2001; Caillé and Parsons 2003). Moreover, independent DA neuronal

circuits have been also proposed to be involved in the regulation of the reward-related

processes (Lupica et al. 2004).

The mesolimbic dopaminergic system, particularly the NAc, has been largely

implicated in the reinforcing properties of most drugs of abuse and natural reward

(Koob and LeMoal 2001; Nestler 2004). Thus, lesions of the NAc impairs cocaine self-

administration (Zito et al. 1985; Ito et al. 2004) suggesting that this limbic structure

plays an essential role in cocaine reinforcement. However, lesions of several brain

structures such as the basolateral amygdala, the medial prefrontal cortex ot the

haippocampus have also been reported to modify cocaine self-administration (Whitelaw

al. 1996; Weissenborn et al. 1997; Chambers and Self 2002), indicating the participation

of these structures in cocaine-seeking behavior. Since CB1 cannabinoid receptors are

highly expressed in basolateral amygdala, medial prefrontal cortex and hippocampus, a

possible explanation for our results could be that the lack of CB1 receptors in these

brain structures interfered with cocaine-seeking behavior. Cannabinoid system has also

been related to neuronal processes underlying reinstatement of cocaine seeking

behavior. Thus, the CB1 cannabinoid agonist HU-210 provokes relapse to cocaine

seeking after prolonged withdrawal periods, and the antagonist SR141716A attenuates

this response induced by re-exposure to cocaine-associated cues or cocaine itself (De

Vries et al. 2001).

In summary, the present study provides further evidence for the role played by

the endocannabinoid system as a common neurobiological substrate underlying drug

Olga Valverde

26

addictive processes. Indeed, mice lacking CB1 cannabinoid receptor failed to maintain a

reliable operant responding for self-administer cocaine although cocaine-induced CPP

(Martin et al. 2000) and DA release in the NAc were preserved in these knockout mice.

This finding supports the hypothesis that cocaine acute rewarding properties are not

enough to develop an addictive behavior and provides evidence for a role of the

endocannabinoid system in the acquisition and consolidation of cocaine addiction. The

lack of motivation for cocaine observed in CB1 knockout mice could be due not only to

the reduction of its reinforcing efficacy, but also to impaired detection, association and

representation of the reward signal or to inadequate responding to the rewarding stimuli.

The endocannabinoid system seems to modulate cocaine addiction through neuronal

circuits different from its acute effects on DA activity in the NAc, which is a prominent

substrate for drug rewarding effects.

Olga Valverde

27

Acknowledgements

This study was supported by grants from Spanish MCYT (SAF 2001/0745) and

(GEN2003-20651-C06-04), HFSP (RG007/200-B), Generalitat de Catalunya (Distinció

de la Generalitat and 2002SGR00193), Redes del Instituto de Salud Carlos III (C03/06

and G03/005) and European Communities QLRT 2001-01691. CT is a fellowship from

DURSI (Generalitat de Catalunya). PR is a researcher supported by FIS Programme.

VM is a fellow supported by Fundación Carolina.

Olga Valverde

28

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Olga Valverde

34

Figure Legends

Fig. 1 Food self-administration in CB1 knockout (KO) and wild-type mice (WT).

(a) Average of the number of nose-pokes in both the active and the inactive holes made

in the three consecutive sessions (1 hour each) required to achieve the acquisition

criteria in FR1 schedule of reinforcement. WT mice required 6.5 ± 0.81 days to

achieve this criteria, whereas KO mice required 10.33 ± 1.91 days. (b) Breaking

point achieved in PR schedule. Data are expressed as mean ± SEM (n = 8 per group).

P < 0.01 comparison between holes (one-way ANOVA).

Fig. 2 Water self-administration in CB1 knockout (KO) and wild-type mice (WT).

(a) Average of the number of nose-pokes in both the active and the inactive holes made

in the three consecutive sessions (1 hour each) required to achieve the acquisition

criteria in FR1 schedule of reinforcement. WT mice required 6.14 ± 0.99 days to

achieve this criteria, whereas KO mice required 5.00 ± 0.71 days. (b) Breaking point

achieved in PR schedule. Data are expressed as mean ± SEM (n = 7-8 per group).

P < 0.01 comparison between holes (one-way ANOVA).

Fig. 3 Acquisition of cocaine self-administration in CB1 knockout (KO) and wild-

type mice (WT). Number of nose-pokes in both the active hole and the inactive holes

in 1 hour session at (a) 0.32 mg/kg/infusion during 7 days, (b) 1 mg/kg/infusion during

10 days and (c) 3.2 mg/kg/infusion during 10 days. Data are expressed as mean ± SEM

(n = 7-13 per group). P < 0.05; P < 0.01 comparison between either holes (one-

way ANOVA).

Olga Valverde

35

Fig. 4 Cocaine self-administration (1 mg/kg/infusion) in CB1 knockout (KO) and

wild-type mice (WT). (a) Average of the number of nose-pokes in both the active and

the inactive holes made in the three consecutive sessions (1 hour each) required to

achieve the acquisition criteria in FR1 schedule of reinforcement. (b) Breaking point

achieved in PR schedule. Data are expressed as mean ± SEM (n = 8-9 per group). P

< 0.05; P < 0.01 comparison between either holes or genotypes (one-way

ANOVA).

Fig. 5 Cocaine dose-response curve in CB1 knockout and wild-type mice. Number

of infusions during the two-hour self-administration session performed at different

doses of cocaine. Data are expressed as mean ± SEM (n = 8 per group). P < 0.01

comparison between genotypes (one-way ANOVA).

Fig. 6 Effects of SR141716A (0.3, 1 and 3 mg/kg, i.p.) on the breaking points

achieved under PR schedule. Data are expressed as mean ± SEM (n = 6). P <

0.05; P < 0.01 comparison with vehicle treatment (Fisher post-hoc test).

Fig. 7 (a) Representative coronal section (20 µm) of the mouse brain stained with

Cresyl Violet illustrating the placement of the probe in the nucleus accumbens (bregma

+ 1.34 mm). (b) Diagram showing among bregma + 1.78 and + 1.34 mm the placement

of the probes in all the mice included in the experiment.

Fig. 8 Effects of cocaine (20 mg/kg, i.p.) and saline on DA concentrations in dialysates

obtained by in vivo microdialysis from the NAc of either CB1 cannabinoid receptor

knockout and wild-type mice. Arrow indicates cocaine or saline administration at time

Olga Valverde

36

0. Dialysate samples were taken every 15 min during 1 h before, and 3 h following

injection. ○ cocaine-treated wild-type mice; ● cocaine-treated knockout mice; △

saline-treated wild-type mice; ▲ saline-treated knockout mice. All values are expressed

as mean ± S.E.M. (n = 4-5 per group).

Olga Valverde

37

Table 1. Three-way ANOVA of cocaine self-administration time-course at different training doses.

Three-way ANOVA repeated measures with hole (H) and genotype (G) as between subject factors and day (D) as within subject factor. See Materials and Methods for details.

0.32 mg/kg/infusion 1 mg/kg/infusion 3.2 mg/kg/infusion

F-value p -value F-value p -value F-value p -value

Day F(6.222) = 7.078 0.001 F(9.252) = 5.164 0.001 F(9.216) = 8.303 0.001 Hole F(1.37) = 59.22 n.s. F(1.28) = 16.161 0.001 F(1.24) = 33.452 0.001 Genotype F(1.37) = 9.48 n.s. F(1.28) = 13.336 0.01 F(1.24) = 19.469 0.001 DxH F(6.222) = 0.233 n.s. F(9.252) = 2.107 0.05 F(9.216) = 4.365 0.001 DxG F(6.222) = 0.535 n.s. F(9.252) = 1.743 n.s. F(9.216) = 0.476 n.s. HxG F(1.37) = 0.97 0.05 F(1.28) = 4.924 0.05 F(1.24) = 5.547 0.05 DxHxG F(6.222) =1.309 n.s. F(9.252) = 0.681 n.s. F(9.216) = 1.924 0.05

Table 1. Three-way ANOVA of cocaine self-administration time-course at different training doses.

Three-way ANOVA repeated measures with hole (H) and genotype (G) as between subject factors and day (D) as within subject factor. See Materials and Methods for details.

0.32 mg/kg/infusion 1 mg/kg/infusion 3.2 mg/kg/infusion

F-value p -value F-value p -value F-value p -value

Day F(6.222) = 7.078 0.001 F(9.252) = 5.164 0.001 F(9.216) = 8.303 0.001 Hole F(1.37) = 59.22 n.s. F(1.28) = 16.161 0.001 F(1.24) = 33.452 0.001 Genotype F(1.37) = 9.48 n.s. F(1.28) = 13.336 0.01 F(1.24) = 19.469 0.001 DxH F(6.222) = 0.233 n.s. F(9.252) = 2.107 0.05 F(9.216) = 4.365 0.001 DxG F(6.222) = 0.535 n.s. F(9.252) = 1.743 n.s. F(9.216) = 0.476 n.s. HxG F(1.37) = 0.97 0.05 F(1.28) = 4.924 0.05 F(1.24) = 5.547 0.05 DxHxG F(6.222) =1.309 n.s. F(9.252) = 0.681 n.s. F(9.216) = 1.924 0.05

Resultados

91

Artículo 2

The Lack of A(2A) Adenosine Receptors Diminishes the Reinforcing Efficacy of

Cocaine. Soria G, Castañé A, Ledent C, Parmentier M, Maldonado R, Valverde O.

2005 Neuropsychopharmacology. 31(5):978-87.

OBJETIVOS

Estudiar la part icipación de los receptores de adenosina A2A en las propiedades

adict ivas de la cocaína. Para ello se evaluaron diferentes respuestas

comportamentales inducidas por cocaína en animales deficientes en el receptor A2A

knockout y wild-type.

Evaluar los efectos agudos de la cocaína sobre la act ividad locomotora y la

sensibilización a estos efectos tras un tratamiento crónico.

Invest igar el efecto reforzante de la cocaína en un paradigma de condicionamiento

espacial y de autoadministración intravenosa.

RESULTADOS

Los animales deficientes en el receptor de adenosina A2A fueron capaces de adquirir

y mantener una conducta operante mantenida por infusiones int ravenosas de

cocaína, pero el consumo de la misma fue signif icat ivamente menor que el de los

animales wild-type.

El máximo esfuerzo para obtener una infusión de cocaína realizado por los animales

A2A knockout fue significativamente menor en comparación con el grupo wild-type.

La curva dosis respuesta de cocaína en los animales A2A knockout most ró una

desviación vertical respecto a la de los animales wild-type.

La sensibilización a los efectos locomotores y el condicionamiento espacial

producidos por cocaína fueron similares en los animales wild-type y A2A knockout.

CONCLUSIÓN

La ef icacia reforzante de la cocaína está regulada por los receptores de adenosina

A2A participando de esta manera en las propiedades adictivas de dicha droga.

http://www.nature.com/npp/journal/v31/n5/abs/1300876a.html

Resultados

92

Los sust ratos neurobiológicos que regulan la sensibilización de los efectos

locomotores de la cocaína no son idént icos a los que regulan sus propiedades

reforzantes en un paradigma de condicionamiento operante.

Olga Valverde

1

The lack of A2A adenosine receptors diminishes the reinforcing efficacy

of cocaine

Guadalupe Soria1, Anna Castañé1, Catherine Ledent2, Marc Parmentier2, Rafael

Maldonado1 and Olga Valverde1#

# To whom correspondence should be addressed: [email protected] 1 Laboratori de Neurofarmacologia, Departament de Ciències Experimentals i de la

Salut, Universitat Pompeu Fabra, C/Doctor Aiguader 80, 08003 Barcelona, Spain 2 IRIBHM, Université Libre de Bruxelles, N-1070 Bruxelles, Belgium

Olga Valverde

2

Abstract

Adenosine is an endogenous purine nucleoside which acts as a neuromodulator

in the central nervous system. A2A adenosine and D2 dopamine receptors are co-

localized in the same neurons in discrete brain areas, and the dopaminergic transmission

plays a crucial role in the addictive properties of drugs of abuse, such as cocaine. In the

present study, we have investigated the specific role of A2A adenosine receptors in

cocaine-induced behavioral responses related to its addictive properties. For this

purpose, we have evaluated the acute locomotor effects produced by cocaine and the

development of locomotor sensitization by repeated cocaine administration. In addition,

we have also examined cocaine acute rewarding properties by using the conditioned

place preference. Finally, we used the intravenous drug self-administration paradigm to

investigate the acquisition of an operant response maintained by cocaine self-

administration and the reinforcing efficacy of the drug in these knockout animals. Acute

cocaine induced a similar increase of locomotor activity in mice lacking A2A adenosine

receptors and wild-type littermates. Cocaine-induced locomotor sensitization and

conditioned place preference were also maintained in A2A knockout mice. Nevertheless,

these knockout mice showed a lower rate of cocaine self-administration than wild-type

mice in both fixed ratio 1 and 3 schedules of reinforcement. Moreover, a reduction in

the maximal effort to obtain a cocaine infusion was found in A2A knockout mice under a

progressive ratio schedule. In addition, a vertical-shift of the cocaine dose-response

curve was observed in mice lacking A2A adenosine receptors in comparison with wild-

type littermates. Our study demonstrates that A2A adenosine receptors play an important

role in cocaine addictive properties, and these receptors seem to be required to develop

the addictive effects of this drug.

Olga Valverde

3

Keywords: mouse, knockout, cocaine reinforcement, self-administration, conditioned

place preference, reward, sensitization, A2A adenosine receptors.

Olga Valverde

4

Introduction

Adenosine is an endogenous purine nucleoside which acts as a neuromodulator

in the central nervous system (CNS). The physiological effects of adenosine are

produced through the activation of four receptor types: A1, A2A, A2B and A3. A2A

adenosine receptors are found at high concentrations in the olfactory tubercle, the

striatum and the nucleus accumbens (Nac) (Moreau et al, 1999). In the striatum, A2A

adenosine receptors are particularly expressed in the GABAergic striatopallidal neurons

where they are co-localized with D2 dopamine receptors (Ferré et al, 1997). Adenosine

regulates dopamine transmission through antagonistic interactions between adenosine

A1/dopamine D1 receptors and adenosine A2A/dopamine D2 receptors (Franco et al,

2000). Dopaminergic transmission in the mesocorticolimbic system plays a crucial role

in the modulation of reward related process (Koob, 1996; Di Chiara, 2002), as well as in

the addictive properties of drugs of abuse.

There is evidence to support a role for adenosine in mediating different

responses induced by several drugs of abuse such as opioids, cannabinoids and

psychostimulants. Thus, adenosine agonists inhibit the expression of morphine

withdrawal while adenosine antagonists increase the incidence of withdrawal signs

(Kaplan and Sears, 1996; Salem and Hope, 1997). In agreement, mice lacking A2A

adenosine receptors showed an increased morphine withdrawal in comparison with

wild-type mice (Berrendero et al, 2003). On the other hand, we have recently shown

that A2A knockout mice exhibited a significant reduction of THC-induced rewarding

and aversive effects, as well as rimonabant-precipitated THC withdrawal syndrome

(Soria et al, 2004). However, there are controversial results about the possible

involvement of A2A adenosine receptors in the reinforcing effects induced by

psychostimulant drugs. It has been demonstrated that the A2A receptor antagonist 3, 7-

Olga Valverde

5

dimethyl-1-propargylxanthine (DMPX) and the non selective adenosine antagonist

caffeine decreased cocaine-induced-conditioned place preference in rats (Poleszak and

Malec, 2002), and that the A2 agonist 5'-N-ethylcarboxamido-adenosine (NECA)

reduced cocaine self-administration in rats (Knapp et al, 2001). A role for adenosine in

reinstatement of cocaine-seeking behavior has been also suggested since caffeine and

CGS15943 reinstated this behavior (Weerts and Griffiths, 2003). In addition, the

selective A2A receptor agonist CGS21680 attenuated the rewarding impact of brain

stimulation whereas the A2 adenosine antagonist DMPX reversed the reward

impairment produced by cocaine withdrawal (Baldo et al, 1999). Furthermore,

CGS21680 also potentiated the discriminative-stimulus actions of cocaine as shown by

the leftward shift of the cocaine dose-response curve (Justinova et al, 2003). Therefore,

the specific role of A2A adenosine receptors in the processes underlying cocaine

addiction remains unclear.

The generation of A2A receptor knockout mice with complete and specific

inactivation of the A2A receptor (Ledent et al, 1997) provides a useful genetic model to

clarify the role of A2A receptors on cocaine pharmacological responses in vivo. The aim

of the present study was to investigate the specific role of A2A adenosine receptors in

cocaine-induced behavioral responses related to its addictive properties. For this

purpose, we have evaluated the acute locomotor effects produced by cocaine and the

development of locomotor sensitization by repeated cocaine administration. In addition,

we have also examined cocaine acute rewarding properties by using the conditioned

place preference. Finally, we used the intravenous drug self-administration paradigm in

order to evaluate the acquisition of an operant response maintained by cocaine self-

administration and the reinforcing efficacy of the drug in these knockout animals.

Olga Valverde

6


Animals

Mice lacking A2A adenosine receptors were generated as previously reported

(Ledent et al, 1997). In order to homogenize the genetic background of the mice, the

first generation heterozygotes were bred for 30 generations on a CD1 background

(Charles River, France) with selection for the mutant A2A gene at each generation. The

A2A receptor knockout mice derived from the backcrossing of chimeric CD1-A2A

receptor knockout mice developed by Ledent et al, (1997) with wild-type CD1 females

(Charles River, France). Beginning with the 30th generation of backcrossed mice,

heterozygote-heterozygote matings of A2A knockout mice produced wild-type and

knockout littermates for subsequent experiments. Breeding couples were periodically

renovated by crossing heterozygote mice with wild-type CD1 females (Charles River,

France) in order to maintain a genetically diverse outbred background.

Fourteen weeks old A2A knockout mice and wild-type littermates (30-35 g) were

housed five per cage in temperature (21 ± 1ºC) and humidity (55 ± 10%) controlled

rooms, with a 12-h light/12-h dark cycle (light between 8:00 AM and 8:00 PM). For the

self-administration study mice were exposed to a 12 hours light:dark reversed cycle

(light on between 8:00 PM and 8:00 AM), and the experiments took place during the

dark phase. Food and water were available ad libitum during all experiments except

during the exposure to the different behavioural paradigms. Mice were handled for one

week before starting the experiments.

Animal procedures were conducted in accordance with the guidelines of the

European Communities Directive 86/609/EEC regulating animal research and approved

by the local ethical committee (CEEA-IMAS-UPF). All experiments were performed

under blind conditions.

Olga Valverde

7

Drugs

Cocaine hydrochloride was obtained from Ministerio Sanidad y Consumo

(Spain) and dissolved in sterile 0.9 % physiological saline.

Locomotor effects induced by cocaine

Locomotor activity responses induced by an acute injection of cocaine (5, 10 and

20 mg/kg, i.p.) or vehicle were evaluated by using locomotor activity boxes (9 x 20 x 11

cm) (Imetronic, Bordeaux, France). The boxes were provided with two lines of 14

photocells each, one 2 cm above the floor to measure horizontal activity, and the other

located 6 cm above the floor to measure vertical activity (rears), in a low luminosity

environment (5 lux). Mice were habituated to the locomotor cages during 10 min for 3

consecutive days. On the day 4, mice were placed in the locomotor activity boxes

immediately after cocaine (5, 10 and 20 mg/kg, i.p.) or vehicle injection, and their

locomotor activity was recorded during 10 min. Locomotor activity was measured as

number of beam breaks, and two different measures were evaluated: directional or

ambulatory movements and small local movements.

“Context-specific” sensitization to the locomotor responses induced by chronic

cocaine treatment. Mice treated with 10 mg/kg of cocaine or saline on the acute test,

received chronically the same treatment during the following 12 days. These animals

received cocaine (10 mg/kg, i.p.) or vehicle once daily and were then immediately

confined into the locomotor activity boxes to record locomotion during 10 min. After

finishing chronic cocaine administration on day 12, mice remained without any

treatment from day 13 to 18. On day 19, animals received a challenge of cocaine (10

mg/kg, i.p.) or vehicle and locomotor activity was measured for 10 min in order to

Olga Valverde

8

evaluate the sensitization maintenance. On day 20, all the mice received a saline

injection and locomotor activity was evaluated again for 10 min. As above, locomotor

activity was measured as number of beam breaks, and two different measures were

evaluated: directional or ambulatory movements and small local movements.

Cocaine-induced conditioned place preference

The acute rewarding properties of cocaine (5, 10 and 20 mg/kg, i.p.) were

measured using a place conditioning paradigm. The apparatus consisted of two main

square conditioning compartments (15 x 15 x 15 cm), with differences in visual and

tactile cues, separated by a triangular central area (Maldonado et al, 1997). The light

intensity within the conditioning chambers was 30 lux. During the pre-conditioning

phase, drug-naive mice were placed in the middle of the central area and had free access

to both compartments of the apparatus for 18 min. The time spent in each compartment

was recorded by computerized monitoring software (Smart; Panlab, Barcelone, Spain).

During the conditioning phase, mice received alternating injections of cocaine (5, 10 or

20 mg/kg) or vehicle and were immediately confined into one of the two conditioning

compartments during 20 min. Three pairings were performed with cocaine and three

pairings with vehicle on alternate days. Treatments were counterbalanced as closely as

possible between compartments. Control animals received vehicle every day. The post-

conditioning phase was conducted exactly as the pre-conditioning phase, i.e. free access

to each compartment for 18 min. A score value was calculated for each mouse as the

difference between times spent in the drug-paired compartment during the post-

conditioning and pre-conditioning phases.

Olga Valverde

9

Cocaine maintained operant self-administration

Apparatus. The self-administration experiments were conducted in mouse

operant chambers (Model ENV-307A-CT, Medical Associates, Georgia, VT, USA)

equipped with two holes, one was selected as active hole for delivering the reinforcer

and the other as inactive hole. Nose-poking on the active hole resulted in a reinforcer

(cocaine infusion) while nose-poking on the inactive hole had no consequences. The

chambers were housed in sound- and light-attenuated boxes equipped with fans to

provide ventilation and white noise. A stimulus light, located above the active hole, was

paired contingently with the delivery of the reinforcer.

Surgery for drug self-administration study. Mice were anaesthetized under

isoflurane anaesthesia (1.5-2.0 %) and then, implanted with indwelling i.v. silastic

catheters as previously described (Caine et al, 1999) with minor modifications. Briefly,

a 6 cm length of silastic tubing (0.3 mm inner diameter, 0.6 mm outer diameter)

(Silastic®, Dow Corning, Houdeng-Goegnies, Belgium) was fitted to a 22 gauge steel

cannula (Semat, Herts, England) that was bent at a right angle and then embedded in a

cement disk (Dentalon Plus, Heraeus Kulzer, Germany) with an underlying nylon mesh.

The catheter tubing was inserted 1.3 cm into the right jugular vein and anchored with

suture. The remaining tubing run subcutaneously to the cannula, which exited at the

midscapular region. All incisions were sutured and coated with antibiotic ointment

(Bactroban, GlaxoSmithKline, Spain). After surgery, animals were allowed to recover

for 3 days prior to initiation of self-administration sessions. The catheter was flushed

daily with a saline solution containing heparin (30 UI/mL) in order to maintain its

patency. The patency of intravenous catheters was evaluated periodically

(approximately every 6 days) and whenever drug self-administration behavior appeared

to deviate dramatically from that observed previously, by the infusion of 0.1 ml of

Olga Valverde

10

tiobarbital (5mg/ml) through the catheter. If prominent signs of anesthesia were not

apparent within 3 sec of the infusion, the mouse was removed from the experiment.

Drug self-administration procedure. Cocaine self-administration sessions were

performed as previously described (Soria et al, 2005). Briefly, sessions started 3 days

after surgery. Responding was maintained by cocaine (1 mg/kg per injection) delivered

in 23.5 µl over 2 sec. Cocaine was infused via a syringe that was mounted on a

microinfusion pump (PHM-100A, Med-Associates, Georgia, VT, USA) and connected,

via Tygon tubing (0.96 mm o.d., Portex Fine Bore Polythene Tubing, Portex Limited,

Kent, England) to a single channel liquid swivel (375/25, Instech Laboratories,

Plymouth Meeting, PA, USA) and to the mouse intravenous catheters. The swivel was

mounted on a counter-balanced arm above the operant chamber. One hour daily self-

administration sessions were conducted 6 days per week. The house light was on at the

beginning of the session for 3 sec and off during the remaining time of the session. Each

daily session started with a priming injection of the drug. First, mice were trained under

a fixed ratio 1 (FR1) schedule of reinforcement. A 30 sec time-out period was

established after each reinforcement. During this 30 sec period, the cue light was off and

no reward was provided on the active hole. Responses on the inactive hole and all the

responses during the 30 sec time-out period were also recorded. The session was

terminated after 50 reinforcers were delivered or after 1 hour, whichever occurred first.

The stimulus light signaled delivery of the reinforcer. The criteria for the acquisition

was achieved when mice maintained a stable responding with less than 20% deviation

from the mean of the total number of reinforcers earned in three consecutive sessions

(80% of stability), with at least 75% responding on the active hole, and a minimum of

10 reinforcers per session. Once achieved the acquisition criteria, the reinforcement

schedule was changed to fixed ratio 3 (FR3). The same criteria as above was used to

Olga Valverde

11

move mice from FR3 to a progressive ratio (PR) schedule in which the response

requirement to earn an injection escalate according to the following serie: 1 - 2 - 3 - 5 -

12 - 18 - 27 - 40 - 60 - 90 - 135 - 200 - 300 - 450 - 675 - 1000. The PR session lasted for

2 hours or until mice did not complete the ratio for delivery of one reinforcer within 1

hour, and was performed only once. The breaking point to extinguish self-

administration behavior was determined in each animal. After each session, mice were

returned to their home-cages.

A cocaine dose response curve was performed in new group of naive animals

which were operated and trained to self-administer cocaine (1 mg/kg/infusion) under a

FR1 schedule of reinforcement on the same conditions as described before. After

acquisition (same criteria as above), self-administration of various doses of cocaine

(0.032, 0.1, 0.32, 1, 3.2 mg/kg/infusion) was tested during 2 hours using a Latin square

design: a single dose was presented each session, and the order of presentation was

counterbalanced between mice.


Acute effects of cocaine administration and cocaine-induced conditioned place

preference scores were compared by using two-way ANOVA (genotype and treatment

as factors of variation) between subjects, followed by one-way ANOVA and Tukey

post-hoc test when required. Data of sensitization study were compared by using three-

way ANOVA (genotype and treatment as between factors and day as within-group

factor of variation). Tukey post-hoc test were made when required. For cocaine

maintained operant responding, two-way ANOVA was calculated on the mean of nose-

pokes performed during the last 3 days required to reach the stability criteria, with hole

(active vs inactive) and genotype (knockout vs wild-type) as factors of variation. This

Olga Valverde

12

statistical analysis was performed for FR1 and FR3 schedules of reinforcement in

cocaine operant responding experiments. One-way ANOVA and Dunnet post-hoc test

were made when required. The breaking point values obtained on the PR schedule for

cocaine self-administration were compared by calculating Mann-Whitney U test

between genotypes. For the cocaine dose-response curve, the number of infusions was

compared by repeated measures two-way ANOVA (dose as within subject factor and

genotype as between subject factor). Subsequent one-way ANOVA were made to

calculate differences between genotypes at each dose. Additionally, one-way ANOVA

within subjects was performed to discard a day effect for the Latin square design in the

dose-response curve Differences were considered significant if the probability of error

was less than 5%.

Olga Valverde

13

Results

Acute locomotor effects induced by cocaine

On days 1, 2 and 3, animals were exposed to the locomotor activity boxes in

order to be habituated to the test environment (data not shown). Acute cocaine

administration (5, 10 and 20 mg/kg) increased ambulatory movements in a dose-

dependent manner in both genotypes, as shown in figure 1a. Two-way ANOVA

and subsequent one-way ANOVA are shown in table 1. Post-hoc analysis revealed

a significant increase in locomotor activity in cocaine-treated wild-type mice at the

doses of 10 (p < 0.01) and 20 mg/kg (p < 0.01) compared to saline-treated mice.

Similarly, cocaine-treated knockout mice showed a significant increase in

locomotor activity at the doses of 10 (p < 0.05) and 20 mg/kg (p < 0.01) compared to

saline-treated mice (Figure 1a).

Acute cocaine administration (5, 10 and 20 mg/kg) also increased local small

movements in a dose-dependent manner in both genotypes, as shown in figure 1b.

