UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

IZTAPALAPA

Servicio Social

"Efecto del cloruro de mercurio sobre la respiración

mitocondrial en la línea celular hepática fetal humana WRL-68"

Norma Edith López Díaz-Guerrero

México, D.F. 1998

. * "Efecto del cloruro de mercurio sobre la respiración mitocondrial en la linea

celular hepática fetal humana WRL-68"

1. INTRODUCCION

1.1 EL MERCURIO Y SUS USOS

El mercurio es un elemento metálico de transición, a temperatura ambiente es un

liquido de color blanco plata, con peso molecular de 200.59, que forma compuestos

monovalentes y divalentes (Microsoft Encarta, 1995). Se encuentra en el lugar 67 de

abundancia en la corteza terrestre y es liberado a la atmósfera en cantidades menores

a una parte por billón. El ciclo natural de circulación del mercurio en la tierra

P :y;\ dispersa a este metal a través de las esferas habitables en cantidades traza que no

ponen en peligro a la vida (Goldwater, 1971). Sin embargo el mercurio elemental e

inorgánico es utilizado en la industria del cloroálcali y en la manufactura de equipo

..',\, eléctrico y cientifico, preparación de amalgamas dentales, catálisis y explosivos (von

I - C 2 desechada a los ríos, mares v atmósfera, entrando al ambiente en tres formas

p Burg, 1995). Como consecuencia del amplio uso de este metal, una gran cantidad es I

'Y i 3 &- posibles: mercurio elemental, sales de mercurio y compuestos organonlercuriales. c iT - 1

4 2 3+ 1.2 BIOMAGNIFICACION DEL MERCURIO i

'U Q El mercurio es un metal persistente y el Único para el que hay evidencia de 3 5 Ln .* -%- J biomagnificación general (Bryan, 1984), esto significa que cuando se encuentra en la - ; & atmósfera el mercurio se deposita en el agua y en el suelo. Algo del mercurio

depositado sobre la tierra se absorbe por l a materia orgánica siendo los musgos y las

2 5 bacterias quienes lo transforman de mercurio inorgánico a metilmercurio lo que

2 -;Z resulta en una fuente continua de mercurio para corrientes y lagos por largos

.J periodos de tiempo, acumulándose tanto el mercurio orgánico como el inorgánico en i ) c 3 E algas y peces. .J>'

x $

, t 9

,J Este metal es tóxico para los microorganismos, plantas, invertebrados y vertebrados,

en donde las formas orgánicas son generalmente más dañinas que las inorgánicas

(von Burg, 1995), particularmente la forma metilada del mercurio es tóxica para los

organismos trófkos superiores (Burger et al., 1992). Los resultados de algunas

investigaciones sugieren que los efectos tóxicos del metilmercurio son debidos a su

capacidad de atravesar más fácilmente las membranas biológicas que el mercurio

inorgánico.

Se han realizado relativamente pocos estudios sistemáticos del efecto del mercurio

Hg(II) inorgánico, sin embargo el efecto de este es similar a los compuestos

mercuriales orgánicos (Weinberg et al., 1982). I& 999'87 rr) S

La ingestión de alimentos contaminados con mercurio, particularmente alimentos de

especies acuáticas son la fuente primaria de exposición humana no ocupacional al

mercurio y han conducido a episodios catastróficos de intoxicación (Konigsberg,

1998), como el sucedido en 1956 en la bahía de Kiushu en Minamata, Japón, donde

muchas personas murieron por envenenamiento al consumir pescado contaminado.

Ante este tipo de sucesos se han acumulado un gran número de datos

epidemiológicos, clínicos y patológicos por intoxicación con metilmercurio (Miura et

al., 1987).

1.3 VIAS DE ABSORCION, EXCRECION Y DISTRIBUCION DEL MERCURIO

El mercurio penetra en el cuerpo humano a través de varias puertas de entrada: es

absorbido por vía digestiva, por la piel, y por inhalación. Los principales órganos

blanco del cloruro de mercurio son el riñón, el sistema nervioso central y el hígado.

Oservándose que en el hígado fetal y la placenta se acumula en concentraciones

mayores (Ashour et al., 1993).

La mayor parte del mercurio iónico es excretado en las heces, la orina, las glándulas

salivales, las glándulas mamarias y la bilis (von Burg, 1995).

Con respecto a la distribución subcelular del mercurio, se ha reportado que el

metilmercurio que se acumula en el cerebro se encuentra en la mitocondria, el

reticulo endoplásmico, el complejo de golgi, la envoltura nuclear y los lisosomas

(Atchison et al., 1994). Omata y col. (1986) reportaron que el metilmercurio se

distribuye principalmente en los lisososmas, los microsomas y las mitocondrias en

hepatocitos de rata, alterando una amplia variedad de procesos celulares y

bioquímicos (Bucio et al., 1995). Nakada e Imura (1983), demostraron que el mercurio

inorgánico reacciona con los dobles enlaces de residuos de ácidos grasos en

fosfolípidos, irrumpiendo primero sobre la función de la membrana plasmática y

moviéndose hacia el interior de las células inhibiendo las funciones celulares.

