UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Facultad de Ciencias Químicas

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I

SHOCK ENDOTOXICO:

HEPATOTOXICIDAD. ACCION DIRECTA DEL LIPOPOLISACARIDO DE f. coli

SOBRE DISTINTOS TIPOS CELULARES HEPATICOS

M.’ Jesús Ainaga Logrofio

Madrid. 1992

Colecci6n Tesis Doctorales. N.P lW92

0 IvI.~ Jesús Ainaga LcgroM

Edtia e imprtme la Editorial de la Universidad Complutense de Madrid. Servicio de Reprografía Escuela de Estomatología. Ciudad Universitaria. Madrid. 1992. Ricoh 3700 Depbtto Legal: M-12223-1992

: y M.? i’ORTO¿ES . . . . . . . ..-.“.....”

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hbiendn recibido 1A calificación 61? .:!?.?.‘:?:!. :.??E”

POR INPNIMIUAL. . . . . . .._.*_...........................................

Wdrid. A *’ de junio dA.lgyl.

EL SEcmAaIo DEL TRIBuwAL.

SHOCK ENDOTOXICO: HEPATOTOXICIDAD.

ACCION DIRECTA DEL LIPOPOI.ISACARIDO DE Exdi

SOBRE DISTINTOS TIPOS CELULARES HEPATICOS.

Tesis Doctoral

que presenta

M’ Jesús Ainaga Lngroño

NDISC”SION. ......................... .... .................... 131

ACcKm DEL Ll5 IN WVCJ. MODELO DE SHGCK uywToxlco REVERSIBLE .............. ... 131

1.1. s”psr*udo dismutasa (Sm) ..... ... ......... ... .. 132 1.2. PcraUdacián lipídica .................. ......... ... ... 133 11.Nivdadecitmomob,. ........ .,., ...................... 134

:. ACCION DEL LPS IN VTTRO. UTLLIZACION DE DKm.mS TIFOS CELULARES fEPh77C”S ........ !35

2.1. .‘utenciorlw modol6gi’ca ...... ............................ m 2.2. Incorporacid” y ,&ón intracdular del LFS .................. 137 2.3. Ropiedadcs fisiras de la membrana phsmcdka ................... 138

23.1. meraci*n de LDH ................................ 138 23.2. Retención huacelti de tluorercina ................... 139 2.33. Micrwiworidad. Heno de I* cndototia .............. 141 2.1.4. tiovbridad. Efecm de sale5 biliares. ................. 143

2.4. F”“chldidad de la membrana plasmatica ...................... 147 24.1. hmpraci6” de [ 1. q-*4esoxigl”msa .......... ........ 147 2.42 “ni& e internación dc [~T.i”Wl,i”~ ....... ............ 148 2.4.3. Unión e imemaci6n de [‘“I].LDL ................. .... iso

25. Parhstror bioq uimra. intracelulares ..................... 152 2.5,. Gl”cq”imra .......... ................. .... 153 2.52. Fosfatas3 kida ............ ....................... 153 2.5.3. Superóxido ckmu<asa (Sm) y capacidad otida*iw intraCel”lar 154 25.4. Pertidaci6” lipidica ~. ........................... 155 2.55. Niveles de citcaomo b, .................... .. ... 156 25.6. Homeortasis del cakio intraceluia: ................ .... 157 2.5.7. pH intracdtdar ........................ ........... ISV

2.6. Interacción caulas “0 parcnquimatasas - c4ulas parenquimatosas .... 100

v. CONcL”SIONEs. ~. 162

\7,BIBUOGRARA. 167

1. INTRODUCCION.

ImmupiuI Y4wa ! -.i

,-__-. _-

N 8

l?Tfm.Q---~ - _., -.-.-9

W

-- ---.-

ü

i

/ 1

__-- J

1

--~-- LL! ___ ---------_

23

N 2.5

29

22 --

3.5

36

5. OBJETIVOS

- 32

IL MATERIALES Y METODOS.

3.2. .AISLAMIENTo DE DEJmToS ms CELULARES HEPATICOS.

c

-.

IIL RESULTADOS.

w

246 24 7,

300

G-

200 0

r-3

100 =

i

0

2

TIEMPO (horas)

-69

tc í: 0 600

\

i? ., 0 50” _.

<.

TIEMPO (hot-asj

s a9.

.-.-..-

J 3

/ is

t

NA.-DPH »PH

c

.

RFSW TÁDOS fo’

Sin embargo en las células parenquimatosas, la disminución de la mioroviscosidad de sumembrana plasmática, observada tras el tratamiento con tas distintas sales biliares, no parecetener una relación directa con la hidrofobicidad de ¿sus, siendo el efecto mayor en la zonaexterna que en la interna acepto para el TUDC (el más polar). que prácticamente no afectaa los hepawcitos en la zona exterior de su bicapa lipfdica (Talt 1?).

TaNa 17: Efectode lañnbaciá. <3&nin/rC)caz d¿shntas talasbitares <2nM~ sobrelanuoosucos,dad

dela nsanbnma plasmdácadeahilar parenquimatosas hetkasp.rihatbad«s ca’ 7M4-DPHo DPI?. L,spa’renaja secaln.r¿ae req,actoo lo ~niorniycoñda4delas Uhilas cafl¿

1R&TAMIEPJTU‘y (qE,)

TMA-DPH DM4

Control 100*5 100±tTUflC ~±6 85±2TC 78±3 83±1Mezcla 82±3 92±2TtJC 85±2 96±1

En términos generales, se puedeapreciar un efecto lluidificanse de todas las sales biliaresensayadas, tanto en células parenquimatosas como en células no parenquimatosas.Considerando el efecto contrario ejercido por el LPS a nivel celular hepático; así como elhecho de que estas sales billares disminuyen la unión de la endotoxina a lns maerófajos deKupffer (excepto el TUDC), se procedió a analizar la influencia sobre la microviscosidad dela incubación de células parenquimatosas o no parenquimatosas con sales biliares y LPSsmultánean,ente,

Us Tablas 18 y 19 muestran los resultados obtenidos, apreciándose que la incubaciónsimultÁnea <le las células con so] biliar y endotorina, anula los efectos tluidificantes de lassales biliares, así como el efecto contrario del LP$. Esto ocurre en ambas poblacionescelulares (parenquimatosas y no parenquimatosas) y en las dos zonas estudiadas de la bicapalipídica (externa e interna).

PrsuLr400s 102

TÚ¿. I& Efecto de le bnbaci¿n (3&nM/WC) cas distintas sales bilmas (2’nM) y LPS (200&¡/ml),sinwk4neamente, sobre la miasn¿scenidad de ¿a ,ncmbmna plcsmdtca de células painqsdmaloseshepáticaspreincubedas can 77t4-DPHo DPI!. Lasporrentajes se calculan ‘espacioe la mla.Mscosidad de las cAdas casuaL

MIcRoVlSa)smAD

TRATAMIENTO TMA-DPH DPI!e (Pat) % q (Fas> %

Control 0370±0.010 103±3 0.174±OflF 103±5TUDC 0338±0.032 91±4 0167±0.035 96±3TC 0.351±O~5 95±1 0.177±0~ 102±0Mezcla 0371±O.~~ 103±2 0.161±0.035 96±3TDC 0.390±0.036 105±1 0.~9±0rn2 120±1

Tale 1* Efecto de la incbbaciá (3&nM/3~C) con diMitas sales billares (2,nM) y LYS <200jsg/ns 1>,sunsd’dnemnenz sobre la ,nicnsscosidad de la manbrasa plasmática de células noparenquñna*osas hepáticaspreincubadss con TMÁ-DPH o DPI!. Las po.reniajes se calculanaspecto a la micraviscosidad de las cAdas controL

MIGROVISCOSIDAD

TRATAMIENTO TMA-DPH DPHq(Pas) % n(Pas) 91

Control 0.503±0.016 103±3 0.322±0.01.5 103±5TUDC 0.472±0.0~ 94±0 0323±0.031 103±1TC 0.498±0.010 99±2 0.336±0.01.5 104±4Mezcla 0.4S7±0.01S 97±3 0.315±0011 98±4WC 0.434±0.~ 86±2 0.340±0.038 I~±2

3.4. FUNCIONALIDAD DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA

DE CELULAS HEPATICAS.

3.4.1. Incorporaciónde j4q.2-desoxiglucosa.

La 2-desoxiglucosa,metabolito que es transportadoy fosforilado por los mismos

mecanismosque la D-glucosa, no puede ser metabolizadopor la célula. Por ello la

PPtflY.TAN1.C ini

incorporación dc este compuesto marcado radiactivamente permite comprobar la fundo-nalidad de la membrana plasmática de los cuhivos celulares utilizados.

En este sentido, los hepatocitos en cultivo muestran un cornportasniento dosis-dependienterespecto a la dosis de 2-desoxiglucosa (Tabla 20). En cuanto a la influencia ejercida por elLPS, se observa una disminución del transporte de glucosa directamente proporcional a ladosis de endotoxina utilizada <Tabla 2)).

Tablar

TaU. 21;

lnca7n,táMde(“CP2-drsot*cosep~ hepeocitosen o~hhn

CONCENTRACIONDE [‘q-2.DESOXIGLUCOSA NCORJ’ORAflA

DESOXIGLUCOSA (emoles/lO’Pc)

O.lStnM 16.93±113

0.5OmM 24.07 ±2.271.03,raM 50.17 ±167

Efectodel LPSsobre la incorpomcic¶ndef>’C].2.dcsasWacosapo,céhilaspannquimalosasen<tUrno. La conceatracaóndedesongh¿cosa— el medioesde O.S&nM.

INCORPORACIONDE [“CI.2.DESOXIGLUCOSA

TRATAMIENTO

(nrnks/10’Pc)

Control 24.07 ±2.27 Itt) ±9

LPS 10 20.94 ±0.63 87 ±3LPS 50 13.48±0.29 56±2

LPSUYJ 1.2.76±0.31 53±2

Asimismo, los cultivos primarios de células no parenquimatosas incorporan activamentela 2-desoxiglucosa, siendo la influencia de LPS diferente en dependencia de la dosisempleada, como se obseiva en la Tabla 22.

RESUL TADOS 104

Tabla fl EfectodelLPSsobrela Incorporacióndef”CJ-2-desañgtucasaporcélulasrio pwrnquirnatosarencUtis. La co.acnwncióndedesosigluconaen el medioesdeL$YMsM?

INCORPORACIONDE I”CI-2-DESOXIOLUCOSA

TRATAMIENTO(p<noles/10’NPC) 91

Control 343±30 103±9LPS 10 513±15 150±3

LFS50 271±5 79±2tPS1~ 354±8 103±2

3.4.2. Unión e internación de [Zfl~insulina.

Las alteraciones producidas por la endotoxina en las propiedades fricas de la membranaplasmática pueden repercutir en la unión e internación de distintos ligandos. Entre ellos lainsulina tiene un interés especial por desarrollarse, durante el shock endotéxico, unaresistencia periférica a esta hormona.

Por estas razones se ha analizado el efecto de la endotoxina sobre la unión de [‘flJ.insulina a bepatocitosen cultivo. obteniendose los resultados que —muestran en la fIgura43. E 0L)

100.1

80

60

40

20

o

INSULINA (pg/io6cals)

¡‘ira e EfectodelLPSsobrela uniónespecíficade insulina a hepatocitosa oUám

Lascélulassonp’rincubadasenpresencia< • ) o ausencia( o ) deLPS<2&7~ig/ml) durante3Onsln a 25’C El medioesespinadoy se¡tilde entoncesla incubación con una concennución

constantede (‘5’IJ-insullna <1.Irig/Ztt Pc) y concentracionescrecientesde la hormonafrío (4íd, io~ JQ’ 10’ y JO’p~h>’ Pc) du,antc9onina 2?C.Lospo’rcntajcssccalculanrcspectoe

la unióncontrol def’5!J-insulina en a’4senciadehormonafila

10 102 102 io~ 10~ itA ~

orcrnrArbrbc 105

Se observa que el LPS produce una disminución en la unión de insulina a las células contodas las dosis de hormona utilizadas.

También se ha analizado el efecto de la temperatura y el LPS en la unión especifica deinsulina <Tabla 23).

Tabla21 Efecto del LPSsobra la unión específicade insulina a hepatocito.en addsto, a diferentes

1~.

Las cAda,— praincubadascon o sin125 <2001i5/mJ).h¿mnfr30.nina SC El medioes

asp<mdoyseinicieentonceslaincubacióncon (>31fln.dina<8Ot?pg/ml)espresenciao ausencia

de —seso de hemnonafila <lOOpg/mJ); domnieQúnina 4 256 P’C La porcentajesse

calada,,>tqxcto a la uniónespecíficacontrol de (tZ¡Jq>~5jjfi>.~ a cadatempoatu¿.at>isa>,tdt

TEMPflATLJRA 4C 2TC 37’C

B(%) 41±7 70±14 100±9

La disminución de la unión de [‘9)-insulina inducida por el LPS en las células parenqui-matosas, es mucho oUa patente cuanto menor es la temperatura del ensayo, desapareciendoel efecto a 3rC.

Para analizar la influencia de la endosoxina sobre la internación de insulina y su tiempo-y temperawra-depadeocia, se nevaron a cabo diversos experimentos utilizando Ja técnicade lavados ácidos <Olefsky & ¡Cao, ¡982) ya que es conocida la disociación de los complejosreceptor-ligando inducida mediante acidificación <Davis es aL, 1987).

En primer lugar se ha estudiado Ja unión específica tota] de f all.insulina a Sepatocitosen cultivo preincubados (LPS) o no CC> con la endotoxina (200ttg/mfl, durante diferentestiempos (3VC) <Fig. 44). La distinción hecha entre hormona unida a la superficie celular yhormona internada, permite observar que a tiempos conos de incubación <30min), el LPSdisminuye claramente la unión total de hormona, tanto la contribución de insulina superficial(enralbie por el lavado ácido) como la de insulina internada. A medida que aumenta eltiempo de incubación con la endotoxina, la unión total de insulina va siendo menos afectada,desapareciendo el efecto previamente observado sobre la cantidad de hormona asociada ala superficie, la cual llega a ser incluso mayor que en los controles. La internación de insulinase ve, no obstante, claramente disminuida por el 125 a todos los tiempos de incubaciónensayados.

En segundo lugar se procedió a analizar la dependencia de la temperatura en el efectoejercido por la endotoxina sobre la internación de la hormona. Para ello, los hepatocitos encultivo fueron preincubado. con LPS (200pg/rnl) e incubados posteriornsente coninsulina durante 96mnin a 4 ó 3~C.

En la Figure 45 se pone de manifiesto que 1. disminución de 1. internación de insulina,producida por el LPS, es mucho más patente a temperaturas bajas (CC) que a 37C.

PFVULTADOS 1t~

5

Abetodel 125saé.w la unión

L ahilassonpdnatbadasa ¡maciso asad,de1.25<200%tg/nsl)whaw,te3&nina 25CEJmetilo a aspáwdoy las dbdas— entonenincubadasconf~’IJ-inssd1na<&¶Xip,JnuJ> —

presadao asadade unwao deho,monafha<1(N)ug/rtsl), ¿tazase34 606 9<Msin aMtTresretiresdmeuí~la italia, hasmadasedetemInemediastela técnicade add4Tcad&

O InmErsauruda a la sttp.~fioe. 5 Insw.ilselatenada.

La nonade adsw t¿’mmoseq»oala uruás.espec4icatotal del. &aw.asa4<5Ce

o—2~

c,ys dra cU’S

30 90 trata)

e mtenadá.de Insulinaa hepocitcsa o¿hiw a distintos

Al a

iii

*1

e u-s c u>$Pipan4±Efectodel 125sobre la unión e buentaciónde insulina a hqaeodaen o¿Mw.. a distintas

LascAdassonpreincabailasenpresenciao a.tsenciade125<2OO~ig/ml)duranteIlknin a25t

El medioesaspiradoy las c&las so,’ otsoncestriotiadas con f04j-bLntlina <800pg/ml)en

presenciao atraco de un excesodehonnonafha (HijAs/mO, d4raníe91Ms1na CC 44) ¿ a

37’C <E). Tras nnrar el medio la ,assUina internada se deterní,.,mediantela técnica de

Q¡ruuíínaunsóaa la supefic.e. ,~.J Insulina intentada

La sumadeambosténntnosopresala uniónespecíficatotalde la hormona

RESULTADOS 107

3.4.3. Unión e internación de ¡9J-LDL

La mayoría del colesterol plasmático está contenido en las lipoproteinas de baja densidad(LDL) (Gold,tein & Brown, 1977) cuyo catabolismo bepático (Bhanacha¡wet aL, 1984)

requiere una endocitosis mediada por receptor <GoW.neinti aL, 1985;ICJeinJ±ntris,Jc.Slins

era4 1990).

Puesto que durante el shockendotóxico el metabolismo hepático se halla comprometido.,se ha analizado el efecto de la preincubacién con distintas dosis de endotoxina, sobre la unióntotal de (91-LOL a hepatocitos en cultivo (Fig. 414.

g 120-

q :oo--

L .— 60- .-. 0 O

40-

20-

o60 120 180 240

TIEMPO (mm>

flgn * EfectodelLESsobrela unión totalde LDL a hepatocitosenc,Utiso.

LascAdas— prek¡cabadasen muenda<o )o presenciade distintasdosisdeLES<. LES

1Mw 12521%))durante3&nin a WC El medioa aspiradoy seinicia entoncesla incubaciónca,f”’1J-LDL (4SOog/nsl)enpinada (0 O)o ausencia&) —0> de un ~ra cresode

LDLfila <3%jsg/ml), ¿tate ¿bilatastionposa WC Lospatasi*s secalculan respectoala m*fantauniónconúojen ausenciadelipoprc*elnafila.

Sólo con dosis de 200pg LES/ml se observa una disminución en la unión de lalipoproteina, ints patente a tiempos más largos.

Se ha descrito que la incubación con HII)L aumenta el nOmero de R,,,,~ presentes en lasuperficie celular <Ifavekesfluí, 198dm,Havelcesci a4 198614. Por ello se procedió a realizarun estudio paralelo al anterior pero incubando además las cÉlulas con HDI, con el fin dcanalizar si el incremento del nOmero de R~ es capaz de revertir el efecto del LES(200¡g/ml) sobre la unión de [“‘fl-LDL a los hepatocitos. Los resultados obtenidos <Pl

1. 47)

O.~1

RESfIL TADOS los

indica, no obstante, una inhibición de la unión específica de LDL excepto en el caso de quelas células sean pretratadas con lOOitg/ml de endotoxina.

