Sergio Crespo, Mariela Rivera, Idupulapati Rao, Jaime Eduardo Muñoz Florez y Ligia Carmenza Muñoz Florez

Introducción

• El fríjol tepari, P. acutifolius, es originario del norte de Mexico y el sur de Estados Unidos.

• Se considera una especie muy prometedora frente al cambio climático.

• Posee características de gran interés como resistencia a múltiples enfermedades, a insectos.

• Presenta altos niveles de tolerancia a estrés por sequía, a altas temperaturas y a la salinidad (Muñoz et al. 2006; Rao et al., 2013).

• El fríjol tépari presenta una baja diversidad genética, principalmente en las formas cultivadas (Muñoz et al., 2006; Jiménez G. y Acosta G. 2012)

• Se inició un programa de inducción de mutagénesis con metanosulfonato de etilo (EMS) en el marco del proyecto «Heat effects on tepary bean and relatives» financiado IAEA (Viena).

Introducción

• La polinización y la fecundación son características fundamentales para los procesos de fitomejoramiento y producción de cultivos (Frankel y Galun, 1977)

• Las fallas en la formación y desarrollo del polen son una causa primaria de inviabilidad de especies o híbridos (Lagos et al., 2005)

Introducción

ObjetivosObjetivo general

Determinar si existen efectos de los tratamientos de riego/sequía e inóculos de rizobio en condiciones de alta temperatura en la viabilidad del polen de 6 genotipos mutantes M5 y dos parentales de P. acutifolius.

Objetivos específicos• Estimar el porcentaje de viabilidad y la densidad de polen

como indicativo de la producción de polen.• Correlacionar los resultados con los tratamientos del

ensayo y con otras variables morfofisiológicas• Estandarizar un método eficiente, preciso y confiable para

la determinación de la viabilidad del polen mediante el uso del Software ImageJ

Materiales y métodosEste estudio se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular dela Universidad Nacional de Colombia sede Palmira.

• Se evaluaron 6 genotipos mutantes de fríjol tepari *de la generación M5 (M53P2R2, M53P4R2, M118,M191, M205 y M304) y 2 parentales (G40068 yG40159)

• provenientes de un ensayo de resistencia a altatemperatura realizado en un invernadero del CentroInternacional de Agricultura Tropical (CIAT) y que teníaun diseño de parcelas subdivididas con 3 repeticiones.

* Mutagenesis: Metanosulfonato de etilo, EMS.

Tratamientos

Parcela: Ambiente o Condición de humedad de suelo– Sequía: Inducción a sequía 12 días después de la siembra, se mantuvo a

40% de capacidad de campo.– Riego: Se mantuvo a 80% de capacidad de campo.

Subparcela: Cepa de rizobios– CIAT461: Bradyrhizobium sp. – CIAT899: Rhizobium tropici– Sin inóculo.

Subsubparcela: Genotipos– Mutantes M53P2R2, M53P4R2, M118, M191, M205 y M304 – parentales G40068 y G40159

Materiales y métodos

Figura 1. Ensayo de P. acutifolius mutantes M5 sembrados en los invernaderos del CIAT. Se colectó dos botones florales por planta, y se evaluaron 128 materiales.

Materiales y métodos

Esquema general del método de estimación de la viabilidad polínica en mutantes de P. acutifolius

Colecta de botones florales

Montaje de placas

Fotografía de placas

Conteo de polen en Imagej

Análisis de resultados

Materiales y métodos

Colecta de botones florales• Los botones se colectaron entre los 25 y 35

días después de la siembra.

• Los botones fueron almacenados a 4°C en frascos plásticos con una solución 3:1 de etanol/ácido acético.

Materiales y métodos

Figura 2. Vista estereoscópica de Un botón floral de P. acutifolius. (entre 5 y 9mm de longitud).

Materiales y métodos

Figura 3. El proceso de montaje de placas para la evaluación:

1. Disección del botón floral2. Macerado y tinción con carmín acético al 2%3. Adición de 75µl de agua para generar una suspensión de polen4. Aplicación de la muestra con micropipeta y secado5. Sellado de las placas permanentes con resina.