1.4 EFECTOS CITOTOXICOS DEL MERCURIO

El metilmercurio reacciona por inhibición no competitiva con los grupos sulfhidrilo

presentes en algunos sitios activos de algunas enzimas de la membrana celular, ya

sean óxido-reductoras o de transporte, alterando la distribución de iones y cambios

de potencial eléctrico (Byczkowski et al., 1984). En general, el mercurio interfiere con

la síntesis de proteínas afectando también las funciones de la membrana y el

citoesqueleto (Lachapelle et al., 1993). La síntesis de ADN parece también ser un

blanco primario de la citotoxicidad del cloruro de mercurio (Choi et al., 1984).

1.5 EFECTOS DEL MERCURIO SOBRE LA MITOCONDRIA -: n . I

Se ha demostrado que el mercurio inhibe la respiración de las mitocondrias (Inskip et c;; 8 " c. .;I

al., 1985), esto último es importante puesto que todos los seres vivos utilizan dicho 5 '' 2 5 proceso para generar energía metabólica y posteriormente utilizarla para sintetizar el - . -4 i7

ATP requerido para el crecimiento y mantenimiento de múltiples funciones celulares. o

Se ha encontrado que los metales pesados como el mercurio, pueden inhibir oxidasas y !,, T i,)

específicas así como deshidrogenasas, pueden interrumpir y disminuir también la 4 r; 5 2.

fosforilación oxidativa en mitocondria (Omata et al., 1985). Santos y col. (1997) ir .. ( 3 r:;

encontraron in vivo que la presencia del cloruro de mercurio en mitocondria produce

una condición de estrés oxidativo caracterizado por un incremento de

lipoperoxidación y oxidación de las proteínas, así como un cociente disminuido de

GSH/GSSG paralelo a la reducción en la actividad de enzimas del ciclo redox.

El principal efecto tóxico del Hg(1I) surge de las alteraciones en l a integridad

estructural de la membrana interna mitocondrial del riñón de la rata, resultando en la

pérdida de la selectividad normal para cationes, a su vez la cadena respiratoria y las

ATPasas son directamente inhibidas por especies reactivas de oxígeno (Santos et al.,

1997).

Palmeira y col. (1997) reportaron que el cloruro de mercurio promueve una fuerte

perturbación de l a bioenergética mitocondrial en hepatocito de rata, deprimiendo el

:-I1 P c'

IT

"7

estado 3 de la respiración, estimulando el estado 4 y disminuyendo el potencial de

membrana de la mitocondria causando una acción desacoplante. Sone y col. (1984)

reportaron que el transporte de electrones en membrana interna mitocondrial en el

hepatocito de la rata es inhibido por el cloruro de metilmercurio, entre las flavinas

del NADH o succinato-deshidrogenasa y el citocromo b, siendo la fosforilación la

función mitocondrial más afectada. Durante un estudio de citotoxicidad con Hg(1I)

Santos y col. (1997), encontraron que con una concentración de 5 uM de Hg(II), se

afectaba la respiración mitocondrial in vitro, estimulando el estado 4 de la respiración

y disminuyendo l a relación ADP/O, desacoplando así la fosforilación oxidativa. De

manera similar, el cloruro de mercurio a bajas concentraciones suprime la

fosforilación oxidativa en mitocondria aislada de riñón de rata y afecta el

acoplamiento de síntesis de ATP (Southard et al., 1973).

Aunque se han realizado algunos estudios bioenergéticos sistemáticos, estos no son

suficientes (Palmeira et al, 1997), por lo que en el presente trabajo fue de interés

conocer el efecto del cloruro de mercurio sobre la respiración mitocondrial en una

línea celular.

Se usó la línea celular hepática fetal humana (WRL-68) debido a que Gutiérrez y col.

(1994) demostraron que mantiene muchas características de las células hepáticas in

vivo y que por lo tanto son un modelo sensible y una herramienta útil en la

investigación del mecanismo de toxicidad de metales pesados como cadmio y

mercurio (Bucio et al., 1995).

2. OBJETIVO GENERAL

Cuantificar el efecto del HgC12 sobre la respiración en las mitocondrias aisladas de la

línea celular WRL-68.

2.1

2.1.1

2.1.2

2.1.3

2.1.4

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Montar la metodología para aislar mitocondrias activas de la línea celular

W RL-68.

Cuantificar la proteína en cada uno de los pasos del proceso de aislamiento

mitocondrial por el método de Lowry (Lowry, 1951).

Cuantificar el consumo de oxigeno utilizando sustratos d e sitio I e inhibidores

específicos de la cadena respiratoria mitocondrial, de las mitocondrias aisladas

de la linea celular WRL-68 obtenidas de las células tratadas con 5 uM de HgC12

y d e las células control.

Cuantificar el consumo de oxigeno, con sustrato de sitio I1 estimulado con

ADP en presencia de un inhibidor de la fosforilación oxidativa en las

mitocondrias aisladas de la linea celular WRL-68, de las células tratadas con

5uM de HgCl2 y de las células control.