-2

o

CV

120

100

80

60

40

20

o

r~o~47: Efectodel LESy la HDL sobre la unión totalde LDL a hepasod4osen a4ltirÚ

LascAdassonprrtncnbadasenausencia<0> opresenciade distintasdosisdeLES < ~ LES1O~ U 1.25 20<1) ¿transe3&nin a WC El medioesaspiradoy selleva a caboentonceslaincubación con ¡¡DL <260jlg,/ml> durante 4Smnin a 3~C Tras retirar el medio se inicia lainatbacitin con f’~1j-LDL <4SCng/ml) en presencia(O . o ausencia<O — O) deun gwn

asesodeLIII. pta (300#g/nd).durante distintosttemposa 37’C Losporcentajessecalculanrespectoa la másirnaunióncontroj en ausenciadelipoproteinafría (LDL y ¡¡DL).

La ampliación de este estudio con distintas dosis de HDL <Fig. 48) confirma los resultadosanteriores indicando que esta lipoproteina de alta densidad disminuye la unión de LDL a susreceptores en hepatocitos. Esta disminución es parcialmente inhibida en presencia de LES.

TIEMPO (roso>

Prc,ITTÁnO& 109

120

q IGO

80LoCO— 60

40

20

0

HDL (gg/ml)

* E>’eao dedituasconcentracionesde¡¡DL sobrelaunid. totaldeLDL a htpatoci*osencukis.LasciAdas sonpreincubadasa esencia< O ) opresenciadedísdrttasdosisdeLPS<~ LES

164 3 LES260) durrante 3&nin a WC El medioesaspinzdoy selleva a caboentoncesla

inosbad&,con¡¡DL <134 260y520Mg/ml) durante4SminaWC Trasretirarelmedioseinicia

la bsajbeddnc,~Zq.LDL <fltg/ml) enpresenció<0 0>0 tit¿senda<O—O) deUn

go. cresodeLDL j5t (360iJg/m12¿transe240oti, a WC Losporcentajesse caicalan

respectoa la máximaunióncatul en ausenciade l~uapn,eeina.IWa <LDL y ¡¡DL).

Para analizar si el efecto de la endotoxina se ejerce sólo a nivel de la unión de la LDLo si también existe alteración de la internación de la lipoproteina por el hepatocito. se hadeterminado el porcentaje de internación de dicho ligando tanto en presencia como enausencia de LPS <TabLa 24).

Tabla2k EfectodelLESsobre la intanadónde LDL en hepotocíros en cultivo.

LascAdassa~preincubadasapresenciao auso,ciadeLES(100¡ig/ml)durante3iYtnin a JTtZ

El medio es aspiradoy las célulasson entoncesincubadasce,, f151J-LDL <es/Mg/mi) en

presenctao ausenciadeun gran cresode LDL frió (ICMflsg/rnO. ¿transe24ikmna WC Tres

,wtfrs el medio la LDL intensadase detenninamediantefa técnica de acidiflcactórt. L,s

p<wce’tiajes secalculasrespeesoa la rnktmauniónconfrol en ausenciade hwprotetnafrió.

lotera. 4. Supesfacial Superfidal Interna % Internación

CONTROL 62.1 37.6 24.5 39.51.25 1~) 54.3 12.5 41.8 77.0

0 130 260 390 520

lío

Los resultados indican que la cantidad de LOt. internada es prácticamente el doble en lascélulas preincubadas con endotouina que en las control.

Teniendo en cuenta la especial naturaleza de este ligando, que presenta la posibilidad deformar complejos estables con el ¡SS (Van Lensence aL, ¡986), se ha analizado detallada-mente la influencia de la endocoxina sobre la unión específica de la LOT., comprobándosela existencia de una alteración de la unión como consecuencia del aumento de interaccióninespecífica LOL-membrana celular <flgs.

49ySO).

a

1)02

120

100

80

60

40

20

TIEMPO (mm>

l20min 24Omin

Total 593±0.9 87.1 ±11.7 im.o ±05Inespeolica 36.8 ±1.5 39.0 ± 2.0 37.9 ±1.1Específica 22.6 48.1 62.1

Figrra 4* Uni&t específicadeLDL a hepasocilosen niltivo.Lascdnlassonpreincubadasenausenciade LESduranteS&nina 32”C El medioesaspirado

y las chulasson entoncesincubadascon f’~II-LDL (480’ng/ml) enpresencia<o-- O > oausencia6j—ódeun ¡ran escesodelipoproteinafría (SOOMg/ml),durantedistintosdernpos

aWCLodiferenciadeantbosténninosesla Unión específica(s).Losporcentajessecalcu lar,

respectoa la mdtnhaunióncontrol enausenciade lipoproteinafrió.

#tvflt tAnnt

60 120 180 240

O11

o

01

0 60 120 160 240

TiEMPO (mm)

6é3min llOmin lAOmin

Total 67.9 ±7.6 80.8 6.4 1t13.O ±11.2lneapet~ca 47.9 ±4.6 43.6 ±2.9 45.7 2.1Específica 20.1 37.2 54.3

FigawSé EfectodelLESsobrela uniónespecíficade LDL a hepatocitosenad¿h.Las célulassonpreincubadasenpresenciadeLES<100»g/ml)durante3&nin a J7CEl medio

esespiradoy las célulassonentoncesincubadacon (trIJ.LDL <4SOng/ml)enpresencia

(0 0)0 ausencia(O—O) de — goscresode lipoproteina fría (300gg/ml),durante

dsatnntiemposa WC La «esenciadeambostinninceesla uniónespecífica( • ). Losportenlajessecaldila.’t respecioa la mAslnwunióncentral enausenciadeh>,opneMofría

3.5. PARAMETROS BIOQUIMICOS INTRACELUlARES.

Ea este apartado se analiza la influencia de la endotoxina en diversos aspectos de lafusición celular, aspectos que incluyen la actividad de algunas enzimas: glucoquinasa, fosfatanácida y superóxido dismutas.; la peroxidación lipídica, los niveles de citocromo b, laconcentración de caldo citosélico y el pH intracelular.

RESULTADOS

•.~0

.27-’

CO

it’

120

130-

80~

60 -

40

20

o

RFSlIli TA DOS Ii,

3.5.1. Glucoquinasa (<3K).

La actividad de la enzima OK se ha estudiado en hepatocitos en cultivo analizando lainfluencia de distintas dosis de endotoxina. Los resultado. indican (Fig. Si) que sólo a partirde lO<lpg/n’1 se obsesva un incremento sigrsifscativo de la actividad enzixnática intracelular.

200 -L

150

Y0 100

50

0 -0 DO 100 200

LPS (pg/mI>

¡rpm SL’ Efeno dela incubación(2h/37”C) con diferentesdosisde LPS,sobrela actirédadintracelular

de OK eni.epuztocitosen cultivo. Losporcentajessecalculanrespectoa la actividadde OKen

las cihdascontrol (

Asimismo, se analizó la influencia del tiempo de incubación con la endotoxina y el efectoque las sales biliares It y TC +TDC ejercen sobre este parimetro. La Figuro Si muestra queel LPS (200pg/ml) a las 2 horas de incubación con los hepatocitos, duplica la actividad deOK. efecto que se anula si el tiempo de incubación es menor (30min). En cuanto a las salesbiliares, no muestran influencia a ninguno de los tiempos de incubación ensayados y. ademtis,anulan el efecto del LES {200pg/ml) llegando incluso a convertirlo en efecto de signocontrario (TC+TDC).

pEvir rAr,ns 113

Gl< (%)

200

150

100

50

#Ygar52- Efectodeltiempodeino¡bacióncon LPSy/o distintostiposdesalesbiRa,ersobele actMdedintracelulardeOI<c. hepatocitasa. cidá,. Losporteasajes secaladasrespectoa la actiindod

de GRde los monocapascontrol (CX%). (A)3ánM (E) iZGnñtTCTaoocMa¿asddico2rnMTDCTaurodesoricalatosuico2mM?C+ lTJCMaciafisiológica

E .4usenciadeLES. .~ Presenciade LES.

3.5.2. Fosfatasaácida (FA).

El efecto de la endotoxina sobre la liberación de enzinias lisosomales dei parénquimahepático se ha analizado utilizando como modelo espesimental el cultivo primario dehepatocitos en monocapa, y como indice del daño lisosomal la actividad de fosfatan kidaen el medio.

Para ello, se toman alícuotas a distintos tiempos de los sobrenadases de los cultivos.incubados o no con distintas dosis de LPS. Los valores obtenidos de la actividad de lafosfatan ácida correspondientes a estas muestras se representan en la Tabla25, observándoseque sólo en presencia de cantidades elevadas de la endotoxina (lmg/nil), hay un aumentosignificativo de la actividad extracelular de la enzima.

O ‘10 TCi-’lDG O lO 90-VIDe

RESULTADOS 114

Tabla21 Efectodel LESsobrela actividad etacebilar& fosfasosaácida en hepatocitosen odtivo. ad~n —

mSFATASAACIDA EJCrRACELULAR(U/I)

LPS(Mg/mí)

TIEMPO (niTRaL5W 1o~

Oh 0.22 ±0333 0.18 ±orn 0.18 ±orn on ±0.08 oló ±0.03

28 0.29±0.15 0.13±0.06 0.15±0.01 0.41±0.06 0.49±0.0848 034±0.10 022±0.09 0.20±0.02 031±0.01 0.~±03l

6h 0.47±0.09 0.31±0.02 0.32±0333 0.25±0.04 0.74±024

Tabla2* Efectodel¡¿PSsobrela actividadún’acehdsdefosfatasaácida en hepatodiosen

FOSPATASAACIDA tNTRACELtJLALR(13,1)

LPS(ps/mí>

TIEMPO CONTROL103 203 5W

a 41.22±2.20 32.22±2.~ 37.64±7.03 39.16±1.~

La Tabla 26 muestra la ausencia de efecto de la endotoxina sobre la actividad de lafosfatasa ácida en el interior de los hepatocitos en cultivo.

3.5.3. Superóxido dismutasa (SOD) y capacidad oxidativa intracelular.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los estudios inviva (Resullados,apdo.21),el análisis ha s~n de este parámetro puede esclarecer si existe un efecto directo ejercidopor la endotoxina sobre los hepatocitos o si por el contrario, es un efecto indirecto debidoa los mediadores del shock.

Con este punto de vista se ha analizado la influencia de distintos tiempos de incubacióncon LPS (200pg/ml), sobre la actividad de la SOD en hepatocitos en cultivo. El tiempo deincubación de 2h es el que manifiesta un aumento de actividad respecto a los controles (Fig.SS>. En consecuencia la incubación con distintas dosis de endotoxina se llevó a cabo a dostiempos diferentes (2 y 4 horas), manifestándose dos comportamientos distintos en lo que aactividad de SOD se refiere (Fig. 54).

RRStll7’AflflC lis

e

120 210

TIEMPO (mm)

r~au 5±Efectodeltiempode incitación con ¡¿PS (2lJOgg/rnl) < • ), sobrela actividadinrmcelufrdeSODen hepatocztosencultiv-ú Losporcentajessecalculantrapecioa los controlescon’espondien.

Lesa cada tiempo ( cM~

~1

0 50 100 200

LPS (p¿g/ml)

FlemSt Efectode diferentesdosisde LESsobrela actividad intracelular de 500 en hepatocitosencultivc~ a 2horas( * ) ¿4 hotos< • ) deincubación.Losporcentajessecalculan respectoa

*tosco.’utroles con’espondientesa cadatiempo (

150

oo-Dc

100

500 30

50©

00--

50 -

PC’77 11K

La incubación durante 2horas con la endotoxina, produce un efecto antiogo al observadoir. viso (Tabla 8), consistente en una disminución ‘inicial (‘fase aguda’) de la actividad deSOD, que luego increznenta (‘fase de recuperación”) respecto a los controles.

Sin embargo, La incubación durante 4 botas con distintas dosis de LES, determina unavariación de la actividad de SOL) que no puede considerarse significativa.

Seguidamente se llevó a cabo el estudio de la influencia de distintas sales biliares sobrela actividad de SOL), de modo análogo a lo realizado con la <3K (Fig. .52). Los resultados seespresan en la Figura SSe indican que las sales biliares estudiadas disminuyen considerable-mente la actividad de SOL), efecto contrario al ejercido por el LPS (200pg/ml) a las 2 horasde ‘incubación. Además, se observa de nuevo que el tratamiento de los hepatocitos en cultivocon sales biliares y endotoxina simuhtieamente, anula el efecto de este altimo, manifestalx-dote únicamente la influencia de La sal biliar.

‘su

SOS (2~

50

SI, Efectodeltiempodebntbaciá,.ca ¡..PSy/o distintos~ desalesbiffans,sobrela actividadintracelulardeSODenhepatocisosencultivo.Losporrentajessecalculenrespectoa lo actividad

de501)de las monacapascontrol <u 1<10%). (A) 30.nin (E) 12&nin.

Tcuraurocolatosódico2’nM mcrTawodescrdcolaiosádico2mM TC+ IDC MezclafIsiológica

Ausenciade LES ‘5 PresenciedeLPS.

Por otra parte, se ha realizado un estudio análogo con suspensiones de NPc enriquecidasen células de Xupffer y mediante la técnica de citornetría de flujo. La sonda utilizada es elDCFH (diclorofluoresceina), que en presencia de radicales superóxido se oxida y se hacefluorescente. El tratamiento con LPS (lOpg/ml) da lugar a un incremento del número decélulas que presentan elevados niveles de O; (Fig. Stnyb). La Figuro Sóa pone de manifiesto

o lO TC+TDC O TU TCi-TOC

RESULTADOS

r OC 4flT .r4U vOT-t.Ot ~<T0a-~ so’tTÑTS &51T5

D

— 1 +1

MI li~t

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14 1<1~ 1

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4.

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Z~~fr

Representacióntridinsensional del efectode la adición & LPS(iOlzg/mJ). sobre laintensidaddefluorescenciaemitidaporsuspensionesde NPcenriquecidasencélulasde

K.upffesypreincubadasconDCFH (3&nin/37N3).

<A) Controles (E) LES5 segundos

(C) Efectodel LESa lo largo deltiempo(1)) Efectodel¡SSa los 1.Z ¿Oy120 segundos

En los ejesse representaN <no de c&las), LGFL (Logadisno de la intensidad deIbsoxsceade)y FSC(Taaaado«Atar)

Count=n0de ciAdas Cha..sel.lntensidaddefiteescencia

RESULTADOS

A 4

r

S=t&1<%~

~a ..~a s.gasc H

~~ O O

-‘ -jI.

- •4-L

‘en

~Z’ 2

- .1’ ~e5 ~au

Flgwn 5& Representaciónbidinsensionaicíe! efectode la adición de LES (10/igAnl), sobre laintensidaddeflt¿orescessciaemitidapors¿spensionesde NPcenriquecidosencilulas de

Kupffe,y preincubodoscon fiCE!! (JOnsin/37’C).

(A) Con¡soles (B) LPS2 minutosEnlos ejesserepresentaEL (Int¿<nsidaddefluorescencia)frenteafsC(Tantañocelular)

Rrvrn rAflnt .119

que dicho incremento es muy rápido pues ya se aprecia a los 5 segundos de la adición delLES a las NPc <,paneles A y fi), siendo el efecto mayor a medida que aumenta el tiempo deincubación (paneles C y 1$ En la flg¡na 5db se observa claramente la existencia de despoblaciones con distinta rapacidad oxidativa intracelular (distinta intensidad de fluorescenciadebida al DCF). En el caso de los controles (panel A) la población mayoritaria emite unabaja intensidad de fluorescencia y tras 2 minutos de incubación con LES (lOpg/ml) (panelE) dicha pobJacióa pasa a emitir una mayor intensidad de fluorescencia (mayor capacidadoxidativa intracelular).

354. Peroxidación lipídica.

La comparación de los resultados obtenidos ña ,*., .l estudiar la peroxidación lipídica enel shock endotóxico reversible (Raultados¿apdo.22>, con los que se indican a continuaciónobtenidos ha ,*p, permitirá discutir si las alteraciones apreciadas son debidas o no a unefecto directo ejercido por el LES.

E análisis de los niveles de MDA en cultivos de hepatocitos tratados con distintas dosisde endotoxina y durante distintos tiempos, queda reflejado en la Figura 57.

Se observa que la gráfica relativa al LPS 50 esanáloga a la obtenida los via (Fig. 17). Sinembargo, al ir aumentando la dosis, el comportamiento sen alejando del observado lo. vh’oya que para las dosis LES 100 y LES 200, los niveles de MDA a las

4y6 horas de incubaciónson prácticamente controt siendo las características de la gráfica completamente diferentespara la dosis de LES 500.

PFsrrITA DOS 120

15%

loe

504’

o -~-—-—--—~—-<---—--.-——-‘-

0 2 4 6

O

E

fon E’~ -<

150 -r

bU

04—0 2 4 £

150 +- t

£1- -4 6

Q o

TIEMPO (hovai

o-

0 2 4 6

TIEMPO (horas>

rwn 521 EfectodedistintasdosisdeLPS( .LESS4 • LPSJ(Y4 u LES200y • LPS500) sobrelos nivelesintracelularesdeMDAen hepalocitosen nflti mo, Losporcenlajessecalculenrespecto

a los controlescorrespondientesa cadatienzpo( ),

1K

0

4:

O

4: 50

PESVILTADOS 121

3.5.5.Niveles de citoaon,o b~.

La disminución observada en los niveles de citocromo P450 en monocapas de hepatocítostratadas con lipopolisadrido parece deSuse a una aarión directa de Ja endotoñsa sobre lascélulas parenquimatosas (Paganie! aL, 1987>.

Con intención de realizar un análisis paralelo respecto a la influencia del LPS en losniveles de citocromo b,. se ha llevado a cabo la valoración de dichos niveles en tnonocapasno replicativas de Isepatodios en cultivo, ¡ras el tratamiento con distintas dosis de endotoxina.

Los resultados obtenidos con estos experimentos Li vftt, (Fig. 58), concuerdan con losobtenidos 1. sto (Rwltatlas,apdo. 234. confirmando que durante el shockendotóxico seproduce en el parénquima hepático una elevación de la concentracidn de citocromo 5,.

1y.

0 2 4 6

TIEMPO (horas)

rwiw St EfectodedstñatasdosisdeLES<. LES 101 • LES201 U LES.500)sobre los nivelesde

citocrorno b, en hepatadiosen culth Loe powta,ujesse calculan respedaa los controlesconapo.dieuaa cada— ( 3).

3.5.6. Concentraci6n de calcio cirosólico.

Durante la endotoxicosis, el LES bacteriano se une a la membrana plasmática celular,mterfinendo en los mn«asusmos de tranaducción de adala e induciendo perturbaciones deprocesos rntracelularea y me¿abdlicc. (flzguni eral, 7985; P-agani eral, ¡9*5; Ponv’Us el al,

1987~Pa~.snie! aL, 1988>.