Materiales y métodos

Figura 4. Microscopio Axio Lab A1 con cámara AxioCam Cr1de Carl Zeiss donde se tomaron las fotos de lasmuestras de polen, con ayuda del software ZEN.

Materiales y métodos

97

1 2 3

6 5 4

7 8 9

Figura 5. Método secuencial en que se obtuvo las fotografíasde campos ópticos sin repetición. Con el objetivo de5x, cada fotografía abarca un área de 5mm2

Determinación de la viabilidad

Materiales y métodos

2mm

Figura 5.1. Nueve microfotografías de polen (5x, Ph1), del ID1correspondiente a un M53P4R2 con cepa CIAT461y tratamiento sequía.

Figura 6. Microfotografía individual de polen (10x, Ph1). Se distingue el polen viable bien teñido con el carmín acético (2%) y no viable no teñido (flechas rojas).

ID24. M53P4R2, CIAT899, Sequía

Figura 7. Microfotografías de a. Polen no viable (40X) del ID1 (M53P4R2,CIAT461, Sequía) b. Polen viable (40X) del ID136 (G40159,Sin inóculo, Riego) y c. Polen no viable (100X) ID165 de la generación M2.

a b c

Materiales y métodos

Figura 8. Conteo manual en el software ImageJ con el plugin CellCounter. Los datos de número de polen viable y polen no viable aparecen en el cuadro rojo. El conteo mínimo fue de 500 granos de polen por botón floral.

Materiales y métodos

VariablesA partir del conteo se obtuvo dos variables para el análisis de viabilidad:

-Porcentaje de viabilidad

%𝑣𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 =𝑁𝑜. 𝑔𝑟𝑎𝑛𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑝𝑜𝑙𝑒𝑛 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒

𝑁𝑜. 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑔𝑟𝑎𝑛𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑝𝑜𝑙𝑒𝑛× 100

-Densidad (No. granos de polen/mm2)

𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 =𝑁𝑜. 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑔𝑟𝑎𝑛𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑙𝑒𝑛

(𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑜𝑠 × Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑜)

Materiales y métodos

Figura 9. Diagrama de cajas de distribución del porcentaje de viabilidad de acuerdo a: a. cepa x condición de humedad y b.genotipo. En ambos casos se puede observar que el porcentaje de viabilidad se mantuvo por encima del 90%

Resultados y discusión

a b

Figura 10. Diagrama de barras del porcentaje de viabilidad de los 8 genotipos evaluados en riego (negro) y sequía (rojo) con la cepa a.CIAT461 b. CIAT899 y c. sin inóculo.

Resultados y discusióna b

c

Figura 11. Diagrama de cajas de distribución de la densidad de polen (No. polen/mm2) de acuerdo a: a. cepa x condición de humedad y b. genotipo. Se observan que la mayor densidad de polen aparece en el tratamiento sin inóculo y en condición de riego y en el genotipo G40068

Resultados y discusión

a b

Figura 12. Diagrama de barras de la densidad de polen en los 8 genotipos evaluados en riego (negro) y sequía (rojo) con la cepa a.CIAT461 b. CIAT899 y c. sin inóculo.

Resultados y discusión

a b

c

ParámetrosViabilidad Densidad Peso Temperatura

GL Polen Polen Semilla Hojas

Rep (R ) 2

Ambiente (A ) 1 * * **

R × A 2

Cepa (C ) 2 * ***

A × C 2 ***

R × C (A ) 8

Genotipo (G ) 7 **

A × G 7

C × G 14

A × C × G 14 *

*, **, *** Niveles de significancia al 0.05, 0.01, 0.001 respectivamente

Tabla 1. Análisis de Varianza (Significancia) para %Viabilidad, Densidadde polen (No granos/mm2), Peso de semillas (g/pl) y temperatura hoja(°C)