3. METODOLOGÍA

LINEA CELULAR 2 2 2 5 0 7 Las células WRL-68, se obtuvieron del Laboratorio de Fisiología Celular de la

División de Ciencias y de la Salud (UAM-Iztapalapa), las cuales se mantuvieron en

medio esencial Dulbecco (DMEM) con suplemento del 8% de suero de bovino

(Hyclone, Logan, UT, USA), 1% de aminoácidos no esenciales, 100 U/mL de

penicilina y 100 ug/mL de estreptomicina. El medio se reemplazó cada 2 días y a las

células se les tripsinizó y diluyó durante 5 veces cada siete días. Las células crecieron

a 37" C, en una atmósfera con 95% aire y 5% dióxido de carbono.

CELULAS TRATADAS CON CLORURO DE MERCURIO

Las células tratadas se selnbraron de igual forma que las células control, y después

de 48 horas, el medio se suplementó con 5 uM de cloruro de mercurio y se incubaron

por 1 hora.

3.1 Aislamiento mitocondrial.

Debido a que no se tenía un método establecido y montado para el aislamiento

mitocondrial se probaron 5 metodologías, escogiéndose aquella cuyos resultados

fueran los más satisfactorios.

Metodo 1

1. Las células WRL-68 se utilizaron posterior a un cultivo de 24 horas con medio

esencial modificado de Dulbecco (DMEM). Se emplearon 5 cajas de cultivo celular.

2. Al cabo de este tiempo, se desechó el DMEM y se lavaron las células con 500 UL de

una solución de Sacarosa 0.25 M+Tris 10 mM., pH 7.4.

3. Se volvió a desechar la solución y se les agregó otros 200 UL de medio.

4. Se abrieron las cajas con un cuchillo y se rasparon las células con un gendarme de

goma para obtener las células.

5. Este homogenado celular se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min a 4" C y el

botón se resuspendió con 2 mL de medio de Sacarosa 0.25 M+Tris 10 mM., pH 7.4

6. Se sonicó con 5 pulsos de 30 seg cada uno con descanso de 1 min entre cada serie

para romper las células; se observó al microscopio que las membranas plasmáticas

estuvieran rotas.

7. Las células rotas se centrifugaron a 2750 rpm por 10 min a 4°C.

8. El sobrenadante se centrifugó a 12500 rpm por 10 min a 4" C y el botón (fracción

mitocondrial) se resuspendió con 1.5 mL de Sacarosa 70 mM+Manitol 220

mM+TEA 5 mM, pH 7.4.

9. En cada uno de los pasos durante el aislamiento de mitocondrias, se tomaron

alicuotas de 50 UL para la prueba de Lowry de las siguientes fracciones:

A. Botón celular resuspendido después de centrifugar a 3000 rpm 10 min a 4OC.

B. Botón celular resuspendido y sonicado.

C. Sobrenadante después de centrifugar a 2750 rpm por 10 min a 4°C

D. Botón resuspendido después de centrifugar a 2750 rpm por 10 min a 4OC y

desechado.

E. Sobrenadante después de centrifugar a 12500 rpm 10 min a 4OC y

desechado.

F. Botón resuspendido después de centrifugar a 12500 rpm 10 min a 4°C.

Método 2

1. Se realizaron los mismos pasos que en el método 1, excepto que se sonicó con 5

pulsos de 30 seg cada uno con descansos de 1 min entre cada serie, posteriormente

se introdujeron las células en nitrógeno líquido para ocasionar rompimiento de las

membranas plasmáticas por choque térmico.

Método 3

1. Se realizaron los mismos pasos que en el método 1, pero para el rompimiento de

las membranas celulares se sonicó la muestra con 6 pulsos continuos de 1 min cada

uno con descansos de 2 min entre cada serie.

Método 4

1. Las células WRL-68 se utilizaron posterior a un cultivo de 24 horas con medio

esencial modificado de Dulbecco (DMEM).

2. Al cabo de este tiempo, se desechó el DMEM y se lavaron las células con 500 UL de

Las células WRL-68 se utilizaron posterior a un cultivo de 24 horas con medio una

solución de Sacarosa 250 mM, HEPES 5 mM y EGTA 1 mM (SHE) a pH 7.4.

3. Se volvió a desechar la solución y se agregaron 200 uL de medio SHE.

4. Se abrieron las cajas con un cuchillo y se rasparon las células con un gendarme de

goma para obtener las células.

5. Se centrifugó a 3000 rpm 10 min a 4°C y el botón se resuspendió con 2 mL de

medio SHE.

6. Se tituló el homogenado con 0.01 % de digitonina, dejando incubar por 15 min en

baño de hielo con agitación constante y se observó al microscopio invertido para

asegurarse de que hasta un 70 % de las células tuvieran rotas sus membranas

plasmáticas, cuando el porcentaje de células rotas era menor, se les agregaba otro

0.01% de digitonina hasta lograr la ruptura deseada.

7. Las células rotas se centrifugaron a 2750 rpm por 10 min a 4°C , el botón se

resuspendió con 2 mL de SHE.

8. Se centrifugó a 10000 rpm por 10 min a 4°C y el botón se resuspendió con 2 mL de

SHE.