__ 175

~ ís&f

Ql~ 1254oao loo-E-”O

‘75 - -

50

RESULTAD ¶fl

Dado que la respuesta de muchos tipos celulares frente a estímulos extracelulares implicaun aumento de la concentración de calcio citosólico libre (Rastnussen& Banw41984),se haprocedido a estudiar la influencia que ejerce la endotoxina sobre la hon,eostasis del calcioen distintos tipos celulares hepáticos (hepatocitos aislados y en culti9o primario, y

suspensiones enriqi~ecidas en células de Kupflefl.

a) Especftofluoá’nefrtz

Cuando las células parenquimatosas aisladas, preincubadas con fura-2, son sometidas aun tratamiento con LES (lOOpg/10’ Pc/0.Snsl) a 37’C, durante distintos tiempos, se observa(Fig. .59) un incremento tiempo-dependiente del contenido de calcio citosólico, alcanzandoéste valores dos veces superiores a los control, tan sólo a los ISmin de incubación con laendotoxirta.

‘7

4-

+el

A~2C0

ion

- -

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 23

TIEMPO (mm)

Figure St Efectodel LESsobrela concentraciándecalcio citosolico enhepatocitosaislados.Las células,¡ras la inco.poraciánde la rondafume.~ son incubadasa 37’C cono sin LES

<iOOi¿rJid Fc) durante distintos tiempos.Los po4rentaiessecalculan rcspectoa la (Ca’’!cilosálico delas celular control.

El tratamiento de hepatocitos en suspensión con dosis diferentes de endotoxina, durantelOmin a 37’C, produce de nuevo un incremento de la concentración de calcio citosólico, quees directamente dependiente de la dosis de LPS utilizada (Tabla 2?).

RFSIJLt4DOS 191

Tabla27: Efectode distintasdosis de LESsobre la conw,bwciónde caldo dtosó&to en hepatocitos

Las dAdas, tres <a ñtcoqx>.csdndela sondeJ¶n-¿ soninc.badasa 37’C en presenciaoausenciadeLES (100y 200us/10’Pc) mhnsteltknir..

TRATAMIENTO [CCI CITQSOUCX)(nAO

Control lfl±6

¡15103 156±8LPS200 267±8

Con el fin de conocer si el incremento producido por la endotoxina al la [Cafl citosólicoprocede de Ca~ estracelular ode la movilización de las reservas intracelulares, o de ambos,bepasocitos en cultivo primario en ¡nonocapa fueron preincubados con fura’2 y posterior-mente tratados con LES (lOO>¡g/atil~ bien en tampón con calcio o bies, en tampón sin calcioy con EGTA (0.2rnM) (3ómin/3VC). La Tabla 28 muestra los resultados obtenidos, queconcuerdan con los anteriores relativos a células aisladas, observándose de nuevo unconsiderable incremento (335%) de la fCa’ 1 cisosólico en las monocapas tratadas con LESrespecto a las control. Además, este efecto se observa tanto en presencia como en ausenciade calcio extracelular, siendo en este último caso inferior el aumento observado de los nivejesde calcio citostilico (212%).

Tabla 2k EfectodelLIS sobrela n,o,tliraciíln decalcio inncebdsenhepatocitosal cnliho.

Lestnonocapa.~buslahrcoqonscióndelo smdafin-~ sonkíatbeda,e nro. ¡maído oausenciadeLES<l00!±g/10’Pc)duranteSOnin:en ,nedio concaldo o sin calcio y con EGTA

(0. 2nsM).

MEDIO TRATAMIENTOIC”J CITOSOLICO

(nM) (%)

Ceocalcio

ControltJ’S101

143±2479±6

103±1335±4

Sincaldo

ControlUPSltlI

147 a 3311 a 3

103 ±2212 ±2

R.FSLrABOU 124

b) CkomeMadeflujo.

I.os resultados obtenidos en el apanado anterior han sido ratificados mediante la técnicade citometría de flujo utilizando la senda Indo-1. En las Figuras 60 y 61 se representa, en elpanel A, la intensidad de fluorescencia emitida por los hepatocitos a 422nm (indo unido acalcio) frente a la emitida a 4BSnm (lado libre de calcio). El panel 13 corresponde a larepresentación del número de células N frente a la intensidad de fluorescencia emitida a422nn, (indo unido a calcio). En esta representación se observan tres poblaciones celularescon disairno contenido en calcio citosólico. Dichas poblaciones se han identificado comonegaliva (j, positiva (+) y m¿q’ posEsiva (+ +) en orden creciente de intensidad defluorescencia a x,,~

422nm. En porcentajes está indicada la cantidad de células de cadapoblación.

El tratamiento con LPS (lOOpg/ml) (Fig. 61) produce un incremento en el porcentaje dela población + + (21% -‘ 32%), indicando un aumento en la concentración de calciocitosólico. Por otra parte, el incremento observado en la población (16% -. 25%)corresponde a una pérdida de la senda intracelular consecuencia de la alteración que el LPSproduce en la membrana plasmática.

En el caso de las células de Kupffer, se ha llevado a cabo un estudio paralelo. Lassuspensiones de NPc enriquecidas en osacrófagos y obtenidas por tripsinización de cultivos(48h), han sido incubadas (l5rnin/3TC) con distintas dosis de LPS (10 y lOOpg/ml). Isisresultados no muestran diferencias siyñtlcativas entre os controles y los tratados con ¡25.

Sin embargo, se ha observado que la adición de endotoxina a la suspensión de célulasproduce un aumento instantáneo de los niveles de calcio citosélico, que vuelven inmediata-mente a los valores control.

»nfl’r.jnn.t

len, , l~ap.. •

23su 50 51?

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1~te

FL(4BBnm)

a

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L

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B

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F’.gmm 6& (A) ¡niensidaddefluorescenciaemitidaa X422nm(¡rudo inidoa calcio)frentealaintensidaddefluorescenciaemitida a =4RSnm(indolibre), por hepatocitoso. suspensión.

(B) NCmnode hepatoeltos(1V)frentea la intensidadde.ljuaescencieemitida. A- 422aun.

Los pareenrajes indican lo cantidadseladvade célulasdecadapoblación t’.. + y + +),

so.FL(422nm)

FL(422nm)

flA

1s~LGFL<422 nn.)

53 —

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LGFL (488 n.a,)

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rl ~ ra.r N.,a5%t

LGFL<422nm)

flpm 6k <A) intensidaddeflhto.’rseendaemitidaa A-427,rn<ledounidae cabo)fin a le intasadad

dejlao’eseenciaemitidaa A - 48&vn (indohlmn~ porheFatocitosen suspensiónretadosconLIS(lOOpg/bnl) (3&nin/WC).

(A) Númerode>.epatadtos<N) fine e le b.tmsidaddejbscevscesdaemItidae A- 422am.Lospantatejabatiesele cantidadrelativa de células decedepoblación <~ + y +

e

1’--4,

<4.

25% 1 42% 1 32%

— 1+1 ++

RPÑ¡ffTADOS 127

35.7 pH intracelular.

La dishon,eostasis celular inducida por la endotoxin, puede alterar el ph, parámetro denotable interés en la regulación de procesos metabóla~. por lo que se ha procedido a su

estudio en hepatócitos ea cultivo incubados o no con LES.El pH, se ha medido utilizando la sonda fluorescente BCECF, requiriendo el procedi-

miento fluorimnétrico de un calibrado intracelular realizado con soluciones tamponadas adistintos pl-ls y que contienen nigericina (12.5»M) (Materiales y Métodos,~,do. 15). Losvalores obtenidos para la relacide R’=F,,

5/F~ durante el proceso de calibrado, tanto enmonocapas control como en las tratadas con LPS, se indican en la Fisura 62.

7oci

ci

II 4

3

2

65 66 7.1 7.4 7.7

pH

ra,. 6=Calibradointracebilarde la relación R= FM,>/F enInonocapasde hepatocítosmarcadascon

la sondeflz~orocateBCECFytratadas(e ) ono(o) con LES.

Se puede apreciar que en el intervalo de pH comprendido entre6.áy 75, existe linearidad

entre R y el pH,.La laterpolación de los valores de Robtenidos con las monocapas de hepatocitos control

y tratados con LPS en la recta de calibrado correspondiente, pennite determinar en cada casoel pH intracelular (TabLa29). La endotoxina produce una disminución muy significativa delpH, de los hepatocitos, disminución que además es tiempo-dependiente.

(162

RESULTÁflOS

a E>ao delLISsobredpi!, dehep.tocítosa. cukh

Lar mawqa busseñ.c,tbadasenpacida o ausenciadeIJS (lUAig/ml) a 3?CduranteJOy 45,nh., sasmacadascon la sondéflua’ncmte BCECF pee le pestañarmedida

~luonmifries delpu,

1RATAMIENTO pl~

Coenrol 7.46 ±0.01¿PS(lauta) 1.14 t 0.04

lis (4Ssis) la t CfI

3.6. INTERACCION CELULAS NO PARENQUIMATOSAS -. CELULASPARENQUIMATOSA&

La acción de la asdotomna soire el parénquima hepático puede estar modulada por losmediadores producidos por las células de Kupffer. Para comprobarlo se han inosbado loscultiyo. de células no parenquimatosas hepáticas enriquecido. en marnifagos de Kupffet enpresencia o ausencia de ¡25 (l00pg/nsl) durante distintos tiempos. Lo. sobrenadantesobtenidos son utilizado. para el tratamiento posterior de Peas cultivo. EJ parámetro elegidopara la estimación de la lesión celular en los hepatocitos es la actividad de la GOT.caracteeSsia del parénquima hepático. Además, la actividad estracelular de esta enzima nose ve alterada significadvarnente por la acción directa del LPS sobre los hepatocitos (Papalea aL. 1987> por lo que cualquier modificación en este sentido, será debida a la presencia demediadores secretados por los maerófagos.

Ea la Tabla 30 se pone de manifiesto que las Pc tratadas con sobrenadantes de NPc,presentan mayor actividad extracelular de OOT sobre todo en el caso de que los sobrenadan-tes procedan de macrófagos incubados con LPS.

RESL~TADOS 1

TablaSt EfectoindkecsodelLASsobrela actMdadonceAd.de GO?en hepatodtos— otitis.El sob,csadantedeodtivosensitpteddosennhaotifflor de Kupffe’~ prelno¿beda,a. p.wnoa

o ,vsso.dade LIS <¡WUg/mI) (2h/flfl es atibado Coe~ ‘itetsS de asasbactánconhepatockosa. odtivo(4h/3?C).rmalnientesesobrale actisidadaimcehdsdeCGT— esos

aáivcede&

GOT (U/l)

Pretrat.n,ientodelas NPcTrSamserto&lsPc

O2NTROL t.is la?

Medio 34.77*0.65 39.82±3.42

SotsecaadaoieNPc(2h) 66.92* OS 8148±3.43

A medida que aumenta el tiempo de preincubación de las NPc con la endotoxias,disminuye el efecto inductor que esos sobitenadanaes ejercen sobre la actividad extracelularde 001 en los cultivos de hepatocitos (TablaSi).

TeMaSt Efectoi~6rcto itt LISsobrela ac#~idadesiscehilardeGOTa.Aqatocúos— otitisaEl sob’w,adantedeadásosenaLqueddosa. macMfa¡osde Lq<~r, prino¿bedora. presencia

o ausenciadeLES (la?jig/nd) tirante ,tántastiempo.(2h ely Mt) a WC esatibadocantametilo de ñnbacidn cat hepatodbosos o¿kñs~ (64/WC>. Fanabna,lese vaIna laacd.jdad~aceh¿Lsrde GO]’ a. esoscultivosde Pc.

607 (U/l)

Tratamieto delas PcPretrata,nica,to de las NPc

CtrzrRoL ¿SS la?

Sobrenadante NPc (21.)Sobrenadante NPc (4h)Sofrenadante NPc (61.)

63.72 ±liS 86.93 ±6.6373.78 s 1.72 8257 ±3.737107 ±0D= 7857 ±632

Por otra parte, si tras dar un pulso a las NPc (2h/3~C) con 155 (IOOng/ml), este mediose sustituye por medio carente de endot~ñm (4811/3?C)4 los sobrenadantes obtenidos (notienen ¡SS) no muestran efecto sobre la liberación de (507 por hepatocitos en cultivo (4067

1.20 Ufl).

nf! ti riflnc ¶30

Se ha comprobado que el medio de cultivo de las NFc (2/3 DMEM + 1/3 RPM!) noafecta al metabolismo de los hepatocitos, normalmente incubados con William’s; como queda

demostrado con los resultados de incorporacitin de [“q-2.desoxigjucosapor Pc incubadoscon distintos medios de cultivo (TabLa32).

TabEs3=!ncoeporaciónde(“CJ,24eso~cig¿ucosaporhepatocitosincubadoscondistintosmediosdecultivo.

Medio

INCORPORACION DE I’CF2-DESOXKLUCOSA (amolca/tO’ Pc)

ra~ Concentración de 2-desosiglucasa

O.25nsM 0.5OmM tcomM

William’aE

21.

4h

1719 *1.31 25h4 t 2.03 5114 t 2.46

23.40 153 28.16±4.a? 53.66±9.33

2/3DMEM+I/3RPMI

21.4h

18.20±2A3 29.26±0.83 44.66±2.16fl.30±133 36.60±3.90 64.83±9.66

131

IV. DISCUSION.

Desde que Morrison yulevitch en 1928 realizaron un profundo estudio del efecto de lastoxinas bacterianas sobre el organismo, concluyendo que las endotoxinas producen graves

alteraciones en los sistemas dc coagulación y complemento y que actúan sobre distintosblancos celulares, se han usado endotoxinas bacterianas aisladas para intentar esclarecer laflsiopa¡o>ogia del shock.Concretamente se ha desarrollado una amplia labor de investigaciónbasada fundamentalmente en estudios de modelos experimentales de shock.

En la actualidad, las dos áreas de investigación de mayor interés incluyen el estudio delas interacciones entre los distintos órganos y tejidos afectados (tnod.e¡OS ha vivo) y la identi-ficación de los procesos moleculares primarios implicados en la acción directa de lasendotorinas sobre células y sistemasde membrana celulares (modelosk. sim,>.

De acuerdo con esto, los modelos experimentales de estudio utilizados en el presentetrabajo han sido dos: modelo hastio, mediante la inducción de un estado de shockendotóxicoreversible y modelo ha sino, que implica la utilización de distintos tipos celulares hepáticos.

1. ACCIONDEL ¡28 IN 11W.MODELO DE SHOCKENDOTOXICOREVERSIBLE

Se ha inducido en ratas un estado de slsock etdotdxlco reversible mediante la inyección

intravenosa de una dosis subletal de LPS, que produce un estado de shockagt¿do entre las4 y 6 horas, con todos los síntomas clínicos del shock (pioerección. sed, aumento de latemperatura corporal y pérdida de peso), síntomas que desaparecen cuando el animal entraen la fasedeMaq.’emción (24-72>4.

U reversibIlidad del proceso permite un estudio preciso de los daños producidos por ellipopolisacárido (12$), sin que se solapen alteraciones ocasionadas por el fracaso general delorganismo, fracaso que tiene lugar en las situaciones de shockineversible,

De este modo, el seguimiento de las alteraciones macroscópicas y microscópicas de losdistintos órganosy de las al:eraciona, paralelas de algunosparámetrosbioquímicos (nivelesséricos de glucosa, albúmina y glutaniato oxalacetato transarninasa) (Fig. 16>, puedeconsiderarse un indice de la afectación y recuperación de los animales tratados, con-fhn,Andose la validez de este modelo experimental (Boschet aL, 1988).

Su uUlización ha permitido el estudio de distintos parámetros (actividad de la superóxidodismutasa, peroxidación lipídica y niveles de citocromo b,) que puedenser decisivosen laafectación hepática durante las sucesivas fases del shock (agnda y de recuperación);aportándose nuevos datos para el esclarecimiento de las primeras etapas de la endotox.cosas.

fllSflsttflN 132

1.1. StWEROXTDO DISMUTASA (SOD)

Los radicales derivados del oxígeno, generados principalmente por células fagocítias trasuna activación inducida por distintos esdmulos, pueden ser a su vez los inductores de lesiones

tisulares durante la sepsis o shockendotóxico <Fantone& Warr4 1982, FZOh¿& G¡enz 1987).La activación de las células tagocíticas aumenta su consumo de oxigeno, activa el shunthexosa monofosfato e induce la actividad NAD(P)H oxidasa (A2ebanoff 1980). Comoresultado se prodvcen y liberan el anión superóxádo (O;). el sinsiete de oxígeno (‘O,). elradical hidroxilo (OH) y el peróxido de hidrógeno (l4~O~). La liberación deO,; OH y H

20,por tnac-ófagos y neufrófilos polimorfonucleares, está asociada con mecanismos asti-microbianos (flebanoff 1980) pero estos metabolitos pueden convenirse, si aumentan susniveles, en tóxico, para s~idoa como pulmón. rifióo, intestino e higado (Pantone& Wa,d,1982,-Maunda eraL, 1988>.

El modelo de shockendotáxico reversible permite obae*var (Tabla8) un comportamientobifásico que implios la disminución de la actividad de la 5Gb en un 50% (que puede corre-lacionarse con una elevación de los niveles de O,) durante 1. fase aguda del shoclq paraluego no sólo revertir el efecto, sino aumentar por encima de los controles dicha actividadde SOD (fase de recuperación, 24h). De hecho, durante el estado inicial de una infección, losmacrófagos están hiperactivados <Dlscusi@ apdo. 24.1.) y liberan elevados niveles deradicales libres de oxigeno, que no sólo poseeir-un-efectobactericidnhio qu&úmtiMiafectan a tejidos adyacentes <Weftsger,1986). Debido a ello, tras la inicial inmunopoten-ciación, tiene lugar una inmunosupresión (¡‘tarad etaL, 1990).

Existe, por tanto, una clara concordancia entre estos resaltados y la reduaión de la

necrosis hepática y la mortalidad de ratas en estado de shock endotcir¡co In-eversible,demostrada tras el tratamiento con Sol) y catalasa (ArePtarelaL, 1985;Kunfniotoelal, 1987~

Schne¡der& Manhiesen,1990).

Las causas de este efecto observado ha ,éo pueden ser:

- Una acción directa del LPS sobre las células hepáticas. Los principales blancoscelulares del LPS en el hígado son los macrófagos de lCupffer, que captan laendotoxina mediante pinocitosis adsortiva (Mathleson&L/Ievitch,1979;Foxeíal,1987)

o vía un receptor específico (VonSossuye& Wisse 1988).También se ha demostradoque el LPS se une a los hepatocitos <Pagan1el aL, 1981; PraaningVan-Daten el al,

1981; Pagani et al. 1988) por lo que igualmente podría tener lugar un efecto citotóxicodirecto de la endotoxina sobre las células parenquimatosas hepáticas. Esto no estaríade acuerdo con lo concluido en estudios ha uño por Bautista elal (1990> acerca deuna intervención exclusiva de las células de Kupffer y PMNinfiltrados, en lo que aliberación de 0; se refiere, como respuesta a la inyección de LPS. Sin embargo, los

hepatocitos sí intervienen en este aspecto (Décuskin,apdo. 2=2).