Two-way ANOVA and subsequent one-way ANOVA are shown in table 1. Post-

hoc analysis revealed a significant increase in local small movements in cocaine-

treated wild-type mice at the doses of 10 (p < 0.01) and 20 mg/kg (p < 0.01)

compared to saline-treated animals. Similarly, cocaine-treated knockout mice

increased local small movements at the doses of 5 (p < 0.05) and 10 mg/kg (p <

0.01) compared to saline-treated animals (Figure 1b).

Sensitization to the locomotor responses induced by chronic cocaine treatment

Chronic cocaine treatment induced a sensitization to its locomotor effects in both

genotypes as shown in figure 2a. Three-way ANOVA is shown in Table 2. Subsequent

post-hoc analysis showed significant differences between day 1 and days 19 (p = 0.05)

Olga Valverde

14

and 20 (p < 0.05) in cocaine-treated wild-type mice. Significant differences were also

observed between day 1 and day 19 (p = 0.05) in cocaine-treated knockout mice

(Figure 2a).

Three-way ANOVA calculated for small local movements is shown in Table 2.

Subsequent post-hoc analysis showed significant differences between day 1 and 20 (p <

0.01) in cocaine-treated wild-type mice. (Figure 2b).

Cocaine-induced conditioned place preference

Acute rewarding responses induced by cocaine were investigated in A2A

knockout and wild-type mice using the place conditioning paradigm. A similar

conditioned place preference was observed in wild-type and knockout mice treated with

cocaine (5, 10 and 20 mg/kg) (Figure 3). Indeed, two-way ANOVA revealed a

significant effect of cocaine treatment (F [3.123] =12.637; p < 0.01), but not effect of

genotype (F [1.123] =0.233; n.s.) nor interaction between these two factors (F [3.123] =

0.399; n.s.). Subsequent one-way ANOVA calculated for each genotype to compare

treatment effects in each dose showed significant effect in both wild-type (F [3.64] =

5.553; p < 0.01) and knockout (F [3.64] = 7.081; p < 0.01) mice. Post-hoc analysis

revealed significant differences between saline- and cocaine-treated mice at doses of 5,

10 and 20 mg/kg in both genotypes (p < 0.01 for all the cases) (Figure 3).

Cocaine maintained operant self-administration

The effects of the A2A receptor mutation on the reinforcing properties of cocaine

were evaluated by using the operant self-administration procedure. Nose-poke behavior

maintained by cocaine infusions (1 mg/kg/infusion) was acquired by both wild-type

(86%) and A2A knockout (76.9%) mice. Knockout mice reached the acquisition criteria

Olga Valverde

15

faster than wild-type mice (7.8 ± 0.88 days and 4.4 ± 0.57 days, respectively) (F [1.13]

= 10.601; p < 0.01). Despite the fact that A2A knockout mice showed a lower cocaine

intake (F [1.13] = 9.227; p < 0.01), both genotypes maintained active nose-poke

preference during the whole experiment, as shown in figure 4a. Thus, two-way ANOVA

showed in FR1 a significant effect of nose-poke preference (F [1.24] = 50.231; p <

0.01), genotype (F [1.24] = 4.692; p < 0.05) and interaction between genotype and nose-

poke (F [1.24] = 12.481; p < 0.01). Nose-poke responding by cocaine in FR3 schedule

of reinforcement was maintained by both genotypes, with a clear preference for the

active vs the inactive nose-poke, and no differences between genotypes in the time spent

to reach the FR3 criteria (F [1.13] = 0.038; n.s.). However, cocaine intake was again

reduced in knockouts in comparison with wild-type mice (F [1.13] = 10.912; p < 0.01).

Two-way ANOVA showed a significant effect of nose-poke (F [1.24] = 50.305; p <

0.01), genotype (F [1.24] = 10.925; p < 0.01) and interaction between these two factors

(F [1.24] = 10.474; p < 0.01). Subsequent one-way ANOVA revealed significant

preference for the active vs the inactive nose-poke in wild-type during FR1 (F [1.13] =

35.801; p < 0.01) and FR3 (F [1.13] = 32.203; p < 0.01) schedules of reinforcement, and

also in A2A knockout mice during FR1 (F [1.13] = 14.872; p < 0.01) and FR3 (F [1.13]

= 21.643; p < 0.01) schedules of reinforcement. The infusion pattern of the cocaine self-

administration sessions was also evaluated (Figure 4b). A regular and consistent

pattern of response was observed in both wild-type and A2A knockout mice during the

whole duration of the self-administration session, which excludes a possible random

nose-poking behavior. In the case of PR schedule, the breaking point values were

significantly reduced in mice lacking the A2A adenosine receptor when compared to

wild-type littermates (Mann-Whitney U test, p < 0.01) (Figure 4c). A limit of two hours

was established to terminate the PR session in both wild-type and knockout mice. The

Olga Valverde

16

decreased breaking point values observed in knockout mice were not due to the relative

short time period of the PR session since the analysis of infusion patterns revealed that

most of the knockout mice stopped nose-poking before than wild-type animals (data not

shown). Furthermore, 43% of knockout mice showed an inter-infusion interval longer

than 1 hour while this pattern was not observed in any of wild-type mice.

As shown in Figure 5a, a bell shaped dose-response curve was obtained when

different doses of cocaine were tested in wild-type and in A2A knockout mice.

Nevertheless, a vertical-shift of this dose-response curve was observed in the knockout

group. Two-way ANOVA with repeated measures revealed a main effect of the dose (F

[4.40] = 11.552; p < 0.01), genotype (F [1.10] = 11.882; p < 0.01), but no interaction

between these two factors (F [4.40] = 1.607; n.s.). One-way ANOVA for genotype

revealed significant differences at the doses of 0.032 (F [1.11] = 9.012; p < 0.05), 0.1 (F

[1.11] = 7.592; p < 0.05) and 1 (F [1.11] = 12.024; p < 0.01). One-way ANOVA

revealed no effect of the day in the Latin square design (F [4.59] = 0.534; n.s.). Figure

5b shows the total cocaine intake received when different doses were tested. Two-way

ANOVA revealed main effects of genotype (F [1.50] = 12.627; p < 0.01), dose (F [4.50]

= 22.174; p < 0.01), but no interaction between these two factors (F [4.50] = 2.408;

n.s.). One-way ANOVA revealed significant differences between genotypes at the

doses of 0.032 (p < 0.01), 0.1 (p < 0.01) and 1 mg/kg (p < 0.01).

Olga Valverde

17

Discussion

The present study demonstrates the involvement of A2A adenosine receptors in

the addictive properties of cocaine. Mice lacking A2A adenosine receptors showed a

decreased rate of self-administration and motivation for cocaine, as well as reduced

efficacy of cocaine reinforcing effects. Nevertheless, the increased locomotor activity

produced by an acute injection of cocaine, the development of locomotor sensitization

by repeated cocaine administration and cocaine-induced conditioned place preference

were maintained in these A2A knockout mice.

Deletion of A2A adenosine receptors did not modify acute effects induced by

cocaine. Thus, acute cocaine (5, 10 and 20 mg/kg)-induced hyperlocomotion was

similar in wild-type and knockout mice, suggesting that A2A adenosine receptors do not

mediate these acute effects of cocaine. Our data also confirm the hypolocomotor

phenotype described in A2A knockout mice (Ledent et al, 1997) since locomotor basal

activity of knockout mice was decreased versus wild-type littermates. However, this

hypolocomotion did not impair the acute effects induced by cocaine administration. On

the other hand, a similar locomotor sensitization was observed when A2A adenosine

receptors knockout mice and wild-type littermates were chronically treated with cocaine

(10 mg/kg). In contrast, other authors have shown that locomotor responses to acute

cocaine administration were attenuated in mice lacking A2A receptors (Chen et al,

2000). In addition, a recent study demonstrates that conditional A2A knockout mice

showed no sensitization to locomotor effects of amphetamine (Bastia et al, 2004).

Although the discrepancies between these findings could be due to the different genetic

background used to generate each line of A2A knockout mice, C57Bl/6 vs CD1, the

different experimental conditions employed in each study could probably better explain

this divergence. Indeed, locomotor activity was measured during a longer period in the

Olga Valverde

18

previous studies (120-480 min) whereas a the 10 min period was used in the present

work. Repeated drug exposure is known to induce sensitization to its behavioral

stimulant effects (Koob, 1996; Vanderschuren and Kalivas, 2000). The

mesocorticolimbic dopaminergic system has been proposed as the neural substrate

underlying this phenomenon (Kalivas et al, 1992), which is also involved in the

reinforcing properties of all drugs of abuse (Koob and LeMoal, 2001; Nestler, 2004).

Locomotor sensitization has been proposed to reflect the increase of the expectation or

“wanting” for drug reward produced by the repeated exposure to drugs of abuse and that

would be the result of increasing the basic responsiveness of dopaminergic neurons to

stimuli (Robinson and Berridge, 1993). The locomotor activity displayed by animals in

a novel environment has been positively correlated with the sensitivity to both the

locomotor and reinforcing effects of psychostimulants such as cocaine (Piazza et al,

1989; Hooks et al, 1991a, b). In the present study, A2A knockout mice showed similar

acute cocaine locomotor effects and cocaine-induced locomotor sensitization than wild-

types, although cocaine self-administration behavior was different in both genotypes,

suggesting separate neuronal substrates for these behavioral responses induced by

cocaine.

Acute rewarding properties of cocaine were indirectly evaluated by using the

place conditioning procedure. Mice lacking A2A adenosine receptors showed similar

conditioned place preference to different doses of cocaine (5, 10 and 20 mg/kg) than

wild-type littermates. In agreement with this result, the amount of cocaine self-

administered in the first session of the operant self-administration paradigm was similar

in both wild-type (9.69 ± 1.70 mg/kg) and knockout mice (11.08 ± 2.03 mg/kg).

Although acute rewarding effects are important to initiate the drug addictive process,

Olga Valverde

19

other factors are also needed to develop this complex behavior (Koob and LeMoal,

2001).

A2A adenosine receptor knockout mice acquired an operant behavior maintained

by intravenous cocaine infusions and showed a reliable cocaine self-administration.

However, the cocaine intake under FR1 and FR3 schedules was significantly lower in

A2A knockout mice comparing with wild-type littermates (40%-50% approximately).

This result is in agreement with the reduction in the maximal effort required to obtain a

cocaine infusion in A2A knockout mice under a PR schedule of reinforcement. In animal

drug self-administration studies, response rates usually show an inverted U-shaped

function of drug dose where rate of responding is inversely related to the injection dose

(Meisch and Lemaire, 1993). In the present study, typical inverted U-shaped dose-

response curves were obtained in both wild-type and A2A knockout mice. The

possibility that A2A knockout mice would experience increased reinforcing effects of

cocaine, and therefore a reduction in cocaine-self-administration, can be ruled out since

knockout mice did not show a leftward shift in the dose-response curve. Indeed, the

vertical shift obtained indicates a difference in the efficacy, but not in the potency of the

reinforcing effects of cocaine. In agreement, A2A adenosine knockout mice showed a

decreased breaking point in the PR schedule and did not exhibit a higher sensitivity to

cocaine-induced behavioral effects in the other models evaluated (locomotion,

sensitization and CPP). There is evidence showing that vertical shifts in self-

administration dose-response curve predict a drug-vulnerable phenotype predisposed to

addiction (Piazza et al, 2000). Thus, it could be hypothesized that A2A knockout mice

represent a low-vulnerable phenotype to cocaine addiction and the lack of A2A

adenosine receptors could provide resistance against the addictive properties of cocaine.

The lower reinforcing efficacy of cocaine found in A2A adenosine knockout mice that

Olga Valverde

20

have acquired a stable cocaine self-administration behavior was not due to an

impairment of the acute rewarding properties of cocaine since cocaine-induced

conditioned place preference and the cocaine intake in the first session of the self-

administration paradigm were not modified in these knockouts. Differences in

conditioned place preference and self-administration results are not surprising since the

behavior responses evaluated in these two paradigms are not equivalent. While

conditioned place preference evaluates the expression of indirect reward, self-

administration paradigm is used to directly study the reinforcing effects of a drug.

Adenosine and its receptors have been involved in learning and memory

processes (de Mendoça and Ribeiro, 1997; Svenningsson et al, 1999; Hauber and

Baireiss, 2001; Justinova et al, 2003). However, the lower rate of cocaine self-

administration found in A2A knockout mice does not appear to be a consequence of

learning impairment since operant responding for food is maintained in these animals

(Soria et al, 2004). In addition, A2A adenosine receptor knockout mice achieved the FR1

acquisition criteria for cocaine self-administration faster than wild-type littermates (7.8

± 0.88 days and 4.4 ± 0.57 days respectively). Moreover, the similar results obtained on

cocaine-induced conditioned place preference in both genotypes also support a normal

learning and memory response in these knockout mice.

Dopamine D2-like receptors are known to be particularly important in mediating

the abuse-related effects of cocaine (Caine et al, 2002). Adenosine A2A receptors are co-

localized with dopamine D2 receptors in striatopallidal GABAergic neurons and

stimulation of A2A adenosine receptors decreases the affinity of D2-dopamine receptors

(Ferré et al, 1997). Our study do not show this antagonistic interaction since the

reinforcing efficacy of cocaine was diminished in A2A knockout mice. However, other

indirect interactions between A2A and D2 receptors have been also reported at

Olga Valverde

21

intracellular levels, which may account to explain our results. DARPP-32, a

downstream effector molecule of D2-like receptors, has been reported to play an

important role in mediating the pharmacological effects of a variety of drugs of abuse

(Nairn et al, 2004). In this sense, mice lacking DARPP-32 showed attenuated

conditioned place preference to cocaine without involving alteration of dopamine

release or reuptake (Zachariou et al, 2002). DARPP-32 phosphorylation could also be

directly regulated by A2A adenosine receptors (Svenningsson et al, 2004). Dopamine D1

receptors are also involved in cocaine effects (Hummel and Unterwald, 2002). In this

sense, D1 and A2A adenosine receptors have an additive effect on DARPP-32

phosphorylation (Svenningsson et al, 2004), raising the possibility that D1 receptors

could compensate the consequences of the absence of A2A on intracellular signals

implicated in cocaine reward. On the other hand, extracellular signal-regulated kinase

(ERK) pathway activation has been involved in synaptic plasticity related to long-term

effects of psychoestimulants addiction (Valjent et al, 2000; 2003). More recently, the

control of ERK pathway by DARPP-32 in the shell of the Nac has been demonstrated,

suggesting a critical role for DARPP-32 in long-term effects of psychostimulants

(Valjent et al, 2005). Interestingly, DARPP-32 has been reported to be altered in mice

lacking A2A adenosine receptors (Svenningsson et al, 2000). Therefore, a possible

explanation for our findings could be that intracellular cascades downstream of

dopamine release could be impaired in mice lacking A2A adenosine receptors producing

an alteration in the brain reward function. Thus, recent studies reported the existence of

a synergy between A2 and D2 dopamine receptors in protein kinase A signaling

mediated by βγ dimmers of G-proteins (Yao et al, 2002, 2003). Therefore, this synergy

might be absent in A2A knockout mice, which would have a negative effect in drug

reinforcement properties.

Olga Valverde

22

In conclusion, the present study demonstrates the important role played by A2A

adenosine receptors in cocaine addictive properties, as revealed by the decreased rate of

self-administration and motivation for cocaine, and the lower efficacy of cocaine

reinforcing effects found in mice lacking A2A adenosine receptors. However, acute

locomotor effects of cocaine, repeated cocaine-induced locomotor sensitization and

conditioned place preference were preserved in these animals. These findings support

the hypothesis that separate neuronal substrates mediate cocaine-induced locomotor

effects and the self-administration in an operant behavior paradigm Therefore,

pharmacological manipulation of these receptors may be a possible target in the

treatment of cocaine addiction.

Olga Valverde

23

Acknowledgements

This study was supported by grants from Spanish MCYT (SAF 2001/0745)

(SAF 2004/568) and (GEN2003-20651-C06-04), HFSP (RG007/200-B), Redes del

Instituto de Salud Carlos III (C03/06 and G03/005) and European Communities

(NEWMOOD OJ2003/C164-05166). GS is a fellowship from Spanish MCYT. AC is a

fellowship from DURSI (Generalitat de Catalunya).

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Olga Valverde

30

in mice lacking the protein phosphatase 1 inhibitors DARPP 32 or Inhibitor 1. Biol

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Olga Valverde

31

Figure legends

Figure 1. Acute locomotor effects induced by cocaine in A2A knockout and wild-

type mice. Mice were exposed to the locomotor activity boxes immediately after

cocaine injection (0, 5, 10 and 20 mg/kg, i.p.). Measurements of (a) ambulatory

movements and (b) local small movements were performed during 10 min. Data are

expressed as mean ± SEM of the percentage of increase versus last day of habituation (n

= 16 for each group). White columns represent wild-type mice and black columns

represent A2A adenosine receptor knockout mice. Stars over the bars mean differences

versus vehicle group. P < 0.05; P < 0.01 (Tukey post-hoc test).

Figure 2. Locomotor sensitization to the effects induced by chronic cocaine

administration in A2A knockout and wild-type mice. Mice received chronic cocaine

during 12 days and were exposed to the locomotor activity boxes immediately after the

injection (10 mg/kg, i.p.). Mice remained without any treatment from day 13 to 18. On

day 19, animals received a challenge of cocaine (10 mg/kg, i.p.) or vehicle and

locomotor activity was measured in order to evaluate the sensitization maintenance. On

day 20, all the mice received a saline injection and locomotor activity was evaluated

again. Figure 2 shows locomotor activity on days 1, 12, 19 and 20. Measurements of (a)

ambulatory movements and (b) local small movements were performed during 10 min.

Data are expressed as mean ± SEM of the percentage of increase versus last day of

habituation (n = 15-16). White columns represent saline treated mice and black columns

represent cocaine treated mice. P ≤ 0.05 (Tukey post-hoc test cocaine-treated group

versus day 1).

Olga Valverde

32

Figure 3. Cocaine (5, 10 and 20 mg/kg, i.p.)-induced conditioned place preference

in A2A knockout and wild-type mice. Results are expressed as mean ± SEM of the

place preference score, calculated as the time spent in the drug-paired compartment on

the test day minus the time spent in the same compartment on the pre-conditioning day.

Wild-type (WT) vehicle (n = 25), knockout (KO) vehicle (n = 25), WT cocaine 5 mg/kg

(n = 10), KO cocaine 5 mg/kg (n = 10), WT cocaine 10 mg/kg (n = 11), KO cocaine 10

mg/kg (n = 11), WT cocaine 20 mg/kg (n = 20), KO cocaine 20 mg/kg (n = 19). P

< 0.01 versus vehicle (Dunnet test).

Figure 4. Cocaine self-administration (1 mg/kg/infusion) in A2A knockout and wild-

type mice. (a) Average of the number of nose-pokes in both the active and the inactive

holes made in the three consecutive sessions (1 hour each) required to achieve the

acquisition criteria in FR1 and FR3 schedule of reinforcement. (b) Patterns of cocaine

self-administration in FR1 and FR3 schedules of reinforcement in A2A knockout (KO)

and wild-type (WT) mice. Each vertical line represents a cocaine infusion (1

mg/kg/infusion). (c) Breaking points achieved in PR schedule. Data are expressed as

mean ± SEM (n = 7 per group). P < 0.05; P < 0.01 comparison between either

holes (one-way ANOVA). ☆☆ P < 0.01 comparison between genotypes (one-way

ANOVA).

Fig. 5 Cocaine self-administration (0.032, 0.1, 0.32, 1 and 3.2 mg/kg/infusion) dose-

response curve in A2A knockout and wild-type mice. (a) Number of infusions during

the two-hour self-administration session performed at different doses of cocaine (see

material and methods for details). (b) Cocaine intake (mg/kg) received per session in the

Olga Valverde

33

dose-response curve. Data are expressed as mean ± SEM (n = 6 per group). ☆ P < 0.05;

☆☆ P < 0.01 comparison between genotypes (one-way ANOVA).

Olga Valverde

34

Table 1. Two-way and one-way ANOVAs for acute locomotor effects induced by cocaine in A2A knockout mice (ambulatory movements and local small movements).

Two-way ANOVA with treatment and genotype as factors of variations, and subsequent one-way ANOVA for treatment effect in each genotype. See material and methods for details.

Ambulatory movements Local small movements

F-value P-value F-value P-value

Two-way ANOVA Genotype (G) F 1,108 = 1.412 n.s. F 1,107 = 6.127 P< 0.01 Treatment (T) F 3,108 = 19.122 P< 0.01 F 3,107 = 10.024 P< 0.01 G x T F 1,108 = 0.567 n.s. F 3.107 = 1.984 n.s. One-way ANOVA for treatment effect Wild-type F 3,52 = 11.070 P< 0.01 F 3,51 = 6.824 P< 0.01 Knockout F 3,55 = 8.974 P< 0.01 F 3,55 = 5.109 P< 0.01

Olga Valverde

35

Table 2. Three-way ANOVA for locomotor effects of chronic cocaine treatment in A2A knockout mice (ambulatory movements and local small movements).

Three-way ANOVA with treatment and genotype (between subjects) and day (within subjects) as factors of variations. See material and methods for details.


F-value P-value F-value P-value Genotype (G) F 1,48 = 2.915 n.s. F 1,48 = 11.051 P< 0.01 Treatment (T) F 1,48 = 53.635 P< 0.01 F 1,48 = 28.075 P< 0.01 Day (D) F 4,192 = 27.406 P< 0.01 F 4,192 = 15.247 P< 0.01 G x T F 1,48 = 0.317 n.s. F 1,48 = 0.518 n.s. G x D F 3,48 = 0.774 n.s. F 4,192 = 1.219 n.s. T x D F 4,192 = 29.167 P< 0.01 F 4,192 = 26.787 P< 0.01 G x T x D F 4,192 = 0.341 n.s. F 4,192 = 1.243 n.s.

Table 1. Two-way and one-way ANOVAs for acute locomotor effects induced by cocaine in A2A knockout mice (ambulatory movements and local small movements).

Two-way ANOVA with treatment and genotype as factors of variations, and subsequent one-way ANOVA for treatment effect in each genotype. See material and methods for details.


F-value P-value F-value P-value

Two-way ANOVA Genotype (G) F 1,108 = 1.412 n.s. F 1,107 = 6.127 P< 0.01 Treatment (T) F 3,108 = 19.122 P< 0.01 F 3,107 = 10.024 P< 0.01 G x T F 1,108 = 0.567 n.s. F 3.107 = 1.984 n.s. One-way ANOVA for treatment effect Wild-type F 3,52 = 11.070 P< 0.01 F 3,51 = 6.824 P< 0.01 Knockout F 3,55 = 8.974 P< 0.01 F 3,55 = 5.109 P< 0.01

Table 2. Three-way ANOVA for locomotor effects of chronic cocaine treatment in A2A knockout mice (ambulatory movements and local small movements).

Three-way ANOVA with treatment and genotype (between subjects) and day (within subjects) as factors of

variations. See material and methods for details.


F-value P-value F-value P-value Genotype (G) F 1,48 = 2.915 n.s. F 1,48 = 11.051 P< 0.01 Treatment (T) F 1,48 = 53.635 P< 0.01 F 1,48 = 28.075 P< 0.01 Day (D) F 4,192 = 27.406 P< 0.01 F 4,192 = 15.247 P< 0.01 G x T F 1,48 = 0.317 n.s. F 1,48 = 0.518 n.s. G x D F 3,48 = 0.774 n.s. F 4,192 = 1.219 n.s. T x D F 4,192 = 29.167 P< 0.01 F 4,192 = 26.787 P< 0.01 G x T x D F 4,192 = 0.341 n.s. F 4,192 = 1.243 n.s.

Resultados

104

Resultados

105

Artículo 3 Adenosine A2A receptors are involved in physical dependence and place

conditioning induced by THC. Soria G, Castañé A, Berrendero F, Ledent C,

Parmentier M, Maldonado R, Valverde O. 2004 European Journal of Neuroscience.

20 (8), 2203-2213.

OBJETIVOS

Invest igar la part icipación del receptor purinérgico A2A en los efectos

farmacológicos del THC en animales A2A knockout.

Estudiar las propiedades mot ivacionales del THC en estos animales mediante el

paradigma de condicionamiento espacial.

Evaluar la implicación del receptor A2A en los fenómenos de dependencia física y

tolerancia al THC.

RESULTADOS

No se observaron cambios signif icat ivos en los efectos agudos del THC sobre la

actividad locomotora ni sobre la nocicepción entre los animales knockout deficientes

en el receptor adenosina A2A y los wild-type.

Los animales wild-type most raron una preferencia de plaza inducida por THC que no

fue observada en los animales A2A knockout.

Los efectos aversivos del THC, evaluados mediante el paradigma de aversión de

plaza, resultaron bloqueados en los animales A2A knockout en comparación con los

animales wild-type.

La adquisición de una conducta operante mantenida por comida y agua fue similar

en ambos genotipos.

El tratamiento crónico con THC desarrolló tolerancia a los efectos antinociceptivos e

hipolocomotores de forma similar en ambos genot ipos. Sin embargo, durante dicho

t ratamiento se observaron diferencias en el pat rón de peso corporal de los animales

A2A knockout en comparación con los animales wild-type.

La expresión del síndrome de abst inencia al THC fue atenuada en los animales

knockout deficientes en el receptor adenosina A2A.

http://www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1460-9568.2004.03682.x?journalCode=ejn&volume=20&issue=8

Resultados

106

El estudio autorradiográfico para cuant if icar la densidad de receptores CB1 no

most ró cambios compensatorios en los niveles de receptores CB1 en ausencia del

receptor adenosina A2A.

La act ividad funcional de los receptores cannabinoides CB1, evaluada mediante la

unión de GTPγ35S est imulado por el agonista cannabinoide CB1 WIN55212-2, fue

similar en los animales deficientes en el receptor A2A y en los animales wild-type.

CONCLUSIÓN

Por primera vez se demuest ra que los receptores de adenosina A2A part icipan en las

propiedades motivacionales de los cannabinoides, aunque no están implicados en los

fenómenos de tolerancia y dependencia física inducidos por el THC.

Los receptores A2A podrían participar en el efecto del THC sobre el comportamiento

de ingesta.

Copyright. Federation of European Neuroscience Societies and Blackwell Publishing. The definitive version is available at www.blackwell-synergy.com

1

Adenosine A2A receptors are involved in physical dependence and

place-conditioning induced by THC

Guadalupe Soria1*, Anna Castañé1*, Fernando Berrendero1, Catherine Ledent2, Marc

Parmentier2, Rafael Maldonado1 and Olga Valverde1#

* These authors contributed equally to this work # To whom correspondence should be addressed: [email protected] 1 Laboratori de Neurofarmacologia, Departament de Ciències Experimentals i de la

Salut, Universitat Pompeu Fabra, C/Doctor Aiguader 80, 08003 Barcelona, Spain 2 IRIBHM, Université Libre de Bruxelles, N-1070 Bruxelles, Belgium

Running title: A2A receptor and THC dependence

Number of pages: 42; Number of figures: 5; Number of tables: 3

Number of words: whole manuscript: 8604; Abstract: 240; Introduction : 575

Keywords: mice, knockout, THC withdrawal, conditioned place preference, reward

2

Abstract

A2A adenosine and CB1 cannabinoid receptors are highly expressed in the

central nervous system where they modulate numerous physiological processes,

including adaptive responses to drugs of abuse. Both, purinergic and cannabinoid

systems interact with dopamine neurotransmission through A2A and CB1 receptors

respectively. Changes in dopamine neurotransmission play an important role in the

addictive-related behaviours. In this study, we investigated the contribution of A2A

adenosine receptors in several behavioural responses of ∆9− tetrahydrocannabinol

(THC) related to its addictive properties, including tolerance, physical dependence and

motivational effects. For this purpose, we first investigated acute THC responses in

mice lacking A2A adenosine receptors. Antinociception, hypolocomotion and

hypothermia induced by acute THC administration remained unaffected in mutant mice.

Chronic THC treatment developed similar tolerance to these acute effects in wild-type

and A2A knockout mice. However, differences in the body weight pattern were found

between genotypes during such a chronic treatment. Interestingly, the somatic

manifestations of SR141716A-precipitated THC withdrawal were significantly

attenuated in mutant mice. The motivational responses of THC were also evaluated by

using the place conditioning paradigm. A significant reduction of THC-induced

rewarding and aversive effects was found in mice lacking A2A adenosine receptors in

comparison with wild-type littermates. Binding studies revealed that these behavioural

changes were not associated with any modification in the distribution and/or functional

activity of CB1 receptors in knockout mice. Therefore, this study shows, for the first

time, a specific involvement of A2A receptors in the addictive-related properties of

cannabinoids.