9. Se centrifugó una vez más y el botón se resuspendió en 1.5 mL de SHE+albúmina

O.l%+ADP 1mM.

10.En cada uno de los pasos durante el aislamiento de mitocondrias, se tomaron

alícuotas de 50 UL para la prueba de Lowry de las siguientes fracciones:

A)Botón resuspendido después de centrifugar a 3000 rpm por 10 min a 4°C.

B) Homogenado con digitonina 0.01% e incubado 15 min.

C)Sobrenadante después de centrifugar a 2750 rpm por 10 min a 4°C.

D)Botón resuspendido después de centrifugar a 2750 rpm por 10 min. a 4°C y

desechado.

E) Sobrenadante después de centrifugar a 10000 rpm 10 min a 4°C y

desechado.

F) Botón resuspendido después de centrifugar a 10000 por 10 min a 4°C.

G)Sobrenadante después de centrifugar a 10000 rpm por 10 min a 4°C y

desechado.

H)Botón resuspendido después de centrifugar a 10000 por10 min a 4°C.

Método 5

1. Las células WRL-68 fueron utilizadas posterior a un cultivo de 24 horas con medio

esencial modificado de Dulbecco (DMEM). Se emplearon 5 cajas de cultivo celular.

2. Al cabo de este tiempo, se desechó el DMEM y se lavaron las células con 500 UL de

solución de Sacarosa 250 mM, HEPES 5 mM y EGTA 1 mM (SHE), pH 7.4.

3. Se volvió a desechar la solución y se agregó otros 200 UL de medio SHE.

4. Se abrieron las cajas con un cuchillo y se rasparon las células con un gendarme de

goma para obtener las células.

5. Se centrifugó a 3000 rpm por 10 min a 4 C y el botón se res-uspendió con 2 mL de

SHE.

6. El botón se resuspendió en 2 mL de medio SHE.

7. El homogenado se tituló con 80 UL de Digitonina (0.2%) en frio, se incubó durante

15 min.

8. Al término se observó otra muestra al microscopio para asegurarnos de que hasta

un 70 % de las células tuvieran rotas sus membranas plasmáticas.

9. Al honlogenado se le agregó 2 mL de medio SHE y centrifugó a 5000 rpm por 5

nlin a 4°C.

10.E1 botón se resuspendió con 2 znL de medio SHE y se centrifugó a 2100 rpm, 5 min

a 4°C esto último se realizó en tres ocasiones, recolectando cada vez los

sobrenadantes.

11.El recolectado se centrifugó a 10000 rpm por 10 min a 4°C.

12.E1 botón se resuspendió e incubó por IO minutos con 2 mL de medio SHE-

albúmina 0.1%-ADP lmM en baño de hielo.

13.Pasado ese tiempo se agregaron 2 mL de medio SHE y se centrifugó a 8500 rpm

por 10 min a 4 C.

14.E1 botón final (fracción mitocondrial) se resuspendió con 1 mL de medio SHE.

15.En cada uno de los pasos durante el aislamiento de mitocondrias, se tomaron

alícuotas de 50 UL para l a prueba de Lowry de las siguientes fracciones:

A. Botón celular resuspendido después de centrifugar a 2750 rpm por 10 min a

4°C. 2 2 2 5 0 7 B. Botón resuspendido después de agregar 0.2% de digitonina e incubado por

15 min, después de centrifugar a 5000 rpm por 5 min a 4°C.

C. Sobrenadantes de 3 centrifugaciones a 2100 rpm por 5 min a 4°C cada uno.

D. Botón resuspendido después de centrifugar a 2100 rpm por 5 min a 4°C y

desechado.

E. Sobrenadante después de centrifugar a 10000 rpm por 10 min a 4OC y

desechado.

F. Botón resuspendido después de centrifugar a 10000 rpm 10 min a 4°C e

incubado con SHE+Albúmina+ADP.

G.Sobrenadante después de centrifugar a 85000 rpm 10 min a 4°C y

desechado.

H. Botón resuspendido después de centrifugar a 85000 rpm 10 min a 4°C.

Con este método se obtuvieron los mejores resultados, y por lo tanto es el que se

utilizó para llevar a cabo los experimentos del efecto del cloruro de mercurio sobre

la respiración de las células WRL-68.

3.2 Determinación de proteínas.

1) La determinación de proteínas se realizó por el método de Lowry (Lowry, 1951)

utilizando una curva estándar con albúmina de suero de bovino (BSA) como

referencia y fueron leídas en un espectrofotómetro a 500 nm.

3.3 Consumo de oxígeno.

Se cuantificó el consumo de oxígeno de las mitocondrias aisladas de las células

control y tratadas con un electrodo tipo Clark en una celda cerrada a temperatura

ambiente (Estabrook, 1967).

El medio de reacción para todos los experimentos contenía sacarosa 230 mM, TEA

lOmM, fiP0.I 5 mM, MgC12 3 mM pH 7.4, más 0.5 mL de suspensión mitocondrial y

el agua necesaria para obtener un volumen final de 3 mL.