DISCUSION lii

Una acción indirecta que implique la actuación de citoquinas (¡Li, TNF) (V¡sner

el aL, 1990) o la liberación por los hepatocitos de una proteína de fase agudaidentificada como proteína capaz de unir el LPS (LBP) <Tobias etaL, 1986) y que

aumenta la unión de la endotoxina a los macrófagos ha .*~ (Wanenel aL, 1988;

Wñg#ssel aL, 1989>.

Con el fin de distinguir entre ambas causas, se han llevado a cabo estudios ha vino quehan demostrado la existencia de un efecto directo del LPS sobre los distintos tipos celulareshepáticos (Discusión,q,do. 25.2).

1.2. PEROXIDACION unríc.A,

Un incremento en la formación de radicales libres da lugar a alteraciones en elmetabolismo y en la funcionalidad celular como consecuencia de su acción a tres nivelestúndamencales (Sbces ¡984; InaueneraL, 1980):

- Reacción con proteínas que contienen grupos -Sil dando lugar a entreo-uzaznientosproteína-lípido <Stebsb,echg1987).- Modificaciones de ácidos nucléicos (Mooíty& Hasran, 1982) o ruptura de la hebradeDNA (Brown & hídovjch, 1981).

- Peroxidación lipidies (Co.npont 1985), que compromete la integridad de las

membranas (Sa’anio.n& Rin 1985) y daba también orgánulos suboeltilares (Petenesal, 1985).

El análisis de la peroxidación lipidies en el estudio de los efectos celulares del ¡SS. esesencial debido a la importancia de los sistemas de membrana en el correcto metabolismocelular. Se ha sugerido (Watanabe¿sal, 1990)que existen dos posibles factores mediante loscuales los radicales libres alteran la estructura de los fosfolípidos de la membrana celular: laconcentración intracelular de calcio y la peroxidación lipidica. Ambos factores actúanindependiente pero sinérgicamente (Bon te aL, 1990).El primero se analiza en este trabajo(Discusión,apdo.25.5.>. demostrándose un incremento de la ICaL como consecuencia deltratamiento directo de hepatocitos con LPS, El segundo, se ha estudiado tanto en el modele,de shockendotóxio, reversible ka vivo (Resultados,q,do. 22) como en el modelo o, ,‘iOo

(Resultados,apdo. 3.5.3.).

Los resultados ka.~, indican un comportamiento bifásico consistente en un incrementesde la peroxidación lipidies en la fase aguda del shocky una disminución por debajo de losniveles control en la fase de recuperación <Tabla 23). Ello concuerda con el comportamientotambién bifásico de la actividad de la SOn durante el shock(Tabla 8>, produciéndose unaumento del 38% en dicha actividad a las 24 horas de la inyección del ¡SS y una disminucióntambién dcl 38* en los niveles de MDA durante esta fase de recuperación del rhode.Todoinduce a postular una relación causa-efecto entre radicales libres y peroxidación.

PNCTSInM 134

LS. NIVElES DE CITOCROMO b,

Existen evidencias que asocian un aumento de la peroxidaciónlipidica hepática havivo conanormalidades en el sistema vacuolar ciíoplasmátia, concretamente con una reducciónselectiva de los citocromos P454 y b, (BaconeraL, 1986).Dicha reducción ha sido observadaen el caso del P450, como consecuencia del tratamiento con 125 ha viws e ha vino <Paganleral, 1981; Bosch¿e aL, 1988). En relación con el citocromo b, y dada la gran importanciade su papel en el sistema de oxidasa, de función mixta microsomal y de desaturación deácidos grasos, se procedió a analizar si sus niveles experimentaban alguna alteración duranteel ¡bock endotóxico <Resultados,apdo.23.), observándose (Fig. 18) un incremento de bastaun 35% respecto a los controles, en coincidencia con la fase aguda del shock(4-óh).

Por el contrario, los niveles de citocromo P450 exluben una disminución progresiva quese mantiene incluso a las 72 horas de la inducción del shock<Bosch el aL, 1988). En estesentido, eL 123 actÚa probablemente impidiendo la unión de la proteína al grupo hemo odegradando dicho pupo hemo <Williotns, 1985; Pagani et al.. 1987). Los radicales libresproducidos por el ¡SS <DiscusiMt, opdos. ¡.1 y 25.2) podrían estar alterando la estructura

de la proteína (Steinb,echer,1987).

La correlación positiva del cociente cisocromo b,/citocromo P450 (Fig. 19), sugiere queel citocromo b, puede participar directamente en el proceso endotéxico. Esta hipótesisconcuerda «>0 el hecho de que el cisocromo b, aumente la oxidación dependiente de 1>450.de hepatotoxinas <De Mamo & Mccoy, ¡985) ya que es capaz de transferir electronesdirectamente al P450 (Stahvook, 1984) y potenciar las reacciones de rnonooxigenación<Ingelnsan,Sunelbery& Johanrson,1984- Janssonel aL, 1985; Ponenel aL, 1986). Ello se ha

observado no sólo en sistemas reconstituidos fis vino sino también en microsomas intactos<Nos/tiro el al, 1981)y en células (Aoyamael aL, 1990). De este modo, durante la oxidaciónNADPH-dependiente de determinados sustratos, ms niveles de citocromo P450 permaneceninalterados mientras que los de b, aumentan considerablemente <De Marco & McCoy, 1985).

El hecho de que el citocromo 1>, pueda recibir electrones tanto del NADH como delNADPH a través de las respectivas reductasas, dependiendo de la situación celular, sugiereque en la endotoxicosis dicho citocromo está suplementando al P450 de alguna manera,explicándose asl quia concentración de éste último no v,,elvaa sus valores normales durantela fase de recuperación del ¡bock reversible inducido expertmentalniente.

Otros estudios han indicado que la administración de endotoxina fis vivo, va acompafiadade una disminución en el contenido hepático microsomal de citocromo b, (Morgan, 1989).

Sin embargo dicha disminución no es estadísticamertse significativa y se refiere a tiempos

superiores a las 6 horas tras la inyección del LPS.Puesto que la respuesta ha áo implica factores estrahepáticos que pueden modificar los

nivelesde citocromo b,, se han utilizado monocapas de hepatocitos en cultivo para comprobarla acción directa del LPS en las alteraciones de este citocronio (Discusión,apdo. 25.5.).

n,rn,r,naj

2. ACCION DEL ¡SS 17< ~77Ra LYrILIZACION DE DISTINTOS TIPOS CELUlARESHEPÁTICOS.

Ins estudios in siso, que proporcionan una aproximación importante en el conocimientode las alteraciones fisiopatológicas de los estados de shock, no permiten distinguir. dada lacomplejidad del proceso, entre las causas primarias de la acción de las endotoxinas y lassecundarias producidas por la liberación de mediadores y/o estados de hipoxia.

En los últimos 30 años las investigaciones sobre el a/toe/e endotóxico han prestado especialatención a las alteraciones celulares <lVdhianison el aL, 1970; Alguna¿tal, 198.3) ya que es elgrado de lesión celular el que determina la irreversibilidad del ¡bock<Sayee41983).

El estudio a nivel celular y subcelular requiere la puesta a punto de modelos experimen-tales ka atoo que incluyen el aislamiento de poblaciones celulares puras y el cultivo primarioo a largo plazo de dichas células. Esta aproximación experimental permite simplificar elsistema y es la que se ha utilizado mayoritariamente en el presente trabajo.

El aislamiento y caracterización morfológico-funcional de las células del parénquimahepático o hepatocitos (Pc> se ha realizado en estudios previos, que demostraron la existenciade una correcta correlación entre ambosaspectos celulares (Paganiel cl, ¡988>.

La obtención de células no parenquimatosas hepáticas libres de Pc es difícil, dada lainferioridad numérica de las primeras en el hfgado. Por otra parte, la utilización de uno uotro método de aislamiento es decisiva si el objetivo final es el enriquecimiento de esa

preparación en células de Kupffer, mediante su cultivo y la adherencia diferencial al sustrato.E empleo de colagenasa durante el aislamiento celular, no ha permitido una purificación

apreciable de los macrófagos hepáticos <Tabla 7). Sin embargo, la combinación colagenasa/¡prona» introduce una marcada diferencia entre la capacidad de adhesión de ¡Cc y Ecpudiendo obtenerse cultivos enriquecidos en células de ¡Cupifer <FIRL 20, 2L 22, fly 24).

En la Tabla 33 se muestra el rendimiento celular obtenido por distintos procedimientosexperimentales de aislamiento de NPc y purificación de macrófagos hepáticos. El métododesarrollado en este trabajo permite obtener rendimientos más elevados (6.SxlO’ lCc/higado)que los alcanzados por otros autores sin la técnica de ellarÚrlón como paso final de lapurificación.

La caracterización morfológica de las células obtenidas, se ha llevado a cabo mediantemicroscopia óptica y electrónica, mostrando las características típicas de los macrófagos <Fig.21), así corno preservación en el cultivo de la ultraestnsctura celular intacta (Flg. 23). Dehecho, las células recién sembradas presentan un elevado número de vacuolas (Fig 22.4),signo característico de cÉlulas aczivadas, quizás como consecuencia del proceso deaislamiento. Este efecto revierte a las 48h de cultivo.

La correcta funcionalidad de los cultivos enriquecidos en células de Kupffer, se pone demanifiesto mediante las pruebas de tinción para peroxidasa (Figs.

20y23), característica demacrófagos <roseex aL, 1974; BZsse,197?>.

O(t(l hflt4 136

Tabla 3* Rendimientocc/sirobtenido p~’ distintosnt/todosdc aistwnientodc NPcypw,ficacalndc cc/iSa, de

Iúqsffer epm7de /dgodo dcma

AISLAMIENTO PURIEICACION KcclO’/g higado

Colagenusa’ Cenuifsgadóndiferencial a laja velocidad 41)Gradientepernil + Adherenciadiferencial LSGradientemnnnmsda, Adberennadiferencial 6.5Gradientereconnalda+ Elurrisobn 80

Pronas. Gradientepercoil . Adherenciadiferencial 80Gradientemaaizaznida, Blutrisdén 80

Prontas Mt Gradientepernil . Etetristión 65

Cotaeenasa.pronastGradienterecodeoz+ Elutriaoón 7,0

El rendimientode adhnióaal estratoes(Va,, Bossrqsej aL, 1988):(a) 3.5z10’Kc/g hígado(Ó) 29a106 Kc/g hígado(c) 4,9s10 Kc/g hígado

Número oral de Kc pcr grazno dehígado 17.0

Referencia

Ooolirste & Richter (1981>Smedartd y Penoft (1985>

Sacifan e, aL <1986)

Xnnok e, aL (1986)

Munshe.Kaas eraL (1975)¡bock cal. (1977)

Praaning.Van Daten (1982)

Van Boasuyt e’ aL (1988)

Knook eraL (1977)

Bouwena nr aL <1986)

La obtención de distintos tipos celulares hepáticos y su utilización tanto en suspensióncenso en cultivo, ha permitido analizar los siguientes aspectos en relación con la acción delLPS lo asín:

Morfología de NPc.- Localización ultraesíructural e incorporación de la endotoxina en NPc- Propiedades fisicas de la membrana plasmática.- Funcionalidad de la membrana plasmática.- Parámetros bioquímicos intracelulares.- Interacción NPc Pc.

2.1. ALTERACIONES MORFOLOGICAS.

Estudios previos han demostrado mediante técnicas de microscopia óptica y electrónicaque el tratamiento con LPS de las monocapas no replicativas de hepatocitos induce retraccióncitoplasmática <Pagani e! aL, 1988). Un efecto análogo ha sido observado por Franceschi exaL (1989) en cÉlulas dcl endotelio de la aorta como consecuencia de elevados nivelesintracelulares de calcio. Este hecho parece estar relacionado también con la existencia de

niveles anormalmente altos de radicales libres de oxígeno en dichas células, revirtiendo las

DISCIJSION 137

alteraciones morfológica, tras el tratamiento con SOD y catalasa. Por ello, sepodría pensarque el LPS afIera la morfología de los cultivos de hepatocitos como consecuencia de unarápida elevación de la concentración de calcio cilosólico (.Dfraaá@ apda 25.6)y/o un

incremento de los niveles de radicales libres de oxígeno <Discusión,~do. 25.3.).En relación con las células no parenquimatosa.. el tratamiento directo con LPS disminuye

la adhesión al sustrato, incrementa la vacuolización, produce alteración de mitocondrias,dilatación de la membrana nuclear y aparición de numerosos autofagosomas (FYgs. 20, 21 y

24>.Las vacuolas pueden estar relacionadas con la fagocitosis de la endotoxina postilada en

estas células (Moshieson& lJlevfrc4 1979; Fox e! aL, 1987> y coincidente con lo observadomediante la técnica inmunocitoqulmica del oro coloidal (Discusión,apdo. 224.

Los autofagosomas, se relacionarían con las alteraciones mitocondriales observadas trasel rra¿aznien¡ocon la endoto~ina, yaque aparecen a menudo figuras de mielina característicasde restos de membranas mitocondriales dañadas.

2.2. [NCoRPORAaoN Y LOCALIZACION INTRACELUlAR DEL [SS.

lEn los hepatocitos, estudios de unión y desplazamiento con I”CI-LPS, revelan que launión a la membrana celular no parece responder a la existencia de receptores funcionalesespecíficos sino a interaceinnes fisico.quhnicas concomponentes paniculares de la membrana(Fagenl e! aL, 1981; Froo.ning Van.Dafrn e! aL, 1981; Faganiet aL. 1988).

Los ensayos de unión del [‘t]-LPS realizados en las células no parenquimatosasenriquecidas en células de Kupffer, ponen de manifiesto una incorporación de la endotoxinadependiente de la dosis (Tañkz9>. En los macrófagos hepáticos, parece darse un mecanismode pinocitosis adsoniva (Mashleson& L

tlesltck 1979 Fox el al, 1987) para la incorporación

del LPS. No obstante, algunos autores sugieren la existencia de receptores específicos deunión (Van Rosxuyr & Ii7sse, /988) aunque todavía no se ha aislado el posible receptor.

Con el fin dc conocer la localización subc.elular dc la endotoxina en las céIuls noparenquimatosas de forma paralela a lo ya realizado en Pc (Mwúc&, eral, 1990; Diaz-Lavíadael aL, 1991), se han llevado a cabo estudios inmsínomarcaje con oro coloidal Los resultados

(Figs. 25y 2ó) indican una incorporación de la endotoxina que ya se aprecia a los l5ruin deratamiento y que está asociada a menudo a vacuolas. Sin embargo, en hepatocitos, a estos

tiempos tIc incubación el LPS permanece fundamentalmente asociado a microvellosidades dela membrana plasmáncús, requiriendo su internación tiempos de incubación más largos.

Esto apoya la hipótesis de una fagocitosis del LPS por las cÉlulas de Xupffer, rnecanisn,odiferente al postulado para Pc. A los dos tiempos ensayados el LPS alcanza la membranamitocondrial, que se encuentra desorganizada, Wduciéndose procesos de autofagocitosis tal

como se apreciaba en los estudios morfológicos (Discusión, apdo. 2.1.>.

O!VnhthjM 138

23. PROPIEDADES FISICAS DE ¡A MEMflRANA PLASMATICA.

Los mecanismos primarios delshockendotóxico todavía no se conocen pero es indudableque la interacción del LES con la superficie celular constituye la etapa inicial en el desarrollode su acción.

Los parámetros elegidos para caracterizar las alteraciones que puede producir lo Wanlaendotoxina sobre las propiedades fisicas de la membrana plasmática, son:

1) Liberación de LDH: la salida de esta enzima al n,edio está directamente relacionadacon Lesión de La membrana celular siendo un marcador de estados de citotoxicidad<PontoMr ¿tal, 198% Moni a al, 1990/ Ohioa al, 1990).

2) Retención de fluorescefna en el interior celular: la utilización de los llamados sustratostluorogénicos como el FDA, tiene un gran interés en estudios de viabilidad celular puesla retención del fluoróforo depende de la integridad de la membrana plasmática (Rorrnan& Popennastev1966>.3) Microviscosidad de la membrana plasmática: su análisis suminisara información sobrela estructura y dinámica de la matriz lipídica de la membrana, parámetros ambosindispensablespara la comprensión de cualquierfenómeno relacionado con lasmembranasbiológicas <Shininky& Bonnholz1978).

2.3.1. Liberación de LDH.

La interacción directa de la endotosina con bepatocitos en cultivo produce un incremento,tiempo- y dosis-dependiente, en la actividad estracelular de LDH (FYgs 27), indicando unaalteración de la membrana plasmática.

Por otra parte, cabe destacar la importancla que puede tener la LDH en estados deendotoxicosis ya que esta enzima está implicada en la transformación reversible de pirituatoa lactato. Dado que la acción del LES induce lactoacidosis lo ¡‘twa (Nishijimae! al, 1973)y

que, en estudios previos con hepatocitos en suspensión se ha observado una disminución dela gluconeogénesis tras el tratamiento con endotoxina (Pagan!~t aL, 1985),puede pensarseen una alteración del metabolismo de hidratos de carbono en los hepatocitosque produzcaun acúmulo anormal de piruvato. Este sería transformado posteriormente a lactato por laLDH y ello determinaría una disminución del pH, concordante con lo observado por otrosautores lo ¡‘ño <Nishijinza a aL, 1971~ Schu,r,e, 1983). La posible disminución del pH, Isasido efectivamente puesta dc manifiesto en el presente estudio con hepatocitos en cultivo,mediante técnicas fluorinsétricas (Discusión,~do, 257.)y prueba la existencia de un efectodirecto de la endotoxina a este niveL

n,cr,,c,n,Q ~I39

2.3.2. Retención intracelular de fluoresceína.

En los estudios deviabilidad celular realizados con FDA sobre bepatocitos, se observa queel tratamiento con endotoxina (100 y 200»g/nsl) <TabLa 10) produce un ligero aumento delnúmero de células fluorescentes aunque éstas presentan una intensidad de fluorescenciaconsiderablemente menor que las células control (Fig. 28). Una posible explicación de esteaumento en el número de células con fluorescencia sería considerar que la unión LPS-mem-brana plasmática crea dominios hidrofdbiccs en la membrana que facilitan la entrada delFDA. Esto esté de acuerdo con la interacción del tipo l~xido-llpido (lípido A-lípidos de labicapa), que permite la unión de la endotoxina a liposomas artiftciales y a membranasbiológicas (Rietschela aL, 1985).Por otra parte, también podría relacionarse con la unióninespeciflca del LES a la membrana plasmática de hepnrocitos <Paga.nie/aL, 1935), que bariaposible la existencia de estos dominios en cualquier zona de la membrana.