3

Introduction

Adenosine is an endogenous nucleoside acting as a neuromodulator in the

central nervous system (CNS). Four receptor subtypes that specifically bind to

adenosine have been identified, namely A1, A2A, A2B and A3 (Fredholm et al., 1994).

A2A and A2B receptors are positively coupled to adenylate cyclase activity whereas A1

and A3 receptors are negatively coupled to this enzyme. Adenosine modulates numerous

physiological processes and participates in mediating different responses induced by

several drugs of abuse, such as psychostimulants and opioids (Sweeney et al., 1991;

Chen et al., 2000; Berrendero et al., 2003). Thus, amphetamine-mediated

hyperlocomotion is potentiated by adenosine antagonists and attenuated by adenosine

agonists (Turgeon et al., 1996; Ferré, 1997). In addition, genetic inactivation of A2A

receptors attenuates amphetamine and cocaine-induced locomotion (Chen et al., 2000).

Pharmacological studies have also suggested a role of adenosine in opioid dependence.

Indeed, the blockade of adenosine metabolism by adenosine kinase inhibitors decreases

the severity of morphine withdrawal (Kaplan & Coyle, 1998). Furthermore, the

adenosine agonist CGS 21680 inhibits the expression of morphine withdrawal whereas

adenosine antagonists or the deletion of A2A gene increase the severity of morphine

abstinence (Kaplan & Sears, 1996; Salem & Hope, 1997; Berrendero et al., 2003;

Bailey et al., 2004).

Endocannabinoids have been described as important neuromodulators in

the brain (Di Marzo et al., 1998) that regulate several behavioural and physiological

responses (Maldonado & Rodríguez de Fonseca, 2002; Piomelli, 2003). Cannabinoid

effects in the CNS are mediated through the activation of CB1 cannabinoid receptors

(Ledent et al., 1999), which are negatively coupled to the adenylate cyclase activity.

A2A and CB1 receptors have been found in common areas in the CNS including the

4

striatum, cerebellum, hippocampus and cerebral cortex (Herkenham et al., 1991;

Svenningsson et al., 1999). Both adenosine and cannabinoids participate in the

modulation of different physiopathological processes such as nociception, anxiety,

aggressiveness, motor activity, and drug addiction (Fredholm & Svenningsson, 2003;

Piomelli, 2003).

There is evidence that dopamine transmission in the mesolimbic system plays a

crucial role in the modulation of the rewarding processes (Koob, 1996; Di Chiara, 2002)

and, therefore, in the addictive properties of drugs of abuse. Adenosine regulates

dopamine transmission through antagonistic interactions of adenosine A1/dopamine D1

receptors and adenosine A2A/dopamine D2 receptors (Franco et al., 2000). A close

relationship between cannabinoid and dopamine system has also been described (Nava

et al., 2000; Hermann et al., 2002). Thus, THC and other cannabinoid agonists increase

dopamine levels in limbic areas related to reward (Tanda et al., 1997), and the D2

agonist quinpirole is able to decrease some behavioural responses induced by the

cannabinoid agonist CP 55,940 (Sañudo-Peña et al., 1998). Furthermore, chronic

treatment with D2 receptor antagonists results in an up-regulation of CB1 receptor

mRNA in the striatum (Mailleux & Vanderhaeghen, 1993). However, the role of

adenosine receptors in the behavioural effects of cannabinoids and in cannabinoid

addiction has not been yet investigated. Therefore, the aim of the present study was to

investigate the specific role of A2A adenosine receptors in the behavioural responses of

THC that are related to its addictive properties. For this purpose, we have investigated

the acute pharmacological responses of THC, the development of tolerance and physical

dependence after chronic THC administration, and the different motivational effects

induced by this drug in mice lacking A2A adenosine receptors. In addition, the possible

existence of compensatory changes in CB1 cannabinoid receptors was investigated in

5

these knockout mice by using autoradiography of cannabinoid receptor binding and

cannabinoid-agonist-stimulated [35S]-GTPγS binding.

6


Animals

Mice lacking A2A adenosine receptors were generated as previously reported

(Ledent et al., 1997), and were bred on a CD1 background. Fourteen weeks old A2A

knockout mice and wild-type littermates (30-35 g) were housed five per cage in

temperature (21 ± 1º C) and humidity (55 ± 10 %) controlled rooms, with a 12-h

light/12-h dark cycle (light between 8:00 AM and 8:00 PM). Food and water were

available ad libitum during all experiments except for the food self-administration

study. Mice were handled for one week before starting the experiments.

Animal procedures were conducted in accordance with the guidelines of the European

Communities Directive 86/609/EEC regulating animal research and approved by the

local ethical committee (CEEA-IMAS-UPF). All experiments were performed under

blind conditions.

Drugs

THC was purchased from THC Pharm (Frankfurt , Germany), Cremophor EL

was provided by Sigma Chemical Co. (Madrid, Spain). THC was dissolved in vehicle as

follows: 5 % ethanol, 5 % Cremophor EL, 90% distilled water. The volume of injection

was 0.1 ml per 10 g body weight and the administration route was intraperitoneal (i.p.).

SR141716A, kindly provided by SANOFI, was dissolved in vehicle based on: 10 %

ethanol, 10 % Cremophor EL, 80 % distilled water. The volume of injection was 0.2 ml

per 10 g body weight and the administration route was subcutaneous (s.c.).

7

Acute THC effects after the first administration

Locomotor activity responses induced by THC (20 mg/kg, i.p.) or vehicle were

evaluated by using locomotor activity boxes (9 x 20 x 11 cm) (Imetronic, Bordeaux,

France). The boxes were provided with two lines of photocells, one 2 cm above the

floor to measure horizontal activity, and the other located 6 cm above the floor to

measure vertical activity (rears), in a low luminosity environment (5 lux). Mice were

habituated to the locomotor cages during 10 min for three consecutive days. On the

fourth day, 20 min after THC or vehicle injection, mice were placed in the locomotor

activity boxes during 10 min.

Antinociceptive effects induced by an acute administration of THC (20 mg/kg,

i.p.) or vehicle were evaluated 30 min after injection by using the tail-immersion test, as

previously described (Simonin et al., 1998). The latency to a rapid tail-flick in the bath

(50 ± 0.5º C) was registered with a cut-off latency of 15 s in order to prevent tissue

damage. Subsequently, the hot-plate test was performed 35 min after THC or vehicle

injection in the same experimental sequence, as previously reported (Simonin et al.,

1998). A glass cylinder was used to maintain the heated surface of the plate, which was

kept at a temperature of 52 ± 0.5º C (Columbus Instruments, Columbus Ohio, USA).

The nociceptive threshold evaluated was the jumping and the licking response, and a

240-s cut-off was used to prevent tissue damage.

Rectal temperature was measured before and 1 hour after the injections by using

a digital thermometer (TMP 812, Letica, Barcelona, Spain) with an electronic

thermocouple flexible rectal probe. The probe was lubricated and introduced 3 cm into

the rectum of the mice for 20 s (Valverde et al., 2000).

8

THC tolerance and withdrawal

Mice were injected twice daily at 9:00 a.m. and 7:00 p.m. during 5 days with

THC (20 mg/kg, i.p.) or vehicle. On day 6, mice received only the morning injection.

For the tolerance study, three different parameters were measured each day during THC

chronic treatment: nociception, rectal temperature, and body weight. Antinociceptive

responses were evaluated on the tail-immersion test (50º C), 30 min after morning and

evening injections from day 1 to 5. Rectal temperature was measured before and 1 hour

after the injection on days 1, 2 and 3, after both morning and evening injections of THC,

and on days 4 and 5 only after the morning injection. Body weight was recorded for

each animal twice a day using an electronic balance (Mettler PM 4800, sensitive to 0.01

g), before morning and evening injections. Body weight changes were calculated by

subtracting each weight value from the preceding value.

On the 6th day of THC chronic treatment, the THC withdrawal syndrome was

precipitated by injecting the CB1 cannabinoid receptor antagonist SR141716A (10

mg/kg, s.c.) or its corresponding vehicle, 4 hours after the THC or the corresponding

vehicle morning injection. Each mouse was placed in identical test chambers consisting

of round boxes (30 cm diameter x 35 cm high) with white floor and moderate lighting

(30 lux), and was evaluated for any somatic manifestation of abstinence during 15 min

before the antagonist injection. After SR141716A administration, the somatic signs of

abstinence were measured during 45 min, as described previously (Hutcheson et al.,

1998). The number of bouts of writhing, wet dog shakes, and forepaw tremor were

counted. Penile licking or erection, hunched posture, tremor, ptosis, and piloerection

were scored 1 for appearance and 0 for non-appearance within each 5 min during the

observation time period. A quantitative value was calculated in each animal for the

different checked signs by adding the scores obtained in each 5 min time period. A

9

global withdrawal score, ranging from 0 to 100, was calculated for each animal by

giving to each individual sign a relative weight, as previously described (Valverde et

al., 2000).

Rewarding and aversive effects of THC in the place conditioning paradigm

The rewarding and the aversive properties of THC (1 and 5 mg/kg, i.p.,

respectively) were measured using a place conditioning paradigm, as previously

described (Valjent & Maldonado, 2000). The apparatus consisted of two main square

conditioning compartments (15 x 15 x 15 cm), with differences in texture and colours,

separated by a triangular central area (Matthes et al., 1996). The light intensity within

the conditioning chambers was 30 lux. During the pre-conditioning phase, drug-naive

mice were placed in the middle of the central area and had free access to both

compartments of the apparatus for 20 min. The time spent in each compartment was

recorded by computerized monitoring software (Videotrack; View Point, Lyon, France).

During the conditioning phase, mice received alternating injections of THC (1 or 5

mg/kg) or vehicle and were immediately confined into one of the two conditioning

compartments during 45 min. Five pairings were carried out with THC and five pairings

with vehicle on alternate days. Treatments were counterbalanced as closely as possible

between compartments. Control animals received vehicle every day. The post-

conditioning phase was conducted exactly as the pre-conditioning phase, i.e. free access

to each compartment for 20 min. When evaluating the rewarding properties of THC (1

mg/kg, i.p.), the possible negative motivational effects of the first drug exposure were

avoided by administering mice a single injection of THC (1 mg/kg, i.p.) in their home

cage 24 hours before starting the conditioning phase, as previously reported (Valjent &

10

Maldonado, 2000). This THC pre-exposure was not administered when aversive

properties of THC (5 mg/kg, i.p.) were evaluated.

Operant paradigm for food self-administration

The food self-administration experiment was conducted in mouse operant

chambers (Model ENV-307A-CT, Medical Associates, Georgia, VT, USA)

equipped with two holes, one was selected as active hole for delivering the

reinforcer and the other as inactive hole. Nose-poking on the active hole resulted in

a reinforcer (food pellet) while nose-poking on the inactive hole had no

consequences. The chambers were housed in sound- and light-attenuated boxes

equipped with fans to provide ventilation and ambient noise. A removable food

dispenser equidistant between the two nose-pokes permitted delivery of food

pellets when required. A stimulus light, located above each hole, signalled the

delivery of the reinforcer. Mice were deprived of food (3.5 g of food were provided

daily) during four days, in order to obtain 95 % of their initial weight. The same

food deprivation regime was maintained during the whole evaluation of food-

maintained operant behaviour. Water was available ad libitum during the whole

study. Four days after starting food deprivation, mice were trained in the operant

chambers to nose-poke for food pellets (Noyes Precision Pellets, Research Diets.

Inc., New Brunswick, NJ, USA). One hour daily self-administration sessions were

conducted 6 days per week. The house light was on at the beginning of the session

for 3 sec and then remained off during all the complete session. First, mice were

trained under a FR1 schedule of reinforcement. A 10 sec time-out period was

established after each reinforcement. During this 10 sec period, the cue light was

off and no reward was provided on the active hole. Responses on the inactive hole

11

and all the responses during the 10 sec time-out period were also recorded. The

session was terminated after 100 reinforcers were delivered or after 1 hour,

whichever occurred first. The criteria for the acquisition of FR1 was achieved

when mice maintained a stable responding with less than 20 % deviation from the

mean of the total number of reinforcers earned in three consecutive sessions (80 %

of stability). Then, the response requirement to earn a reward was changed to a

FR3 schedule. When the 80 % stability criteria was reached in FR3, the

experiment was finished. After each session, mice were returned to their home-

cages.

Brain slicing

Coronal sections 20 µm-thick were cut in a cryostat according to the Paxinos &

Franklin atlas (1997). Sections were thaw-mounted on gelatin/chrome-coated slides,

dried briefly at 30º C and stored at –80º C until used. For the identification of the

different brain nuclei, adjacent sections to those used for autoradiographic analysis were

stained with cresyl-violet and analyzed according to the Paxinos & Franklin atlas

(1997).

Autoradiography of cannabinoid receptor binding

The protocol used was basically the method described by Herkenham et al.

(1991). Slide-mounted brain sections were incubated for 2.5 h at 37º C in a buffer

containing 50 mM TRIS with 5 % bovine serum albumin (fatty acid-free), pH 7.4, and

10 nM [3H]CP-55, 940 (Perkin Elmer Life Sciences, Madrid, Spain) prepared in the

same buffer, in the absence or presence of 10 µM unlabeled CP-55,940 (Tocris, Madrid,

Spain) to determine total and nonspecific binding, respectively. Following this

12

incubation, slides were washed in 50 mM TRIS buffer with 1 % bovine serum albumin

(fatty acid-free), pH 7.4, for 4 h (2 x 2 h) at 0º C, dipped in ice-cold distilled water, then

dried under a stream of cool dried air. Autoradiograms were generated by apposing the

labeled tissues, together with autoradiographic standards ([3H]micro-scales, Amersham,

Barcelona, Spain), to tritium-sensitive film (Biomax MS, Amersham, Barcelona, Spain)

for a period of 4 weeks and developed for 4 min at 20º C.

Analysis of WIN 55,212-2-stimulated [[[[35S]]]]-GTPγγγγS binding

The protocol used was the method described by Sim et al. (1995). Briefly, slide-

mounted brain sections were rinsed in assay buffer (50 mM TRIS, 3 mM MgCl2, 0.2

mM EGTA, 100 mM NaCl, and 0.5 % bovine serum albumin fatty acid-free, pH 7.4) at

25º C for 10 min, then pretreated for 15 min with an excess concentration (2 mM) of

GDP (Sigma Chemical Co., Madrid, Spain) in assay buffer. Afterwards, sections were

incubated at 25º C for 2 h in assay buffer containing 0.04 nM [35S]-GTPγS (Amersham,

Barcelona, Spain), 2 mM GDP, and 5 µM WIN-55,212-2 (Sigma Chemical Co., Spain).

Basal activity was assessed in the absence of agonist, whereas nonspecific binding was

measured in the presence of 10 µM unlabeled GTPγS. In pilot experiments, additional

brain sections were incubated in the presence of the cannabinoid receptor antagonist

SR141716A (1.5 µM) (Rinaldi-Carmona et al., 1994) in addition to 0.04 nM [35S]-

GTPγS, 2 mM GDP, and 5 µM WIN-55,212-2. SR141716A significantly antagonized

the increase in WIN-55,212-2-stimulated [35S]-GTPγS binding, thus supporting that this

increase was specifically caused through activation of CB1 cannabinoid receptors (data

not shown). Slices were rinsed twice in 50 mM TRIS buffer, pH 7.4, at 4º C and

deionized once in water, then dried under a stream of cool dry air. Autoradiograms were

generated by apposing the labelled tissues to film (Biomax MR, Amersham, Barcelona,

13

Spain) for a period of 3 days and developed for 4 min at 20º C. For all autoradiographic

studies, developed film was analyzed and quantified in a computerized image analysis

system (MCID, St. Catharines, Ontario, Canada).


Acute effects of THC administration, body weight loss and withdrawal data

were compared by using two-way ANOVA (genotype and treatment as factors of

variation) between subjects, followed by one-way ANOVA and Scheffé post-hoc

comparisons when required. Data of tolerance study were compared by using three-way

ANOVA (genotype and treatment as between factors and day as within-group factor of

variation). Subsequent two-way and one-way ANOVA were made when required. For

the conditioned place preference and place aversion experiments, paired two-tailed

Student´s t-tests were made between the post-conditioning and pre-conditioning time

spent in the drug paired compartment. For food maintained operant responding, two-

way ANOVA was calculated on the mean of nose-pokes performed during the last

3 days required to reach the stability criteria, with hole (active vs inactive) and

genotype (knockout vs wild-type) as factors of variation. This statistical analysis

was performed for FR1 and FR3 schedules of reinforcement. One-way ANOVA

was made when required. Biochemical studies were analyzed by using one-way

ANOVA. Differences were considered significant if the probability of error was

less than 5%. The level of significance was corrected by Bonferroni when

consecutive analysis were made.

14

Results

Acute THC effects after the first administration

The acute administration of THC (20 mg/kg) induced antinociceptive responses

in the hot-plate and tail-immersion tests, a decrease of body temperature and a decrease

of locomotor activity in both wild-type and knockout animals. No differences between

genotypes were found for any of the acute responses evaluated. Antinociceptive

responses in the jumping threshold of the hot-plate test were similar in wild-type

(vehicle-treated: 73.48 ± 11.57, THC-treated: 176.99 ± 18.59) and knockout mice

(vehicle-treated: 60.58 ± 5.46, THC-treated: 154.73 ± 10.89). Indeed, two-way ANOVA

showed a significant effect of THC treatment (F [1.46] = 55.699; p < 0.01) without

effect of genotype (F [1.46] = 1.763; n.s.) nor interaction between these two factors (F

[1.49] = 0.125; n.s.). Antinociceptive effects on the licking threshold of the hot-plate

test were also similar in wild-type (vehicle-treated: 11.30 ± 1.52, THC-treated: 21.14 ±

2.04) and knockout mice (vehicle-treated: 9.57 ± 0.75, THC-treated: 25.18 ± 1.53).

Thus, two-way ANOVA revealed a significant effect of THC treatment (F [1.47] =

63.764; p < 0.01), but no genotype effect (F [1.47] = 0.527; n.s.), nor interaction

between genotype and treatment (F [1.47] = 3.255; n.s.). In the tail-immersion test,

THC also induced similar antinociceptive effects in both wild-type and knockout mice

(Fig 1a, a.m. D1). Two-way ANOVA revealed a significant effect of the treatment (F

[1.47] = 70.936; p < 0.01), without genotype effect (F [1.47] = 0.481; n.s.) nor

interaction between genotype and treatment (F [1.47] = 1.507; n.s.). The body

temperature was also similarly decreased by THC (20 mg/kg) treatment in both

genotypes (Fig 1b, a.m. D1). Two-way ANOVA indicated a significant effect of the

THC treatment (F [1.47] = 237.336; p < 0.01), without genotype effect (F [1.47] =

0.008; n.s.) nor interaction between these two factors (F [1.47] = 0.024; n.s.).

15

Locomotor activity was reduced in a similar way by the acute injection of THC (20

mg/kg) in both genotypes (photobeam counts mean values ± SEM in vehicle-treated

wild-type: 61.38 ± 10.52, vehicle-treated knockout: 57.4 ± 6.24, THC-treated wild-type:

11.5 ± 3.28, THC-treated knockout: 15.30 ± 5.29). Two-way ANOVA revealed a

significant effect of treatment (F [1.47] = 52.769; p < 0.01) no effect of genotype (F

[1.47] = 0.103; n.s.) nor the interaction between these two factors (F [1.47] = 36.310;

n.s.). The level of significance was p < 0.025 for all the cases after applying

Bonferroni´s correction.

Tolerance to the effects of THC after repeated administration

Repeated administration of THC (20 mg/kg) developed tolerance as revealed

by a progressive decrease in the antinociceptive, and hypothermic effects of the drug

during the treatment (Fig 1). Development of tolerance to THC antinociceptive effects

was observed in the tail-immersion test in both genotypes (Fig 1a). Three-way ANOVA

revealed a significant effect of day, treatment, genotype and interaction between day

and treatment (Table 1). Subsequent two-way ANOVA calculated for each genotype

showed for wild-type animals a significant effect of day (F [9.225] = 7.159; p < 0.01),

treatment (F [1.25] = 38.511; p < 0.01) and interaction between these two factors (F

[9.225] = 8.029; p < 0.01). Two-way ANOVA for knockout mice also revealed a

significant effect of day (F [9.198] = 6.237; p < 0.01), treatment (F [1.22] = 24.845; p <

0.01) and interaction between these two factors (F [9.198] = 6.841; p < 0.01). One-way

ANOVA to compare treatment effects on each day showed significant differences

between vehicle- and THC-treated mice, until the 4th day in wild-type mice and until the

3rd day in knockout animals. The level of significance was p < 0.016 for all the cases

after applying Bonferroni´s correction.

16

Tolerance to the hypothermic effects developed similarly in both genotypes (Fig

1b) reaching the initial body temperature baseline at the end of the chronic treatment.

Three-way ANOVA revealed a significant effect of day, treatment and interaction

between these two factors (Table 1). Subsequent two-way ANOVA on each genotype

showed for wild-type animals a significant effect of the day (F [6.150] = 9.868; p <

0.01), treatment (F [1.25] = 97.317; p < 0.01) and interaction between these two factors

(F [6.150] = 17.737; p < 0.01). Two-way ANOVA for knockout mice revealed a

significant effect of the day (F [6.132] = 6.753; p < 0.01), treatment (F [1.22] = 74.214;

p < 0.01) and interaction between these two factors (F [6.132] = 18.853; p < 0.01). One-

way ANOVA to compare treatment effects on each day indicated significant differences

between vehicle- and THC-treated mice until the 3rd day in wild-type mice and until the

2nd day in knockout animals. The level of significance was p < 0.016 for all the cases

after applying Bonferroni´s correction.

Effects of THC on body weight after repeated administration

A decrease of body weight during chronic treatment was observed in the THC-

treated groups (Fig 2a). Thus, three-way ANOVA showed a significant effect of

treatment (Table 1).

We have also analyzed the loss of body weight observed between each injection

of the chronic treatment. The chronic administration of THC in wild-type mice revealed

a different pattern of food intake compared to A2A adenosine receptor knockout mice

(Fig 2b). Indeed, THC-treated wild-type animals presented an homogeneous and

progressive loss of weight during day and night periods. This pattern was not observed

in the other groups of animals, including THC-treated knockout mice, whose body

weight changes were dependent on the circadian activity and the loss of weight was

17

mainly observed during the light period. Three-way ANOVA revealed a significant

effect of day (F [3.47] = 28.708; p < 0.01), no effect of treatment (F [1.47] = 2.389; n.s.)

but the interaction between these two factors (F [3.47] = 7.246; p < 0.01). However, no

effect of genotype (F [1.47] = 3.659; n.s.), nor interaction between treatment and

genotype (F [1.47] = 0.733; n.s.), day and genotype (F [3.47] = 2.155; n.s.) and day,

genotype and treatment (F [3.47] = 1.196; n.s.) were observed. Subsequent two-way

ANOVA performed for each genotype, showed for wild-type animals, a significant

effect of the day (F [8.200] = 12.030; p < 0.01), no effect of the treatment (F [1.25] =

0.163; n.s.) and interaction between these two factors (F [8.200] = 6.571; p < 0.01).

Two-way ANOVA for knockout mice revealed an effect of day (F [8.176] = 18.232; p <

0.01), treatment (F [1.22] = 7.353; p < 0.01) and no interaction between the two factors

(F [8.176] = 2.210; n.s.). One-way ANOVA calculated for wild-type animals to

compare treatment effects on each day indicated significant differences between

vehicle- and THC-treated mice until the 4th day. The level of significance was p <

0.016 for all the cases after applying Bonferroni´s correction.

SR141716A-precipitated THC withdrawal

The severity of THC withdrawal was evaluated in A2A knockout and wild-

type mice. Thus, mice chronically treated with THC (20 mg/kg, i.p., twice daily) or

the corresponding vehicle for 6 consecutive days were challenged with the

cannabinoid antagonist SR141716A (10 mg/kg, s.c.) or its corresponding vehicle.

No signs of withdrawal were observed in any group of mice during the behavioural

observation performed 15 min before the antagonist injection (data not shown). A

significant expression of different behavioural signs of withdrawal was observed in

both genotypes after the antagonist injection during the 45 min of observation

18

period (Fig 3). Two-way ANOVA was performed for each individual sign of

withdrawal. A significant effect of treatment was observed in wet dog shakes (F

[3.90] = 19.314; p < 0.01), paw tremor (F [3.90] = 33.622; p < 0.01), tremor (F [3.90]

= 19.371; p < 0.01), ptosis (F [3.90] = 23.489; p < 0.01), piloerection (F [3.90] =

40.515; p < 0.01), genital licks (F [3.90] = 5.413; p < 0.01) and mastication (F [3.90]

= 9.138; p < 0.01). A significant effect of genotype was observed in wet dog shakes

(F [1.90] = 14.659; p < 0.01), paw tremor (F [1.90] = 7.626; p < 0.01) and ptosis (F

[1.90] = 7.240; p < 0.01). A significant interaction between genotype and treatment

was observed in paw tremor (F [3.90] = 4.340; p < 0.01) and piloerection (F [3.90] =

4.318; p < 0.01). For the global withdrawal score, two-way ANOVA revealed a

significant effect of treatment (F [3.90] = 92.346; p < 0.01), a significant effect of

genotype (F [1.90] = 13.815; p < 0.01) and the interaction between these two factors

(F [3.90] = 4.126; p < 0.01). One-way ANOVA for wild-type animals revealed a

significant effect of treatment in paw tremor (F [3.48] = 18.830; p < 0.01),

piloerection (F [3.48] = 14.007; p < 0.01) and the global withdrawal score (F [3.48]

= 49.881; p < 0.01). Subsequent post-hoc comparisons revealed a significant

difference between THC-SR group and VEH-VEH group in paw tremor,

piloerection and the global withdrawal score. One-way ANOVA for knockout

animals revealed a significant effect of treatment in paw tremor (F [3.48] = 19.574;

p < 0.01), piloerection (F [3.48] = 32.903; p < 0.01) and the global withdrawal score

(F [3.48] = 45.078; p < 0.01). Subsequent post-hoc comparisons revealed a

significant difference between THC-SR group and VEH-VEH group in paw

tremor, piloerection and the global withdrawal score. The level of significance was

p < 0.016 for all the cases after applying Bonferroni´s correction. No significant

differences were observed between VEH-VEH, VEH-SR and THC-VEH groups in

19

both wild-type and mutant mice. One-way ANOVA calculated for THC-VEH-

treated mice revealed a significant difference between genotypes in piloerection

and global withdrawal score. One-way ANOVA calculated for THC-SR-treated

mice revealed a significant difference between genotypes in paw tremor and global

withdrawal score. The level of significance was p < 0.025 for all the cases after

applying Bonferroni´s correction.

Rewarding and aversive effects induced by different doses of THC in the place

conditioning paradigm

Motivational responses induced by THC were investigated in A2A knockout and

wild-type mice using the place conditioning paradigm. We first investigated the

rewarding properties of THC (1 mg/kg, i.p.), by using a protocol that minimizes the

dysphoric consequences of the first THC exposure (Valjent & Maldonado, 2000). Under

these experimental conditions, a significant conditioned place preference was observed

in wild-type mice treated with THC, as revealed by a significant increase in the time

spent in the drug-paired compartment in the post-conditioning versus the pre-

conditioning phase (t [1.12] = -2.89; p < 0.05). In contrast, A2A knockout mice did not

show any significant difference in the time spent in the drug-paired compartment in the

post-conditioning versus the pre-conditioning phase, demonstrating the absence of THC

rewarding effects of THC in these mutant mice (t [1.16] = 1.21; n.s.) (Fig 4a). To

evaluate the aversive effects of THC (5 mg/kg i.p.), we used a similar place

conditioning protocol without pre-exposing mice to THC, as previously reported

(Valjent & Maldonado, 2000). In these experimental conditions, THC induced a

significant decrease in the time spent in the drug-paired compartment in the post-

conditioning versus the pre-conditioning phase in wild-type mice, revealing an aversive

20

effect of THC in this genotype (t [1.12] = 2.40; p < 0.05) (Fig 4b). However, this

aversive response was not observed in A2A knockout mice, as revealed by the similar

time spent in the drug-paired compartment during post-conditioning and pre-

conditioning phases (t [1.16] = -0.14; n.s.) (Fig 4b).

Food maintained operant behaviour

As shown in figure 5, nose-poke behaviour maintained by food pellets was

similarly acquired by both wild-type and A2A knockout mice. All the wild-type and

A2A knockout mice reached the stability criteria in FR1 and FR3, and both

genotypes maintained active nose-poke discrimination during the whole

experiment. Thus, two-way ANOVA showed in FR1 a significant effect of nose-

poke discrimination (F [1.26] = 122.903; p < 0.01), no effect of genotype (F [1.26] =

2.991; n.s.) nor interaction between genotype and nose-poke (F [1.26] = 0.880; n.s.).