Se realizaron 2 tipos de experimentos:

1. Expmimlzto con inhibidores de la cadena respiratoria. Se cuantificó el consumo de

oxigeno utilizando como sustrato de sitio I y 11,5 mM de glutamato-malato pH 7.4

y succinato pH 7.4, respectivamente. Como inhibidor de sitio I se utilizó 1 ug/mL

de rotenona y como inhibidor de sitio 111 0.83 mM de KCN. SE agregó también

1mM de ADP para estimular la respiración

2. Experilrrento con zltz irzlzibidor de la ATP sitztetasn. Se cuantificó el consumo de

oxigeno utilizando como sustrato del sitio I1 a 5 mM de Succinato pH 7.4,

estimulado con 1 mM de ADP en presencia de 1 ug/mL de oligomicina.

En el método 1 se observó una muy baja respiración, debido tal vez a que cuando se

hizo l a ruptura de membrana con sonicación de 5 pulsos de 30 seg cada uno, ésto no

fue suficiente.

En el método 2, se observó una respiración casi nula, causado posiblemente por un

rompimiento tan grande de las células que hasta las membranas de los organelos

sufrieron daño.

Con el método 3, se observó una respiración lenta pero sí sensible a sustratos e

inhibidores.

En el método 4, se obtuvo una mejor respiración, sin embargo no eran sensibles a

inhibidores, debido tal vez a que no se lavaron suficientemente las mitocondrias

después de poner la digitonina para el rompimiento de las células.

En el método 5, se observó una respiración mitocondrial sensible a sustratos e

inhibidores, debido posiblemente a que se hicieron lavados consecutivos y

suficientes, así como una incubación por 10 minutos con mrdio SHE-albúmina 0.1%-

ADP posterior al rompimiento de membranas con digitonina (Gráfica 1).

3.4 Análisis estadístico.

Se utilizó la prueba t de student con un nivel de significancia de p< 0.05, para la

evaluación estadística de los valores de todos los experimentos.

4. ACTIVIDADES REALIZADAS

Las actividades fueron desarrolladas en el Laboratorio de Bioenergética (S-251A) y

en el Laboratorio de Fisiología Celular (S-361), ambos de la División de Ciencias

Biológicas y de la Salud de la UAM-Iztapalapa y se realizaron de acuerdo a lo

planeado:

4.1 DURACION Y ETAPAS

Marzo

Revisión Bibliográfica.

Análisis de Resultados.

X Trabajo Experimental.

de LowryLowry.

x Estandarización de la técnica

X Manejo de Aparatos.

X Preparación de soluciones.

X

Elaboración de Informe Final.

Julio 1 Agosto Sept. I

I I X

X

5. OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

1. Se montó la mejor metodología para aislar mitocondrias activas de l a línea celular

WRL-68.

2. Se cuantificó la cantidad de proteína en cada uno de los pasos del proceso de

aislamiento mitocondrial por el método de Lowry (Lowry, 1951).

3.

a) Se cuantificó el consumo de oxigeno utilizando sustratos e inhibidores de la

cadena respiratoria.

b) Se cuantificó el consumo de oxigeno utilizando un inhibidor de la

ATPsintetasa.

6. RESULTADOS

6.1 Aislamiento mitocondrial.

El aislamiento mitocondrial realizado por el método 1, a pesar de obtener proteína

mitocondrial, se midió un consumo de oxigeno lento. Lo que indica que la sonicación

no fue suficiente, obteniendo en la determinación de proteínas y consumo de

oxígeno, un aparente buen rendimiento pero una muy baja respiración

respectivamente como se aprecia en la tabla 1.

En el método 2, cuando se hizo la ruptura de membrana con sonicación de 5 pulsos

de 30 seg cada uno y choque térmico con nitrógeno líquido, los resultados indican un

rompimiento tan grande que sufrieron daño las membranas de los organelos,

mostrando una determinación de proteína alterada y una respiración nula (tabla 1).

Con el método 3, al hacer la ruptura de membrana con sonicación de 6 pulsos de 1

min cada uno con descanso de 2 min entre cada pulso resultó ser menos perjudicial

teniendo proteína mitocondrial, sin embargo presentó un consumo de oxígeno

disminuido (tabla 1).

En el método 4, la utilización de 0.01% digitonina para el rompimiento de las

membranas celulares y el cambio de la solución amortiguadora, dieron mejores

resultados a diferencia de los métodos anteriores, con obtención de proteína

mitocondrial y una mejor respiración , sin embargo la preparación obtenida no era

sensible a inhibidores, debido tal vez a que no hubieron lavados suficientes después

de poner la digitonina a las células continuando ésta con el rompinliento de las

membranas (tabla 1).

En el método 5, en el aislamiento se utilizó una solución de Sacarosa 250 mM,

HEPES 5 mM y EGTA 1 mM (SHE) como amortiguador, se estandarizó el

rompimiento de las membranas plasmáticas con digitonina calculado un 0.2%, se

realizaron lavados consecutivos y suficientes, así como una incubación por 10

minutos con medio SHE-albúmina O.l%-ADP, se logró obtener proteína mitocondrial

y respiración sensible a sustratos e inhibidores (tabla 1). Por lo que se eligió este

método para aislar las mitocondrias de células tratadas y control.