El aumento numérico de la viabilidad celular sería por tanto una consecuencia de lainternación incrementada de la sonda. De hecho, cuando se utilizan dosis elevadas deendoroxina<ln,g/ml) (Zg. PV), se produce una disminución considerable de la viabilidad, locual indica una alteración irreversible de la membrana plasmática que hace imposible laretención de fluoresceína el~ el interior de la célula. En este caso prevalece la alteraciónproducida en la integridad de la membrana sobre la entrada facilitada de FrA, efectos ambos

ejercidos por el LES.La disminución de la intensidad de fluorescencia emitida por los liepatocitos tratados con

LES y observada mediante microscopia óptica (Fig. 28) se confirma mediante citometria deflujo (flg. 3/4. Esas disminución es tantomáselevada cuanto mayor es la dosis deendotoxinacon que se incuba la suspensión de células (100, 200 y 500,~g/tnl) y puede ser debidafundamentalmente a dos causas:

Una disminución de la concentración de fluoresceína presente en las células; lo cualimplicaría que los heparocitos tratados con endotoxina tienen una mayor dificultad pararetener en su interior la fluoresceína. Esta sustancia polar no posee ningún transportadorde membrana conocido, por lo que sólo un daño a nivel de membrana facilitaría la salidade dielto fluorófo,-o al medio,

Una disminución de la intensidad de fluorescencia emitida por una misma concentra-ción de fluoresceína presente en el interior de los hepatocitos. En este sentido se hademostrado que el pH ejerce una notaNe influencia disminuyendo la intensidad defluorescencia a medida que se acidilica el medio (Ronnan & Papennane~1966). Deacuerdo con ésto, el LES estaría disminuyendo el ph de los hepatocitos.

La técnica espectrofluorimésrica, utilizando hepatocitos en cultivo, permite evaluar lafluorescencia procedente de la fluoresceína intracelular y la debida a la fluoresceína liberadaal medio. Sirve por tanto para determinar si el descenso de la intensidad de fluorescencia en

DESCUSION ‘df)

el interior de los hepatocisos (Figs 28 y 30), es o no debido a una salida facilitada delfluoróforo como consecuencia de lesiones en la membrana plasmática ocasionadasdirectamente por el LES.

Los resultados representados en la Figura 32 ponen de manifiesto que las muestraspreincubadas con la endotoxina emiten menor intensidad de fluorescencia que las control. Secomprueba por tanto, utilizando el modelo de cultivo primario de hepatocitos, lo yaobservado con células en suspensión mediante las técnicas de microscopia y citometría deflujo. De nuevo la disminución de la intensidad de fluorescencia es directamente dependientede la dosis de LES empleada y además existe una dependencia respecto al tiempo.

Con relación a la liberación de fluoresceína al medio extracelular, se demuestra que es

idéntica en los hepatocitos control y en los incubados con LES, manteniéndose ademásconstante a lo largo del tiempo (40% del máximo de intensidad de fluorescencia presenteen el interior de las células) (Fig. 33). En consecuencia, la disminución de fluorescenciaintracelular en los hepatocitos tratados, no se debe a un astmento de la salida del fluoróforosino a la influencia del pH sobre la intensidad de fluorescencia emitida por la fluoresceína.Los estudios del pH intracelular llevados a cabo en hepatocitos en cultivo mediante técnicasespectroflttoriniétricas, han puesto de manifiesto efectivamente una disminución en el pH,.como consecuencia del tratamiento directo con endotoxina (Discusión,t~,do. 256).

Los resultados obtenidos sugieren, por tanto, quela interacción del LES con la membranade los hepatocitos favorece la entrada de la molécula apolar FIJA en la célula, posiblementeaumentando la hidrofobicidad de la zona externa de la membrana y creando dominioslipofflicos que facilitan inespecíficamente la incorporación de la sonda (Pagvznia al, 1985~Riersche¡ e al, 1935). Esta interacción perturba la integridad de la membrana plasmática(Discusión, apios. 211. y 23.3.) pero no es suficiente (con dosis bajas de LPS) para permitiruna salida masiva de la fluoresceína al medio extracelular. Los resultados obtenidos con FIJAsugieren por otra parte, un efecto directo de la endotoxina sobre el pH,. que seria disminuidoya a los l5mir, de incubación de los bepatocitos con el LES como se comprueba en losestudios específicos de este parámetro (Décusñir., apdo. 25.7).

En el caso de los macrófagos de Kupffer. los resultados indican (Tabla 11, FYg. .31) quela incubación con LES (10 y lOúpg¡nd) produce un aumento de la intensidad de fluorescenciaemitida por las células. No obstante, en el raso de la dosis baja de endotoxina (lQpg/nd), elnúmero de células fluorescentes disminuye (viabilidad menor que en los controles) y cuandola dosis de endotoxina es lOOpg/ml, el número de células fluorescentes es mayor que en elcaso anterior (viabilidad igual que en los controles). Por ello, se podría pensar que en elprimer caso (lOpg/ml) el LES produce una activación de las esterasas citoplasniáticasmientras que en el segundo caso (lOússg¡nsl), tiene lugar un efecto inespecífico sobre lamembrana plasmática, favoreciéndose la incorporación de la sustancia apolar FIJA.

Esta explicación concuerda con los resultados obtenidos para la incorporación de QCj-2-desoxiglucosa por cultivos de células de Kupffer (Discusión.qxlo. 2 4.1.) y apoya la idea deuna acción específica de dosis bajas de 125 (lOpg/ml) respecto de la acción inespecifica

n,crr,rtnv 141

ejercida por lOOpg ¡SS/ml sobre las propiedades físicas de la membrana plasmática

(Dtc±tsiAn,apdo. 23.3.).

2.3.3. Microviscosidad. Efecto de La endotoxina.

La endotoxina induce la desestabilización de membranas artificiales (SoMate,a aL, 1970;

RenMenoeraL,1973)ysuinteracciónhidrofóbicayelectrostáticaconliposomasfosfolipidicosocasiona cambios en las cargas supeiliciales de tales sistemas (CMft& Lía,1979).Asimismo,el efecto del LES sobre la temperatura de transición de fase de distintos fosfoilpidos, pareceindicar que disminuye la fluidez de fosfol4iidos cargados negativamente como el ácidofosfatidico y la fosfatidfletanolamina (Lía ci al, 2982). Esto sugiere que el LES podríamodificar la función de las membranas biológicas modificando las propiedades fisicas de suslípidos.

Teniendo en cuenta estos antecedentes y la repercusión fisiológica que puede tener estainteracción, se ha hecho necesario el estudio del efecto de la endotoxina sobre la fluida den,embrsnas plasmáticas hepáticas utilizando las sondas fluorescentes DP}{ y TMA-DPH. Losresultados indican que el 1>5 aumenta la microviscosidad de la zona externa e interna de labicapa lipídica, siendo el incremento directamente dependiente de la dosis de LES utilizada(Figz .34y 35). El efecto es muy rápido en el interior y se mantiene a lo largo del tiempopuesto que a los lSmin de incubación con la endotoxina es similar que a los 4Smin (Tablas12 y 13).

Con el fin de comprobar a nivel celular este efecto, que parece indicar una rápidaintegracióa de la endotozina en la membrana plasmática, se utilizaron como sistema deestudio, suspensiones de los dIstIntos tipos reltalmns hepáticos incubadas durante SOnsin a31V con la endotosina.

El LES produce un aumento de la microviscosidad de la zona externa de la membranaplasmática de ios hepatocftos,mientras que casi no afecta al interior de la bicapa (Fig. 37).Eno no está en desacuerdo con lo observado en membranas plasmáticas hepáticas dado queen éstas existe una mayor accesibilidad del 1>5 al interior puesto que la superficie expuestaes mayor.

Estudios previos llevados a cabo a 25’C~ hablan puesto de manifiesto un notableincremento de la microviscosidad del interior de la membrana plasmática de célulasparenquimatosas aisladas, tras el tratamiento durante 3flmin con distintas dosis de endoroxina(Fonolésa aL, 1987). Evidentemente la temperatura influye de manera decisiva en este tipode experimentos. La mayor fluidez de la membrana a 37V respecto de 25V, posiblementeenmascara el incremento de tnicroviscouidad producido por el [PS y observado claramentea 25V en ambas zonas de la membrana plasmáric. Algunos autores, de acuerdo con esterazonamiento, analizan la microviscosidad a 24V cuando la sonda utilizada es DPH(aumentando la sensibiiidad puesto que la zona interna ea la más fluida de la membrana) ya WC si la sotada es TMA-DPH (aumentando así la sensibilidad pues una temperatura más

DISCUSION 14.2

alta permite mayor movilidad en la zona extensa que siempre es más rígida) (Dechetaol,

1990).

Los resultados obtenidos indican por tanto, un aumento de la microviscosidad producidopor el LES sobre la membrana plasmática de hepasocitos y concuerdan con la hipótesis deuna unión de la endososina a regiones hidrofóbicas de la membrana plasmática de las Pc(PaganleL aL, 1981)siguiendo el modelo bifásico de interacción propuesto por Price y Jacobs(1986> y que sugiere la existencia de dos etapas:

1’)Adherencitetapa reversible, de naturaleza fónica.Y) Coakxencia. etapa irreversible, que supone la inserción del lípido A en la bicapa

lipidica.Aunque las células del parénquima hepático son las mayoritarias en el hígado, el

conocimiento del efecto de la endotoxina sobre este órgano requiere también el análisis desu a~ión sobre las células no parenquimatosas. Por ello, se ha estudiado también lainfluencia delLES sobre la fluidez de la membrana plasmática de células no parenquimatosashepáticas en suspensión.

Se coniptueba que la endotoxina disminuye significativamente la microviscosidad de lazona externa de la membrana plasmática de las NPc (flg. 38). al contrario de lo que ocurrecon los hepatocitos, lo cual hace pensar en un diferente proceso de interacción LES-membrana. Esto podría explicarse debido a que las preparaciones de células sinusoidalesestÉn constituidas fundamentalmente por células de Rupifer y células endoteliales que

fácilmente fagocitarían el LES (SteffaneraL,1986), estando este proceso fagocítico asociadoa ‘umn aumento de fluidez (Berlin & Feto, 197~>~ Dicha fagocitosis se ve apoyada por losresultados obtenidos de los estudios de localización intracelular del LES cgt cultivos de NPcenriquecidos en células de Kupffer <Discusión, apdo. 22).

Sin embargo, la inicroviscosidad de la zona interna de la bicapa lipídica es incrementadatras el tratamiento de NPc con endotoxina (Fig. 38). Esto concuerda con el efecto del LPSen bepatocitos, atribuido a una integración de la endotoxina en zonas hidrofóbicas de labicapa lipídica.

Los datos sugieren que la incorporación del LES por las NPc puede implicar de formasimultánea fagocitosis e integración de la endotoxina en la bicapa lipídica. De esta manera,a medida que avanza la fagocitosis y disminuye la microviscosidad en la zona externa (hastaun 26%), se va produciendo la integración del LPS en la membrana aumentando por ello lamicroviscosidad en el interior de la bicapa (hasta un 2894

Comparando el efecto de La endotoxina sobre la zona interior de La bicapa de Pc y NPc,

se aprecia que mientras en las primeras el aumento de microviscosidad es prácticamentenulo (a 31V), en las segundas el aumento es muy significativo. Esto podría ser debido a ladiferente composición fosfolipidica de la membrana plasmática en ambos tipos celulares. Seha demostrado que preparaciones de membranas hepáticas ricas en membranas sinusoidales(NPc) tienen un elevado contenido en esfingomielina (18.25% del total de foafolipidos)(Krenvnera al, 1976). Ello explica la mayor microviscosidad observada en la membrana

n,erSScSnSS 143

plasmática de las NPc frente a las Pc y hace que el aumento de . producido por el LPS seamucho más peTceptible en las primeras. De la misma manera, resultados previos obtenidoscon hepatocitos a 25V <Ponolh a al, 1987) demostraban un notable incremento de lamicroviscosidad en el interiorde la bicapa lipídica tras el tratamiento conLPS, mientras quea WC (membranamás fluida) dicho aumento no se aprecia.

Por lo tanto, factores que incrementan la microviscosidad de la membrana como son elcontenido en esfingomielina o el descenso de la temperatura (25V) hacen más apreciableel efecto de la endotoxina, que es menos notorio en condiciones fluidiflantes.

Con el fin de esclarecer los distintos efectos del LI’S sobre la microviscosidad de las zonasexterna e interna de la membrana de células sinusoidales, se ha analizado el efecto de latemperatura sobre la microvisct,sidad dc células no parenquinsatosas control y tratadas conendotoxina (Tabla 15), cornprobándose que, efectivamente, cuanto ‘tenor es la temperaturamayor es el aumento de microviscosidad inducido por el LPS. Induso con la sondo TMA.DPH, la disminución de microviscosidadobservada a WC. se conviene en aumento cuandoel ensayo se lleva a cabo a 25V.

Estos resultados vuelven a poner de manifiesto que cuanto menor es la fluidez de la

membrana sobre la que actúa el lipopolisacárido, más fácilmente detectable es el incrementode microviscosidad producido.

Durante los procesos de fagocitosis existe una reorganización rnicro¡Obtflo-dependiernede los lípidos de la men,brana, internándose zonas especialmente rígidas de la misma yfluidificándose por tanto la membrana plasmática residual (Bedin & Fem, 1977).El aumentode fluidez producido por el 11>5 en el caso de las NPc es detectable en el exterior de lamembrana y no en el interior (flg. .lBy labIo 15).

En este sentido el 11>5 podría ejercer un efecto análogo al de la colchicina: este inhibidordel ensamblaje de microtúhulos, previene de los cambios de fluidez inducidos durante lafagocitosis en la zona interna de la membrana <Berlin 4 Fe,a,, 1977). pero sin afectar a lacaptación de partículas (Olivera aL, 1974).Ls endotoxina podría tener un efecto sensejarnedado que distorsiona el ensamblaje de los microtúbulos (Riscoaol, 1991),alterando de este

modo la reorganización microtúbulo-dependiente de los lípidos de la membrana que tienelugar durante los procesos de lagocitosis <Olrva eraL, 1974;AszaloseraL, 1085;BenedettieraL, 1990).

2.3.4. Microviscosidad. Efecto de sales biliares.

De acuerdo con la hipótesis de Van Bossuyí eraL (1990),las sales biliares (SE) tienen undoble papel en el desarrollo de endotoxemia de origen intestinal que ocurre durante estadoscolestáticos. Se Isa comprobado quela obstrt,xiónbiliar origina a menudo un estado de sh’ackendotóxico (25-85t?fl de los casos) y que la administración oral de SR previene la absorciónde LPS del intestino <Kocsa, dat, 1069; Ce/sil! a aL, 1987). Por tanto paree que una bajaconcentración intestinal de SR favorece la absorción de LPS y, al mismo tiempo, elevados

IMCCtKIflN 144

niveles séricos de LB inducen una diansinución en la capacidad fagocítie. del sistema retículo-endotelial hepático (RES) (TanakaelaL, 1985; Takiguchi& K,ga, 1988>. Se ha demostradomediante estudios k. vbo,que algunas LB disminuyen la unión de la endotoxina a las célulasde Kupff& <Van Bouu~«a, ion>, pudiendo deherse a un efecto de dicisas SR sobre las

propiedades físicas de la membrana celular que afectarían, por tanto, a la unión de LPS.El posible efecto modulador de las sales biliares en la acción de la endotoxin. y cl hecho

de que el ácido saurocólico (T~A) altera la fluidez de membranas hepáticas aisladas<Schanchnsidtel aL, 1981), han tiendo a estudiar el efecto que, sobre la microviscosidad dela membrana plasmática de distintos tipos celulares hepáticos~ tienen las siguientes salesbiliares:

- Taurocolato sódico (It) y tanrodesoxicolato sódico (TDC), por ser los másimportantes componentes de la bilis de rata (l2mM y 5mM, respectivamente, frentea un 3OmM total de sales biliares) (Lose & Colnna,t 1981>.La macla (M) constituida por <it (85%) + TDC (15*)>. dado que es más similar

a la situación fisioldejea be sto: mezcla de varias sales biliares de disinl. hidrofobici-dad con predominio de las hidrofilicas, menos tóxicas (Nakagawaa aL, 1990).- Tauroursodesoxicolato sédico <TUDC). ya que se Isa comprobado que no afecta ala unión del LES a las células de Kupffer, contrariamente a lo que ocurre con lasanteriores (VanBoag* e al, 1996). (Control negativo).

Distintos autores han intentado relacionar las propiedades flsicm-quln,lcas de las SR consus actividades biológicas y cisotoxicidad, poniéndose de manifiesto que éstas dependenfundamentalmente de tres factores (Cresro.nite aL, 1989; Fasano a aL, 1990; Zitas & Hin41990):

El estado de conjugación de la sal: la forma no conjugada es más citotóxica que laconjugada (Oheati al, 1996).

En el presente estudio sc han elegido los conjugados de taurina por ser ésta más polary menos tóxica que la glicina (Nakagawael aL, 1990).

- La concentración micelar crítica (ClAC): el posible daño celular inducido por las SR

transcurriría según dos mecanismos en dependencia de su concentración (Oribergex al,19%):

• A concentraciones mayores que la CMC, las SR actúan como detergentes quesolubilizan componente de membrana y alteran su permeabilidad <Nagasa ce al,1990).

• A concentraciones menores que la CMC, las SR inducen un acúmulo intracelularde calcio que puede resultar citotóxico (ilion & iawaharla4 1980;.4nwereral, 1989;

Conshenescrol, 199~Oelbegel aL, 1990).

neCCrrCIflV las

Por ello, la concentración a la que se realizan los experimentos de este estudio essiempre 2mM, inferior a la ClAC de todas las SR utilizadas (Hofinann, /988). de maneraque los resultados se deben a la interacción no lítica de lamelas de SR con la membrana.Además se ha demostrado que a esta concentración las SE empleadas no son citotóxicas

para Isepatocitos (O/sta te aL, /9%).

- El indice de hidrofobicidad (III): este parámetro se hace mayor, excepto en el caso delácido ursodesoxicélico (UDC), al disminuir la itidroxilación del núcleo esteroidico y elioincrementa su poder citotóxico <Schobneñds etaL, 1964; Mumnir/ti, 1990). lítico (Nagata,1990>, su capacidad de interacción y penetración en sistemas modelo de membrana(Shoemaker & Nid’oln 1990) y sss efecto sobre la concentración intracelular de calcio(Anwer ex aL, 1989).