The maintenance of nose-poke responding by food in FR3 schedule of

reinforcement was also similar in both genotypes, with a clear discrimination

between the active and the inactive nose-pokes. Two-way ANOVA showed a

significant effect of nose-poke (F [1.26] = 60.598; p < 0.01) and no effect of

genotype (F [1.26] = 0.000; n.s.) nor interaction between genotype and nose-poke

(F [1.26] = 0.342; n.s.). Subsequent one-way ANOVAs revealed significant

discrimination between the active and the inactive holes in wild-type and A2A

knockout mice during FR1 and FR3 schedules of reinforcement. The level of

significance was p < 0.025 for all the cases after applying Bonferroni´s correction.

21

Autoradiography of cannabinoid receptor binding

The distribution of CB1 cannabinoid receptors labeled with [3H]CP-55,940 in

coronal sections of brain of control mice was similar to those previously reported

(Herkenham et al., 1991). Thus, a high density of CB1 cannabinoid receptors was found

in several brain structures including basal ganglia, cerebellum, hippocampus and

cerebral cortex. There were no significant differences between wild-type and A2A

knockout mice in the levels of CB1 cannabinoid receptor in any of the brain structures

analyzed (Table 2).

Autoradiography of WIN 55,212-2-stimulated [[[[35S]]]]-GTPγγγγS binding

The anatomical distribution of WIN 55,212-2-stimulated [35S]-GTPγS binding

qualitatively paralleled receptor distribution as determined in the previous experiment

by receptor binding autoradiography. The highest functional activity of CB1

cannabinoid receptor was revealed in several nuclei of the basal ganglia such as globus

pallidus, entopeduncular nucleus and substantia nigra, as previously reported (Sim et

al., 1995). As shown in table 3, no differences between A2A adenosine receptor

knockout mice and wild-type animals were detected in the stimulation of [35S]-GTPγS

binding in any of the brain areas investigated.

22

Discussion

The aim of the present study was to investigate the behavioural responses related

to THC addictive properties in A2A adenosine receptor knockout mice. The deletion of

A2A adenosine receptors abolished both rewarding and aversive responses produced by

THC in the place conditioning paradigm and attenuated the severity of THC

withdrawal. These effects were produced without any compensatory change in the

distribution and functional activity of CB1 cannabinoid receptors in the brain.

Deletion of A2A adenosine receptors did not modify several acute effects induced

by THC. Thus, THC (20 mg/kg) acute antinociceptive responses in both the tail-

immersion and hot-plate tests were similar in wild-type and knockout mice. A

hypoalgesic phenotype has been previously reported when using stronger thermal

stimuli than that used in the present study (Ledent et al., 1997; Bailey et al., 2002).

Changes in basal nociceptive responses in A2A knockout mice do not seem reliable

when using the tail-immersion test at 50º C. THC administration induced a similar

decrease in both locomotor activity and rectal temperature in wild-type and knockout

animals. Lower doses of THC (5 and 10 mg/kg) also induced the same effects on

nociceptive thresholds, locomotion and rectal temperature in both genotypes (data not

shown). These data demonstrate that A2A receptors do not participate in the acute effects

induced by THC.

Chronic treatment with THC developed a similar degree of tolerance to

antinociceptive, hypothermic and body weight loss effects of the drug in wild-type and

A2A knockout mice, although tolerance developed slightly faster in the knockout group.

Interestingly, the analysis of body weight changes for the different experimental groups

revealed that THC treatment modified the pattern of daily weight oscillation in wild-

type but not in knockout mice. Both groups of vehicle-treated mice showed the

23

expected weight pattern based on the light/dark cycle, and exhibited an increase of body

weight during the dark phase, corresponding to the normal eating period in rodents, and

a decrease during the light phase. THC-treatment modified this pattern in wild-type

mice, which exhibited a stable line of body weight loss without the rhythmic

oscillations observed in vehicle-treated mice. Interestingly, chronic treatment with THC

did not modify the daily oscillation pattern of body weight in A2A knockout mice.

Cannabinoid receptors and their endogenous ligands have been implicated in the control

of feeding and body weight regulation (Di Marzo et al., 2001; Williams & Kirkham,

2002; Kirkham et al. 2002). Thus, THC treatment interfered with the satiety threshold

in rodents (Williams et al., 1998). It is important to note that the dose of THC used in

this study was high in order to induce a reliable degree of tolerance and dependence,

and does not correspond to the doses currently used to reveal THC hyperphagic effects

(Williams & Kirkham, 2002). Several studies have also proposed a role for A2A

adenosine receptors in the regulation of feeding behaviour (Kittner et al., 2004; Nagel et

al., 2003). Thus, our findings provide evidence that A2A adenosine receptors could

regulate the effects of THC on feeding behaviour.

We have evaluated the involvement of A2A adenosine receptors in THC-induced

physical dependence. SR141716A precipitated a withdrawal syndrome in THC-

dependent wild-type and A2A adenosine knockout mice. However, in mice lacking A2A

adenosine receptors the withdrawal syndrome was attenuated as revealed by the

significant decrease of the global withdrawal score. Both A2A adenosine and CB1

cannabinoid receptors are present in common brain areas related to the control of motor

activity such as the cerebellum and the striatum (Herkenham et al., 1991; Svenningsson

et al., 1999). Cannabinoid withdrawal syndrome is accompanied by a strong motor

impairment (Hutcheson et al., 1998; Tzavara et al., 2000) and the cerebellum has been

24

reported to play an important role in the somatic manifestations of THC withdrawal

(Tzavara et al., 2000). A2A adenosine receptors are positively coupled to adenylyl

cyclase, and the activity of this enzyme was selectively increased in the cerebellum

during SR141716A-precipitated cannabinoid withdrawal. Therefore, we postulate that

A2A receptors may contribute to the increased cAMP levels during THC withdrawal and

the deletion of these purinergic receptors would then result in an attenuation in the

severity of cannabinoid withdrawal. However, other second messenger systems coupled

to CB1 receptors, such as MAP-kinase pathway, could be also implicated in the somatic

manifestations of cannabinoid withdrawal, which would justify the moderate magnitude

of the behavioural effect in A2A knockout mice.

Motivational responses to THC were explored by using the place conditioning

procedure. Rewarding and aversive effects of THC were revealed in wild-type mice, as

previously reported (Valjent & Maldonado, 2000), but these effects were suppressed in

mice lacking A2A receptors. To exclude the possibility of a general learning

impairment in knockout mice lacking A2A receptors, food maintained operant

behaviour was investigated in a self-administration paradigm. Both wild-type and

A2A knockout mice acquired and maintained operant self-administration for food

in a similar way in FR1 and FR3 schedules of reinforcement, which suggests that

learning processes were not impaired in mutant mice. Previous pharmacological

studies using adenosine agonists and antagonists have provided confusing data

about the contribution of A2A receptors in reward-related processes (Brockwell &

Beninger, 1996; Baldo et al., 1999; Sahraei et al. 1999; Poleszak & Malec, 2003).

The use of different behavioural paradigms and compounds makes the

interpretation of these pharmacological studies difficult. Our study represents the

first direct evidence showing an interaction between A2A adenosine receptors and

25

THC motivational effects in the place conditioning paradigm. A2A receptors are

mainly located in striatal neurons where interact with multiple neurotransmitter

systems. Thus, A2A receptors are coexpressed with postsynaptic D2 receptors in

GABAergic neurons in this brain structure (Fink et al., 1992). CB1 cannabinoid

receptors are also highly expressed in the striatum where interact with A2A

adenosine receptors in the control of different behavioural responses (Berrendero

et al., 2003). Taking into account the participation of the opioid system in the

responses induced by cannabinoids (for review see Manzanares et al., 1999;

Valverde et al., 2000; Ghozland et al., 2002) and the regulation of proenkephalin

gene expression by A2A adenosine receptors (Ledent et al., 1997), we cannot

exclude a possible involvement of the endogenous opioid system in the modification

of THC responses in A2A knockout mice. Indeed, THC place preference was

abolished in mice lacking mu-opioid receptors (Ghozland et al., 2002), whereas

THC-induced place aversion was suppressed in both mice deficient of kappa-

opioid receptors (Ghozland et al., 2002) and dynorphin gene (Zimmer et al., 2001).

However, no changes in the binding properties of the different opioid receptors

were detected in the brains of A2A knockout mice (Bailey et al., 2002). On the other

hand, the suppression of A2A adenosine receptors leads to a functional

hypodopaminergic state in the striatum and cerebral cortex (Dassesse et al., 2001), and

dopamine neurotransmission plays a crucial role in the regulation of the rewarding

effects of drugs of abuse (Koob, 1996; Di Chiara, 2002). The activation of CB1

cannabinoid receptors has been suggested to disinhibit dopaminergic neurons producing

an increase of dopamine release (Van der Stelt & Di Marzo, 2003), and it could be

hypothesized a possible modulatory role of A2A receptors on cannabinoid-induced

dopamine release. Thus, DARPP-32, a potent endogenous inhibitor of Protein

26

Phosphatase 1 which plays an obligatory role in dopaminergic transmission, is altered in

mice lacking A2A adenosine receptors (Svenningsson et al., 2000). Interestingly, a

deficit in DARPP-32 is sufficient to decrease the conditioned place preference for

cocaine, indicating that modulation of downstream processes of dopamine release

appears to be critical for cocaine rewarding properties (Zachariou et al., 2002). A recent

study reported the existence of an important synergy in protein kinase A signaling

between CB1 cannabinoid and D2 dopamine receptors in the nucleus accumbens.

Adenosine A2 receptor activation is required for this synergy (Yao et al., 2003). These

authors proposed that colocalization of D2 and CB1 receptors on the same neurons

confers hypersensitivity to cannabinoids. All these complex interactions between A2A

adenosine receptors and the dopamine system may explain that the effects of THC on

dopamine transmission could be impaired in the absence of A2A receptors, thereby

producing a suppression of both THC-induced rewarding and aversive responses.

Finally, the distribution and the functional activity of CB1 cannabinoid receptors

was measured in several brain structures related to cannabinoid behavioural effects,

such as cerebellum, hippocampus, cortex, and different nuclei of the basal ganglia

(Ameri, 1999). The distribution of CP 55,940 binding sites was similar in A2A knockout

mice and wild-type littermates. Similarly, WIN 55,212-2 produced a similar stimulation

of [35S]-GTPγS binding in both genotypes in all the brain areas evaluated indicating that

the functional activity of CB1 cannabinoid receptors was not modified in A2A knockout

mice. These results indicate the absence of compensatory changes in CB1 cannabinoid

receptors in A2A knockout mice that could have been of relevance to explain the

modification of THC behavioural responses.

In summary, the present study shows that A2A adenosine receptors do not

participate in the acute effects induced by THC, nor in the development of THC

27

tolerance to these effects. However, A2A adenosine receptors seem to play a role in THC

control of feeding behaviour. Furthermore, A2A adenosine receptors are involved in the

motivational properties of THC and the somatic expression of THC withdrawal. These

behavioural changes were not due to a learning impairment nor to compensatory

changes in the distribution or functional activity of CB1 cannabinoid receptors in A2A

knockout mice. Therefore, these results demonstrate for the first time the participation

of A2A adenosine receptors in the behavioural manifestations of THC addictive

properties and provide a further advance in understanding the complex neurobiological

processes underlying cannabinoid addiction.

28

Acknowledgements

This work was supported by grants from Spanish MCYT (SAF 2001/0745), HFSP

(RG007/200-B), Generalitat de Catalunya (Research Distinction and 2002SGR00193),

Redes de centros y grupos del Instituto de Salud Carlos III (C03/06) and (G03/005) and

European Communities QLRT 2001-01691. AC is a fellowship from DURSI

(Generalitat de Catalunya). FB is researcher from Ramón y Cajal Programme (MCYT).

We thank Dr G. Mengod and Dr. R. Cortés for their help in image analysis.

Abbreviations

central nervous system (CNS), ∆9-tetrahydrocannabinol (THC).

29

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Table 1. Three-way ANOVA of antinociception, hypothermia, hypolocomotion and loss of weight induced during chronic THC treatment in mice lacking A2A adenosine receptor.

Three-way ANOVA repeated measures with treatment (T) and genotype (G) as between subject factors and day (D) as within-subject factor. See Materials and Methods for details.

Antinociception (TI) Hypothermia Loss of body weight

F p F p F p

Day F(9.47) = 13.14 0.001 F(6.47) = 15.66 0.001 F(3.14) = 2.74 n.s.

Treatment F(1.47) = 59.22 0.001 F(1.47) = 169.68 0.001 F(1.47) = 19.78 0.001

Genotype F(1.47) = 9.48 0.01 F(1.47) = 0.01 n.s. F(1.47) = 0.42 n.s.

DxT F(9.47) = 14.40 0.001 F(6.47) = 35.03 0.001 F(4.47) = 1.55 n.s.

DxG F(9.47) = 0.38 n.s. F(6.47) = 0.71 n.s. F(4.47) = 0.44 n.s.

TxG F(1.47) = 0.97 n.s. F(1.47) = 0.48 n.s. F(1.47) = 0.78 n.s.

DxTxG F(9.47) = 0.55 n.s. F(6.47) = 1.94 n.s. F(4.47) = 0.75 n.s.

39

Table 2. CB1 receptor binding of [3H]CP-55,940 (fmol/mg of tissue) in several brain regions of A2A knockout mice and wild-type littermates.

Brain regions Wild-type A2A knockout Cerebral cortex superficial layer (I) 94.28 ± 14.54 93.39 ± 4.58 deep layer (VI) 93.09 ± 15.47 86.22 ± 5.33 Basal ganglia lateral caudate-putamen 97.38 ± 18.10 95.23 ± 15.38 medial caudate-putamen 73.52 ± 12.97 74.00 ± 7.99 globus pallidus 254.47 ± 40.57 289.02 ± 38.74 entopeduncular nucleus 199.39 ± 43.90 270.65 ± 45.29 substantia nigra 216.52 ± 8.12 200.38 ± 15.78 Cerebellum molecular layer 193.97 ± 25.70 182.08 ± 29.39 Hippocampus 83.13 ± 14.58 81.44 ± 9.35 Periaqueductal grey matter 67.68 ± 9.50 71.62 ± 19.27 Values are mean ± S.E.M. of 6 determinations per group. No significant differences were found between genotypes (one-way ANOVA with genotype as between factor).

40

Table 3. WIN-55,212-2-stimulated [[[[35S]]]] GTPγγγγS binding (% of stimulation of basal binding) in several brain regions of A2A knockout mice and wild-type littermates.

Brain regions Wild-type A2A knockout Cerebral cortex superficial layer (I) 20.70 ± 4.26 24.30 ± 4.51 deep layer (VI) 30.39 ± 5.06 28.55 ± 3.54 Basal ganglia lateral caudate-putamen 22.00 ± 3.56 19.65 ± 4.80 medial caudate-putamen 16.80 ± 2.92 14.16 ± 3.68 globus pallidus 86.32 ± 8.55 103.05 ± 11.96 entopeduncular nucleus 102.52 ± 19.54 76.22 ± 6.73 substantia nigra 64.21 ± 12.20 64.42 ± 9.31 Cerebellum molecular layer 52.33 ± 7.62 50.30 ± 9.25 Hippocampus 23.56 ± 5.10 24.61 ± 2.67

Values are mean ± S.E.M. of 7 determinations per group. No significant differences were found between genotypes (one-way ANOVA with genotype as between factor).

41

Legends of the figures

Figure 1. Development of THC tolerance in A2A knockout (KO) and wild-type

(WT) mice. Development of tolerance during chronic THC treatment (20 mg/kg, i.p.,

twice daily, 5 days) was evaluated by measuring antinociceptive responses in the tail-

immersion test (a), and changes in body temperature (b). Data are expressed as mean ±

SEM in WT vehicle (white squares, n = 11), WT THC (white circles, n = 14), KO

vehicle (black squares, n = 12) and KO THC (black circles, n = 13) mice. � p < 0.01;

comparison between treatments (one-way ANOVA).

Figure 2. Loss of weight in A2A knockout (KO) and wild-type (WT) mice during a

chronic treatment with THC. (a), Daily loss of body weight (g) during 5 days of THC

or vehicle treatment. Data are expressed as mean ± SEM of the difference between daily

am measurement of body weight and each previous pm determination in WT vehicle

(white squares, n = 11), WT THC (white circles, n = 14), KO vehicle (black squares, n

= 12) and KO THC (black circles, n = 13) mice. Three-way ANOVA showed a

significant effect of treatment (p < 0.01). (b), Body weight differences (g) measured

after each injection of THC (20 mg/kg, i.p., twice daily, 5 days). Data are expressed as

mean ± SEM in the different groups. � p < 0.01; comparison between treatments (one-

way ANOVA).

Figure 3. SR141716A-precipitated THC withdrawal signs in A2A knockout (KO)

and wild-type (WT) mice. Withdrawal syndrome was precipitated by the

administration of SR141716A (10 mg/kg, s.c.) or the corresponding vehicle (VEH) in

mice receiving a chronic treatment of either vehicle or THC (20 mg/kg, i.p.). Counted

(wet dog shakes, paw tremor, and writhes) and checked (ptosis, body tremor, hunched

posture, piloerection, mastication and penile licking) signs of withdrawal were observed

42

45 min immediately after the SR141716A administration. The global withdrawal score

was calculated for each animal by giving each individual sign a relative weight. Data

are expressed as mean ± SEM in WT (white bars, VEH-VEH n = 10, VEH-SR n = 16,

THC-VEH n = 5, THC-SR n = 18) and KO (black bars, VEH-VEH n = 10, VEH-SR n

= 14, THC-VEH n = 6, THC-SR n = 19) mice. � p < 0.01 (post-hoc comparison vs

VEH-VEH group). p < 0.025 comparison between genotypes (one-way ANOVA).

Figure 4. THC conditioned place preference and aversion in A2A knockout (KO)

and wild-type (WT) mice. Results are expressed as mean ± SEM of the time spent in

the drug-paired compartment (sec) during the pre-conditioning phase (white bars) and

post-conditioning phase (black bars). Conditioned place preference experiment: WT

vehicle (n = 15), KO vehicle (n = 17), WT THC (n = 13), KO THC (n = 17).

Conditioned place aversion: WT vehicle (n = 12), KO vehicle (n = 12), WT THC (n =

13), KO THC (n = 17). � p < 0.05; comparison between the time spent in the drug-

paired compartment during the pre-conditioning and post-conditioning phase (two tailed

paired Student´s t-test)

Figure 5. Food maintained operant behaviour in A2A knockout (KO) and wild-type

(WT) mice Average of the number of nose-pokes in both the active and the inactive

holes made in the three consecutive sessions (1 hour each) required to achieve the

stability criteria in FR1 and FR3 schedule of reinforcement � p < 0.025 comparison

between holes (one-way ANOVA).

Figure 1. Soria et al.

WT VEH

KO VEH

WT THC

KO THC

0

2

4

6

8

10Ta

il w

ithdr

awal

late

ncy

(sec

)

D1 D3am pm am pm am pm

D1 D2 D4am pm

D5am pm

a

-5-4-3-2-1012

Tem

pera

ture

dec

reas

e(º

C)

D D4am pm am pm am am

D1 D2 D3amD5

b


a

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1D2-D1 D3-D2 D4-D3 D5-D4

Wei

ght l

oss

(g)

WT VEH

KO VEH

WT THCKO THC

am pm-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

Wei

ght c

hang

es(g

)

b

am pm am pm am pmD D4D2 D3 D5


Wild-type mice

A2A knockout mice

0

20

40

60

80

100

VEH-VEH VEH-SR THC-VEH THC-SR

wet

dog

sha

kes

0

20

40

60

80

100


Paw

trem

or

0

1

2

3

4

5


Writ

hes

0

1

2

3

4

5


Peni

le li

ckin

g

0

1

2

3

4

5


Hun

ched

pos

ture

0

2

4

6

8

10


Bod

y tr

emor

0

2

4

6

8

10


Ptos

is

0

2

4

6

8

10


Pilo

erec

tion

0

1

2

3

4

5


Mas

ticat

ion

0

20

40

60

80

100


Glo

bal W

ithdr

awal

Sco

re

400

500

600

700

800

Tim

e sp

ent i

n dr

ug-p

aire

d co

mpa

rtm

ent (

sec)

Vehicle THC 5 mg/kg

Pre-conditioning time Post-conditioning time

THC conditioned place aversion

a

b

400

500

600

700

800

Tim

e sp

ent i

n dr

ug-p

aire

d co

mpa

rtm

ent (

sec)

Vehicle THC 1 mg/kg

THC conditioned place preference

0

0

400

500

600

700

800

Tim

e sp

ent i

n dr

ug-p

aire

d co

mpa

rtm

ent (

sec)

Vehicle THC 5 mg/kg

Pre-conditioning time Post-conditioning time

THC conditioned place aversion

400

500

600

700

800

WT WTKO KO

Tim

e sp

ent i

n dr

ug-p

aire

d co

mpa

rtm

ent (

sec)

Vehicle THC 1 mg/kg

THC conditioned place preference

0

0


WT WTKO KO


02040

6080

100120

140160180

WT KO WT KO

FR1 FR3

Num

ber o

f nos

epok

es/ h

our

Active

Inactive

Resultados

118

Resultados

119

Nicotina "Un complemento habit ual y sumament e import ant e en la vida del guerrillero es la fuma, ya sean t abacos, cigarros o picadura para la pipa, pues el humo que puede hechar en moment os de descanso es un gran compañero del soldado solitario".

Ernesto 'Che' Guevara

La nicot ina es un alcaloide que se encuent ra principalmente en plantas de la familia de

las solanáceas tales como la patata, el tomate y el tabaco (Doolit t le y cols., 1995). Este

compuesto tiene un papel primordial en la iniciación y mantenimiento de la adicción del

tabaco (Buisson y Bert rand, 2002). El potencial adict ivo asociado al hábito de fumar es

mayor que el de ot ras sustancias psicoact ivas. No obstante, la nicot ina ej erce ot ros

efectos en el organismo. Así, se ha descrito que es capaz de modular la t ransmisión del

dolor, el cont rol del movimiento, los procesos cognit ivos y las respuestas de t ipo

emocional (Picciot to y cols., 1995; File y cols., 2002; Decker y cols., 2004; Katner y

cols., 2004; Sacco y cols., 2004).

La nicot ina es un poderoso y potente agonista de varias subpoblaciones de receptores

nicotínicos del sistema colinérgico (nAChRs) (Vidal, 1996; Paterson y Nordberg, 2000).

Los receptores nicot ínicos de acet ilcolina pertenecen a la familia de canales iónicos

que se act ivan mediante la unión de un ligando (Le Novère y Changeux, 1999). El

l igando endógeno para los nAChRs es la acet ilcolina. Existe una variedad de subt ipos de

nAChRs neuronales. Estos receptores se componen de cinco subunidades alrededor de un

canal iónico. La unión del agonista hace que la conformación en reposo de las

subunidades cambie y permita el f luj o de iones de Na+, lo que causa despolarización de

la célula (Corringer y cols., 2000).

En el cerebro, los receptores nicotínicos están situados principalmente en los terminales

presinápt icos y modulan la liberación de neurot rasmisores. En consecuencia, los efectos

de la nicot ina pueden relacionarse con varios sistemas de neurot ransmisión como los

sistemas dopaminérgico, opioide, glutamatérgico, colinérgico y serotonérgicos (Kenny y

Markou, 2001; Malin, 2001). Asimismo, la nicot ina promueve la síntesis de dopamina, al

incrementar la expresión de t irosina hidroxilasa y su liberación, mediante la act ivación

de AChRs somatodendrít icos en las rutas dopaminérgicas nigroest riada y mesolímbica

(Clarke y Pert, 1985; Panagis y cols., 2000).

Resultados

120

Resultados

121

Artículo 4 Attenuation of nicotine-induced rewarding effects in A2A knockout mice. Castañé A,

Soria G, Ledent C, Maldonado R, Valverde O. 2006. Neuropharmacolgy. (En prensa).

OBJETIVOS

Invest igar la part icipación del receptor purinérgico A2A en los efectos

farmacológicos de la nicotina en animales A2A knockout.

Estudiar las propiedades placenteras y discriminat ivas de la nicot ina en estos

animales, mediante el paradigma de condicionamiento espacial y la aversión

condicionada al gusto, respectivamente.

Evaluar la implicación del receptor A2A en los efectos de la nicotina sobre el sistema

dopaminérgico mendiante la técnica de microdiálisis in vivo para determinar los

niveles extracelulares de dopamina en el NAc.

Estudiar el papel del receptor A2A en los fenómenos de dependencia f ísica de

nicotina.

RESULTADOS

No se observaron cambios signif icat ivos en la act ividad locomotora, ni en la

ant inocicepción inducidas por la administ ración aguda de nicot ina en los animales

knockout deficientes en el receptor adenosina A2A y wild-type.

Los animales wild-type most raron una preferencia de plaza inducida por nicot ina

que no fue observada en los animales A2A knockout.

Las propiedades discriminativas de la nicotina fueron preservadas en los ratones A2A

knockout.

La expresión del síndrome de abst inencia de nicot ina fue similar en los animales

knockout deficientes en el receptor adenosina A2A y en los animales wild-type.

La administ ración aguda de nicot ina induj o un aumento de los niveles ext racelulares

de dopamina en el núcleo accumbens en los animales wild-type que no fue

observado en los ratones deficientes en el receptor de adenosina A2A.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T0C-4K7FB4C-2&_coverDate=09%2F30%2F2006&_alid=457575454&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=4859&_sort=d&view=c&_acct=C000053451&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1517318&md5=01b880a2ed1cb0f6ad495c29617036bc

Resultados

122

CONCLUSIÓN

Los receptores de adenosina A2A regulan las propiedades de recompensa de la

nicotina.

Los receptores de adenosina A2A son requeridos para los efectos agudos de la

nicotina sobre la transmisión dopaminérgica en el NAc.

Publicación definitiva: Castane A, Soria G, Ledent C, Maldonado R, Valverde O. Attenuation of nicotine-induced rewarding effects in A(2A) knockout mice. Neuropharmacology. 2006 Sep;51(3):631-40. Epub 2006 Jun 21 http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T0C-4K7FB4C-2&_coverDate=09%2F30%2F2006&_alid=457575454&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=4859&_sort=d&view=c&_acct=C000053451&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1517318&md5=01b880a2ed1cb0f6ad495c29617036bc

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T0C-4K7FB4C-2&_coverDate=09%2F30%2F2006&_alid=457575454&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=4859&_sort=d&view=c&_acct=C000053451&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1517318&md5=01b880a2ed1cb0f6ad495c29617036bc

Resultados

123

-----Mensaje original-----

De: Neuropharmacology [mailto:[email protected]]

Enviado el: viernes, 05 de mayo de 2006 12:20

Para: VALVERDE, OLGA

Asunto: Your Submission

Ms. Ref. No.: NEUROPHARM-D-06-00066R1

Title: Attenuation of nicotine-induced rewarding effects in A2A knockout mice

Neuropharmacology

Dear OLGA VALVERDE, I am pleased to be able to tell you that your manuscript

"Attenuation of nicotine-induced rewarding effects in A2A knockout mice" in its revised

form is acceptable for publication in Neuropharmacology, and is being sent to press. We

look forward to seeing your work in its final published form. Thank you for submitting this

manuscript to Neuropharmacology, and I hope you will consider submitting future work of

a similar nature to this Journal.

With kind regards,

Dawn Brittain

Journal Manager

Neuropharmacology

Resultados

124

Resultados

125

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126

Resultados

127

Attenuation of nicotine-induced rewarding effects in A2A knockout mice

Anna Castañé1* , Guadalupe Soria1*, Catherine Ledent2, Rafael Maldonado1 and Olga

Valverde1#

# To whom correspondence should be addressed: [email protected], telephone: 34 93

542 28 30, fax: 34 93 542 28 02

* These authors contributed ecqually to this work 1 Laboratori de Neurofarmacologia, Departament de Ciències Experimentals i de la Salut,

Universitat Pompeu Fabra, C/Doctor Aiguader 80, 08003 Barcelona, Spain 2 IRIBHM, Université Libre de Bruxelles, B-1070 Bruxelles, Belgium

Keywords: A2A adenosine receptors, knockout, nicotine, microdialysis, dopamine.