Método Consumo de oxígeno Proteína mitocondrial

(mg/mL)

1

Sensible a inhibidores 1.96kO. 6 5

No sensible a inhibidores 3.31f1.0 4

Disminuido 6.11k0.9 3

No se registró 8.86H.8 2

Disminuido 3.13f0.8

Tabla 1. Relación entre cada uno de los métodos para el aislamiento mitocondrial en

cuanto a su rendimiento en la obtención de proteína mitocondrial y el consumo de

oxígeno.

6.2 Determinación de proteína.

Método Proteína de extracto Proteína del

homogenado celular mitocondrial

tmg/mL) tn1g/mL)

1

1.96k0.6 4.58f0.8 5

3.31k1 8.29f1.2 4

6.11k0.09 7.54f1.3 3

8.86k1.8 14.72+2 2

1.99k0.6 3.13k0.8

Tabla 2. Relación entre los diferentes métodos para el aislamiento mitocondrial y el

rendimiento en la obtención de proteína total y mitocondrial.

Proteína de homogenado celular

4.84k1.2 mg/mL Proteína de extracto mitocondrial

10.54k1.5 mg/mL

Tabla 3. Determinación de proteína en células incubadas 48 h, utilizada en los

experimentos de respiración.

Se utilizó en los experimentos 5uM de HgC12, teniendo como referencia el trabajo

realizado por Bucio et al. (1995), en el que determinaron que se apreciaba un efecto

sobre la mitocondria al utilizar ésta concentración.

Consumo de oxígeno -

Se realizaron 5 series de experimentos para las mitocondrias control y para las

tratadas con HgC12 5uM:

Expmirfrento con slrstrntos e inhibidores de In cndenn respiratoria. 2 2 2 5 0 7 Control

(natomog/min/mg proteína) (natomog/min/mg proteína)

HgC12 5 UM

Glu-mal

1.36k0.067 1.92-tO.83 ADP

1.3620.067 1.92-tO.83

Rotenona 10.74.+0.40 10.64k0.16

Succinato I2.89-tl.17 13.57k3.33

KCN l o l o I I

Tabla 4. Consumo de oxígeno de mitocondrias aisladas con sustratos e inhibidores de

la cadena respiratoria.

En la respiración con inhibidores de la cadena respiratoria, aunque se ve una

disminución en el consumo de oxigeno en las células control en comparación con las

células tratadas, este no es diferente significativamente (Fig. 1)

CONSUMO DE OXIGENO CON INHIBIDORES DE LA CADENA RESPIRATORIA

S L U - M A L

5.9 natomogo, 1 - 1 rnin

- Mitocondrias control

- - - Mitocondrias tratada5 con HgCI, 5 uM

Contr

HgCl 'O I

2 5uM

Glu- Rotenona Succinato KCN mal+ADP

Fig. l. Consumo de oxigeno de mitocondrias tratadas con HgCI, 5uM y control. El medio de reacción fue sacarosa 230mM, TEA 10 mM, fosfato lOmM, MgCI, 3mM a pH 7.4, aprox. 0.5 mg/mLde suspensión de mitocondrias en un volumen final de 3 mL. Se usó como sustrato de sitio I , activadordel estado 3 e inhibidor de sitio I a glu-mal 5mM, ADP 1 OOuM y rotenona 1 ug/mL respectivamente y sustrato de sitio I I e inhibidor de sitio Ill a succinato 5 mM y KCN respectivamente. Los datos no sonestadísticamente diferentes con p 0.05.

Experinrento con oligolnicina: inhibidor de In fosfmilnción oxidntiva.

Control

(natomog/min/mg proteína) (natomog/min/mg proteína)

HgC12 5 UM

I Succinato 12.16k0.71 12.7350.48

ADP

3.16k0.35 2.29k1.41 Oligomicina

2.8350.32 2.32k0.40

Tabla 5. Consumo de oxígeno de mitocondrias aisladas con sustratos e inhibidor de

la fosforilación oxidativa.

En la respiración con inhibidor de la fosforilación se observa que las mitocondrias

tratadas respiran más que las control después de adicionarles oligomicina (Fig.2).

: t

CONSUMO DE OXIGENO CON INHIBIDOR DE LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA

*SUCCINATO

5.9 natomogo,

1 min

OLlGOMlClNA - Mitocondrias control

- - - Mitocondrias tratada: con HgCI, 5 uM

ADP Oligomicina

Fig. 2. Consumo de oxigeno de mitocondrias tratadas con HgCI, 5uM y control. El medio de reacción fue sacarosa 230mM, TEA 10 mM, fosfato IOmM, MgCI, 3mM a pH 7.4, aprox. 0.5 mg/mLde suspensión de mitocondrias en un volumen final de 3 mL.Se usaron sustrato de sitio II y activador del estado 3 de la respira- ción a succinato 5 mM, ADP 100 uM e inhibidor de la fosforilación oxidativa a oligomicina.Los datos son esta- dísticamente diferentes con p < 0.05.