Teniendo ésto en cuenta se han representado los resultados de mieroviscosidad frenteal IB de la sal biliar correspondiente (Lateon,1990).

En términos generales, se apeada un significativo efecto fluidificante de todas las salesbiliares ensayadas sobre la membrana plasmática de las células hepáticas tanto paren-quirnatosas como sinusoidales (Figs. 39, 40, 41 y 42). Dicho efecto guarda una propor~cionalidad directa, con ci 11* de la SE. sobre todo en el caso de las NPc.

En éstos, la disminución de 1. microviscosidad es mucho más pronunciada en el interiorde la bicapa (DPH) que en la zona enema (TMA-DPH), excepto para el caso del TDC (elmás apolar>, que aumenta considerablemente la fluidez de la superficie (Tabla ¡6). Por elcontrario, en los hepatocitos el efecto es mayor en el exterior (TMA.DPH) excepto para elTUDC (el más polar) que prácticamente no afecta dicha zona (Za/sIc 17).

Todo parece indicar que el efecto de las sales biliares depende, ¡so sólo de tu índice dehídrofobicidad, sino también de las características ffsicas de la membrana con la queinteraccionan. Así, cuanto más elevada es la ~ de la membrana, más le afectan las SE muyapolares, tanto en el exterior como en el interior de la bicapa. En cambio, cuanto más fluida(baja q) es la membrana, más le afectan las SE muy polares, sobre todo en el interior (zonade mayor fluidez).

Esta hipótesis concuerda con la presentada por Lose y Coleman (1981) quienes planteanque cuanto más fluida es la membrana del eritrocito (valores bajos de la relación esftn-gozrtieflna/fosfatidilcoliaa). más susceptible es a la lisis por SE. sobre todo por las polaces(gilcocolaro). Asimismo, sus resultados indican que cuanto más rígida es la membrana deleritrocito, tanto mayor poder Inico tiene la SE apelar (gjicodesoxicolato) respecto de lahidrofilica <glicocolato).

Les mismos autores postulan que la baja fluidez, comprobada experimentalmente. de lasmembranas hepáticas ricas en membranas sinusoidales (Keefee e: aL, 1979), podría explicar,al menos parcialmente, su resistencia ha t*o al poder lítico de las SE. Los estudios la sém,del presente trabajó, ponen de manifiesto quelas membranas con mayor q (Sc, zona externa)

fltcrrltrfl&t

son más resistentes al efecto fluidificante de las SR sobre todo de las más polares, que son

las mayoritarias en la bilis. Sin embargo, cuando las SS son preferentemente hidrofóbicasse ven menos afectadas las membranas más fluIdas (Pc, zona interna).

Por otra parte, en condiciones colestáticas se observa una disminución de la capacidadfagocítica del RES (Tonaba aol, 1985; Takiguchi& Koga, 1988) que podría ser explicada.al menos parcialmente, como consecuencia del efecto fluidificante de las SB sobre lamembrana de las células sinusoidales hepáticas. Así, el Tune, que no afecta a la microvis.cosidad de la zona externa de esa membrana (F¡g. 4), Tabla 16), tampoco aliera la capacidadfagocítica de las células de Kupffer (Van Bossr

0< ex al, 19%), sugiriéndose la importancia de

una especial microviscosidad en la zona externa de la membrana plasmática para una correctafagocitosis. Este proceso par~ ir acompañado de una reorganización microtúbuio-dependiente de los Ilpidos de la membrana, que implicaría la migración de los receptores delectinas a zonas especialmente rígidas de la bicapa, que envuelven a la panícula fagocitadasiendo posterionnente internadas y dejando por tanto una membrana plasmática residual másfluida (Berlin& Fera, 1977).Cabe por ello pensar que una anormal fluidez de la membranaplasmática podría alterar la actividad fagocítica.

Puesto que el efecto de las SS consiste en una fluidificación general de la membranaplasmática y considerando el incremento de microviscasidad ejercido por el LES sobre lamisma, resulta de gran interés estudiar la influencia del lipopolisacárido y las SB simultánea-mente.

Los resultados (Tablar 18y 19) ponen de manifiesto que los efectos contrarios ejercidosindividualmente por la endosoxina y las SE se anulan al añadir ambos al medio de incubación,tanto en las células pa.renqtiin-aatosas como en las no parenquimatosas.

Esto podría deberse a que ambos efectos simplemente se contrarresten: en Pc, el LES(20014/ml) aumenta la microviscosidad =13% y las SR (2mM) la disminuyen =18

0k (máximo),excepto en el caso del TDC; en NPc, el LES (206pg/ml) aumenta la microviscosidad =28%y las SR (2mM) la disminuyen ~2O%,excepto en el caso del TDC.

Por otra parte, también podría edstir una interacción LES-SE, formando apegadoslamelares o micelas mixtas que no tengan ningún efecto sobre la microviscosidad de Pc o deNPc. En este sentido, Van Bossuyt eta! (19%) han demostrado una menor captura de cm-LES por las ¡Cccuando se incuban las células simultáneamente con la endotoxina y SR. Puestoque no se han observado alteraciones en la microviscosidad de la membrana de estas célulasen dichas condiciones, se puede efectivamentepostular la existencia deuna rápida interacciónLES-SR base del efecto protector de dichos agentes. Así, Slsands y Chun (1980) postulanque el DC interacciona con el LES disgregando las moléculas de lipopolisatárido. Además,las SR forman complejos reversibles con la albúmina a la cual se unen con gran afinidad (Pico& Houssier, 1989), habiéndose observado que dicha proteína desplaza al LES de su unión aPc <Pagmsiex aL. 1981>. Por otra parte, las tipoproteinas interaccionan con las sales biliares(Frons’n, 1989) y también con el LES (Van Lenreri eral, 1984 Warreneral, 1986), siendo estainteracción dependiente del contenido de colesterol de la Lp (Van Unten eraL, 1986). Todo

nzscu~ou 147

ello apoyada la existencia de la interacción LPS-SB que impediría la interacción de ambos

agentes con la membrana plasmática.

2.4. FUNCIONALIDAD DE LX MEMBRANA PL&SMA11CA

Para estudiar las alteraciones que puede ocasionar la endotoxina en la Itincionalidad dela membrana plasmática, se han considerado los siguientes mecanismos:

- Incorporación de 2-desoxiglucosa: permite obtener información sobre la viabilidad

funcional de las células parenquimatosas y no parenquimatosas en relación con e]transpone de glucosa a Inavés de la membrana.

- Unión e internación de insulint dada la importancia de la insulina en la regulacióndel metabolismo hepático y considerando las alteraciones metabólico-hormonalesobservadas durante el shock endotóxico ha st.> (Hbashaw ex al, 1983), resulta denotable interés analizar el efecto de la endotoxina sobre la unión e internación de estahormona en hepatocitos.

- Unión e internación de LDL la naturaleza lipoprotéica del ligando aporta un interésadicional al análisis de su unión a las células parenquimatosas debido a la posibleinteracción LPS-LDL (Van temen eral, 1986).

2.4.1.Incorporación de [“C)-2-desoxiglucosa.

Los resultados obtenidos en ausencia de endotoxina (Tablas 20, 21 y 22), permitencomprobar la viabilidad funcional de las células parenquimatosas y no parenquimatosas encsiltivo primario, indicando que el transpone de glucosa a través de la membrana es normal.

El tratamiento con lipopolisacárido produce en los hepatocitos una disminución deltransporte de glucosa lo cual podría ser consecuencia de la alteración de las característicasfísicas de la membrana tras su interacción con la endotoxina (Disaulón. apdo. 21). Estadisminución de la captación de glucosa conducirla a una ausencia intracelular cada vez mayorde compuestos energéticamente activos, siendo ésta una alteración característica del estadode ±hockendotóxico.

En el caso de las células no parenquimatosas, el LES produce un aumento del transportede glucosa a dosis bajas de endosoxina (lOsg/ml). Este efecto ha sido demostrado para lasc&las de Kupffer en estadio, ha .ño (Spiter ea!, 2990> y es un Indice del estadobipennetabólico en el que se encuentran los macrófagos tras el tratamiento con LES. Todoparecc indicar que dosis bajas de endotoxina (lOpgftnl) activan específicamente elmetabolismo celular de los macrófagos bep~ticos. mientras que dosis mayores (ItIOpg/ittl)

OK~ÉYC,ON 148

actúan inespecificamente alterando las propiedades de la membrana plasmática <Dúcusi&tcq’dos. 212y211).

Esto concuerda con lo postulado por Bautista e! aL (19%) que sugieren que el estadohipermetabólico inducido por el LES fe vts~ en tnacrófagos hepáticos, puede estar relacionadocon una elevada generación de O; (Dircurlan, eqxlos. 1.1. y 25.1), contribuyendo esto últttnoa la inducción de las lesiones hepáticas características de la endotoxicosis.

2.4.2. Unión e internación de [9)-insulina.

Durante los procesos de endororicosis se producen graves alteraciones que afectan almetabolismo hepático así como a su regulación hormonal. En este sentido el LES induce unahipergiucemia temprana transitoria, seguida de hipoglucemia y disminución de las reservasde carbohidratos del organismo (Hinshaw, 1976; McCaIkan, 1980). La respuesta hipergiucé-mica de la primera fase parece deberse a un incremento de la secreción de glucagón. Estahormona hipergiucemiante estimula los procesos de glucogenolisis y giuconeogénesishepáticos (SwhcrIand & Robinson, 1969) a través de su unión a los receptores hormonales enla membrana plasmática y la activación de la adenilato ciclan (Bimbaura & Fula, 1977).

Estudios previos han demostrado que el LES disminuye fe rifo la unión de glucagón ahepatocitos aislados (Pagan] e’ aL, 1985), lo cual podría contribuir al desencadenamiento dela segunda tase hipoglucémica característica del shock (1-Iínshaw, 1976; McCallwn, 1980).

La disminución de la gluconeogénesis hepática y el aumento de la utilización de glucosapor tejidos periféricos, determinan esta profunda hipoglucemia, que ha sido relacionada conla transición entre la endotoxicosis reversible y el shock endotóxico letal.

Los sucesos metabólicos de esta segunda fase son característicos de un estado hiperin-sulinémico y por esta razón la insulina ha sido implicada como factor clave en la dishorneos-tasis de la glucosa desarrollada durante la endotoxicosis <Yelich & Fil/das, 1980). Dicho estadohiperinsulinémico ha sido comprobado durante el shock endotóxico (Sp&zer eraL, 1976) y,aunque parece relacionado con un estado de hipersecreción pancreática (Yellch & Fil/das,1982), el mecanismo responsable de la elevación de los niveles de insulina no estácompletamente esclarecido. Existen evidencias de la implicación de algunas monoquinas (lb1) en la hiperinsulinemia postséptica, lo que pone de maniflesto la importancia de algunosmediadores en el desarrollo del shock.

Por otra parte, ha sido descrita una cierta resistencia a insulina durante el shock (Stoncrdat, 1983).

Con el fin de conocer si existe un efecto directo de la endotoxina sobre la interacción dela insulina con los bepatocitos, se ha investigado la influencia del LPS bacteriano sobredistintas etapas del mecanismo de acción de la hormona.

Los resultados obtenidos de los estudios de unión de [‘1].tnsulina a monocapas debepatocitos muestran las características tipicas de la unión hormona-receptor (ng. 43) comOha sido descrito para diferentes tipos celulares y preparaciones de membranas plasmáticas

n,tn,c,nn I49

(Donnen 1982; O¿efsky & ¡Gao~ 1982). La interacción de la endotoxina con hepatocitos encultivo disminuye la unión eq’ecifica de insulina con todas las dosis de hormona utilizadas<flg. 43), tras 9Omin de incubación a 2TC. Esto concuerda con los resultados obtenidospreviamente utilizando hepatocitos en suspensión <Pagan/a aL, 1985) y demuestra que launión del LES a la membrana del hepatocito no permite la normal interacción hormona-receptor.

Este efecto ha sido investigado a diferentes tiempos y temperaturas de incubación coninsulina observándose que la acción del LES sobre la unión de La hormona es más evidentea 3omin y baja. temperaturas (CC). Sin embargo, dicho efecto desaparece a tiempos máslargos de incubación (9omin) y a temperan más altas (3VC) (Tabla 23, Hp. Uy 45).

Previamente se ha postulado que el LES se une a ingredientes particulares de la bicapalipidica mediante interaccione flsioo-qulmicas que no implican la existencia de un receptorespec/fico (Pagani ex al, ¡Mi). Dado que la arción del 125 induce un aumenta de lamicroviscosidad de la membrana plasmática de hepatocitos (Discusión q4o. 23.3.),permaneciendo sobre la superficie celular de forma más prolongada a temperaturas bajas(Manido a aL, 1990; DI4-LMaA, a 01, 1991), las moléculas de lipopolisacáriclo podríanaherar los receptores de insulina o interaccionar con ellos, disminuyendo así la unión de lahormona.

También se ha investigado la internación de la hormona a diferentes temperaturas ytiempos, comprobándose que la endocitosis eun proceso tiempo-y temperatura-dependiente(rw~. Uy 45). lo ojal .pc»’a los resultados de otros autores <Osen01, 196O~ O~fsky & JCn1982). Tanto la endocitosis de insulina (Fig 45) como la internación de 125 (Maniría e! al,1990; D(az-Laviada eraL, 1991), son más lentasa temperaturas bajas (CC) pero incluso a esatemperatura ambos procesos tienen lugar.

La endotoxina disminuye significativamente la internación de insulina en todas lascondiciones experimentales ensayadas CF/gr.

44y 45), incluso cuando la unión de la hormonaestá menos afectada (3VC/9Omin).

La acidificación del citoplasma celular disminuye los procesos de internación (Sandvrg elaL, 1981; PulAn eraL, 1990) y, dado que se ha comprobado que el LES reduce el pl!, en 0.3unidades a los lOada de su incubación con hepatociros en cultivo (Discusión, cqida. 25.7),ésta puede ser la causa de la disminución de la endocitosis de la insulina.

Además estos resultados concuerdan con los mecanismos de unión e incorporación delLES observados mediante técnicas de inmunomarcaje con oro coloidal <Maniría e: aL, 1990;Dfaz.Lov¿adacrol, 1991), que indican que la unión e incorporación de la endotoxina a loshepatocitos son procesos tiempo- y temperatura-dependientes. Así, el LES permanece en lasuperficie celular a temperaturas bajas y/o tiempos cortos de incubación, mientras que atiempos y temperaturas superiores, se observa una unión e internación más rápidas de laendotoxina. Por esta razón, cuando el tiempo de incubación es corto o la temperatura baja,la endotoxína afecta a la unión y a la internación de insulina. Sin embargo, cuando laincorporación del LPS es mayor (tiempos más largos o temperaturas mayores), la unión dela hormona se ve menos afectada permaneciendo la endocitosis alterada.

DISCUSION 150

Teniendo en cuenta que el aumento de microviscosidad producido en la membrana de lascélulas parenquimatosas por la acción directa del LPS <DiscaríAn, apdo. 23.3.). podría ser lacausa de una alteración de los procesos endocíticos, se ha analizado el efecto ejercido porun conocido inhibidor de endocitosis (óxido de fenilarsina, PhAsO) sobre la microviscosidadde membranas hepáticas aisladas. La Fig. 36 pone de manifiesto un paralelismo entre laacción del LES y la del PhAsO, que supone una disminución notable de la fluidez de lamembrana, sobre todo en el caso del inhibidor de endocitosis <Tabla 14).

Esto permite concluir que un incremento de la microviscosidad de la membranaplasmática afectaría negativamente a la endocitosis de complejos receptor-ligando, disminu-yendo la movilidad de los componentes de la membrana, alterando los mecanismos derransduec¡ón de seftales y pudiendo ser responsab/e de la resistencia a insulina observadadurante la endotoxicosis. Asi,nistno, se ha observado que el tratamiento con LES altera lasíntesis de AMPc inducida por glucagón (Paganíe~ aL, 1985).

Todos estos datos apoyan la existencia de una acción directa del LES sobre losmecanismos de unión e internación de la insulina.

2.4.3. Unión e internación de [~lJ-LDL.

El hígado estA implicado en la eliminación de LDL circulantes (Brown & Golóstein, 198.3),lipoproteinas de baja densidad que contienen la mayor parte del colesterol plasmático<Golóstein& Brown, 1977). En el curso de bacteremias Gram-negativas, se ha observado laexistencia de estados hipercolesterolétnicos (Gallin e! al, 1969; Blockbwn, 1977) que podríanestar relacionados con las alteraciones hormonales características del shock.

Por otra parte, la especial estructura química de las LDL, formadas por un núcleo apolarde colesterol esterificado y triacilgliceroles, rodeado por una monocapa de fosfolípidos ycolesterol libre con proteínas integradas (Siten ci aL, 1977), les confiere la capacidad deinteraccionar con la molécula del LES (Van Lenren eraL, 1986; WanenriaL, 1986).

Es, por tanto, de notable interés estudiar el efecto de a endotoxina sobre la unión einternación de LDL a hepatociros. ya que una alteración de este proceso podría tenerconsecuencias importantes en relación con los estados hipercolesterolémicos que se inducendurante el desarrollo del shock.

Los resultados obtenidos indican que el LES (2O0~g/ni]) disminuye la unión total de LOLa las células del parénquima <Fig. 46), siendo el efecto más significativo a tiempos largos(24Ornin). Sin embargo, dosis más Sajas de endotoxina (lOú,íg/ml) no alteran de formasignificativa dicha unión.

Se ha demostrado que el LES disminuye la fluidez dc la membrana plasmática de loshepatocitos <Discusión, apdo. 23.3,). Ello podría alterar la funcionalidad del receptor deLOL (R~,.) disminuyendo la unión de lipoproteina. De hecho este efecto ha sido observadoen membranas hepáticas que, tras ayuno del animal, ven incrementada su microviscosidad ypresentan una unión disminuida de LDL (Loo eraL, ¡990). Sin embargo, en las condiciones

Igl

del ensayo (3VC/tienwos largos) no deberla estar aherado considerablementeeste parámetrode la membnaa.

Además, la unión inespecífica del 1>5 a la membrana de los bepatocitos (Paganí aol,1461; Paganáa 01, 1988), podría alterar total o parcialmente el ~ dismintqendo su

acnesibilid.d a la lipopwtelna según un mecanismo paralelo al postulado para la unión deinsulina (Discusión,qxk 24.2), y ésto explicaría la dependencia de la dosis observada enla unión de LI7)L

En ensayos paralelos, las oélulas se incubaron con HDLpara estimular la respuesta celulara las LOl, puesto que ha sido descrito un efecto activador de la presencia de R..