Resultados

128

Abstract

The non-selective A2A antagonist caffeine has been reported to modify nicotine-

induced locomotor and reinforcing effects. In the present study, we have investigated the

specific role of A2A adenosine receptors in the behavioural responses induced by nicotine

by using genetically modified mice lacking A2A adenosine receptors. Acute nicotine

administration induced a similar decrease of locomotor activity in A2A knockout mice and

wild-type littermates. Acute antinociceptive responses elicited by nicotine in the tail-

immersion and hot-plate tests were unaffected in these mutant mice. The rewarding

properties of nicotine were then investigated using the place-conditioning paradigm.

Nicotine-induced conditioned place preference was suppressed in A2A knockout mice.

Accordingly, in vivo microdialysis studies revealed that the extracellular levels of

dopamine in the nucleus accumbens were not increased after nicotine administration in

mutant mice. Wild-type and A2A knockout mice were trained in conditioned taste aversion

procedure in which drinking a saccharin or saline solution was paired with nicotine or

saline injections. A similar reduction in the intake of nicotine-paired solution in this

paradigm was obtained in both genotypes. Finally, the administration of the nicotinic

antagonist mecamylamine in nicotine-dependent mice precipitated a similar withdrawal

syndrome in both genotypes. Together, the present results identify A2A adenosine receptors

as an important factor that contributes to the rewarding properties of nicotine.

Resultados

129

Introduction

Nicotine is the main addictive component of tobacco smoke and the identification

of the mechanisms involved in nicotine addictive effects is of particular relevance.

Nicotine stimulates nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), which are ligand-gated

cation channels formed by the co-assembly of five different protein subunits (Le Novère et

al., 2002). These receptors are widely expressed in the central and peripheral nervous

system, and physiologically bind the neurotransmitter acetylcholine (ACh). In the central

nervous system (CNS), nAChRs are mainly presynaptically located and facilitate the

release of several important neurotransmitters such as ACh, dopamine (DA),

noradrenaline, γ-aminobutyric acid (GABA) and glutamate (Wonnacott, 1997). Thus,

nicotine by acting on nAChRs plays an important neuromodulatory role in the CNS and is

involved in a large number of physiological and pathological processes including drug

abuse (Wonnacott et al., 2005).

Adenosine is an inhibitory neuromodulator in the CNS that acts through four

subtypes of G-protein-coupled adenosine receptors named A1, A2A, A2B and A3 (Fredholm

et al., 2001). Epidemiological data and pharmacological studies using caffeine, a non-

selective adenosine antagonist at A1 and A2A receptors, have suggested the existence of

possible interactions between the adenosine system and nicotine. Thus, smokers trend to

consume more cigarettes while drinking coffee (Brown and Benowitz, 1989) and more

caffeine than non-smokers (Swanson et al., 1994). Experimental data have revealed that

caffeine enhances the motor stimulating effects of nicotine (Sudakov et al., 2003).

Moreover, caffeine produced cross-sensitization to nicotine-induced hyperlocomotion in

mice (Celik et al., 2006). Several studies have also investigated a possible interaction

between nicotine and caffeine in addictive processes. In this sense, chronic exposure to

caffeine facilitated the acquisition of nicotine self-administration behaviour (Shoaib et al.,

1999) and the discriminative-stimulus effects of nicotine in rats (Gasior et al., 2000).

Emerging evidence indicates that the adenosine system, particularly A2A adenosine

receptors, may be involved in the addictive properties of other drugs of abuse. Thus, we

have recently shown that mice lacking A2A adenosine receptors exhibit a reduction of

THC-induced rewarding effects and rimonabant-precipitated THC withdrawal syndrome

(Soria et al., 2004). Moreover, a decreased efficacy of cocaine reinforcing effects has been

also shown in the self-administration paradigm in mice lacking A2A adenosine receptors

(Soria et al., 2006). The generation of A2A receptor knockout mice with complete and

Resultados

130

specific inactivation of the A2A receptor (Ledent et al., 1997) provides a useful genetic

model to investigate the role of A2A receptors on nicotine pharmacological effects. The aim

of this study was to investigate the possible involvement of A2A adenosine receptors in the

behavioural responses induced by nicotine related to the development of nicotine

addiction.

Resultados

131

Materials and methods

Animals

Mice lacking A2A adenosine receptors were generated as previously reported (Ledent et

al., 1997). In order to homogenize the genetic background of the mice, the first generation

heterozygotes were backcrossed for 30 generations on a CD1 background (Charles River,

France) with selection for the mutant A2A gene at each generation. Heterozygote-

heterozygote mating produced wild-type and knockout littermates for subsequent

experiments. Breeding couples were periodically renovated by crossing heterozygote mice

with wild-type CD1 females (Charles River, France) in order to maintain a genetically

diverse outbred background. A2A knockout mice and wild-type littermates (30-35 g) were

housed five per cage in temperature (21 ± 1ºC) and humidity (55 ± 10%)-controlled rooms,

with a 12-h light/12-h dark cycle (light between 8:00 AM and 8:00 PM). Food and water

were available ad libitum. Mice were handled for one week before starting the

experiments. For the conditioned taste aversion paradigm mice were housed individually

and were water restricted, as described in the corresponding section.

Animal procedures were conducted in accordance with the guidelines of the

European Communities Directive 86/609/EEC regulating animal research and approved by

the local ethical committee (CEEA-IMAS-UPF). All efforts were made to minimize the

number of mice used and the suffering. All experiments were performed under blind

conditions.

Drugs

(-)-Nicotine ([-]-1-methyl.2-[3-pyridyl]pyrrolidine) hydrogen tartrate salt and

mecamylamine hydrochloride (Sigma Chemical Co., Madrid, Spain) were dissolved in

physiological saline (0.9%), and administered in a volume of 10 ml/kg subcutaneously

(s.c.). Ketamine chlorhydrate (100 mg/kg) (Imalgène 1000, Rhône Mérieux, Lyon,

France) and xylazine hydrochloride (20 mg/kg) (Sigma Chemical Co., Madrid, Spain) were

mixed and dissolved in ethanol and distilled water (1:9). The anaesthetic mixture was

administered in an injection volume of 20 mg/kg body weight by intraperitoneal rout (i.p.).

Nicotine doses are reported as nicotine hydrogen tartrate salt (1 mg/kg of nicotine

hydrogen tartrate salt equals to 0.35087 mg/kg nicotine free base).

Resultados

132

Acute effects induced by nicotine

Locomotor activity responses induced by nicotine hydrogen tartrate salt (1, 3 and 6

mg/kg, s.c.) or vehicle were evaluated by using locomotor activity boxes (9 x 20 x 11 cm)

(Imetronic, Bordeaux, France). The boxes were provided with two lines of photocells, one

2 cm above the floor to measure horizontal activity, and the other located 6 cm above the

floor to measure vertical activity (rears), in a low luminosity environment (5 lux). Mice

were habituated to the locomotor cages during 10 min for three consecutive days. On the

fourth day, 5 min after nicotine or vehicle injection, mice were placed in the locomotor

activity boxes during 10 min.

Antinociceptive effects induced by the acute administration of nicotine hydrogen

tartrate salt (1, 3 and 6 mg/kg, s.c.) or vehicle were evaluated 15 min after injection by

using the tail-immersion test, as previously described (Simonin et al., 1998). The latency to

a rapid tail-flick in the bath (50 ± 0.5ºC) was registered with a cut-off latency of 15 sec in

order to prevent tissue damage. Subsequently, the hot-plate test was performed 16 min

after nicotine injection. Two nociceptive thresholds were evaluated in the hot-plate test: the

licking of the hind paws and the first jump observed. 240-sec cut-off was used to prevent

tissue damage. A glass cylinder was used to maintain the heated surface of the plate, which

was kept at a temperature of 52 ± 0.5ºC (Columbus Instruments, Columbus Ohio, USA).

Nicotine dependence and withdrawal

Nicotine dependence was induced by using Alzet osmotic minipumps (Model 2001;

Alzet, Cupertino, CA, USA) as previously reported (Castañé et al., 2002). The minipumps

containing saline or nicotine hydrogen tartrate salt were implanted s.c., and delivered a

constant flow in a rate of 1 ?l/h. The concentration of nicotine was adjusted to compensate

for differences on body-weight of mice. Thus, average-weight mouse received a dose of

approximately 10 mg/kg/day of nicotine hydrogen tartrate salt (first experimental

condition) or 25 mg/kg/day of nicotine hydrogen tartrate salt (second experimental

condition) over 7 days. After 6 days, the nicotine withdrawal syndrome was precipitated by

injecting the nicotinic receptor antagonist, mecamylamine (1 mg/kg, s.c.). The somatic

signs of withdrawal syndrome were evaluated 10 min before and 30 min after

mecamylamine injection. The number of wet dog shakes, front paw tremors, and scratches

was counted. Body tremor, ptosis, teeth chattering, genital licks, and piloerection were

scored 1 for appearance or 0 for non-appearance within each 5 min period. The locomotor

activity over 5 min periods was rated 0, 1, or 2 (0 for inactivity, 1 for low activity, and 2

Resultados

133

for normal activity). The classification of locomotor activity as non activity, low activity or

normal activity was made by scoring the trajectories and area crossed by the animal during

each 5 min period. Less than 2 crossings during 5 min was considered as non activity,

between 2 and 10 crossings during 5 min was considered low activity, and more than 10

crossings during 5 min was considered normal activity. A global withdrawal score was

calculated for each animal by giving each individual sign a relative weight, as reported

previously (Castañé et al., 2002).

Rewarding properties of nicotine in the place conditioning paradigm

The rewarding effects of nicotine were evaluated by using the conditioned place

preference paradigm as previously described Maldonado et al. (1997). The apparatus

consisted of two main square conditioning compartments with different texture and visual

conditions (dotted walls with rough floor and stripped walls with smooth floor), separated

by a triangular central division. During the pre-conditioning phase, each mouse was placed

in the middle of the central division and had free access to both compartments of the

conditioning apparatus for 18 min, with the time spent in each compartment recorded. The

time in the central area was proportionally shared and added to the time value of each

compartment. Treatments were counterbalanced between compartments to use an unbiased

procedure. No initial place preference or aversion for the different compartments was

observed. For the conditioning phase, mice were treated during 8 days with alternate

injections of nicotine hydrogen tartrate salt 0.5 mg/kg (first experiment) and 1 mg/kg

(second experiment) or saline. Mice were confined to the corresponding compartment

immediately after injection for 20 min. Nicotine was administered on days 1, 3, 5, and 7,

and saline was administered on days 2, 4, 6, and 8. Control animals received saline every

day. The post-conditioning phase was conducted exactly as the pre-conditioning phase, i.e.,

free access to both compartments for 18 min, and the time spent in each compartment was

recorded. No initial place preference or aversion for the different compartments was

observed. In the first experimental condition, the time spent in both drug-paired and non

drug-paired during the pre-conditioning phase was similar for wild-type (t [1,25] = 1.405;

n.s.) and A2A knockout (t [1,27] = 1.901; n.s.). Likewise, in the second experimental

condition, the time spent in both drug-paired and non drug-paired during the pre-

conditioning phase was similar for wild-type (t [1,29] = -1.907; n.s.) and A2A knockout (t

[1,29] = -0.767; n.s.).

Resultados

134

Nicotine-induced conditioned taste aversion

The procedure was based on that previously described (Gommans et al., 2000) and

was carried out in individualized mice home cages. Mice were trained to drink tap water

for 30 min twice daily, once in the morning (between 9:30 and 11:00 h) and once in the

afternoon (between 5:00 and 6:00 h). When the amount consumed was stable, conditioning

phase began. Mice were presented only in the morning sessions of days 1 (trial 1) and 3

(trial 2) with either a sweet (sodium saccharin, 0.1%) or a saline (sodium chloride, 0.9%)

solution. After drinking the solutions, mice were injected immediately with either nicotine

tartrate salt (5 mg/kg, s.c.) or vehicle. To balance out effects due to inherent differences in

palatability of the two flavours, half of the animals received nicotine paired with the

saccharin flavour and, vehicle with the saline flavour, and half of the other animals

received nicotine paired with saline, and vehicle with saccharin flavour. The two solutions

were presented alternately and to balance out side preferences each flavour was presented

once at the left side of the cage and once at the right side. During the afternoon drinking

sessions and on days 2, 4 and 5, mice drank normal tap water. On day 6, two days after the

last conditioning session, mice were presented with both solutions simultaneously and

were free to choose the solution to drink. On day 7, the test was repeated and the left–right

position of the two flavours was reversed to counterbalance possible side preferences. The

mean of the nicotine-paired solution consumed in the two tests (days 6 and 7, trial 3) was

calculated for both wild-type and knockout mice. In addition, we calculated the mean of

the nicotine-paired solution consumed in the two tests as a percentage of the total fluid

intake. Scores below 50 % indicated conditioned taste aversion.

Microdialysis procedure

Microdialysis study was performed as previously described (Robledo et al., 2004;

Soria et al., 2005).

Surgery and sample recollection. Mice were anesthetized with a ketamine/xylazine

mixture (0.2 ml/10g body weight i.p) and placed in a stereotaxic apparatus with a flat skull

(Paxinos and Franklin, 1997). A small hole was drilled on the right side of the skull and the

cannula guide (CMA/7, CMA Microdialysis, Stockholm, Sweden) was implanted

vertically 1 mm above the nucleus accumbens (NAc) (AP: + 1.5 mm; ML: - 0.9 mm; DV: -

4.0 mm from the bregma), and then fixed to the skull with dental cement. Three days after

Resultados

135

the surgery, the analytical probe (CMA/7/1mm, CMA Microdialysis, Stockholm, Sweden)

was inserted into the guide cannula. Forty-eight hours after probe implantation, animals

were habituated to the experimental environment overnight. The following morning, a

ringer solution (147 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.3 CaCl2) was pumped through the dialysis

probe at a constant rate of 1 ? l/min. Four consecutive 15-min dialysis samples were then

collected for determination of baseline DA levels. Animals then received a s.c. injection of

nicotine hydrogen tartrate salt (0.5 mg/kg, s.c.) or saline and 8 samples were collected

every 18 min and analyzed by HPLC. Results were expressed as percent of baseline and

the area under the curve (AUC).

Dopamine determination. Dialysate samples (15 ?l) were injected without any

purification into a HPLC apparatus that consisted of a pump linked to an automatic injector

(Agilent 1100, Barcelona, Spain), a reverse-phase column (Zorbax SB C18, 3.5 ? m, 150 x

4.6 mm, Agilent Technologies, Barcelona, Spain) and a coulometric detector (Coulochem

II, ESA Inc., Chelmsford, USA) with a 5011 analytical cell to quantify DA. The first

electrode was fixed at -100 mV and the second electrode at +300 mV. The composition of

the mobile phase was 50 mM NaH2PO4, 0.1 mM Na2EDTA, 0.65 mM octyl sodium sulfate

and 14% (vol/vol) methanol, pH 3.5.

Histology. At the end of the experiments, animals were sacrificed and brains were

quickly removed and stored at -80ºC. In order to check the position of the probe, brains

were cut using a cryostat in 20 µm serial sections, which were then processed with cresyl

violet and observed under a microscope. Only those animals that had been implanted

correctly were used in the study.

Data analysis

Acute effects of nicotine administration, global withdrawal scores and conditioned

taste aversion data were compared by using a between subjects two-way ANOVA

(genotype and treatment as factors of variation). For conditioned place preference, values

for time spent by each animal in drug-paired compartment during the pre-conditioning and

post-conditioning measurements were compared by using a two-tailed Student’s paired t-

test. The microdialysis data were analyzed using three-way ANOVA with treatment (saline

and nicotine) and genotype (wild-type and knockouts) as between subject factors and time

after nicotine injection as within subject factor. Data of AUC were compared by using a

between subjects two-way ANOVA (genotype and treatment as factors of variation).

Resultados

136

Unpaired student t-test was employed to compare DA basal level values between

genotypes. Differences were considered significant if the probability of error was less than

5%.

Resultados

137

Results

Acute effects induced by nicotine

The acute administration of nicotine hydrogen tartrate salt (1, 3 and 6 mg/kg)

decreased locomotor activity and induced antinociceptive responses in the hot-plate and

tail-immersion tests in both wild-type and knockout animals (n = 10 for all experimental

groups). No differences between genotypes were found for any of the acute responses

evaluated. The acute injection of nicotine hydrogen tartrate salt (1, 3 and 6 mg/kg) reduced

locomotor activity in a similar way in both genotypes (Fig. 1). Horizontal and vertical

movements were measured. Two-way ANOVA for horizontal movements revealed a

significant effect of treatment (F [3,69] = 31.996; p < 0.01), no effect of genotype (F [1,69]

= 0.845; n.s.), nor interaction between these two factors (F [3,69] = 1.744; n.s.). Similarly,

two-way ANOVA for vertical activity revealed a significant effect of treatment (F [3,69] =

43.067; p < 0.01), no effect of genotype (F [1,69] = 1.261; n.s.) nor interaction between

these two factors (F [3,69] = 4.291; p < 0.01).

Nicotine-induced antinociceptive responses measured in the tail-immersion and

hot-plate tests were similar in both wild-type and knockout animals (Table 1). In the tail-

immersion test, two-way ANOVA revealed a significant effect of the treatment (F [3,69] =

27.392; p < 0.01), without genotype effect (F [1,69] = 3.243; n.s.) nor interaction between

the two factors (F [3,69] = 2.161; n.s.). In the hot-plate test, two-way ANOVA for the

licking response in the hot-plate test revealed a significant effect of the treatment (F [3,69]

= 7.955; p < 0.01), without genotype effect (F [1,69] = 0.003; n.s.) nor interaction between

genotype and treatment (F [3,69] = 0.876; n.s.). Similarly, two-way ANOVA for the

jumping response revealed a significant effect of treatment (F [3,69] = 22.868; p < 0.01),

without genotype effect (F [1,69] = 2.650; n.s.) nor interaction between the two factors (F

[3,69] = 1.517; n.s.) (Table 1).

Nicotine dependence and withdrawal

During the behavioural observation performed before mecamylamine

administration, no somatic signs of withdrawal were observed in any group of mice (data

not shown). After mecamylamine (1 mg/kg) injection, nicotine withdrawal syndrome was

manifested by the presence of various somatic signs in mice receiving chronic nicotine

hydrogen tartrate salt treatment (10 and 25 mg/kg/day for 6 days) (n = 31 for saline-treated

Resultados

138

wild-type mice, n = 28 for saline-treated knockout mice, n = 16 for wild-type and

knockout mice treated with 10 mg/kg, n = 14 for wild-type and knockout mice treated with

25 mg/kg). The severity of the withdrawal syndrome was similar in both genotypes for

both doses tested (Fig. 2). Thus, analysis of the different individual signs of withdrawal

revealed no differences between genotypes (Table 2). When the global withdrawal score

was calculated, two-way ANOVA showed a significant effect of treatment (F [2,113] =

30.331; p < 0.01), no effect of genotype (F [1,113] = 0.01; n.s.) nor interaction between

these two factors (F [2,113] = 0.337; n.s.).

Rewarding properties of nicotine in the place conditioning paradigm

Rewarding effects induced by nicotine were investigated in A2A knockout and wild-

type mice using the place conditioning paradigm (n = 13-14 for wild-type groups, n = 14

for knockout groups). A significant conditioned place preference was observed in wild-

type mice treated with nicotine hydrogen tartrate salt (0.5 mg/kg), as revealed by a

significant increase in the time spent in the drug-paired compartment in the post-

conditioning versus the pre-conditioning phase (t [1,13] = -3.722; p < 0.05). In contrast,

A2A knockout mice spent a similar time in the drug-paired compartment during the post-

conditioning and the pre-conditioning phases, demonstrating the absence of nicotine

rewarding effects in these mutants (t [1,14] = -0.485; n.s.) (Fig. 3a). A higher dose of

nicotine hydrogen tartrate salt (1 mg/kg) was also tested. However, no conditioned

response was observed after the administration of this dose of nicotine in wild-type (t

[1,13] = -1.309; n.s.) nor in A2A knockout mice (t [1,13] = -1.019; n.s.) (Fig. 3b).

Nicotine conditioned taste aversion

Figure 4 shows that there was a similar conditioned taste aversion to nicotine

hydrogen tartrate salt (5 mg/kg) in both wild-type and A2A knockout mice (n = 10 for

saline-treated wild-type mice, n = 12 for nicotine-treated wild-type mice, n = 10 for saline-

treated knockout mice and n = 12 for nicotine-treated knockout mice). The consumption of

drug-paired flavoured solutions decreased in nicotine-treated wild-type and A2A knockout

mice compared to saline-treated mice during trials 2 and 3 (Fig. 4a). Two-way ANOVA for

trial 2 showed a significant effect of treatment (F [1,40] = 62.274; p < 0.01), but no effect

of genotype (F [1,40] = 0.536; n.s.), nor interaction between these two factors (F [1,40] =

0.320; n.s.). Two-way ANOVA for trial 3 showed a significant effect of treatment (F

Resultados

139

[1,40] = 39.206; p < 0.01), but no effect of genotype (F [1,40] = 0.274; n.s.), nor

interaction between these two factors (F [1,40] = 0.447; n.s.). The percentage of

consumption of drug-paired flavoured solution in trial 3 was similarly decreased in wild-

type and A2A knockout mice treated with nicotine when compared to saline-treated animals

(Fig. 4b). Two-way ANOVA for the percentage of consumption in trial 3 revealed a

significant effect of treatment (F [1,40] = 30.295; p < 0.01), but no effect of genotype (F

[1,40] = 1.319; n.s.), nor interaction between these two factors (F [1,40] = 1.226; n.s.)

Nicotine-induced increase of extracellular levels of dopamine in the nucleus

accumbens

Extracellular levels of DA in the NAc were measured by using microdialysis

technique (n = 5 for saline-treated wild-type mice, n = 8 for saline-treated knockout mice,

n = 6 for nicotine-treated wild-type mice, n = 7 for nicotine-treated knockout mice). Basal

levels of DA in NAc dialysates were similar in wild-type (4.48 ± 0.78 pg/18? l) and A2A

knockout mice (7.18 ± 2.26 pg/18? l) (F [1,25] = 0.97; n.s.). As shown in figure 5a,

nicotine hydrogen tartrate salt administration (0.5 mg/kg) increased DA in NAc dialysates

in wild-type animals but not in A2A knockout mice. The maximal increase of DA induced

by nicotine in the NAc of wild-type mice (160.8%) was significantly different from that of

knockout mice (106.3%) (F [1,12] = 9.102; p?< 0.01). Three-way ANOVA revealed a main

effect of genotype (F [1,22] = 10.073; p?< 0.01), treatment (F [1,22] = 4.543; p?< 0.05) and a

significant interaction between time and genotype (F [7,154] = 2.871; p?< 0.01). No other

significant two- or three-way interactions among factors were observed. Similar results

were obtained when analyzing the AUC values for DA extracellular levels after nicotine

hydrogen tartrate (0.5 mg/kg) or saline administration (Fig. 5b). Thus, two-way ANOVA

indicated significant treatment effect (F [1,22] = 4.056; p?= 0.05), genotype effect (F [1,22]

= 7.045; p?< 0.05), but not interaction between these two factors (F [1,22] = 1.312; n.s.).

Figure 6 shows a representative coronal section of the mouse brain with the

placement of the microdialysis probe through the NAc. Most of the probes were located

medial to the anterior commissure, between 1.94 and 1.18 mm from bregma, and dorsal to

the olfactory tubercule.

Resultados

140

Discussion

The present study demonstrates the role of A2A adenosine receptors in the

rewarding properties of nicotine. Nicotine-induced conditioned place preference and

enhanced extracellular levels of DA in the NAc were abolished in A2A knockout. However,

these mutant mice showed similar locomotor and antinociceptive effects induced by an

acute injection of nicotine, and similar nicotine taste aversion as well as somatic

manifestations of nicotine withdrawal syndrome in comparison to wild-type mice.

Deletion of A2A adenosine receptors did not modify the main acute responses

induced by nicotine. Thus, acute nicotine administration produced similar hypolocomotion

and antinociceptive effects in the tail-immersion and hot-plate tests in wild-type and

knockout animals, suggesting that A2A adenosine receptors do not participate in these

pharmacological responses. The lower basal locomotor activity observed in mice lacking

A2A adenosine receptors is in agreement with previous studies showing a hypolocomotor

phenotype on these mice (Ledent et al., 1997; Soria et al., 2004; 2006). A recent study has

reported that pharmacological blockade of adenosine receptors by theophylline decreases

nicotine-induced antinociception in the formalin test (Homayounfar et al., 2005). This

apparent controversy can be explained by the different tests used and because theophylline

is a non-selective adenosine receptor antagonist also acting on other targets.

We have investigated, in A2A knockout mice, different responses induced by

repeated nicotine administration in relation to its addictive properties. Chronic

administration of a wide range of doses of nicotine, has been shown to develop physical

dependence revealed by the incidence of several somatic signs after nicotine withdrawal in

rodents (Hildebrand et al., 1998; Isola et al., 1999; Castañé et al., 2002; Damaj et al., 2003;

Grabus et al., 2005). In our experimental conditions, the nAChR antagonist mecamylamine

precipitated a withdrawal syndrome with a similar severity in wild-type and knockout mice

chronically treated with nicotine hydrogen tartrate salt (10 and 25 mg/kg/day). This finding

suggests that the A2A adenosine receptors do not participate in the expression of somatic

component of nicotine withdrawal.

Acute rewarding effects of drugs of abuse are known to be responsible for the

initiation of the addictive process (Koob and Le Moal, 2001). The acute rewarding

properties of nicotine were investigated in A2A knockout mice by using the place-

conditioning paradigm. In our experimental conditions, nicotine hydrogen tartrate at the

dose of 0.5 mg/kg induced a significant place preference in wild-type mice, but failed to

produce a significant effect in mice lacking A2A adenosine receptors. The administration of

Resultados

141

a higher dose of nicotine hydrogen tartrate (1 mg/kg) did not produce place preference in

wild-type nor in A2A knockout mice. This result rules out the possibility that the genetic

deletion of the A2A receptor resulted in a rightward shift of the nicotine dose-response

curve. In addition, the impairment of knockout mice to express nicotine-induced

conditioned place preference does not seem to be the consequence of a learning or

discriminative alteration since nicotine conditioned taste aversion was similarly developed

in both genotypes. Moreover we have recently demonstrated that A2A knockout mice

express cocaine-induced conditioned place preference and are able to maintain an operant

responding for food and cocaine (Soria et al., 2004; 2006). Taken together these results

indicate that A2A receptors are involved in a different manner in the addictive properties

induced by the different drugs of abuse.

Like most drugs of abuse, nicotine rewarding properties have been related to the

activation of the mesolimbic dopaminergic system, and the consequent increase of

extracellular levels of DA in the NAc (Di Chiara and Imperato, 1988; Pontieri et al., 1996;

Zocchi et al., 2003). On the other, the discriminative stimulus effects of nicotine, despite

showing some modification with dopaminergic compounds, appear not to be solely

mediated via the mesolimbic dopamine system (for review, see Shoaib, 1998). Accordingly

with our behavioural data, in vivo microdialysis experiments showed that the enhancement

in DA efflux in the NAc induced by nicotine in wild-type mice was abolished in A2A

knockout animals.

NAChRs are present on the presynaptic glutamatergic terminals in the ventral

tegmental area (VTA). Nicotine directly stimulates these VTA glutamatergic terminals, in

addition to an activation of postsynaptic nicotine receptors located on DA neurons

(Mansvelder et al., 2003). Besides, nicotine also binds to nAChRs expressed by the GABA

interneurons in the VTA. Thus, the final activation of the mesolimbic dopaminergic

activity by nicotine depends on a functional balance between the excitatory and inhibitory

inputs on the VTA DA neurons (Mansvelder et al., 2003; Laviolette and Van der Kooy,

2004). It has been recently reported that the increase in glutamatergic activity in response

to nicotine administration causes adaptive changes by up-regulating metabotropic

glutamate group I receptors in the amygdala (i.e. mGlu1 and mGlu5 receptors) (Kane et al.,

2005). In this line, a specific mGlu5 receptor antagonist MPEP decreased nicotine self-

administration (Paterson et al., 2003; Paterson and Markou, 2005), and the reinstatement of

this behaviour in rodents (Tessari et al., 2004; Bespalov et al., 2005), providing further

Resultados

142

support for the involvement of mGlu5 receptor in nicotine reinforcing effects.