6.3.4 Análisis estadístico

Se utilizó la prueba t de student con un nivel de significancia del 0.05, en dónde se

observa que no existe una diferencia significativa entre el consumo de oxígeno de las

mitocondrias tratadas y control al utilizar sustratos e inhibidores de la cadena

respiratoria, sin embargo si existe evidencia suficiente para afirmar que existe una

diferencia significativa entre el consumo de oxígeno de las mitocondrias tratadas y

control al utilizar como inhibidor de la fosforilación a la oligomicina.

Prornedio del conslmo de oxígeno en experirlrento con inhibidores de In cndenn respiratorin.

Sustratos e inhibidores Células tratadas Células control

(natomg 02/min/mg prot.) (natomg 02/min/mg prot.)

GI u-mal 1.36 1.92

ADP

0.64 0.74 Rotenona

1.36 1.92

I I

Succina to 3.57 2.89

Ho= no existe diferencia entre los promedios

Ha= existe diferencia entre los promedios

nl= 4 X= 1.87 SI= 0.ss S21= 0.77

n2= 4 X= 1.74 S2= 1.26 S+ 1.60

Sp2= 1.19

tz 0.172

tO.o5,6= 2.44

2.44> 0.172

Se acepta Ho en que no existe evidencia. suficiente para afirmar que los consumos de

oxígeno entre las células control y las tratadas son significativamente diferentes con

p< 0.05.

7. DISCUSION Y CONCLUSIONES

Se lograron aislar a las mitocondrias de la linea celular fetal humana WRL-68 por el

método 5, el factor determinante fue el rompimiento de las membranas, que se logró

con digitonina al 0.2% con lavados consecutivos para eliminar restos de este sustancia

y evitar que siguiera teniendo efecto sobre las membranas.

El consumo de oxígeno de mitocondrias de la linea celular WRL-68 fue de 5.9

natomog 02/min/mg proteína, a diferencia de lo observado en mitocondrias de

hígado de rata con 111 natomog 02/min/mg proteína (Konigsberg, 1993) o de

mitocondrias de riñón de rata con 50 natomog Oz/min/mg proteína (Santos et al.,

1996).

Sin embargo nunca se logró obtener un control respiratorio en el que la velocidad de

consumo de oxigeno estuviera controlada por la concentración de ADP, debido a que

el metabolismo energético de las líneas celulares in vitro ocurre principalmente por

glucólisis y no por respiración mitocondrial (Freshney, 1983).

En los experimentos de respiración en donde se utilizaron sustratos e inhibidores de

la cadena respiratoria, se encontró que estadísticamente no hubo diferencia entre la

respiración de las mitocondrias tratadas y las mitocondrias control, esto conduce a

suponer que el efecto del cloruro de mercurio no es directo sobre la cadena

respiratoria, lo anterior es apoyado por Santos y col. (1997), que encontraron que a

menor concentración de cloruro de mercurio y/o menor periodo de incubación, no se

afecta la cadena respiratoria.

Sin embargo en los consumo de oxígeno de las mitocondrias tratadas y expuestas a

oligomicina, se observó que respiraron más. Esto sugiere que posiblemente el fracaso

de la oligomicina para inhibir la estimulación respiratoria producida en el consumo

de oxígeno de las mitocondrias tratadas por el mercurio es consistente con la

hipótesis de que la estimulación de la actividad de ATPasa es una consecuencia del

efecto del mercurio que causa permeabilidad de H+ en la membrana interna de las

mitocondrias tratadas expuestas a oligomicina, teniendo como consecuencia el

desacoplamiento de l a fosforilación oxidativa.

La unión preferente del metal a grupos sulfhidrilo de proteínas es ya conocido, en

dónde el efecto del mercurio sobre las funciones mitocondriales depende no sólo de

la concentración del inhibidor sino también de la cantidad de proteína mitocondrial

unida. Bucio y col. (1995), encontraron que la distribución subcelular del mercurio

fue: 48% en mitocondria, 38% en núcleo, 8% en la fracción citosólica y 7% en los

microsomas.

Estos resultados están en consonancia con reportes previos donde el HgC12 muestra

depresión del potencial de membrana asociado con actividad desacoplante

promoviendo el paso de H+ a través de la membrana mitocondrial, que normalmente

es impermeable a dichos iones. El hecho de que las mitocondrias se encuentren

desacopladas puede deberse también a una disfunción mecánica, como el

rompimiento o deterioro d e la membrana (Konigsberg, 1997). Por lo anterior es

posible que el cloruro de mercurio actúe alterando la estructura de la membrana por

la gran afinidad que tiene por los grupos tioles de las proteínas.

Santos y col. (1997) encontraron in vitro que a concentraciones relativamente bajas o

tiempos cortos de incubación con Hg(I1) la fosforilación oxidativa se desacopla y a

concentraciones mayores o tiempos largos de incubación se afecta marcadamente la

cadena respiratoria.

Otra posibilidad es que el cloruro de mercurio haya afectado la ATPsintetasa.

Estudios previos por Yagi y col., (1987), descubrieron que el complejo de ATP- sintetasa de mitocondria de corazón de bovino contiene un grupo esencial de tioles o

ditioles en el sector Fo de la membrana y que la modificación por mercuriales resulta

en desacoplamiento e inhibicion de la actividad de este complejo.