1,~ en lasuperficie celular, como consecuencia de la aposición a dicha lipoproterna de alta densidad<Haveka aol, ¡966<4 Hovekeseral, 19Mb). Los resultados obtenidos (itTg fl indican, sinembargo, una inhibición total de la unión específica de WL a los hepatocitos controL Ello

puede aiplicarse por una atefa 632 HDL-Z,,, como consecuencia de la presencia deapolipoproteina E en las HDL (Nafro, 1986). Dicha apa E reconoce los receptores hepáticosde la apa B/E (R..,<J (Utennwn 1987), pudiendo deteinsinar etas re*ccion% cruzadas,sobre todo en el caso de utilizar especies heteróLops <Fentánder& Mc Namam, 2990).

Por otra parte, en estas condiciones se observa una clara diferencia entre el efecto de lapreincubación con LES 100 y con LPS 200. En el primer caso la unión de LOL es mayor quela unión controlpudiéndose pensar en una acciónsinérgica del LPSy las ROL que determina

la activación de los mecanismos celulares de captación de colesterol de las LOLCuando la preincubación se ha llevado a cabo con una dosis mayor de LPS (200,¿g/ml),

se ve negativamente afectado el metabolismo celular impidiéndose la captación de LDL. Estaalteración ya babia sido observada en ausencia de incubación con ROL (Fig. 46).

El estudio de la influencia de distintas dosis de ¡tUL sobre la unión de [‘Il-LOL (Fig.48), concuerda con esta explicación puesto que incluso a la menor concentración empleada(l3Opg/ml), la ROL es capaz de bloquear todos los R~ (Control), cosa que no ocurre silpreviamente se han incubado los hepatocitos con LES (100 y 200pg/ml).

Las Fígums 49y56 muestran la unión específica de [t’l1-LDL a hepatocitos control y

tratados con LES, respectivamente. Se observa que, en elcaso de las células preincubadas conendotoxina, la unión inespeciflca es mayor (adO%) sobre todo a tiempos cortos (óOmin). Sededuce, por santo, que la endotoxina parece favorecer la unión inespecífica de LDL Esteefecto tiende a desaparecer a tiempos largos de incubación, que implican una totalinternación de las moléculas de LES en la célula (Municio a aL, 1990; D&u-Laviada ti aL,lQQfl.

Esta hipótesis estada de acuerdo con un aumento del intercambio directo de colesterolentre Lp (ROL o LOL) y la membrana plasmática de los hepatocitos, la cual ha vistoincrementada su n,icroviscosidad tras la interacción inespeelfica con el LES <Discusión, apdo.2 3.3.).

Por otra parte, se conoce la existencia de una endocitosis inespecífica de la LO!. nomediada por receptor, que se activa en presencia de elevadas concentraciones de lipopro-teína. Teniendo en cuenta las condiciones experimentales del estudio, este mecanismopodría

VISCUSION 152

estar incrementado. La internación del LES en los hepatocitos, inespecífica y no asociada avesículas <Muflido a aL, 1996, Dfaz-Laviaña ci al. 1991), podría estar facilitando estasegunda vía de internación de las LDL La Tabla 24 apoya esta hipótesis puesto que elpretratamiento con endotoxina (lOOpg/ml) hace que la cantidad de [‘99-LOL internada seaprácticamente el doble <77%) que en células control (39.5%).

Todos estos estudios indican la existencia de un efecto directo del LES sobre la unión deLDL a hepatocitos en cultivo, siendo la respuesta celular dependiente de la dosis deendotoxina.

2.5. PARAMETROSBIOQUTh4ICOS JNTRACELLILARES.

Diversos estudios han descrito que la alteración del metabolismo celular es la causa dela irreversibilidad del shock (Sayee4 1983). Como ejemplo sirva mencionar la resistencia dela especie C3H/HeJ de ratón a muchos de los efectos ftsiopatológicos que se suceden en elcuadro de shock endotóxico (Rosenstreidi,1977). Dicha resistencia parece deberse a laausencia del efecto inhibidor de la endotozina sobre la inducción de la enzima gluconeog¿nicafosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) (McCalluni & Fondas. 1979). Así pues, esfundamental conocer la dishomeostasis celular en la instauración y desarrollo del shockendotóxico.

La influencia directa o indirecta del LES en este sentido, se ha analizado utilizando lossig,áentes parámetros:

- Actividad intra y/o extracelular de enzimas características de la funcionalidad celularen distintos aspectos: LDH, su liberación al medio está directamente relacionada conla integridad de la membrana plasmática (Paganí cf aL, 1985; More! ci aL, 1990; O/une! aL, 1990) <Discusión, apdo. 23.1.); GI<, enzima implicada en el metabolismohepático de hidratos de carbono; FA, enzima lisoson,aI por lo que una alteración desu actividad indicarla lesión a ese nivel ,subcetular.

- Actividad de la SOL) y producción de radicales libres de oxígeno, cuyo papel en lapasogénesis del fallo hepático ha sido inequívocamente establecido, siendo la causade alteraciones metabólicas y lesiones celulares mediante distintas vías (Sióter, 1984).

- Perozidacién lipidica, cuya alteración ca una de las tres principales vías de acciónpor las que los radicales libres de oxígeno inducen dafio celular (Slater, 1984).

- Niveles de citocromo b,, cuya implicación en los procesos de desaturación de ácidosgrasos y en el sistema de oxidasas de función mixta microsomales, le confiere unaespecial importancia en estados citotóxicos ya que éstos van a requerir la utilización

htvflfvtflfl igl

de los mecanismos de remodelación dc membranas y de destoxificación hepática <Laci aL, 1973; Snitflno.ner a aL, 1974; Mogo.n & Coon, 1984).

- Homeostasis del calcio intracelular, catión reconocido como un importante segundo

mensajero dada su participación en numerososprocesos reguladores <Yagi & M~nzaAa1938).

- pH intracelular (¡113, que suele modificarse paralelamente a flujos alterados decalcio, actuando como mensajero sin&gico a través del contexto metabólico en el queestán integradas las acciones de otros doctores <Bt¿sa & Nuecíeteili, ¡984).

2.5.!. Olucoquinasa.

La actividad intracelular de esta enzima (OK) se ve incrementada en hepatocitos comoconsecuencia del tratamiento con endotoxina, de forma dosis y tiempo dependiente <Figs. 51y 52). La ausencia de efecto a los 3omin de incubación con 1>5 y el aumento de casi un100% a las 2 horas, induce a pensar en un efecto a largo plazo de la endotoxina sobre dichaactividad. Esta enziana transforma la glucosa en su metabolito activo glucosa-6-fosfato. que,al estar inhibida la gluconeogénesis, seda sustrato de la via degradativa que llevará a laformación de piruvato y por acción de la LOE a lactato <Discaisó>t apdo. 211.).

Por otra parte, la no alteración de la actividad 01< en bepatocitos tratados con distintassales biliares <Fig. 52), indica la ausencia de citotoxicidad de catos compuestos a laconcentración utilizada (2mM), ausencia demostrada previamente por otros autores (Oh/aeral, 19%). Las sales biliares además protegen a las células del efecto inducido por el UPSsobre 1. 01< <Flg. 52). Este carácter protector de las SR, ya ha sido mencionado y discutidopreviamente (Discusión, apdo. 23.4), llevando a considerar la posibilidad de una interacriónLPS-SB.

2.5.2. Fosfatan ácida.

Los resultados reflejados en la Tabla 25 indican que sólo con concentraciones elevadasde endotoxina (lmg/mi), se produce un aumento significativo de la actividad extracelular defosfatas. ácida. Esto concuerda con la disminución de viabilidad puesta de manifiestomediante la incubación con FDA a esa misma dosis de LPS <Fig. 29) y sugiere de nuevo laexistencia de alteraciones de la membrana plasmática que facilitan la salida de la enzima almedio.

Las dosis menores de lipopolisacárido (100, 200 y SOOpg/ml) no son suficientes paraprovocar la salida de fosfatasa al exterior de la célula, o bien no producen daño lisosomalapreciable mediante este ensayo, manteniéndose así constante la actividad extracelular de la

ttKflrrow ‘SA

enzima. Para comprobar si la actividad FA está aumentada en el citoplasma, se ha realizadola valoración intracelular de la hidrolasa, observándose que el LPS (100, 200 y SOOsg/ml) notiene ningún efecto <Tabla 2s5). Todo parece indicar por tanto, que el LPS no estiniula laactividad de esta enzima lisosomal, si bien no puede descartarse por ello que exista unaactivación de los sistemas lisosomales.

2.5.3. Superóxido dismutasa y capacidad oxidativa intracelular.

La complejidad de la respuesta b¡ 4.o no permite diferenciar entre una acción directadel LPS sobre las células del parénqtsinn y una acción indirecta debida a la intervención demediadores (lUí, TNF) liberados fundamentalmente por macrófagos circulantes y células deKupffer. Por ello se han llevado a cabo estudios ¿o vino que han demostrado <flgs.

53y .54)que el LPS ejerce un efecto directo sobre los hepatocitos, alterando la actis dad intracelularde la SOL).

Así pues también el parénquima hepático colabora, junto con las células de Kupffer y lospoliniorfonucleares infiltrados <Bautista ti aL, 19%), en la liberación de O; manifestada ¿ovivo por una reducida actividad de la SOL) durante la fase aguda del shock <Tabla 8)(Discusión, cwdo. 1.1.).

Se puede apreciar que la incubación con dosis bajas de LPS (SOpg/ml). durante Zh (Fig.54), da lugar a efectos análogos a los resultantes de una incubación con dosis mayores deLPS (200pg/ml) durante tiempos más conos (lOmita) (Fig. 53); reproduciendo la reducidaactividad de SOL) característica de la fase aguda del shnck (Tabla 8).

Cuando el tiempo de incubación es mayor (Fig. 54, 4/a), el comportamiento se aleja delobservado lis vivo, lo cual sería debido a una considerable disminución de la viabilidad celular.

La elevación de los niveles de O; puede ser causa y también consecuencia de alteracionescomplejas de la membrana plasmática de los hepatocisos Un exceso de radicales libres puedeincrementar la rnicroviscosidad de membranas biológicas mediante la activación deperoxidación lipídica <Watannbe ci aL, 1990). mecanismo que se sumaría a la disminución dela fluidez producida por el tratamiento directo con LPS (Discusión, apdo. iii> y que podríaactivar la NAD(P)H oxidasa determinando la producción de radicales libres. Esta hipótesisbasada en alteración de la membrana plasmática celular como desencadenante de la cascadade reacciones de producción de radicales, ha sido postulada previamente para el caso demacrófagos (Benon& Gordon, 3983).

Ello e~licarta los resultados puestos de manifiesto en la Fig. 55 que indican tan efectotic las SB (TC y TC. DC) sobre la actividad de la SOL). Dicho efecto es además contrarioal ejercido por el LPS, coincidiendo con lo observado para el parámetro de microviscosidadde la membrana plasmática de los hepatocitos (Discusión,apdos. 23.3. y 214.). No obstante,cabe destacar que la incubación simultánea con 58 y LPS no produce variacionessignificativas en la fluidez de la membrana y, sin embargo, sí determina disminución de laactividad de SOL). Por tanto, aunque la integridad de la membrana plasmática tea un factor

DISCUÑIOM 155

a tener en cuenta, no es el único determinante de la liberación de radicales libres de oxígenotras el tratamiento directo con LPS. M1 por ejemplo, se ha descrito que el calcio puedeparticipar en la formación hepática de radicales libres de oxígeno durante la endotoxicosis<Sakaguchi eraL, 1989>.

Los resultados obtenidos con suspensiones de NPc enriquecidas con células de Kupffer,muestran una rápida elevación de la capacidad oxidativa intracelular como consecuencia deltratamiento con LPS (Fig. 56), demostrándosc una acción directa de la endotoxina sobre losdistintos tipos celulares hepáticos.

25.4. Peroxidación lipidies.

Con el fin de completar el análisis realizado lis ,É’o respecto a la peroxidación lipidica enel hígado durante el rhode (L)úcusión, c~4o. 1.2), se ha flevado a cabo un estudio paralelola tija. Los resultados obtenidos (flg. 57) reflejan un comportamiento análogo al obtenidoña s~to (flg. 17), sugiriendo una acción directa de la endotoxina sobre los bepatocitos en loque a peroxidación lipídica se refiere. La evolución que experinienta dicho comportamientoal ir incrementándose la dosis de endotoxina, implica un alejamientoprogresivo del observadoen el shock endotóxico reversible y podría ser debido a que dosis excesivamente elevadas delipopolisacirido <SOOpg/ml) <F¿g SZD) producen un descenso notable de la viabilidad <Fig.29) (lesión celular irreversible), sobre todo a tiempos largos de tratamiento. De ahí que lasdiferencias entre las cuatro dosis empleadas se aprecien fundamentalmente a las 6 horas deincubación.

El aumento de la peroxidación lipidies en hepatocitos como consecuencia del tratamientocon LP~ implica una alteración estructural y funcional de la membrana plasmática (Sevanian& FGns, 1985) que podría distorsionar los gradientes transmembrana e inhibir procesosmetabólicos celularex Se ha desairo <MatTreva cg aL, 2989) la existencia de modificación dela seflal de información a nivel de la protehsa quanasa C, imprescindible en el controltranssneanbrana de procesos celulares (Myung-Ho& BtU, 1986).

Entre esas alteraciones estructurales, cabe destacar la disminución de la fluidez observadasanto en membranas biológicas como en sistemas modelo, tras ser sometidos a peroxidación(BarA & fla~r, 1983; Watonoteetal, 1990). EJ LPS tainhihn ejerce un efecto semejantesobre la membrana plasmática (Discusión, apdo. 23.3.) que, por tanto, podría deberse enparte a la peroxidación lip<dica. Además, habría que tener en cuenta tambinn factores tanimportantes como las características de la unión de la endotoxina y la concentraciónintracelular de calcio. Livingstone y Sehachíer <1980) han propuesto una acción moduladoradei calcio sobre la dinámica lipídica de la membrana plasmática de hepatocitos de rata. Dichaaocidn parece llevarte a cabo mediante dos mecanismos que permiten al catión modificar lafluida lipídica:

DISCrISION i56

- Mecanismo directo: implicaría la unión del calcio a sitios aniónicos de la bicapa.Puede ser revertido en presencia de un exceso de EDTA.

Mecanismo indirecto: supondría la estimulación de ciertas enzimas ligadas amembrana y que alteran la composición lipidian de ésta. No es revenido por agentesquelantes como el EDTA.

Alternativamente,y puesto que la fluidez de la membrana podría modular funciones comopermeabilidad y actividades enziniáticas (por ejemplo la Ca’ ‘.ATPasa. Ohta et al., 1989),las alteraciones en la microviscosidad deberían dar lugar a su vez a un aumento de laconcentración intracelular de Ca’t

La complejidad de esta cascada de fenómenos hace que uno de los principales problemasradique en determinar si la peroxidación lipidica es una causa o una consecuencia de lasalteraciones de la membrana plasmática (Kappus, 1987).

Considerando las interrelaciones existentes entre la peroxidación lipídica, la concentraciónintracelular de calcio y la microviscosidad (Watondhe el aL, 1990) y puesto que tanto losradicales libres de O, como el calcio se acumulan en el hígado durante el shode(Fantone &War4 1982, Deaciuc & Spázer, 198?; SM¿ & alear, 1987), se puede postular que lasalteraciones de las propiedades (laico-funcionales de la membrana celular ocasionadas porradicales libres de oxígeno (y/o el LPS), juegan un papel fundamental en la citotoxicidad dela endotoxina, actuando el calcio acumulado como un amplificador de la alteración de lamembrana, que ha sido dañada por los radicales.

Según esta teoría, el oso de scas’engen conducirla a un mejor funcionamiento de losdistintos órganos afectados durante la endotoxicosis, como efectivamente ha sido comprobadopor distintos autores (RamMoto a al, 1987v Sugeno eral, 1087; Seekamp eraL, 1988).

255. Niveles de citocrorno b,.

La utilización del modelo la viet> mediante el tratamiento directo de hepatocitos en cultivocon LPS, ha permitido estudiar las alteraciones inducidas en los niveles de citocrorno b,, deforma paralela a lo realizado con el modelo de shock endotóxico reversible (Discasidn, apdo.1.3.).

Estos estudios ¡a sien vuelven a poner de manifiesto un aumento de los niveles de dichocitocromo a las 4 y 6 horas de incubación de las monocapas con la endotoxhta, no existiendouna relación de dependencia con la dosis empleada de LPS (Fig. 58). Existe, por tanto, unaacción directa sobre los hepatocitos.

Esta respuesta celular puede hacer referencia no sólo a una activación de los procesos dedestoxilicación, sino también a la necesidad de incrementar la reparación y remodelación dela membrana (Schenlonan etal, 1976; Nagí el al, 1983) que ha resultado parcialmente dañadatras el tratamiento con LPS <Discusión, apdo. 23.). Asimismo, el aumento de la biosíntesisde metabolitos relacionados con la respuesta inflamatoria (ácido araquidónico y sus

n,sr,,ctoN 151

derivados) podría relacionarse con el incremento observado de los niveles de citocromo b,(Cooka al, 1982).

Por otra parte, estudios ¡a ,~» han demostrado que la incorporación del citocromo b, ala cadena de electrones dependiente de NADPH, reduce la formación de H~O, (Gon~v &

Coon, 1986; Jansson & Schenlonan, 1987). U explicación dada por estos autores se basa enque el cisocronio 1,, proporciona electrones al complejo intermedio {O,-Fe’‘-citocromoP450-sustraso} más rápidamente que la NADPH-P450 oxidoreductasa. Mt la ausencia de b,,facilita la generación de un exceso de O~ y

1120r En consecuencia, los elevados niveles deeste citocromo desmallados tras eJ tratamiento ¡a itt> e ¡a itt> con LPS, podrían suponerun intento por parte de la célula de disminuir la produaión de radicales libres resultantesde un mecanismo activado de denoxificación NADPH-dependiente. Adicionahnente, dichaincorporación de citocromo b

5 a la cadena electrónica dependiente de NADPH. es activadapor cationes divalentes como el ca” <Tamunz a aL, 1990). El incremento de calcio inducidopor la endotoxina a nivel hepático (Discusión, apdo. 25.6) favorecerla el hecho de que elcitocrorno 1,, suplemente al 1>450 en los pro~os de destoxificación.

2.5.6. Homeosusia del calcio intracelular.

Algunas de las alteraciones metabólicas y funcionales producidas durante el shockendotóxico, han sido interpretadas como consecuencias de una acumulación de calcio enhígado y corazón de rata <Deaduc & Sp¡tzez ¡987). También se ha comprobado que laadministración de bloqueantes de Ca” (verapamil, nivadipina, nitrendipina), previa altratamiento con la endotoxina, produce en ratas una redueción dosis-dependiente de lamortalidad (Lee& Luna, 1986).