Interestingly, mGlu5 receptors regulate adenosine A2A receptor signaling in neostriatal

neurons (Nishi et al., 2003), and morphological data suggest that A2A, mGlu5 and D2 DA

receptors colocalize at a pre- and post-synaptical level in the striatum (Díaz-Cabiale et al.,

2002; Agnati et al., 2003; Rodrigues et al., 2005). In this regard, A2A and mGluR5

receptors have been reported to be co-located in striatal glutamatergic terminals, which

facilitates glutamate release in a synergistic manner (Rodrigues et al., 2005). Thus, we

cannot exclude the possibility that the absence of A2A adenosine receptors may impair

glutamate transmission also in the VTA affecting dopamine efflux in the NAc. In addition,

other different behavioural and biochemical models have demonstrated the existence of

functionally significant antagonistic A2A/D2 and mGlu5/D2 receptor interactions and

synergistic A2A/mGlu5 receptor interactions (for review see Agnati et al., 2003).

The major signal transduction pathway used by A2A receptors depends on the

activation of adenylyl cyclase and cAMP-dependent protein kinase (PKA) enzymes (Kull

et al., 2000), which in turn regulates the state of phosphorylation of various substrate

proteins such as DARPP32, CREB and MAPK. DARPP32 is a signal transduction

molecule that plays an important role in neuronal plasticity associated to drug addiction

(Gould and Manji, 2005), and that has been reported to be altered in mice lacking A2A

adenosine receptors (Svenningsson et al., 2000). The coactivation of A2A and mGlu5

receptors produces synergistic effect on DARPP32 phospohorylation induced by PKA.

Both A2A and mGlu5 receptors have been related to long-term potentiation and long-term

depression processes (d’Alcantara et al., 2001, Sung et al., 2001), suggesting that

A2A/mGlu5 receptor interaction might be involved in striatal neuronal plasticity (Agnati et

al., 2003). Since nicotine regulates DARPP32 phosphorylation in neostriatal neurons

(Hamada et al., 2004, 2005), we postulate that mice lacking A2A adenosine receptors may

have a disruption on the A2A/mGlu5 receptor synergism needed to complete some of the

intracellular responses induced by nicotine. This alteration may underlie the behavioural

and biochemical differences observed in the present study. Interestingly, we have recently

reported that the rewarding and aversive effects of THC (Soria et al., 2004) as well as the

reinforcing efficacy of cocaine (Soria et al., 2006) are reduced in A2A knockout mice. In

agreement, Andersson and colleagues (2005) have shown that intact A2A adenosine

receptor transmission, involving cAMP/PKA/DARPP32 cascade, is required for the

biochemical and behavioural effects of the cannabinoid agonist CP55,940. Similarly to

Resultados

143

cannabinoids, a critical role for DARPP32 has been reported in long-term effects of

different drugs of abuse such as psychostimulants (Valjent et al., 2005).

Altogether, these results suggest the possibility that A2A adenosine receptors play

an important role in the rewarding properties of nicotine and other drugs of abuse, as it has

been demonstrated in previous findings with THC and cocaine (Soria et al., 2004; 2006).

Indeed, we have shown that A2A adenosine receptors are involved in the acute rewarding

properties of THC and nicotine as well as in the motivation to seek cocaine. It is well

known that place conditioning procedures and self-administration paradigms are used to

study different aspects of reward. Place conditioning procedures allow to evaluate an

indirect measurement of the acute rewarding properties of a drug. Self-administration

procedures are complex models that permit to directly determine the reinforcing properties

of a drug of abuse by using several paradigms that resemble the drug-taking in humans.

Taking into account the present and previous results, we postulate that A2A adenosine

receptors play an important role in the rewarding properties of several drugs of abuse. The

different mechanism of action of each drug might account to explain the different role of

A2A adenosine receptors observed in the rewarding properties of psychostimulants, like

cocaine, and other drugs of abuse, such as THC and nicotine.

Resultados

144

Acknowledgements

This study was supported by grants from Spanish Ministerio de Educación y Ciencia (SAF

2004/568, BFU2004-00920/BFI and GEN2003-20651-C06-04), Generalitat de Catalunya

(2002 SGR00193), Redes del Instituto Carlos III (C 03/06 and G 03/005), European

Communities (NEWMOOD OJ2003/C164-05166, GENADDICT LSHM-CT-2004-

005166) and NIH (Extra-mural research project #DA016768). GS is a fellowship from

Spanish MCYT and AC was a fellowship from DURSI.

Resultados

145

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Resultados

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Resultados

150

Table 1. Acute nicotine-induced hypolocomotion and antinociception in A2A knockout and wild-type mice.

Antinociception (latency sec)

TI HP licking HP jumping

Wild-type mice

Vehicle 2.12 ± 0.14 14.60 ± 1.70 48.37 ± 4.31

Nicotine 1 mg/kg 2.80 ± 0.29 13.98 ± 1.31 77.96 ± 14.86

Nicotine 3 mg/kg 3.83 ± 0.57 17.34 ± 1.72 131.73 ± 21.17

Nicotine 6 mg/kg 4.49 ± 0.31 20.34 ± 2.23 157.35 ± 24.13

A2A knockout mice Vehicle 2.33 ± 0.38 12.07 ± 1.47 54.02 ± 5.62

Nicotine 1 mg/kg 2.29 ± 0.25 15.84 ± 1.47 76.54 ± 18.11

Nicotine 3 mg/kg 4.74 ± 0.43 15.40 ± 1.15 195.16 ± 17.26

Nicotine 6 mg/kg 5.65 ± 0.38 22.46 ± 2.07 171.59 ± 19.13

Antinociceptive responses in tail-immersion (TI) and hot-plate (HP) tests for the licking and the jumping responses were measured 15 and 16 min respectively after vehicle or nicotine hydrogen tartrate salt administration (1, 3 and 6 mg/kg, s.c.). Results are expressed as mean ± SEM of latency time in wild-type and A2A knockout mice (n = 10 mice per group).

Resultados

151

Table 2. Mecamylamine-precipitated nicotine withdrawal syndrome in A2A knockout and wild-type mice.

Data are expressed as mean ± SEM of counted (wet dog shakes, paw tremor and scratches) and checked (body tremor, genital licks, ptosis, teeth chattering and piloerection) somatic signs of nicotine withdrawal. Two-way ANOVA revealed a significant effect of nicotine treatment for body tremor, ptosis, wet dog shakes, teeth chattering, paw tremor, scratches, piloerection and the global withdrawal score (GWS). No significant genotype differences or interaction between genotype and treatment in any case. * p < 0.05, ** p < 0.01 (one-way ANOVA, vehicle group comparison).

Wild-type mice A2A Knockout mice

Saline

Nicotine hydrogen

tartrate salt 10 mg/kg

Nicotine hydrogen


Saline

Nicotine hydrogen


Nicotine hydrogen


Body tremor 1.13 ± 0.26 3.68 ± 0.48 ** 4.28 ± 0.52 ** 0.89 ± 0.24 2.31 ± 0.56 * 3.21 ± 0.58 **

Genital Licks 0.32 ± 0.11 0.68 ± 0.25 0.28 ± 0.16 0.64 ± 0.16 1.00 ± 0.46 0.43 ± 0.22

Ptosis 0.42 ± 0.20 1.18 ± 0.49 1.07 ± 0.37 0.79 ± 0.25 1.87 ± 0.57 2.00 ± 0.52

Wet dog shakes 0.77 ± 0.17 2.37 ± 0.49 ** 3.71 ± 0.80 ** 1.04 ± 0.41 4.62 ± 1.09 ** 4.00 ± 0.76 **

Teeth chattering 0.09 ± 0.07 0.31 ± 0.15 1.00 ± 0.27 ** 0.04 ± 0.04 0.12 ± 0.08 1.50 ± 0.55 **

Paw tremor 4.32 ± 0.79 14.50 ± 1.77 ** 12.86 ± 1.53 ** 3.00 ± 0.52 10.68 ± 3.51 8.28 ± 1.29 **

Scratches 6.90 ± 1.07 2.37 ± 1.18 13.07 ± 6.57 10.14 ± 3.52 3.06 ± 0.90 15.93 ± 6.92

Piloerection 0.74 ± 0.23 2.31 ± 0.56 1.93 ± 0.49 ** 0.46 ± 0.17 2.43 ± 0.41 1.07 ± 0.28 **

GWS 10.89 ± 0.95 21.15 ± 1.75 ** 27.03 ± 3.19 ** 12.55 ± 1.71 19.87 ± 2.15 * 26.53 ± 3.26 **

Resultados

152

Legends of the figures

Figure 1. Acute nicotine-induced hypolocomotion in A2A knockout and wild-type

mice. Horizontal and vertical movements were evaluated 5 min after acute vehicle or

nicotine hydrogen tartrate salt (1, 3 and 6 mg/kg, s.c.) administration. Results are expressed

as mean ± SEM of photocells counts during 10 min period in wild-type and A2A knockout

mice (n = 10 mice per group).

Figure 2. Mecamylamine-precipitated withdrawal syndrome in A2A knockout and

wild-type mice. Abstinence was precipitated by acute administration of the nicotine

antagonist mecamylamine (1 mg/kg, s.c.) after a 6-day period of nicotine infusion (10 and

25 mg/kg/day nicotine hydrogen tartrate salt) by using s.c. minipumps. Mice were

observed 30 min after the antagonist administration. A global withdrawal score was

calculated for each animal by giving at each individual sign a proportional weight, as

described in the methods. Results are expressed as mean ± SEM of global withdrawal

score in wild-type (white bars) and A2A knockout (black bars) mice (n = 28-32 mice for

vehicle groups and n = 13-16 for nicotine groups). ?

p < 0.05, ??

p < 0.01 (one-way

ANOVA, vehicle group comparison).

Figure 3. Nicotine conditioned place preference in A2A knockout and wild-type mice.

Results are expressed as mean ± SEM of the time spent in the drug-paired compartment

(sec) during the pre-conditioning (white bars) and post-conditioning phase (black bars) (n

= 13-14 mice per group). Two doses of nicotine hydrogen tartrate salt were tested, 0.5

mg/kg (a) and 1 mg/kg (b). ?

p < 0.05 comparison between the time spent in the drug-

paired compartment during the pre-conditioning and post-conditioning phase (unpaired

Student´s t-test).

Figure 4. Nicotine conditioned taste aversion in A2A knockout (A2A KO) and wild-type

(WT) mice. Nicotine (5 mg/kg) resulted in a similar strong taste aversion in wild-type and

A2A knockout mice ( ? ,WT saline-paired flavour n = 10 ; ¦ , WT nicotine-paired flavour n

= 12, ? , A2A KO saline-paired flavour n = 10 ; ? , A2A KO nicotine-paired flavour).

Results are expressed as (a) the mean ± SEM of the fluid intake (ml) during trials 1-3 and

(b) the mean ± SEM of amounts consumed of the drug-paired flavour as a percentage of

the total fluid intake during trial 3. Trials 1 and 2 were conditioning sessions in which

Resultados

153

flavoured solutions were paired with nicotine and saline. Trial 3 represents the mean of the

two test sessions in which both nicotine and saline-paired flavoured solutions were

presented simultaneously without drug injections.

Figure 5. Dopamine levels in the nucleus accumbens in A2A knockout and wild-type

mice. (a) Effects of nicotine nicotine hydrogen tartrate salt (0.5 mg/kg, s.c.) and vehicle on

DA concentrations in dialysates obtained by in vivo microdialysis from the NAc of A2A

adenosine knockout and wild-type mice (n = 5-8 per group). The arrow indicates nicotine

or vehicle administration at time 0. Dialysate samples were taken every 18 min during 72

min before and 124 min after injection. (b) Bar graphs of area under the curve (AUC)

values for the DA concentration in dialysates after nicotine or vehicle administration in

knockout (black bars) and wild-type (white bars) mice. All values are expressed as mean ±

SEM. ??

p < 0.01, comparison between genotypes (one-way ANOVA).

Figure 6. (a) Representative coronal section (20 µm) of the mouse brain stained with

cresyl violet illustrating the placement of the probe in the NAc (AP: +1.18 mm from

bregma). (b) diagram showing the representative probe placements between AP: +1.70 mm

and AP: +0.86 mm from bregma.

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161

Morfina

"Al l í est aba, descubiert o de pront o, el secret o de la fel icidad sobre el que los f i lósofos durant e t ant as edades habían disput ado; la dicha podía comprarse ahora por un penique."

Thomas de Quincey en “ Confesiones de un inglés consumidor de opio”

La morf ina es el alcaloide mayoritario de la planta de opio (Papaver Somniferum), que

fue int roducido en China y la India por los árabes. Se sabe que los primeros usos (4000

a.C.) fueron medicinales, mediante bebidas e infusiones. En la India, por el cont rario,

fue ut il izada como sustancia para producir euforia o valor ent re los soldados en las

batallas. A principios del siglo XIX se aisló la morf ina (1805), y en 1874 se sintet izó la

heroína. A mediados del siglo XIX, sumado a la invención de la aguj a hipodérmica, las

consecuencias nefastas del uso indiscriminado de los opiáceos comienza a ser notado

por algunos gobiernos occidentales y se reconoce que la adicción de opiáceos es una de

las más temibles a las que se enfrenta la sociedad en todos los est ratos

socioeconómicos. La morf ina puede ser consumida oralmente, sin embargo la forma de

consumo más extendida de la morf ina, así como de la heroína, es inyectada por vía

intravenosa.

Las acciones f isiológicas de los opioides están mediadas por t res receptores opioides

(mu, delta y kappa). Estos receptores opioides pertenecen a la superfamilia de los

receptores acoplados con la proteína G. A t ravés de la unión con proteínas G, los

receptores opioides son capaces de inhibir la actividad de la adenilato ciclasa (Sharma y

cols., 1977), modif icar la conduct ividad de canales K+ y Ca+2 (Surprenant y cols., 1990;

Jin y cols., 1994) y act ivar las vías de señalización de la fosfolipasa C y de las MAP

quinasas (Burt y cols., 1996; Fukuda y cols., 1996). En condiciones f isiológicas, los

receptores opioides son act ivados por un conj unto de compuestos endógenos llamados

pépt idos opioides. Estos pépt idos opioides provienen de la degradación enzimát ica de

tres precursores peptídicos de gran tamaño, la proopiomelanocortina, la proencefalina y

la prodinorf ina. De la proopiomelanocort ina se obt iene principalmente la β-endorfina,

de la proencefalina se obt ienen diversos pépt idos opioides ent re los que cabe destacar

la Met - y Leu-encefalina y de la prodinorf ina se generan las dinorf inas y las

neoendorfinas, entre otros.

Los receptores y pépt idos opioides se expresan de forma importante en el SNC y

también en la periferia (Mansour y cols., 1995). Además de intervenir en las rutas del

dolor, el sistema opioide está muy representado en zonas del cerebro que pertenecen al

sistema límbico como el VTA, y el NAc (Mansour y cols., 1988). Se ha observado una

elevada densidad de receptores mu en el caudado putamen, NAc, tálamo, hipocampo,

sustancia gris periacueductal, sustancia nigra y amígdala, Los receptores delta t ienen

Resultados

162

una localización más rest ringida, con una concent ración más elevada en el est riado,

tubérculo olfatorio y corteza cerebral. Los receptores kappa se encuent ran sobre todo

en el NAc, tubérculo olfatorio, área preópt ica, amígdala e hipotálamo. El sistema

opioide está implicado en una amplia variedad de funciones que regulan las reacciones

al est rés, la alimentación, el estado de ánimo, el aprendizaj e, la memoria y las

funciones inmunológicas (para una revisión detallada, véase Van Ree y cols., 1999; De

Vries y Shippenberg, 2002).

Resultados

163

Artículo 5 Behavioral and biochemical opioid responses related to its addictive properties are

attenuated in adenosine A2A receptor knockout mice. Castañé A, Soria G, Kitchen I,

Maldonado R, Valverde O. (En preparación).

OBJETIVOS

Evaluar la part icipación del receptor A2A en las propiedades mot ivacionales de la

morf ina y de sus efectos farmacológicos ut il izando ratones deficientes en el

receptor A2A.

RESULTADOS

El t ratamiento agudo de morf ina (5 y 10 mg/ kg, s.c.) produce un aumento de la

act ividad locomotora y un efecto ant inocicept ivo similar en los animales deficientes

en el receptor A2A y en los animales wild-type.

Los animales wild-type mostraron una preferencia de plaza inducida por morfina que

no fue observada en los animales A2A knockout.

Los animales wild-type most raron una aversión de plaza inducida por el síndrome de

abst inencia de morf ina que no fue observada en los animales knockout deficientes

en el receptor adenosina A2A.

CONCLUSIÓN

Los receptores de adenosina A2A son esenciales para las propiedades mot ivacionales

tanto gratificantes como disfóricas, producidas por la morfina.

Nota:

Este t rabaj o se está desarrollando en colaboración con el grupo de invest igación del

profesor Ian Kitchen en Inglaterra (University of Surrey, Surrey, UK). Nosot ros hemos

evaluado las propiedades mot ivacionales de la morf ina y sus efectos farmacológicos

ut il izando ratones deficientes en el receptor A2A. En paralelo, el grupo del profesor

Kitchen está evaluando el aumento de dopamina ext racelular en el NAc t ras una

inyección aguda de morf ina, también en ratones A2A knockout . Por esta razón, solo

mostramos los resultados realizados en nuestro laboratorio.

Resultados

164

Resultados

165

DISMINUCIÓN DE LAS RESPUESTAS COMPORTAMENTALES RELACIONADAS CON LAS

PROPIEDADES ADICTIVAS DE LOS OPIOIDES EN LOS ANIMALES DEFICIENTES EN EL

RECEPTOR DE ADENOSINA A2A

Anna Castañé, Guadalupe Soria, Rafael Maldonado, Olga Valverde

Laboratori de Neurofarmacologia, Departament de Ciències Experimentals i de la Salut , Universitat Pompeu Fabra, C/Doctor Aiguader 80, 08003 Barcelona, Spain

Existen diferentes evidencias que nos permiten postular una interacción ent re el

sistema opioide y el purinérgico. En primer lugar, los receptores A2A regulan la

expresión del gen de la proencefalina (Fink y cols., 1992; Shif fmann y Vanderhaeguen,

1993) de cuya proteína se generan diversos ligandos endógenos de los receptores

opioides (Mansour y cols., 1995). Además, estudios previos en nuest ro laboratorio, y

ot ros más recientes, han demost rado que la severidad del síndrome de abst inencia de

morf ina precipitado por naloxona se encuent ra aumentado en los animales deficientes

en el receptor A2A (Berrendero y cols., 2003, Bailey y cols., 2004), sugiriendo un papel

fundamental de este receptor en la expresión del síndrome de abst inencia de morf ina.

Nuestro objetivo en este estudio ha sido evaluar el papel del receptor de adenosina A2A

en las propiedades mot ivacionales de la morf ina mediante el uso del paradigma de

condicionamiento espacial. Con este obj et ivo, hemos estudiado las respuestas

locomotoras y ant inocicept ivas inducidas por un t ratamiento agudo de morf ina. La

respuesta hiperlocomotora inducida por la morf ina fue evaluada mediante caj as de

act ividad locomotora, y fue similar en ambos fenot ipos. El efecto ant inocicept ivo de la

morf ina fue estudiado en el test de inmersión de la cola y de la placa caliente, y

también fue parecido en los animales wild-type y A2A knockout. Mediante la preferencia

de plaza condicionada hemos observado que las propiedades grat if icantes de la morf ina

están bloqueadas en animales deficientes en el receptor A2A. Ut il izando el paradigma

de la aversión de plaza condicionada hemos demost rado que las propiedades disfóricas

asociadas al síndrome de abst inencia de morf ina están igualmente anuladas en estos

animales knockout. Estos resultados indican una implicación específica de los receptores

A2A en las propiedades motivacionales de la morfina.

Resultados

Resultados

166

Efectos agudos inducidos por la morfina en animales A2A knockout y wild-type

La administ ración aguda de morf ina (5 y 10 mg/ kg, s.c.) produj o un aumento de la

act ividad locomotora similar en los animales deficientes en el receptor A2A y wild-type.

Del mismo modo, las respuestas ant inocicept ivas medidas en el test de inmersión de la

cola y en el test de la placa caliente también fueron similares en ambos genot ipos. Las

respuestas locomotoras inducidas por la morf ina fueron evaluadas mediante el uso de

caj as de act ividad locomotora durante 30 min (Mart ín y cols., 2000). Así, la ANOVA de

dos vías reveló efectos del t ratamiento en todas las respuestas agudas, pero no most ró

interacción ent re t ratamiento y genot ipo (Tabla 1). La ANOVA de una vía calculada para

los movimientos ambulatorios (Fig. 1a) mostró un efecto significativo del tratamiento en

los animales wild-type (F [2.29] = 59.414; p < 0.01) y knockout (F [2.29] = 19.326; p <

0.01). Los análisis post -hoc most raron diferencias signif icat ivas en los animales wild-

type y knockout t ratados con morf ina a las dosis de 5 (p < 0.05 para los wild-type; p <

0.01 para los knockout) y 10 mg/kg (p < 0.05 para ambos casos), en comparación con los

animales t ratados con salino. La ANOVA de una vía calculada para la act ividad

horizontal total (Fig. 1b) reveló un efecto signif icat ivo del t ratamiento en los animales

wild-type (F [2.29] = 26.954; p < 0.01) y knockout (F [2.29] = 12.541; p < 0.01). Los

análisis post -hoc most raron diferencias signif icat ivas en los animales wild-type y

knockout tratados con morfina a la dosis de 10 mg/kg (p < 0.01) en comparación con los

animales t ratados con salino. La ANOVA de una vía calculada para la act ividad

locomotora vert ical (Fig. 1c) most ró un efecto signif icat ivo del t ratamiento en los

animales wild-type (F [2.28] = 11.487; p < 0.01) y knockout (F [2.29] = 4.188; p < 0.05).

Los análisis post -hoc most raron diferencias signif icat ivas en los animales wild-type

t ratados con morf ina a las dosis de 5 y 10 mg/ kg (p < 0.01), así como en los animales

knockout t ratados con morf ina a la dosis de 10 mg/ kg (p < 0.05), en comparación con

los animales tratados con salino.

Resultados

167

Tabla 1. ANOVA de dos vías para las respuestas locomotoras y antinociceptivas inducidad por una administración aguda de morfina en ratones deficientes en el receptor A2A y wild-type. ANOVA de dos vías con tratamiento (T) y genotipo (G) como factores de variancia.

Las respuestas ant inocicept ivas inducidas por la morf ina (5 y 10 mg/ kg, s.c.) fueron

evaluadas en ratones deficientes en el receptor A2A y en ratones wild-type mediante el

uso del test de inmersión de la cola y el test de la placa caliente (Simonin y cols.,

1998). La ANOVA de una vía calculada sobre la latencia en ret irar la cola del baño

caliente most ró un efecto signif icat ivo del t ratamiento en los animales wild-type (F

[2.28] = 42.652; p < 0.01) y knockout (F [2.29] = 21.192; p < 0.05). Los análisis post -hoc

most raron diferencias signif icat ivas en los animales wild-type y knockout t ratados con

morf ina a las dosis de 5 (p < 0.05 para los knockout ; p < 0.01 para los wild-type) y 10

mg/ kg (p < 0.01 para ambas dosis) en comparación con los animales t ratados con salino

(Fig. 2a). La ANOVA de una vía calculada sobre la respuesta de lameteo en el test de la

placa caliente most ró un efecto signif icat ivo del t ratamiento en los animales knockout

(F [2.29] = 5.963; p < 0.01), pero no en los animales wild-type (F [2.29] = 3.019; n.s.).

Los análisis post -hoc most raron diferencias signif icat ivas en los animales knockout

t ratados con morf ina a la dosis de 10 mg/ kg (p < 0.01) en comparación con los animales

t ratados con salino (Fig. 2b). La ANOVA de una vía calculada sobre la respuesta de salto

Actividad Locomotora

Ambulatoria Horizontal Total Vertical

F p F p F p

Tratamiento F(2.54) = 63.672 0.01 F(2.54) = 35.977 0.01 F(2.53) = 14.704 0.01

Genotipo F(1.54) = 9.526 0.01 F(1.54) = 17.606 0.05 F(1.53) = 4.523 0.05

TxG F(2.54) = 0.523 n.s. F(2.54) = 0.587 n.s. F(2.53) = 1.749 n.s.

Antinocicepción

Inmersión de la cola Placa caliente: lameteo Placa caliente: salto

F p F p F p

Tratamiento F(2.53) = 50.431 0.01 F(2.54) = 9.785 0.01 F(2.54) = 502.15 0.01

Genotipo F(1.53) = 1.884 n.s F(1.54) = 0.083 n.s F(1.54) = 1.164 n.s.

TxG F(2.53) = 0.930 n.s. F(2.54) = 0.519 n.s. F(2.54) = 0.291 n.s.

Resultados

168

en el test de la placa caliente most ró un efecto signif icat ivo del t ratamiento en los

animales wild-type (F [2.29] = 287.530; p < 0.01) y knockout (F [2.29] = 221.705; p <

0.01). Los análisis post -hoc most raron diferencias signif icat ivas en los animales wild-

type y knockout t ratados con morf ina a las dosis de 5 y 10 mg/ kg (p < 0.01), en

comparación con los animales tratados con salino (Fig. 2c).

Figura 1. Efectos locomotores y antinociceptivos inducidos por un tratamiento agudo de morfina en ratones deficientes en el receptor A2A y wild-type. La act ividad locomotora se evaluó durante 30 min después de la inyección aguda de morf ina (0, 5 y 10 mg/ kg, s.c.). Se midieron (a) los movientos ambulatorios, (b) la act ividad horizontal total (ambulatorios más pequeños movimientos) y (c) los movimientos vert icales. Los datos están expresados como media ± SEM de los counts de actividad locomotora (count = cada vez que el haz fotoeléctrico entre dos fotocélulas se rompe por los movimientos del ratón). Las respuestas ant inocicept ivas medidas en el test de inmersión (d) de la cola y en el test de la placa caliente (e) y (f) fueron evaluadas 30 min después de la administ ración de morf ina (0, 5 y 10 mg/ kg, s.c.). Los datos están expresados como media ± SEM del tiempo de latencia (seg). N = 10 para todos los grupos

p < 0.05; p < 0.01 versus salino (Dunnet test).

Resultados

169

Preferencia de plaza condicionada inducida por morf ina en animales A2A knockout y

wild-type

Los efectos de recompensa inducidos por la morf ina (5 y 10 mg/ kg, s.c.) fueron

evaluados en animales deficientes en el receptor A2A y en animales wild-type utilizando

el paradigma de condicionamiento espacial (Maldonado y cols., 1997, Simonin y cols.,

1998). No se observó preferencia inicial por ninguno de los dos compartimentos (Fig. 3).

En los animales wild-type t ratados con morf ina se observó un efecto grat if icante

signif icat ivo que no fue observado en los animales deficientes en el receptor A2A. De

este modo, los animales wild-type condicionados a la dosis de morf ina de 5 mg/ kg (t

[1.9] = -6.903, p < 0.01) y 10 (t [1.11] = -3.186; p < 0.01) permanecieron

significativamente más tiempo en el compartimiento asociado a la droga durante la fase

de post -condicionamiento, en comparación con la fase de pre-condicionamiento. Por

ot ro lado, los animales A2A knockout que fueron condicionados con 5 y 10 mg/ kg de

morf ina mostraron una preferencia similar por el compart imiento asociado a la droga

durante la fase de pre-condicionamiento y post-condicionamiento (Fig. 3).

Figura 2. Preferencia de plaza condicionada por el tratamiento de morfina (0, 5 y 10 mg/kg, s.c.) en ratones deficientes en el receptor de adenosina A2A y wild-type. Los datos están expresados como media ± SEM del t iempo pasado en el compart imiento asociado a la droga (seg) durante la fase de pre-condicionamiento y la fase de post -condicionamiento. N = 10-12 para los grupos t ratados con morf ina y N = 22 para los grupos t ratados con salino.

p < 0.01 versus post-condicionamiento (t de student para muestras pareadas).

Resultados

170

Aversión de plaza inducida por el síndrome de abst inencia de morf ina, precipitado por

naloxona, en animales A2A knockout y wild-type

Los efectos aversivos producidos por el síndrome de abstinencia de morfina, precipitado

por el antagonista opioide naloxona, fueron evaluados ut il izando el paradigma de

condicionamiento espacial (Valverde y cols., 1996). La ANOVA de una vía most ró que el

t iempo que los animales permanecieron en el compart imiento asociado a la droga en la

fase de pre-condicionamiento fue similar para todos los grupos experimentales

(F[11,153] = 0.233; n.s.), asegurando así el uso de un método sin sesgos (Fig. 4). La

naloxona (0.1 mg/ kg, s.c.) produj o una aversión de plaza en los animales wild-type

dependientes de morf ina, que fue revelada por la disminución de t iempo que los

animales pasaron en el compart imiento asociado a la droga durante la fase de post -

condicionamiento, en comparación con la fase de pre-condicionamiento (t [1.13] =

4.410, p < 0.01). Sin embargo, los animales A2A knockout dependientes de morf ina que

recibieron la misma dosis de naloxona pasaron el mismo t iempo en el compart imiento

asociado a la droga tanto en la fase de pre-condicionamiento como en la de post -

condicionamiento (Fig. 4). La administ ración de una dosis menor de naloxona (0.05

mg/ kg) no produj o respuestas aversivas en los animales dependientes a morf ina en

ninguno de los dos genotipos (Fig. 4).