Palmeira y col. (1997) encontraron que los efectos del cloruro de mercurio en

mitocondria de hígado de rata it2 vifro deprime el estado 3 de la respiracion a

diferentes concentraciones, sugiriendo un fuerte efecto de este metal a nivel del

sistema de fosforilación. También estimula el estado 4 de la respiracion y disminuye

el potencial d e membrana sugiriendo una acción desacoplante. Ellos proponen que el

desacoplamiento puede ser causa de algunas interacciones del cloruro de mercurio

con el sistema molecular mitocondrial por:

1. Permeabilización de la membrana a H', ya sea por un efecto caotrófico o por

apertura de poros que contengan grupos -SH bloqueados por mercurio.

2. Pérdida del rendimiento de la bomba de protones, reduciendo la fuerza

protomotríz con subsecuente liberación de la velocidad de. oxidación de sustratos

no controlados eficientemente por un gradiente de protón adecuado.

3. Interacción en el nivel de la transición de permeabilidad del poro, facilitando s u

apertura o retardando su cierre.

Otra propuesta es que el mercurio puede inhibir a un transportador de ADP en la

mitocondria y el ATP fuera de ella (Weinberg et al., (1982).

Por todo lo anterior puede decirse, que tanto las mitocondrias control como las

tratadas fueron sensibles a inhibidores como la rotenona y el cianuro, lo que indica

que se aisló una cadena respiratoria viable. Siendo l a respiración más lenta en las

rnitocondrias tratadas. Sin embargo, no se pudo cuantificar el control respiratorio

debido a que el metabolismo energético de las células en cultivo es glucolítico.

Los efectos del mercurio sobre l a respiración, fueron causados posiblemente por la 71 P 5 2

unión de este metal a grupos tioles de proteínas de la membrana mitocondrial, más r O

que por inhibición enzimática directa, causando posiblemente desacoplamiento de l a 9 ' 7 4 ~,~

fosforilación por permeabilidad de H' en la membrana mitocondrial afectando la 0 a::

$ Q

V) * E !!?

. i

ATPsintetasa rica en grupos tioles o alterando la estructura de la membrana

8. RECOMENDACIONES

Como apoyo a los resultados obtenidos del efecto del cloruro de mercurio en la

respiración mitocondrial de la línea celular hepática fetal humana WRL-68, se

recomienda realizar los siguientes ensayos:

1. Actividad de la ATPasa mitocondrial, así como la determinación de fosfato Pi

(Konigsberg, 1997).

2. Formación de H202, lipidoperoxidación y glutatión; para cuantifiacar la inhibición

de la cadena respiratoria por especies reactivas productos de la presencia del

cloruro de mercurio (Lund et al., 1993).

3. Reversibilidad del efecto del cloruro de mercurio (el cual muestra gran afinidad

por grupos sulfhidrilo) utilizando ditioeritritrol (Weinberg et al., 1982).

4. Ensayo con atractilósido que es un inhibidor de la fosforilación oxidativa

(Weinberg et al., 1982).

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Nombre: Norma Edith López Díaz-Guerrero

Matrícula: 89341746

Licenciatura: Biología Experimental

Título del Proyecto: "EFECTO DEL CLORURO DE MERCURIO SOBRE LA

RESPIRACIóN MITOCONDRIAL EN LA LíNEA CELULAR

HEPATICA FETAL HUMANA WRL-68"

Registro del S.social: BE.005.98

Fecha de terminación: 3 de Octubre de 1998

Nombre del Asesor: Mina Konigsberg Fainstein

Puesto y Adscripción: Prof. Asociado "D" Tiempo Completo. Departamento de

Ciencias de la Salud.

RESUMEN

Los objetivos principales del proyecto de servicio social fueron cuantificar el consumo de

oxigeno utilizando sustratos e inhibidores de la cadena respiratoria y cuantificar el consumo

de oxigeno utilizando un inhibidor de la ATPsintetasa, en las mitocondrias aisladas de la

lííea celular WRL-68, control y tratadas con 5 uM de cloruro de mercurio. Se observó que no

existe una diferencia significativa entre el consumo de oxígeno de las mitocondrias tratadas y

control al utilizar sustratos e inhibidores de la cadena respiratoria, sin embargo si se observó

evidencia suficiente para afirmar que existe una diferencia significativa entre el consumo de

oxígeno de las mitocondrias tratadas y control a l utilizar corno inhibidor de la fosforilación a

la oligomicina, siendo la respiración más lenta en las mitocondrias tratadas. Sin embargo, no

se pudo cuantificar el control respiratorio debido a que el metabolismo energético de las

células en cultivo es glucolítico. Los efectos del mercurio sobre la respiración, fueron

causados posiblemente por la unión de este metal a grupos tioles de proteínas de l a

membrana mitocondrial, más que por inhibición enzimática directa, causando posiblemente

desacoplamiento de la fosforilación por permeabilidad de H+ en la membrana mitocondrial

afectando la ATPsintetasa rica en grupos tioles o alterando la estructura de la membrana

mitocondrial por disfunción mecánica o por inhibición del transportador de ADP en la

mitocondria.