Resultados y discusión

Parámetros

Viabilidad polen (%) Densidad polen Peso de semillas

% No granos/mm2 Gramos/pl

Riego Sequía Riego Sequía Riego Sequía

Peso Semillas /Pl 0.13 0.16 -0.03 0.18 1.00 -- 1.00 --

No Vainas /Pl 0.21 0.12 -0.03 0.27* 0.79*** 0.78***

No Semillas /Pl 0.22 0.17 -0.04 0.21 0.90*** 0.92***

No Semillas /Vainas 0.07 0.16 0.01 -0.04 0.45*** 0.47***

Peso 100 Semillas 0.11 -0.04 0.00 -0.08 -0.69*** -0.48***

Peso Vainas /Pl 0.26* 0.17 -0.05 0.20 0.46*** 0.67***

No Nódulos /Pl 0.18 0.02 0.13 0.09 0.25* 0.31*

Peso Nódulos /Pl 0.20 0.08 0.14 0.12 0.16 0.32*

Peso Tallos /Pl 0.15 0.12 0.01 0.12 0.67*** 0.35**

Peso Raíces /Pl 0.11 -0.05 0.04 0.22 0.02 -0.03

Clorofila (SPAD) -0.02 0.09 0.11 0.21 -0.06 0.34**

Conductancia estomática (mmol/m2/s) -0.15 0.16 0.09 0.03 -0.07 0.06

Temperatura Hojas (oC) -0.24* -0.22* 0.32* 0.08 -0.43*** -0.29*

Densidad de polen (No/mm2) 0.33** 0.14 1.00 -- 1.00 -- 0.13 0.16

*, **, *** Niveles de significancia al 0.05, 0.01, 0.001 respectivamente

Tabla 2. Coeficientes de correlación (Pearson) entre viabilidad, densidadde polen y peso de semillas con otras variables morfofisiológicas.

Resultados y discusión

• El porcentaje de viabilidad del polen del fríjol tepari se mantuvo en general por encima del 90% lo que indica una alta viabilidad

• Hubo una ligera reducción en la densidad de polen en los mutantes respecto a sus parentales G4068 y G40159 (Fig.11).

• El porcentaje de viabilidad se vió afectado por la condición de humedad, mientras que la densidad del polen estaba más relacionada con la cepa del inóculo (Tabla 1).

• La cepa CIAT899 generó en algunos casos mayor densidad que la cepa CIAT461 y sin inóculo (Fig.12).

Conclusiones

• Probablemente en los genotipos evaluados la respuesta al estrés de la viabilidad del polen, esté dada en mayor medida por una la baja producción de granos de polen, y no en la disminución del porcentaje de viabilidad.

• La evaluación de la modificación al método montaje de placas y conteo mediante ImageJ lo caracteriza como una alternativa eficiente y precisa para la evaluación de la viabilidad del polen.

Conclusiones

BibliografíaFrankel R and Galun E. 1977. Pollination mechanisms, reproductionand plant

breeding. Springer-Verlag, New York. 281 p.

Jiménez Galindo JC and Acosta Gallegos JA. 2012. Characterization of creole genotypes of tepary bean (Phaseolus acutifolius A . Gray ) and common (Phaseolus

vulgaris L .) under rainfed. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas, 3(8), 1565–1577.

Lagos TC, Caetano CM, Vallejo FA, Muñoz JE, Criollo H and Olaya C. 2005. Caracterización palinológica y viabilidad polínica de Physalis peruviana L. y Physalis philadelphica Lam. Agronomía Colombiana. 23(1) 56-61.

Muñoz LC, Duque MC, Debouck DG and Blair MW. 2006. Taxonomy of Tepary Beanand Wild Relatives as Determined by Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP) Markers. Crop Science, 46(4), 1744–1753.

Rao IM, Beebe S, Ricaurte J, Cajiao C, García R and Rivera M. 2013. Can Tepary beanbe a Model for improvement of Drought Resistance in Common bean?. AfricanCrop Science Journal. Vol 21, No 4, pp 265-281.