Figura 3. Aversión de plaza condicionada por el síndrome de abstinencia de morfina, precipitado por naloxona (0.05 y 0.1 mg/kg, s.c.), en ratones deficientes en el receptor de adenosina A2A y wild-type. Los datos están expresados como media ± SEM del tiempo pasado en el compartimiento asociado a la droga (seg) durante la fase de pre-condicionamiento y la fase de post-condicionamiento. N= 11-14 para todos los grupos experimentales. p < 0.01 versus post-condicionamiento (t de student para muestras pareadas).

Discusión

173

La adicción es un t rastorno crónico de la conducta caracterizado por la búsqueda y el

consumo compulsivos de la droga, la pérdida de cont rol para limitar dicho consumo, a

aparición de un estado emocional negat ivo cuando el acceso a la droga está impedido y

la recaída en el proceso incluso t ras largos períodos de abst inencia (Koob y Le Moal,

1997). Si bien el proceso adict ivo t iene su inicio en los efectos placenteros agudos que

producen las drogas de abuso, resulta también necesario el desarrollo de procesos

neurobiológicos adaptat ivos que permiten el mantenimiento y la evolución de dicha

conducta patológica. Diversas estudios han propuesto la existencia de sust ratos

neuronales comunes que se act ivan ante la presencia de las diferentes drogas de abuso,

de manera independiente de su correspondiente mecanismo de acción (Di Chiara, 2002;

Nestler, 2002; Maldonado, 2003; Kalivas y Volkow, 2005).

El sistema dopaminérgico mesolímbico cort ical ha sido propuesto como la principal base

neurobiológica de la adicción (Di Chiara e Imperato, 1988; Di Chiara, 2002). Dent ro de

este sistema, la t ransmisión dopaminérgica establecida ent re est ructuras tales como el

VTA y el NAc t iene un papel primordial (Koob y Le Moal, 2001; Maldonado, 2003; Carelli

y Wightman, 2004; Spanagel y Heilig, 2005). Trabaj os recientes han ident if icado los

cambios adaptat ivos desarrollados durante los procesos de adicción en el sistema

dopaminérgico y la part icipación de ot ros sistemas de neurot ransmisión o sistemas

neuroendocrinos como son los sistemas opioide, glutamatérgico, gabaérgico o las

hormonas que const ituyen el ej e HPA. Estos sistemas t ienen su sust rato anatómico en

diversas regiones del SNC como los núcleos de la amígdala (y las est ructuras

relacionadas de la llamada amígdala extendida), el hipocampo, el hipotálamo y la PFC

ent re ot ras (Koob, 1999b; Nest ler, 2005). Así, en el caso del sistema opioide, existe una

alta densidad de receptores de tipo mu y kappa tanto en el NAc como en el VTA, que se

expresan en neuronas gabaérgicas que modulan la act ividad dopaminérgica. El sistema

glutamatérgico cuyo papel fundamental en los procesos de aprendizaj e y memoria es

conocido (Simonyi y cols., 2005), regula los procesos de plast icidad sinápt ica que se

desarrollan durante el proceso adict ivo (Hyman, 2005). Existen proyecciones

glutamatérgicas desde el hipocampo y la amígdala hacia el VTA, así como aferencias

desde la PFC al NAc que regulan la actividad del sistema mesolímbico dopaminérgico. El

sistema gabaérgico también part icipa en los fenómenos relacionados con la adicción.

Las interneuronas gabaérgicas en el VTA expresan receptores de diversa naturaleza

(p.e: receptores opioides, receptores cannabinoides, receptores nicot ínicos) donde

interactúan diferentes drogas de abuso. Al act ivarse a este nivel los receptores opioides

y cannabinoides desinhiben la act ividad dopaminérgica aumentando la liberación de la

dopamina en el NAc. De forma paralela, el ej e HPA regula la respuesta al est rés y t iene

una doble implicación en el proceso adict ivo. Por una parte, modula los efectos

Discusión

174

reforzantes de las drogas (Piazza y Le Moal, 1998; Goeders, 2002) y debido al

incremento de síntesis de CRF durante el t iempo de abst inencia, part icipa en los

fenómenos de recaída (Marinelli y Piazza, 2002). Además los diferente sistemas

neurot ransmisión citados también modulan la expresión del CRF en regiones cerebrales

como el hipocampo y la amígdala.

En el t rabaj o desarrollado en esta Tesis Doctoral, hemos explorado la implicación del

sistema cannabinoide endógeno y del sistema purinérgico, a t ravés de la supresión

genét ica del receptor CB1 y del receptor A2A respect ivamente, en las propiedades

adict ivas de drogas de abuso protot ípicas como son la cocaína, el THC, la nicot ina y la

morf ina. Nuest ro obj et ivo fundamental ha sido demost rar las posibilidades que estos

sistemas representan como sust ratos neuroquímicos comunes en la neurobiología de la

adicción.

1. Participación del sistema endocannabinoide en las propiedades adictivas

de la cocaína

Existen numerosas evidencias que indican la part icipación del sistema cannabinoide

endógeno en las propiedades adict ivas de ciertas drogas de abuso, tales como los

propios cannabinoides (Ledent y cols., 1999; Valverde y cols., 2005), el etanol (Arnone y

cols., 1997, Hungund y cols., 2003, Rinaldi-Carmona y cols., 2004), los opioides (Chen y

cols., 1990, Manzanares y cols., 1999; Mart ín y cols., 2000, Braida y cols., 2001,

Ghozland y cols., 2002, De Vries y cols., 2003) o la nicot ina (Castañé y cols., 2002,

Valjent y cols., 2002, Cohen y cols., 2002, Le Foll y Goldberg, 2005). Sin embargo, hasta

el momento de iniciar nuest ro t rabaj o, pocos estudios han demost rado una clara

implicación del sistema endocannabinoide en las propiedades reforzantes de los

psicoest imulantes, y los resultados expuestos fueron en ocasiones cont rovert idos. En

primer lugar, los primeros estudios realizados en nuest ro laboratorio demost raron que

los animales CB1 knockout son capaces de most rar una preferencia de plaza inducida

por la cocaína similar a la que desarrollaban los ratones wild-type (Martín y cols., 2000).

Así, la capacidad de asociar una experiencia placentera a un contexto ambiental está

preservada en estos animales mutantes. Del mismo modo, la autoadminist ración de

cocaína y anfetamina en un paradigma de autoadminist ración aguda con movilidad

rest ringida fue similar en ambos genot ipos (Cossu y cols., 2001), lo cual apoya nuest ros

resultados obtenidos en el condicionamiento espacial. Sin embargo, los estudios

realizados por De Vries y cols., (2003), most raron que, en ratas que habían ext inguido

una conducta de autoadminist ración previamente adquirida, la administ ración del

antagonista CB1 rimonabant es capaz de bloquear una conducta de recaída provocada

por est ímulos asociados a la droga. Estos resultados indican un papel crucial de los

Discusión

175

receptores cannabinoides CB1 en los procesos de recaída de la conducta de

autoadministración de cocaína.

El conj unto de estas evidencias demuest ra que el receptor CB1 no parece part icipar de

forma crucial en el refuerzo primario producido por la cocaína, como se observó en el

paradigma de condicionamiento espacial (Mart ín y cols., 2000), pero posee un papel

relevante en el proceso de recaída al consumo de la droga t ras un periodo prolongado

de abst inencia (De Vries y cols., 2003). En este sent ido, uno de nuest ros propósitos ha

sido evaluar la implicación del sistema endocannabinoide, y en part icular del receptor

CB1, en las propiedades reforzantes de la cocaína, y determinar si dicho efecto

reforzante es suf iciente para iniciar y mantener una conducta de autoadminist ración en

el ratón. Con esta idea, realizando un estudio de microdiálisis in vivo, hemos

demost rado que la administ ración aguda de cocaína produce un incremento de los

niveles ext racelulares de dopamina en el NAc similar en animales CB1 knockout y en

animales wild-type. Este resultado nos permite confirmar que el receptor CB1 no

modula el incremento de dopamina ext racelular en el NAc característ ico de los efectos

reforzantes primarios de la cocaína, tal como apuntaban los resultados obtenidos en el

paradigma de preferencia de plaza (Martín y cols., 2000).

Para profundizar en este estudio, nos propusimos evaluar el papel del receptor

cannabinoide CB1 en los procesos de adquisición, consolidación y mantenimiento de una

conducta operante mantenida por infusiones int ravenosas de cocaína en el ratón. Para

ello, el primer obj et ivo de nuest ro t rabaj o fue la puesta a punto de la técnica de

autoadminist ración int ravenosa de cocaína en el ratón, con el f in de poder evaluar a

cont inuación las propiedades reforzantes de la cocaína en animales deficientes en el

receptor CB1. Una vez establecido este modelo en el laboratorio, pudimos demost rar,

con un protocolo de razón f ij a 1, que el 75% de los animales wild-type adquirió una

conducta operante mantenida por la autoadminist ración int ravenosa de cocaína (1

mg/ kg/ inf), mient ras que sólo el 25% de los animales CB1 knockout adquirió dicha

conducta. Los animales deficientes en el receptor CB1 consumieron una menor cant idad

de cocaína que los animales wild-type, y también requirieron un t iempo

signif icat ivamente más largo para cumplir los criterios de adquisición de la conducta de

autoadminist ración. Evaluamos también el esfuerzo máximo que el animal es capaz de

realizar para obtener una infusión de cocaína. Para ello, ut il izamos un protocolo de

razón progresiva donde se incrementa de forma progresiva la dif icultad para obtener

cada infusión de cocaína. En estas nuevas condiciones experimentales, los animales CB1

knockout most raron una mot ivación menor por la droga que los ratones wild-type. Este

resultado se confirmó mediante la ut il ización de un enfoque farmacológico,

administ rando el antagonista CB1 rimonabant en animales CB1 wild-type. Este estudio

Discusión

176

mostró que el rimonabant disminuye de forma signif icat iva el máximo esfuerzo que el

animal es capaz de hacer para obtener dicha infusión de cocaína, de forma similar a lo

observado en el ratón CB1 knockout en condiciones similares.

Teniendo en cuenta la demost rada part icipación del receptor CB1 en las propiedades

adict ivas de ot ras drogas de abuso (THC, opioides, alcohol, nicot ina), los resultados

obtenidos en nuest ro estudio nos permiten resolver la cont roversia existente para el

caso de la cocaína y nos permite concluir que el sistema endocannabinoide modula de

manera común el proceso de adicción de las diversas drogas protot ípicas. No obstante,

la participación del receptor CB1 en la adicción no sería equivalente para todos los tipos

de drogas. Para algunas drogas como la nicot ina, la morf ina, el THC o el etanol, el

receptor CB1 es relevante en las primeras fases del refuerzo primario. No obstante, la

importancia del receptor CB1 en las propiedades adict ivas de la cocaína reside en

procesos más complej os de la adicción, como el desarrollo del fenómeno compulsivo

que caracteriza este t ranstorno. Tales procesos sólo pueden ser estudiados con modelos

más sofist icados capaces de evaluar la respuesta reforzante aguda y el desarrollo del

proceso adict ivo, como el paradigma de autoadminist ración int ravenosa. Dado que el

modelo de autoadminist ración int ravenosa es uno de los más válidos y con mayor valor

predict ivo acerca del potencial de abuso de una droga, nuest ro t rabaj o establece de

forma convincente, y por primera vez, la part icipación del receptor cannabinoide CB1

en la consolidación y mantenimiento de la conducta de búsqueda compulsiva de la

cocaína. Pero, ¿part icipa el receptor cannabinoide CB1 de forma similar en la

modulación de las propiedades adictivas de otros psicoestimulantes?

Recientemente, se han publicado t rabaj os que señalan la existencia de una interacción

ent re el sistema endocannabinoide y los psicoest imulantes, en part icular con el

receptor CB1. En este sent ido, Braida y cols., (2005) han demost rado que el

pret ratamiento con rimonabant es capaz de bloquear los efectos de recompensa

inducidos por el MDMA, evaluados en el paradigma de preferencia de plaza en ratas. De

acuerdo con estos resultados, el pret ratamiento con el antagonista del receptor

cannabinoide CB1, AM 251, provocó una reducción del consumo de la droga de un modo

dosis dependiente, en ratas ent renadas a autoadminist rarse metanfetamina con un

protocolo de razón f ij a 3. Esta reducción de la tasa de autoadminist ración fue revert ida

por la administración de agonistas CB1 como la anandamida o la metanandamida, lo que

sugiere un mecanismo mediado por el receptor CB1 (Vinklerová y cols., 2002). También

se ha explorado el efecto del antagonista del receptor CB1 rimonabant en la conducta

de recaída de autoadminist ración de metanfetamina provocada tanto por est ímulos

asociados a la droga como por una inyección de la misma (Anggadiredj a y cols., 2004,

Yamamoto y cols., 2004). Después de un ent renamiento ut il izando un protocolo de

razón f ij a 1 y la posterior ext inción de esta conducta, el rimonabant reduj o

Discusión

177

signif icat ivamente la conducta de recaída provocada por el est ímulo condicionado y por

la inyección de metanfetamina. Por últ imo, estudios recientes desarrollados en nuest ro

laboratorio parecen apoyar también un papel importante del sistema endocannabinoide

en las propiedades reforzantes del MDMA. Así, mient ras la preferencia de plaza

condicionada a MDMA está preservada en los ratones CB1 knockout , estos animales no

son capaces de adquirir una conducta de autoadminist ración int ravenosa de MDMA del

mismo modo que los animales wild-type (Touriño y cols., en preparación). Así pues,

nuest ros resultados observados para el caso de la cocaína parecen ser confirmados con

los estudios realizados ut il izando ot ros psicoest imulantes tales como la metanfetamina

o el MDMA.

Los mecanismos específ icos por los cuales el sistema endocannabinoide regula las

propiedades adict ivas de los psicoest imulantes no están todavía del todo esclarecidos.

Existen evidencias experimentales que muest ran la part icipación del sistema

endocannabinoide en diferentes procesos que t ienen una importancia crucial en el

desarrollo de la adicción. En concreto, nos referimos a procesos cognit ivos, de

aprendizaje, memoria y la respuesta al estrés. Debido a la localización de los receptores

CB1 en est ructuras relacionadas con dichas funciones, como el hipocampo y la PFC, y a

la capacidad de los compuestos cannabinoides para inducir un cierto deterioro cognitivo

(Chait y Pierri, 1992; Hampson y Deadwyler, 1998; Sullivan, 2000; Marsicano y cols.,

2002; Riedel y Davies, 2005), el sistema endocannabinoide se ha relacionado

est rechamente con la modulación de la plast icidad sinápt ica, en procesos de memoria y

aprendizaj e. En nuest ro estudio hemos demost rado que los animales CB1 knockout

adquieren una conducta operante mantenida por agua y comida de manera parecida a

los animales wild-type. Estos resultados excluyen la posibilidad de que una alteración

del aprendizaj e en los ratones deficientes en el receptor CB1 sea la causa de la

ausencia de autoadminist ración de cocaína observada en estos ratones. La mot ivación

por agua y comida, evaluada en un protocolo de razón progresiva, fue similar en ambos

genot ipos indicando que no existe un déficit mot ivacional general debido a la ausencia

de receptores CB1. Por otra parte, sabemos que la exposición crónica a drogas de abuso

induce alteraciones en la t ransmisión y plast icidad sinápt ica en preparaciones in vit ro

de VTA, NAc, sustancia gris periacueductal e hipocampo (Ingram y cols., 1998; Mart in y

cols., 1999; Thomas y cols., 2001; Beurrier y Malenka, 2002; Harrison y cols., 2002;

Robbe y cols., 2002; Hoffman y cols., 2003). De manera interesante, los

endocannabinoides a t ravés de su función como mensaj eros ret rógrados modulan los

fenómenos de plast icidad sinápt ica en diferentes áreas relacionadas con la adicción,

como son el NAc, la PFC, la amígdala o el hipocampo (Wilson y Nicoll, 2002; Ohno-

Discusión

178

Shosaku y cols., 2001). Se ha demostrado que los cannabinoides exógenos como el THC y

los endocannabinoides como la anandamida inhiben la inducción de LTP en el

hipocampo (Collins y cols., 1994; 1995). Además, estudios bioquímicos y

elect rof isiológicos han demost rado que un t ratamiento agudo de THC, cocaína y

anfetamina puede alterar la plast icidad sinápt ica del sistema de recompensa cerebral

(p.e.: en el NAc) bloqueando la inducción de LTD que está mediada por los

endocannabinoides (Forgeaud y cols., 2004; Mato y cols., 2004). En la amígdala, a través

de la regulación de LTD, los endocannabinoides también part icipan en la consolidación

de la memoria asociat iva (Huang y cols., 2003; Azad y cols., 2004). Por ot ra parte, la

exposición a cocaína o anfetamina induce eventos intracelulares en los cuales el sistema

endocannabinoide está involucrado. En esta línea, Centonze y cols., (2004) han

demost rado que un t ratamiento con cocaína es capaz de inducir un aumento de los

niveles ext racelulares de anandamida en el est riado. Además, han comprobado que la

inhibición de la neurot ransmisión gabaérgica, vía receptores D2, provocada por un

t ratamiento de cocaína se puede reducir t ras el bloqueo del receptor CB1, indicando

que en el estriado los endocannabinoides parecen ser necesarios para que se desarrollen

de forma completa las acciones de la cocaína (Centonze y cols., 2004). En vista de estos

resultados, podemos postular que la falta de receptores CB1 en nuest ros animales

mutantes impediría una acción completa de la cocaína, modif icando así su valor

reforzante e impidiendo el desarrollo de mecanismos adaptativos plásticos que permiten

evolucionar desde el efecto reforzante agudo al t ranstorno de t ipo compulsivo que se

estabece en la adicción.

El sistema endocannabinoide regula la t ransmisión dopaminérgica (revisión en Gardner,

2005). Sin embargo, en este t rabaj o no hemos podido evaluar la liberación de dopamina

durante la exposición al paradigma de autoadminist ración de cocaína. A pesar de que el

receptor CB1 no part icipa en el incremento de dopamina ext racelular inducido por la

administ ración aguda del psicoest imulante, no podemos descartar que produzca una

modulación de la vía mesolímbica dopaminérgica durante la exposición crónica de la

droga. Por ot ra parte, la administ ración aguda de cocaína en el estudio de microdiálisis

se realizó de forma no cont ingente, mient ras que en el paradigma de

autoadminist ración existe cont ingencia ent re la respuesta realizada para obtener el

refuerzo y la infusión de cocaína. La asociación cont ingente ent re el el refuerzo y la

respuesta es fundamental para que se desarrolle el aprendizaj e operante que supone el

paradigma de autoadminist ración (Mackintosh, 1983). En consecuencia, el contexto en

el cual la cocaína es autoadminist rada altera signif icat ivamente la respuesta

dopaminérgica en el NAc (Hemby y cols., 1997). Así pues, para elucidar si el receptor

CB1 regula o no la t ransmisión dopaminérgica en un paradigma de autoadminist ración,

sería necesario el desarrollo de nuevos experimentos en los que se detectara niveles de

Discusión

179

dopamina ext racelular durante las sesiones de autoadminist ración de cocaína, en

ratones CB1 knockout . Asimismo, existe la posibilidad de que el sistema

endocannabinoide part icipe en la regulación de procesos reforzantes que son

independientes de la dopamina, también involucrados en la mot ivación de búsqueda

compulsiva por la droga (Koob y Nestler, 1997). En este sentido, podemos señalar que la

PFC cont iene una alta densidad de receptores CB1, y j uega un papel importante en los

procesos adict ivos al const ituir un punto de integración ent re la información sensorial,

la respuesta emocional y la experiencia hedónica (Maldonado y cols., 2006). Así, una

posible explicación de la función de los endocannabinoides en la mot ivación por las

drogas de abuso, en part icular de los psicoest imulantes, podría estar relacionada con la

asociación ent re la experiencia de apretar una palanca, el hecho de recibir una infusión

de cocaína y la sensación de placer que recibe el animal, integrada en la PFC.

En conj unto, nuest ros resultados y ot ros publicados recientemente (Anggadiredj a y

cols., 2004; Yamamoto y cols., 2004; Braida y cols., 2005; Touriño y cols., en

preparación) nos llevan a proponer que, en efecto, el sistema endocannabinoide

también modula las propiedades adictivas de los psicoestimulantes. Así, estos resultados

confirman la hipótesis de t rabaj o y podemos considerar que el sistema cannabinoide es

también un sust rato común de la adicción de todas las drogas de abuso. Este hecho

puede aportar interés terapéut ico en la búsqueda de t ratamientos para los fenómenos

de adicción. En esta línea, se han desarrollado ensayos clínicos (Programa STRATUS-US,

Sanofi-Avent is) para combat ir el hábito tabáquico, en los cuales se ha ut il izado el

bloqueo farmacológico del receptor CB1 con rimonabant . En referencia al t ratamiento

de la adicción de cocaína, existen numerosas aproximaciones farmacológicas (p.e.: el

bloqueo de receptores y t ransportador de la dopamina, el t ratamiento con agonistas de

receptores gabaérgicos, terapia sust itut iva e incluso vacunas), sin embargo todavía no

se ha conseguido un tratamiento definitvo y eficaz que evite la recaída (de Lima y cols.,

2002, van den Brink y van Ree, 2003). Así, sería de gran interés invest igar sobre las

posibilidades terapéut icas de los antagonistas cannabinoides en el t ratamiento de la

dependencia de cocaína, ya que hasta ahora no existe una terapia efect iva para

combatir este trastorno.

Discusión

180

2. Participación del sistema purinérgico en las propiedades adictivas de

diferentes drogas de abuso: THC, cocaína, nicotina y morfina

El segundo obj et ivo general de este t rabaj o ha sido estudiar el papel del receptor

purinérgico A2A en las propiedades adictivas de diferentes drogas de abuso.

La adenosina tiene un papel relevante en las acciones farmacológicas de la cafeína en el

SNC. La cafeína es un antagonista no select ivo de los receptores purinérgicos y posee

mayor af inidad por el receptor A2A que por los ot ros receptores. Si bien se considera

que la cafeína no representa una droga de abuso, ha sido ampliamente estudiada por el

potencial uso terapéut ico en patologías relacionadas con la t ransmisión dopaminérgica,

como la enfermedad de Parkinson (Chen, 2003). La cafeína y ot ras met ilxant inas como

la teof il ina producen efectos en la conducta opuestos a los análogos de la adenosina, e

incrementan la t ransmisión dopaminérgica en el est riado (revisión en Ferré y cols.,

1992). Dosis baj as de cafeína est imulan la act ividad locomotora (Boissier y Simon, 1965,

Svenningson y cols., 1995), producen efectos de recompensa en el paradigma de

preferencia de plaza condicionada (Brockwell y cols., 1991), y mejoran la realización de

conductas inst rumentales tanto reforzantes como aversivas (Carney, 1982; Spealman,

1988). Además, el bloqueo del receptor A2A con cafeína y teof il ina potencia los efectos

inducidos por la anfetamina sobre la act ivación locomotora (Casas y cols., 1989;

Turgeon y cols., 1996; Ferré, 1997), sugiriendo una interacción antagónica ent re los

receptores A2A y los receptores de dopamina D2. En esta línea, la colocalización de los

receptores de adenosina A2A y los receptores de dopamina D2 en las espinas dendríticas

de las neuronas est riatopalidales da lugar a la existencia de interacciones funcionales

de t ipo antagónico ent re ambos receptores. Según esta relación, la act ivación del

receptor A2A reduce la af inidad de la dopamina para unirse con el receptor D2 (Ferré y

cols., 1991; Kull y cols., 1999). Así, la adenosina regula la t ransmisión dopaminérgica a

t ravés de interacciones antagónicas recíprocas ent re los receptores de adenosina

A1/dopamina D1 y los receptores de adenosina A2A/dopamina D2 (Franco y cols., 2000).

Resultados obtenidos mediante diferentes enfoques experimentales (microdialisis in

vivo, regist ros elect rof isiológicos) han establecido de forma clara que los receptores

A2A ej ercen un papel excitatorio sobre la función de las neuronas est riatopalidales, que

está relacionado, por lo menos parcialmente, con sus efectos antagónicos sobre el

receptor D2 (Ferré y cols., 1992; 1997; Agnat i y cols., 2003, Ferré y cols., 2002). Según

este modelo, en ratones deficientes en el receptor A2A la ausencia de la acción

inhibitoria de dichos receptores A2A sobre los receptores D2, aumentaría la respuesta

hiperlocomotora inducida por la administ ración de psicoest imulantes como la cocaína y

la anfetamina. Paradój icamente, Chen y cols., (2000), observaron una respuesta

atenuada de la act ividad locomotora en ratones A2A knockout t ras un t ratamiento

agudo de cocaína y anfetamina. De forma similar, los mismos autores estudiaron la

Discusión

181

sensibilización locomotora producida por un t ratamiento crónico de anfetamina y

observaron que esta respuesta se encont raba disminuida en los ratones A2A knockout

(Bast ia y cols., 2005). Nuest ros resultados obtenidos con cocaína (Art ículo 2) obt ienen

resultados divergentes con estos t rabaj os. Nuest ro estudio demuest ra que los ratones

deficientes en el receptor A2A muest ran una respuesta locomotora similar a la de sus

hermanos wild-type t ras un t ratamiento agudo y crónico con cocaína (Soria y cols.,

2006). Las discrepancias observadas en estos estudios pueden ser debidas a: (1)

diferencias en el fondo genét ico ent re las dos cepas de animales: CD1 en nuest ro caso

(Ledent y cols., 1999) y C57/ Bl6 en los ot ros estudios (Chen y cols., 2000); (2) las

diferencias en las condiciones experimentales empleadas para cada estudio. Así pues,

los estudios realizados en nuest ro laboratorio no revelaron la interacción antagónica

entre este receptor y el receptor de dopamina D2, descrita anteriormente. No obstante,

existen resultados cont radictorios con respecto a la interacción ent re el receptor A2A y

D2. Así, se ha propuesto una facilitación presinápt ica de la liberación de dopamina y

ot ros neurot ransmisores, mediada por los receptores A2A (Zet terst rom y Fillenz, 1990;

Sebast iao y Ribeiro, 1996; Okada y cols., 1996; Choksi y cols., 1997). Así pues, los

receptores de adenosina A2A part icipan de una forma importante en la t ransmisión

dopaminérgica cent ral, y representan una diana interesante para modular de forma

selectiva dicha actividad dopaminérgica, y a su vez, la acción de las drogas de abuso.

Los receptores A2A se localizan mayoritariamente en el est riado, y se coexpresan con

los receptores D2 de dopamina, regulando la expresión del gen de la proencefalina (Fink

y cols., 1992; Shif fmann y Vanderhaeguen, 1993). Las encefalinas, representan uno de

los ligandos endógenos de los receptores opioides, que muest ran mayor af inidad por los

receptores opioides de t ipo delta y que se encuent ran implicados en los procesos de

adicción (Terenius, 1977). En este sentido, el déficit de encefalinas impide el desarrollo

de la dependencia de THC y nicot ina, tal como ha sido demost rado por diferentes

estudio realizados en el ratón knockout para el gen de la preproencefalina (Valverde y

cols., 2000; Berrendero y cols., 2004). El receptor de adenosina A2A controla de manera

posit iva la expresión de las encefalinas en las neuronas est riatopalidales (Schif fmann y

Vanderhaeguen, 1993). A pesar de que no se han encontrado cambios significativos en la

densidad de receptores opioides en el cerebro de los ratones deficientes en el receptor

A2A (Bailey y cols., 2002), se ha observado una disminución de cDNA del precursor de la

encefalina en el est riado de dichos ratones knockout (Ledent y cols., 1997). Asimismo,

estudios previos en nuest ro laboratorio, y ot ros más recientes, han demost rado que la

severidad del síndrome de abst inencia de morf ina precipitado por naloxona, se

encuent ra exacerbado en los animales deficientes en el receptor A2A (Berrendero y

cols., 2003, Bailey y cols., 2004) indicando un papel fundamental del receptor A2A en la

Discusión

182

dependencia f ísica de morf ina. Dada la importante part icipación del sistema opioide

como sust rato neurobiológico de los procesos adict ivos (Maldonado, 2003), disponemos

de ot ra evidencia para pensar que el sistema purinérgico a t ravés del receptor A2A y de

su modulación sobre el sistema opioide podría mediar también la dependencia f ísica,

un componente adicional de la adicción.