Los resultados obtenidos cras el tratamiento directo de hepatocitos en suspensión conendotoxina, indican que ésta produce un significativo incremento del contenido citosólico deCa” (Fig SOy Tabla 2?). Este incremento es directamente dependiente de la dosis y deltiempo de incubación con el 125. Todo ello concuerda con el aumento del contenido hepáticototal de calcio observado ¡a viso durante el shock endotóxico <Deaciuc & Spilza 1987) y conla acción protectora de los bloqueantes mencionados (Lee & Luna, 1986).

La concentración de Ca” cisosólico ms~ inferior a la extracelular, está mantenida pordistintos mecanismos que controlan el intercambio del catión con el medio extracelular asícomo con las reservas intracelulares (Rasmussen & &r~ ¡984). La existencia de esteimportante gradiente de concentración entre el exterior y el cisosol hace posible la generaciónde respuestas inmediatas ante estímulos extracelulares que desencadenan la entrada de dichocatión. Sin embargo, una elevación inapropiada de la concentración intracelular de calcio,como la producida por el LPS en los bepatocitos, puede producir graves alteracionesmetabólicas así como la activación dc procesos citolíticos (Faito’, 1081; bife a al, 1981;

CamfoU, 1982; BorneosaoL, 1986).

DZSCUSION isa

Estudios previos demostraron que el tratamiento de células del parénquima hepático conendotouina (lOOpg/ 10’ Pc/lOmin/ 37’C), incrementa la incorporación de “Ca” extracelularen más de un 20% respecto a la control, pudiendo relacionarse con alteraciones estructuralesy/o funcionales de la membrana plasmática, inducidas por el LPS (PofloMs, 1984). Noobstante, esta mayor incorporación del catión no puede justificar por sí misma el altocontenido citosólico observado con Fura-2, que es superior en un t~60% (lOmin/3rC) aldeterminado e, células control (Fig. 59).

Con el fin de conocer si la endotoxina producía una movilización de calcio de las reservasintracelulares, se llevaron a cabo ensayos con hepatocitos en cultivo tratados con 128 enpresencia y ausencia de calcio extracelular. Estos estudios demostraron que la endotoxinaincrementa la concentración citosólica de este catión aun cuando no esté presente en elmedio de incubación, siendo este aumento aproximadamente las 2/3 panes del efectoobservado cuando el medio de incubación posee Ca’’ <Tabla 28). Así pues debe existir unaimportante movilización de las reservas intracelulares dc Ca” inducida por el LPS tanto enhepatocitos en suspensión como en cultivo primario.

Dicha influencia parece claramente debida a una acción directa de la endotoxina sobrela célula, implicando la interacción con estructuras subeelulares. Mediante la técnica deinmunomarcaje con oro coloidal (LPS-proteina A.Au) y la posterior observación pormicroscopia electrónica, ha sido analizada la incorporación de endotoxina por los hepatocitos,desde su unión a la membrana plasmática hasta su penetración alcanzando orgánulossubcelulares <MunieL, el aL, 1990; Dlaz.Laviatla a al, 1991). Probablemente una interaccióndirecta del 1.PS con tnitocondrias y/o Tetículo endoplásnuico, podría perturbar losmecanismos de transporte a través de membrana implicados en la homeostasis del calcio(Seckereral, 1980) induciendo el aumento demostrado de la concentración citosólica de estecatión. A este respecto se ha asignado un importante papel a la bomba de Ca ATP-dependiente <Lowrey caL, 1981; Landó,, a cl, lOSÓ). Así, la disminución en los niveles deATP característica del shock, podría también colaborar al desarrollo de la dishomeostasis delcalcio intracelular.

Otro aspecto a tener en cuenta es la distinta respuesta de Pc y NPc frente al LPS en loque a la concentración intracelular de calcio se refiere. Estudios preliminares realizadosmediante citomesría de flujo ponen de manifiesto que los macrófagos de Kupffer tratados conLPS, sufren una elevación instantánea de los niveles citosólicot del catión, pero queinmediatamente se igualan con los valores control. Sin embargo, en los Isepatocitos laelevación de la (Ca’ ]~ se mantiene incluso a los 3Omin. siendo por tanto una respuesta nopuntual sino continua y progresiva a lo largo del tiempo (Figs. dOy 61>.

Esto se relacionaría con urs diferente mecanismo de incorporación del LPS por Pc y NPcya que en este último caso se ha propuesto un proceso fagocírico, que podría producir elinmediato incremento de la concentración intracelular de calcio dado el papel clave de estecatión en los procesos microtúbulo-depeodientes (EspinaL 1989).

Además, datos recientes sugieren que la exposición de macrófagos al LPS induce lahidrólisis de fosfatidilinositol hasta l.4.5-inositol.trifosrato (IP,> y diacilglicerot, conduciendo

n,Cn,Crn,~ 159

a un aumento de la [Ca”) y a la activación de la proteína quinasa C <WeieI a aL, 1984

PipieesaL, 1987). Ello explicarla también los resultados obtenidos con macrófagos hepáticos.Por otra parte, la peroxidación lipfdica consecuencia de unos niveles anormalmente

elevados de radicales libres de oxigeno <Discusión,apdos. 25.2 y lii.), parece alterar lahorneostasis del calcio <Cronensoen ce aL, 1989; Franceschi ti aL, 1990) posiblementedeterminando la fornsación de ionóforos que aumentan la incorporación de Ca’~ <Francesdile: aL, 19%). Taasbi&, se han observado en células del endotelio alteraciones morfológicasrelacionadas con un aumento de los niveles de calcio y que revierten con el uso de 500 ycatalasa. Dichas alteraciones morfológicas implican disminución del perímetro celular conadquisición de una tonta redondeada <Frnncssdd ti al, 1989) y han sido igualmenteobservadas en hepatocitos tras el tratamiento con 128 <Pagrani e aL, 7988>.

8e podría, portanto, pensar que el efecto de la endotoxina sobre la [Ca”] citosólico esté mediado, al menosparcialmente, por radicales libres de oxigeno.

El Ca” a su vez, alterarla el metabolismo celular hepático, mediante la activación deenzisnas catabólicas corno fosfolipasas, proteasas y endonueieasas, que pueden llegar aocasionarais daño celular irreversible <Nicosem eraL, 19A4~ Swke a aL, 1986).

Todo ello indica que los cambios ea la concentración intracelular de caldo podríanjustificar muchas de la. alteraciones inducidas por el LPS durante los procesos deendotoxicosis <McL4sh eral, 1989).

2.5.7.pH intracelular.

Los ensayos de determinación del pH~ han permitido comprobar que el 128 disminuyede fornia tiempo-dependiente el pH citoplasasático de hepatocitos en cultivo (Tabla 29).Esto concuerda con la lactoacidosis observada ¡a ,*o (Nish4bna eraL, 1973; Sclmnses 1983)(Discusión,apdo. 25/.) así como con los resultados obtenidos en los estudios de viabilidadrealizados con hepatocitos y la sonda fluorescente EPA <Disauión, apdo. 23,2).

En estas células, ha sido demostrado que un pH ácido suprime drísticamente laureogénesis y la gluconeogénesis, de tal modo que estas rutas no pueden ser estimuladas deforma efectiva por los principales reguladores hormonales <Kashiwagura a aL, 1985). Portanto y puesto que durante la endotoxicosis in itt> es inhibida la glticoneogénesis hepática

(F$lldns & Comnel4 1974). dicha inhibición podría estar relacionada con la acidificacióncitosólica inducida en los hepatocitos por una acción directa del LPS.

Por otra parte, pequeños cambios del pH~ también pueden tener un efecto importantesobre la concentración intracelular de AMI’,, de manera que la acidificación o alcalinización

intracelulares implicarían una disminución o incremento, respectivamente, de la actividad dela adenilato ciclan (Suso & Nuccke¡141984). Ello concuerda con la inhibición que el 11>8produce sobre la slntesis de AM?, y sobre la gluconeogénesis estimuladas por g)ucagón enhepatocitos <Pagani a aL, 1985).

fl7SflN~flN 160

Además, la [II’]. puede estar relacionada con el intercambio Ca ‘/11’ postulado para laCa

4-ATPasa <MinE es aL, 1982) El exceso de calcio citosélico comprobado en hepatocitostratados con LPS, podría dar lugar a una entrada excesiva de 1V extracelulares comoconsecuencia del intento por parte de la célula de disminuir la [Ca’ ‘1. Dehecho, en vesículas

endocíticas se ha postilado que la bomba de Ca’ puede regular el proceso de acidificacióny por tanto la ruta intracelular de ligandos y receptores (Nilña es aL, 1990).

También se ha observado que la acidificación del citoplasma celular reduce considerable-mente la endocitosis de transfenina y EGE mediada por tus receptores <Sandsdg eraL, 1987).Paralelamente, el LPS inhibe la endocitosis de la insulina (Discusión, ~o. 24.2), inhibicióna la que podría contribuir la disminución del pH, ahora puesta de manifiesto.

2.6. INTERACCION CELULAS NO PARENQUIMATOSAS (NPc) -‘ CELULAS

PARENQUIMATOSAS (Pc).

Los resultados de los experimentos realizados en este sentido, muestran que el medio deincubación de las NPc no altera la funcionalidad de las Pc puesto que se mantiene eltranspone de [“q-2-desoxíglucosaigual que en medio Williassss (Tabla .32).

Las NPc (Xc fundamentalmente) parecen secretar factores que determinan un aumentode la actividad extracelular de la (lOT en cultivos de hepatocitos <Tabla 30>. Dicho efectoes potenciado por la incubación de los macrófagos con LPS. lo cual confirma la activacióncelular inducida fa vivo por la endosoxina en tas células de Kupffer (Spiter er aL, 1900) ypuesta de manifiesto en los estudios de incorporación de f’C]-2.desoxiglucosa (D¡scuriñn,apdo. 24.1.) así como en los estudios referentes a la capacidad oxidativa (Discusión, apdo.25.2) y al calcio intracelular (Dúaoión, e4x¡o. 25.6).

No obstante, la influencia de los sobrenadantea de los osacrófagos de Kupffer sobre loshepatocitos, podría ser debida a la presencia conjunta de mediadores con el LPS y/o LPSmodificado por las Xc, ya que sobrenadantes obtenidos 48 horas después de un pulso (2h)con LPS (lOOpg/ml), no incrementan la actividad extracelular de (lOT en hepatocitus.También podría pensarse en una degradación de los mediadores secretados como causa deesta ausencia de efecto.

El efecto potenciador del LPS sobre la actividad extracelular de (lOT en hepatocitos, vadisminuyendo a medida que aumenta el tiempo de incubación LPS.NPc (Tabla 31): podríaser consecuencia de una metabolización progresiva de la endotoxina por las célulassinusoidales, lo cual determinaría una disminución de su capacidad inductora de secreciónde mediadores solubles. Esta metabolización ha sido demostrada en estudios Li sitio concélulas de Kupffer y, no obstante, no parece implicar destoxificación total de la endotoxina(Van Bosn{W, 1989).

OISCU¶ION 161

Por tanto, si bien se ha demostrado una acción directa de la endotoxina sobre Pc y N?c,

la interacción entre las distintas poblaciones celulares hepáticas sigue siendo un punto daveen la instauración y desarrollo de los estados de endotoxicosis.

SIIOCK ENDOTOXICO

eMEDIADORES—.- LPS -.---——..-HIPOXIA

$RADICALES ItERES OB OX CENO

PEROXIDACION UP O CA

ItAlTERAdOS OB Ei~ BRASA

itOEsTOXtFtCActoN

C. PARENQUIMATOSA

LOL

Ca

INSULINA — PROT. FASE ACUDA 1

SALES BILIARES

Lfl.LrS ~ 1 ‘1LPS

7 \LpLPS . LPSX

LPS A””

ri

MEOLADORES

RADIcALES UBREs

EatrM ondatía

C. ENDOIBUAI.C. KUPFFER

V. CONCLUSIONES.

La acción de las endoroxinas bacterianas sobre el h~ado ha sido investigada en el presentetrabajo utilizando los siguientes modelos experimentales:

a) Inducción de un estado de shock endotádco rewnibte en ratas mediante laadministraesón ¡a vivo del lipopolisacárido de Scott 0111:B4 (LPS).

b) Tratamiento directo bu viern de distintos tipos celulares hepáticos (hepatocitos y

macrófagos de Kupffer) en suspensión y en cultivo con dicho lipopolisacirido. asícomo el tratamiento de las células del parésíquin~a con sobrenadanres de célulassinusoidales.

Los resultados obtenidos con ambos modelos, os viw, eh, viern, conducen a las conclusionesque se detallan a continuación.

1. Acción del LPS la túo:

11 La actívidad de la enzima superóxido disniutasa disminuye en el hígado durantela faseagudadel shock (4-Oh) como respuesta al estrás oxidante, aumentando en lafasederec¿q’emci¿in(24.72h).

1.2. La peroxidación lipIdies hepática assxnenta como consecuencia de la producciónde radicales libres de oxígeno de la fiare aguda, disminuyendo en la fase derecuperación.

13. Los niveles de choca-orno b1 en el hígado se elevan notablemente a las 4-6 horas

de la inyección del LPS, reviniendo el efecto a las 24 horas del tratamiento,

Todo ello indica una participación adiva de los mecanismos de producción de radicaleslibres y peroxidación lipidies en la alteración hepática, así como la importancia de losmecanismos de destoxificación y remodelación de membranas en la respuesta al shock. Los

esperinseolos ¡a .‘ñ’o no pernfllen diferenciar eníre acción directa o indirecta del LPS, por loque se analizó la acción del 128 bu vian.

Cfl >jrr r ‘c’nMrv 1Cs4

2. Acción del 12$ bu

2.1. El LPS ejerce su acción sobre el lsígado de forma directa en los siguientes

aspectos:

2.1.1. Morfología celular: se ha comprobado que la incorporación de laendotoxina (técnicas isotópicase inmunocitoquimicas)en ctlulassinusoidalesenriquecidas en macró!agos de Kupffer origina la aparición de alteraciones

estructurales relacionadas con una rápida activación celular.

2.1.2. Propiedades físicas de la membrana plasmática: la integración del LPSen la membrana induce un incremento de su microviscosidad, tanto en lazona externa como en el interior de la bicapa y el efecto es dependiente dela temperatura. Las alteraciones producidas por la endotoxina sobre la

membrana plasmática favorecen la liberación de LUHal medio extracelular,así como la incorporación de la sonda EVA.

2.13. Unión de ligandos: la interacción insulina-receptor y LDL-receptorseve dificultada como consecuencia de la preincubación de las células con

endotoxina, apreciándose en el primer caso una disminución de la

internación mediada por receptor y en el segundo un incremento de laincorporación inespecifica del ligando.

2.1,4. Actividades enzimáticas: a actividad intracelular de la enzimaglucoquinasa sc ve incrementada tras tiempos largos de incubación con el

12$. Sin embargo, la fosfatasa ácida. enzima marcadora de lesión lisosomal,no experirnerita variación de su actividad como consecuencia del tratamientodirecto de los hepatocitos con endotoxina.

2.1.5. Superóxido dismutasa y peroxidación lipídica: la disminución de laactividad hepática de la 50V observada bu vivo (fase aguda del shock) yrelacionada con una mayor producción de radicales libres de oxigeno, implicala contribución no sólo de los macrófagos de Kupffer sino también de lascélulas del parénquima, puesto que el tratamiento directo con LPS bu viernincrernenta la capacidad oxidativa de las células no parenquimatosas ydisminuye la actividad de la SODen las parenquimatosas. Ello ademásparece ser la causa del incremento paralelo de los procesos dc peroxidaciónlipidies que ha sido comprobado igualmente tras tratamiento it. vivo e bu vinocon endotoxina.

CONCLUSIONES 165

21.6. Niveles de citocromo b, durante la fase aguda del shoek endotóxicoreversible se ven incrementados notablemente, al igual que ocurre tras eltratamiento directo de las células parenquimatosas con 1.25. Ello podríacorresponder a un intento por parte de la célula de reparar las alteracionesproducidas en la membrana plasmática y de potenciar el transponeelectrónico raicrosomal necesario en los procesos de destoxiflcación,alterados por la disminución de los niveles de citocromo P450.

2.1.7. Calcio citosólico: el LPS induce un aumento notable de sus niveles enlos hepatocitos como consecuencia de un incremento de la incorporación decalcio extracelutar y de una movilización activa de las reservas intracelulares.Ello concuerda con el actmuio hepático de este catión durante los estadosde endotoxicosis.

2.1.8. pH intracelular: el ¡PS disminuye el pH de los hepatocitos pudiendoalterar con ello numerosos procesos metabólicos celulares y relacionándose

este efecto directo con la acidosis metabólica característica del shock ‘a tao.

2.2. Las distintas poblaciones celulares hepáticas responden de latina diferente anteel LPS:

2.2.1. El incremento de la microviscosidad producido en la membranaplasmática tras la interaceidtx con la endotoxina es mucho más evidente encondiciones no lluidificantes (temperatura baja, zona externa de la bicapa.membranas con elevado contenido en esfusgomielina). Ello determina uncomportamiento diferente de las células parenquimatosas y noparenquimatosas. En éstas sedebe considerar ademásun aumento de fluidezproducido durante el proceso de fagocitosis del LPS por los inacrófagos de

Kupffer.

2.2.2. La endotoxina activa específica y rápidamente el metabolismo celularde los macrófagos hepáticos, de manera que a dosis bajas induce unincremento de la incorporación de Q’C]-2-desoxigjucosa y de la intensidad

de fluorescencia procedente de la hidrólisis del FDA por esterasascitoplasmáticas. Sir. embargo, en los hepatocitos la acción del LPS sobreestos parámetros produce el efecto contrario.

rnMrr rrvrnajrc 1 M

2.3. Existen diversos compuestos que modulan la respuesta celular hepática frenlea la endotoxina:

2.3.1.Las sales biliares, posiblemente por una interacción con las moléculasde lipopolisacárido, anulan los efectos de éste sobre la microviscosidad dela membrana plasmática.

2.3.2.Las lipoproteinas (MDI.. [DL) que pueden formar complejos establescon el LPS, determinan un comportamiento especial de la endotoxina sobrelos procesos de unión de las lipoproteinas a sus receptores celulares.

2.3.3. Factores secretados por cultivos enriqbecidos en células de K»ptfermodulan el metabolismo celular de los hepatocitos, aumentando la actividadextracelular de GOT en estos últinsos, sobre todo tras el tratamiento de losmacrófagos con 1.25.

Los diferentes aspectos analizados en el presente trabajo aportan nuevos datos para elesclarecimiento de los mecanismos primarios de acción de los lipopotisacáridos bacterianosy apoyan el uso de cultivos celulares como modelo experimental para el estudio de las bases

moleculares de la compleja fisiopatología del shock endotóxico.

167

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