Hasta el momento de iniciar el t rabaj o recogido en esta memoria de doctorado, no se

había evaluado directamente la part icipación de los receptores A2A en los fenómenos

reforzantes de las drogas de abuso. El conj unto de t rabaj os descritos hasta ahora, j unto

a las interacciones descritas por ot ros equipos ent re los receptores purinérgicos y

dopaminérgicos, nos proporcionaban el punto de part ida para nuest ros estudios. Según

nuest ra hipótesis, la actuación sobre los receptores purinérgicos podría modif icar

indirectamente el comportamiento adict ivo. Nuest ros t rabaj os nos permiten demost rar

que la supresión del receptor A2A afecta directamente a las propiedades adict ivas de

drogas como el THC, la cocaína, la nicotina y la morfina.

En el estudio realizado con cocaína, el t ratamiento agudo con este psicoest imulante

induj o el mismo efecto hiperlocomotor en los animales A2A knockout y wild-type. El

t ratamiento crónico con cocaína provocó la sensibilización de los efectos locomotores

producidos por esta droga de una manera similar en los ratones knockout y wild-type. La

preferencia de plaza condicionada a cocaína también fue similar en ambos genot ipos.

Sin embargo, cuando las propiedades reforzantes de la cocaína fueron evaluadas

ut il izando un paradigma de autoadminist ración int ravenosa de cocaína, pudimos

evidenciar que la ef icacia reforzante de este psicoest imulante está disminuida en los

animales A2A knockout . Así, los animales mutantes fueron capaces de adquirir y

mantener una conducta de autoadminist ración de forma clara y reproducible. Sin

embargo, el consumo de cocaína se reduj o alrededor de un 50% en los animales

knockout en comparación con el consumo observado en los animales wild-type. Al

mismo t iempo, el máximo esfuerzo realizado por los animales knockout para la

obtención de una infusión de cocaína evaluado en un protocolo de razón progresiva fue

inferior que el de los animales wild-type (“ Breaking Point ” para los ratones wild-type:

36.00 ± 5.14 y knockout : 12.14 ± 3.54; p< 0.01). Además, los animales mutantes

most raron un desplazamiento vert ical descendente de la curva dosis-respuesta respecto

a los animales wild-type, indicando una disminución en la ef icacia de la cocaína como

refuerzo. En conj unto, este estudio nos permite concluir que el receptor A2A es

necesario para el desarrollo de la conducta adict iva inducida por cocaína y podríamos

especular sobre el hecho de que la ausencia de estos receptores confiere resistencia a

las propiedades adictivas de la cocaína.

Discusión

183

En los dos estudios realizados con cocaína (Art ículo 1 y 2) hemos podido observar

algunas cuest iones metodológicas que se prestan a discusión. En primer lugar, hemos

encont rado discrepancias ent re los resultados obtenidos en los modelos de

sensibilización locomotora y autoadminist ración. Según la teoría de la sensibilización

del incent ivo, la capacidad de las drogas de desarrollar una conducta adict iva está

directamente relacionada con su habilidad de provocar una sensibilización neuroquímica

y comportamental (Robinson y Berridge, 1993, De Vries y cols., 1998; Vanderschuren y

cols., 1999). Por lo tanto, el hecho de encont rar resultados dispares ent re la

sensibilización locomotora y la autoadminist ración demuest ra una clara separación

ent re estos dos fenómenos. En segundo lugar, hemos encont rado diferencias ent re los

resultados obtenidos en el modelo de condicionamiento espacial y la autoadministración

int ravenosa, lo cual confirma que los dos paradigmas no son equivalentes y que evalúan

aspectos dist intos del proceso de adicción. El paradigma de condicionamiento de plaza

se ut il iza para evaluar de manera indirecta los efectos reforzantes primarios producidos

por una droga. Estos efectos primarios son indispensables para el inicio del proceso

adict ivo, pero no son suficientes para su completo desarrollo. Por ot ro lado, el

paradigma de autoadminist ración int ravenosa permite evaluar procesos más complejos

de consolidación de la conducta de búsqueda compulsiva de la droga característ icos de

la adicción, como el “craving” y la recaída.

En relación a las propiedades adict ivas de los cannabinoides, hemos demost rado que el

receptor de adenosina A2A modula las propiedades mot ivacionales asociadas a los

efectos farmacológicos del THC (Art ículo 3). Al evaluar las respuestas inducidas por el

t ratamiento agudo de THC, observamos que los efectos ant inocicept ivos,

hipolocomotores e hipotérmicos provocados por la administ ración de THC están

preservados en los animales A2A knockout . De la misma manera, el t ratamiento crónico

con THC produce el desarrollo de tolerancia a los efectos agudos de forma similar en

ambos genotipos, sugiriendo que el receptor A2A no participa en dichos efectos. A pesar

de no formar parte de nuest ro obj et ivo inicial, hemos demost rado que el t ratamiento

crónico con THC altera el pat rón circadiano de peso corporal en los animales wild-type.

Sin embargo, este efecto no fue observado en los ratones deficientes en el receptor

A2A. En este sent ido, diversos estudios han propuesto que la act ivación tónica del

receptor A2A en el NAc regula la conducta de ingesta (Nagel y cols., 2003). En este

sent ido, Kit tner y cols., (2004) combinando técnicas neuroquímicas y comportamentales

han most rado que tanto el ATP como la adenosina regulan de manera antagónica la

act ividad dopaminérgica asociada a la conducta de ingesta. El THC induce diversos

efectos sobre la ingesta. A nivel cent ral, aumenta el apet ito y la mot ivación por

Discusión

184

sustancias palatables (Koch y Mat thews, 2001; Will iams y Kirkham, 2002; Cota y cols.,

2005). A nivel periférico, los cannabinoides disminuyen el gasto energét ico y facilitan el

acúmulo de energía (Will iams y Kirkham, 2002). Así pues, nuest ros datos indican que el

receptor A2A regula los efectos del THC sobre dicha conducta de ingesta.

En este estudio también hemos evaluado la part icipación del receptor A2A en la

expresión del síndrome de abst inencia de cannabinoides, precipitado por el antagonista

CB1 rimonabant . La administ ración de rimonabant en animales dependientes de THC

produj o manifestaciones somát icas característ icas del síndrome de abst inencia de THC

(Hutchenson y cols., 1998), como son la piloerección, el temblor de patas, el temblor

corporal, la ptosis o las sacudidas. Sin embargo, la severidad de la abstinencia física fue

atenuada en los animales deficientes en el receptor A2A, indicando tan sólo una

implicación parcial del receptor A2A en expresión física del síndrome de abst inencia de

THC.

Del mismo modo, nos interesamos por invest igar las propiedades mot ivacionales

inducidas por THC ut il izando el paradigma de condicionamiento de plaza. Los efectos

reforzantes y aversivos del THC fueron demost rados en los animales wild-type, como

habían sido revelados en estudios previos (Valj ent y Maldonado, 2000). No obstante,

dichos efectos fueron suprimidos en los animales A2A knockout . Para descartar la

posibilidad de un déficit de aprendizaj e causado por la ausencia de receptores A2A,

entrenamos a los ratones en un paradigma de conducta operante mantenido por

comida. En ambos genot ipos observamos la misma capacipad de adquirir y mantener la

conducta operante reforzada por est ímulos naturales. De este modo, nuest ro t rabaj o

revela por primera vez, que los receptores A2A modulan las propiedades mot ivacionales

del THC, tanto reforzantes como aversivas.

Asimismo, nos ha interesado estudiar la implicación del receptor A2A en la dependencia

f ísica de nicot ina y en las propiedades mot ivacionales asociadas a dicha droga (Art ículo

4). Los efectos hipolocomotores y ant inocicept ivos inducidos por una administ ración

aguda de nicot ina fueron similares en los animales wild-type y A2A knockout . Estos

resultados indican que las acciones farmacológicas de la nicot ina están preservadas en

estos animales mutantes. En segundo lugar, hemos estudiado la part icipación del

receptor A2A en el síndrome de abstinencia físico de nicotina. En los animales wild-type

t ratados de forma crónica con nicot ina, la administ ración del antagonista nicot ínico

mecamilamina precipitó un síndrome de abst inencia f ísico, tal como había sido

demost rado en estudios previos (Castañé y cols., 2002). La severidad de la abst inencia

fue similar en ambos genot ipos, lo que sugiere que el receptor A2A no parece part icipar

de forma importante en la expresión de la dependencia f ísica de nicot ina. Asimismo,

Discusión

185

hemos estudiado las propiedades reforzantes de la nicot ina ut il izando el paradigma de

condicionamiento espacial. Los animales wild-type most raron una preferencia de plaza

condicionada por nicot ina, efecto que no fue observado en los animales deficientes en

el receptor A2A. Por ot ra parte, los efectos disfóricos inducidos por una dosis elevada

de nicot ina, evaluados en un paradigma de aversión condicionada al gusto, no se

modificaron en los animales A2A knockout, excluyendo la posibilidad de que la supresión

genét ica del receptor A2A en estos ratones pudiera afectar los efectos discriminatorios

int rínsecos de la nicot ina. Por ot ra parte, realizamos estudios de microdiálisis in vivo

t ras una administ ración aguda de nicot ina, y observamos un incremento del 60% en los

niveles ext racelulares de dopamina en los animales wild-type. Este efecto no fue

observado en los animales deficientes en el receptor A2A, indicando que el receptor

A2A regula de manera específ ica las propiedades placenteras de la nicot ina,

posiblemente debido a la interrupción de los efectos de dichadroga sobre la t ransmisión

dopaminérgica en el NAc.

El sistema purinérgico, a t ravés del receptor A2A, modula de forma negat iva la

expresión del síndrome de abst inencia de morf ina, como reveló un t rabaj o realizado en

nuest ro laboratorio por Berrendero y cols., (2003). En este estudio, los ratones

deficientes en el receptor A2A most raron una mayor severidad del síndrome de

abst inencia de morf ina que sus hermanos wild-type. Con estos datos previos, nos

decidimos a completar dicho estudio y demost rar la posible implicación del receptor

A2A en las propiedades mot ivacionales de la morf ina. Este t rabaj o nos permite

completar el estudio sobre la implicación del receptor A2A en las propiedades adict ivas

de cuat ro drogas protot ípicas: cocaína, THC, nicot ina y morf ina. De este modo, hemos

explorado la part icipación del receptor A2A en las propiedades reforzantes inducidas

por la morf ina, y también en las propiedades disfóricas asociadas al síndrome de

abst inencia de esta droga (Art ículo 5). En primer lugar, evaluamos las respuestas

inducidas por el t ratamiento agudo de morf ina en animales deficientes en el receptor

A2A. Los efectos hiperlocomotores y ant inocicept ivos de la morfina fueron similares en

animales wild-type y knockout , descartando una modulación purinérgica en las acciones

agudas de este opiáceo. Los efectos reforzantes provocados por la morfina administrada

a diferentes dosis fueron observados en los animales wild-type mediante el uso del

paradigma de condicionamiento espacial. De manera interesante, no se ha observado

preferencia de plaza inducida por morf ina en los animales deficientes en el receptor

A2A. En animales dependientes de morf ina, el t ratamiento con el antagonista opioide

naloxona produce el síndrome de abst inencia f ísico, que a su vez, se acompaña de

efectos subj et ivos disfóricos. Ut il izando dosis baj as de naloxona (0.05, 0.1 mg/ kg, s.c.)

Discusión

186

es posible inducir dicho estado disfórico asociado a la abst inencia morfínica sin la

presencia de manifestaciones somát icas evidentes. Así, la aversión de plaza

condicionada por la abstinencia de morfina fue suprimida en los animales deficientes en

el receptor A2A indicando la part icipación de los receptores A2A en las propiedades

motivacionales de los opiáceos como la morfina.

En resumen, nuestros resultados sugieren un papel crucial de los receptores purinérgicos

A2A en las propiedades reforzantes del THC, la nicot ina y la morf ina, así como una

part icipación de estos receptores en la formación de los estados emocionales negat ivos

asociados a la abst inencia de morf ina, y a dosis aversivas de THC y nicot ina. Sin

embargo, el receptor A2A no parece estar implicado en los efectos reforzantes

primarios de la cocaína. Las diferencias observadas respecto a la implicación del

receptor A2A en los efectos placenteros de las diferentes drogas evaluadas en el

paradigma de condiconamiento espacial podrían estar relacionadas con los diferentes

mecanismos de acción que poseen cada uno de estos compuestos. Así, los

psicoest imulantes como la cocaína incrementan los niveles de monoaminas bloqueando

su recaptación en los terminales del sistema mesolímbico e induciendo un aumento en

la liberación de dopamina mediante la unión a su t ransportador de membrana (Madras y

col, 1989). Ot ras drogas como la nicot ina, los opiáceos y el THC, a t ravés de la unión a

sus respect ivos receptores específ icos, actúan de manera indirecta actuando sobre

neuronas (gabaérgicas o glutamatérgicas) que a su vez modulan la act ividad de las

neuronas dopaminérgicas (Kreek y cols., 2002). Se ha demost rado que en el SNC, los

receptores de adenosina A2A interaccionan de una manera funcional con los receptores

opioides (Noble y Cox, 1995), con el receptor cannabinoide CB1 (Andresson y cols.,

2005) y con el receptor nicot ínico de acet ilcolina (nACh) (Shi y Daly, 1999). Sin

embargo, no existen evidencias de una interacción directa ent re el receptor A2A y el

t ransportador de dopamina DAT. Así pues, la interacción ent re los receptores A2A y los

receptores específ icos de la morf ina, el THC y la nicot ina, podría ser la causa por la

cual observamos una implicación del receptor A2A en el refuerzo primario de estas

drogas. Mient ras que en el caso de la cocaína, la part icipación del sistema purinérgico

se encuentra en fases del proceso adictivo posteriores al refuerzo primario.

En relación a las manifestaciones somát icas asociadas al síndrome de abst inencia f ísico

de las drogas evaluadas hemos observado que, en los ratones A2A knockout, la severidad

de la abst inencia f ísica de morf ina se encuent ra aumentada, la de THC disminuida y la

de nicot ina no se modif ica, en comparación con los animales wild-type. Los mecanismos

neurológicos del síndrome de abt inencia descritos para el caso de morf ina, THC y

nicot ina no son idént icos (Maldonado, 1997; Kenny y Markou, 2001; Maldonado, 2002). A

Discusión

187

pesar de la existencia de una interacción ent re opioides, THC y nicot ina a diferentes

niveles (Navarro y cols., 1998; Del Arco y cols., 2002; Castañé y cols., 2003; Castañé y

cols., 2005), se han descrito mecanismos específ icos, así como sust ratos anatómicos

part iculares para la abst inencia f ísica de cada una de estas drogas (Maldonado, 1997;

Kenny y Markou, 2001; Maldonado, 2002). De esta manera, nuest ros resultados sugieren

que no existe un mecanismo purinérgico adaptat ivo común para los fenómenos de

dependencia f ísica, sino que la adenosina modularía estos fenómenos mediante

mecanismos específicos para cada tipo de droga.

3. Posibles mecanismos implicados en las acciones del sistema purinérgico en

los procesos adictivos

En conj unto, nuest ros resultados comportamentales y demuest ran por primera vez que

el sistema purinérgico, a t ravés de los receptores A2A, regula las propiedades adict ivas

de drogas protot ípicas con alto potencial de abuso. Ahora bien, ¿cuál es el mecanismo

por el que los receptores A2A regulan los procesos adict ivos? Con los datos de los que

disponemos, no tenemos una respuesta definit iva a esta cuest ión, pero existen diversas

evidencias descritas en la literatura que nos permiten postular hipótesis explicat ivas de

nuestros resultados comportamentales.

En primer lugar, basándonos en la relación antagónica descrita ent re los receptores de

adenosina A2A y los receptores de dopamina D2, nuest ros resultados son concordantes

con la teoría desarrollada por Volkow y cols., (2002). Estos autores, mediante estudios

de neuroimagen (ver apartado 2.3 de la Int roducción), establecen una relación directa

ent re los niveles de receptores D2 en el est riado y la predisposición al abuso de drogas.

Así, mient ras que individuos adictos muest ran una baj a densidad de receptores D2,

individuos con altos niveles de receptores D2 presentan una protección cont ra los

procesos adict ivos (Volkow y cols., 2002; 2003). Según esta teoría predictora de la

adicción, el bloqueo de receptores A2A favorecería una mayor af inidad de la dopamina

por los receptores D2 confiriendo a los individuos una protección cont ra las propiedades

adictivas de las drogas.

Por ot ra parte, estudios recientes en grupos de invest igación especializados en

mecanismos de señalización int racelular (Lindskog y cols., 1999; Dassesse y cols., 2001;

Nishi y cols., 2003; Yao y cols., 2003; Svenningsson y cols., 2004) permiten postular una

hipótesis complementaria a la anterior, para explicar nuest ros resultados relacionados

con el receptor A2A y los fenómenos de refuerzo. En el est riado, los receptores A2A no

sólo están colocalizados con los receptores D2, también forman complej os funcionales

heteroméricos con los receptores de glutamato mGlu5 (Ferré y cols., 2002, Díaz-Cabiale

Discusión

188

y cols., 2002). El receptor mGlu5 es un buen candidato como modulador de los procesos

de fosforilación regulados por los receptores A2A y D2. Así, el receptor mGlu5 regula

directamente la señalización producida por el receptor A2A (Nishi y cols., 2003). Al

mismo t iempo, la est imulación del receptor mGlu5 potencia la interacción antagónica

existente ent re los receptores A2A y D2 (Ferré y cols., 1999, Popoli y cols., 2001). La

part icipación del receptor mGlu5 en los procesos de adicción ha sido estudiada por

diferentes grupos de investigación. El bloqueo farmacológico del receptor mGlu5 reduce

la conducta de consumo de etanol (Cowen y cols., 2005), de cocaína y de nicot ina

(Kenny y cols., 2003, Tessari y cols., 2004). Por tanto, no podemos excluir la posibilidad

de que la ausencia del receptor purinérgico A2A interfiera la transmisión glutamatérgica

procedente de la PFC hacia el est riado, y como consecuencia los mecanismos de placer

y refuerzo asociados al consumo de drogas de abuso.

Además de las interacciones a nivel de membrana, se ha demost rado la existencia de

una interacción antagónica recíproca ent re los receptores A2A y D2 en sistemas de

señalización int racelular, como el que cont rola la act ividad de la enzima adenilato

ciclasa (Fig. 1). El receptor D2, mediante su acoplamiento a la proteína Gi/o, inhibe la

act ivación de la adenilato ciclasa producida por la est imulación del receptor A2A, el

cual está acoplado a proteínas Gs/olf (Kull y cols., 2000, Hillion y cols., 2002, Kudlacek y

cols., 2003, Vortherms and Wat ts, 2004). Como consecuencia de está interacción

recíproca a nivel de la adenilato ciclasa, la est imulación del receptor D2 inhibe los

productos de la acumulación del AMPc y de la act ivación de la proteína PKA originados

por la act ivación del receptor A2A, que son: fosforilación de la proteína DARPP-32,

fosforilación del factor de t ranscripción CREB y act ivación de la cascada de las MAP

quinasas, con la consecuente disminución de la expresión de genes de act ivación precoz

como c-fos o el gen que codifica para la preproencefalina (Agnati y cols., 2003) (Fig. 1).

La proteína DARPP-32 t iene un especial interés en la t ransmisión dopaminérgica, y

además se ha demost rado su part icipación en la modulación de los efectos

farmacológicos de una gran variedad de drogas de abuso como son los opioides, los

psicoest imulantes, la nicot ina y el etanol (Lindskog y cols., 2002, Nairn y cols., 2004,

Valj ent y cols., 2005). Un estudio realizado con ratones knockout deficientes en la

proteína DARPP-32, demost ró que las acciones est imulantes de la cafeína dependen de

la fosforilación de DARPP-32 (Lindskog y cols., 2002). En la misma línea, dichos ratones

knockout most raron una atenuación de los efectos locomotores inducidos por el

t ratamiento agudo de cocaína, en comparación con los animales wild-type (Fienberg y

cols., 1998), mient ras que en ot ro estudio estos animales mutantes manif iestaron un

aumento de la sensibilización locomotora t ras un t ratamiento crónico con cocaína (Hiroi

y cols., 1999). Además, las propiedades reforzantes del etanol y la cocaína, evaluadas

en el paradigma de condicionamiento espacial y en el modelo de autoadminist ración

Discusión

189

operante int ravenosa, fueron reducidas de manera signif icat iva en los ratones

deficientes en la proteína DARPP-32 (Risinger y cols., 2001; Zachariou y cols., 2002;

Heyser y cols., 2000), demost rando la importancia de dicha proteína en las respuestas

relacionadas con las propiedades adict ivas de las drogas de abuso. Por ot ra parte, la

act ivación de los receptores opioides mu y delta modula los efectos inducidos por la

adenosina y la dopamina sobre la fosforilación de DARPP-32 (Lindskog y cols., 1999),

indicando que el desarrollo de las acciones de las encefalinas en las neuronas espinosas

del est riado está modulado por la fosforilación de DARPP-32. La act ivación de DARPP-32

es una paso crít ico para la expresión de dos formas opuestas de plast icidad sinápt ica, la

LTP y la LTD (Calabresi y cols., 2000). Estos fenómenos de plast icidad están

est rechamente relacionados con la act ivación de receptores dopaminérgicos, y como

consecuencia con los cambios neuroadaptativos que ocurren tras el consumo prolongado

de drogas, que permiten el desarrollo del proceso adict ivo. Resulta interesante

comprobar que los receptores A2A regulan directamente la fosforilación de DARPP-32

(Svenningsson y cols., 2004). Estos mismos autores han most rado que los ratones

deficientes en el receptor A2A presentan un déficit de la proteína DARPP-32, lo cual

guarda relación con el fenot ipo hipolocomotor manifestado en estos ratones, y también

con la ausencia de efectos reforzantes de las drogas de abuso estudiadas en nuest ro

t rabaj o. Por ot ro lado, también se ha demost rado que los ratones deficientes en el

receptor A2A presentan un estado funcional hipodopaminérgico en el est riado y córtex

cerebral (Dassesse y cols., 2001) que apoyaría nuest ra hipótesis y cont ribuiría a explicar

nuestros resultados.

Por ot ro lado, la cascada de señalización int racelular inducida por la act ivación de la

PKA y el resultante aumento de la formación de AMPc es un fenómeno estudiado y

común en los procesos de adicción de todas las drogas de abuso (Nest ler, 2004). En este

sent ido, se ha observado que cuando se coadminist ran dosis no efect ivas de agonistas

CB1 (metanandamida) o agonistas delta opioide (DADLE) con agonistas D2 (NPA), la

señalización PKA/ AMPc se act iva de una manera sinérgica, que requiere a su vez la

act ivación endógena de los receptores de adenosina A2 (Yao y cols., 2003). Estos

autores argumentan que la colocalización de receptores A2, D2, delta opioide y CB1 en

las mismas neuronas en áreas cerebrales como el NAc confiere hipersensibilidad a la

acción de los cannabinoides, los opioides y el etanol. Además, de manera simultanea,

esta sinergia aumenta la sensibilidad de la señalización postsinápt ica ligada a los

receptores D2, relacionada con la adicción de drogas de abuso (Yao y cols., 2003).

Discusión

190

Figura 1. Mecanismos involucrados en distintas interacciones bioquímicas entre los receptores de dopamina D2 y los de adenosina A2A. (Ferré y cols., 2004).

Por ot ro lado, Andersson y cols., (2005) han observado que el efecto psicomotor de los

cannabinoides ocurre gracias a la cascada de señalización int racelular de act ivación de

la PKA, que t iene lugar en las proyecciones est riatales de naturaleza gabaérgica en el

NAc. En dicha cascada, la fosforilación de la proteína DARPP-32, dependiente de la

act ivación de la PKA, representa un paso crucial. Mediante estudios bioquímicos, estos

autores han demost rado que la fosforilación de la proteína DARPP-32 no ocurre sin una

correcta t ransmisión dopaminérgica y purinérgica mediada por la act ivación de los

receptores D2 y A2A, lo que sugiere de nuevo un papel fundamental del receptor A2A

para la completa acción de los cannabinoides. Estos dos trabajos ponen de manifiesto la

existencia de una confluencia en las acciones inducidas por los sistemas cannabinoide y

purinérgico. Según esta hipótesis la presencia de ambos t ipos de receptores, CB1 y A2A,

permite que los efectos de las drogas de abuso como los cannabinoides, los opioides y

los psicoest imulantes se produzcan de un modo completo. Los resultados most rados en

la presente memoria apoyan esta hipótesis y proponen al sistema purinérgico y en

part icular a los receptores A2A como un sust rato común en la adicción de drogas de

abuso. La manipulación farmacológica de dichos receptores A2A podría suponer una

nueva diana terapéut ica en el t ratamiento de las adicciones. Con todas estas

evidencias, y con los resultados comportamentales obtenidos en este t rabaj o, podemos

Ext

Int

Discusión

191

apuntar la existencia de mecanismos de adaptación int racelulares, que ocurren t ras la

liberación de dopamina y la estimulación de receptores D2 que estarían alterados en los

ratones A2A knockout . Los cambios en los sistemas de señalización int racelular podrían

estar relacionados con las respuestas inducidas por las diferentes drogas evaluadas en

dichos ratones mutantes.

En conj unto, nuest ros estudios nos permiten af irmar que ambos sistemas, el

cannabinoide y el purinérgico, son necesarios para el completo desarrollo del fenómeno

adictivo. Así pues, sería de gran interés desarrollar nuevas estrategias de bloqueo de los

receptores A2A y CB1 para atenuar e incluso prevenir el desarrollo de la adicción.

Discusión

192

Conclusiones

195

El t rabaj o desarrollado en la presente Tesis Doctoral permite ext raer las siguientes

conclusiones:

1. El sistema endocannabinoide, a t ravés del receptor CB1, part icipa en la ef icacia

reforzante de la cocaína. Además, la presencia de dicho receptor es necesaria

para los procesos de consolidación de una conducta operante mantenida por la

autoadminist ración de cocaína. Este estudio demuest ra la importancia de dicho

receptor CB1 en las propiedades adict ivas de la cocaína, confirmando que el

sistema endocannabinoide es un sust rato común para la adicción de drogas de

abuso.

2. Los receptores de adenosina A2A part icipan en la modulación de las propiedades

reforzantes de la cocaína. La supresión de los receptores A2A en el ratón

confiere un fenot ipo resistente al desarrollo de una conducta compulsiva de

búsqueda de cocaína. La manipulación farmacológica de estos receptores podría

suponer una nueva diana en el tratamiento de la adicción de cocaína.

3. Los receptores purinérgicos A2A regulan las propiedades grat if icantes y aversivas

del THC. Además, estos receptores part icipan en las manifestaciones somát icas

inducidas por el síndrome de abstinencia de THC precipitado por rimonabant.

4. Los receptores de adenosina A2A part icipan en los efectos de recompensa

inducidos por la nicot ina. Los receptores A2A también part icipan en el aumento

de dopamina ext racelular en el NAc inducido por nicot ina que está relacionado

con sus efectos gratificantes.

5. Las propiedades grat if icantes producidas por la morf ina están reguladas por la

adenosina, a t ravés de los receptores A2A. Los efectos disfóricos asociados al

síndrome de abst inencia de morf ina dependen igualmente de la act ivación de

estos receptores.

6. El sistema purinérgico, mediante los receptores A2A, representa un nuevo

sust rato biológico para explicar el desarrollo del proceso adict ivo originado por

la exposición a distintas drogas de abuso.

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Breath it in and breath it out and pass it on it's almost out

We're so creative and so much more We're high above, but on the floor

It's not a habit, it's cool I feel alive

If you don't have it your on the other side

The deeper you stick it in your vein The deeper the thoughts there's no more pain

I'm in heaven, I'm a god I'm everywhere, I feel so hot



I'm not an addict (maybe that's a lie)

Oohoo, Oohoo, Oohoo, Oohoo, Oohoo, Oohoo, Oohoo Oohoo

It's over now, I'm cold, alone I'm just a person on my own Nothing means a thing to me

Oh, nothing means a thing to me



I'm not an addict (maybe that's a lie)

Free me, leave me Watch me as I'm going down

Free me, see me Look at me I'm falling And I'm falling.........

It is not a habit, it is cool I feel alive I feel.......

It is not a habit, it is cool I feel alive

I'm not an addict, I'm not an addict, I'm not an addict.

Not and addict. K´s Choice

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