Pgina15Universidad nacional Jos Faustino Snchez Carrin

IntroduccinLa electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa.Fue empleado por primera vez por en el ao 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los aos cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separacin de materiales en un campo elctrico en presencia de algn tipo de soporte; aunque este trmino se limito originalmente al anlisis de coloides y partculas submicroscpicas , se ha convertido en estos ltimos aos en una metodologa aplicada a sustancias de bajo peso molecular.Este mtodo, cada da ms empleado en el estudio de casi todas las enfermedades en que el suero y plasma sanguneos juegan algn papel (y sabemos que es muy difcil que haya alguna que no altere o cambie en alguna forma la constelacin albuminoidea de estos lquidos), consiste fundamentalmente en valorar la cantidad y calidad de las diversas fracciones proteicas que los forman. La determinacin de estas, separadas dentro de un campo elctrico por la influencia ejercida por los electrodos clsicos, nodo (-1-} y ctodo (), permite, por comparacin de sus valores normales con los encontrados en la enfermedad, conocer y precisar mejor numerosos cuadros patolgicos.No solo las albuminas del suero y plasma sanguneos son susceptibles de un estudio electrofortico sino que tambin las de tejidos orgnicos, msculos, cuerpo vtreo y cristalino as como las de toxinas, venenos albuminoideos y exudados diversos, las de la leche y las aparecidas en la orina y en el L.C.R.

ElectroforesisSe denomina electroforesis al transporte de partculas en un campo elctrico. Cualquier in o molcula cargada elctricamente migrar cuando se someta a la accin de un campo elctrico. A un pH determinado, muchas molculas biolgicas poseen carga elctrica, cuya magnitud depende del pH y composicin del medio en que se encuentren. Con tcnicas electroforticas, es posible separar los diferentes componentes de una mezcla de aminocidos, protenas, cidos nucleicos y otras biomolculas cargadas. En el laboratorio clnico, la aplicacin ms importante de la electroforesis es la separacin de protenas presentes en el suero, orina y otros fluidos biolgicos como el lquido cefalorraqudeo y el lquido sinovial.

Movilidad electrofortica Si se aplica un campo elctrico a una mezcla de molculas cargadas, stas migrarn al electrodo de polaridad opuesta. Cuando una molcula de carga q se encuentra en un campo elctrico de magnitud E, la fuerza que provoca la aceleracin de la partcula ser qE. Dicha fuerza se ver contrarrestada por la resistencia friccional f dando una velocidad resultante v, de forma que: qE = fvAplicando las leyes de Stokes para una molcula esfrica de radio r que se mueva a travs de un medio de viscosidad n, se cumple: f= 6 nrA partir de las anteriores expresiones se obtiene: qE= 6nrvLa movilidad electrofortica V de una molcula se define como la migracin por unidad de campo de fuerza, de modo que: V=v/E=q/f= q/6 nrPor tanto, la movilidad electrofortica depende de la carga de las partculas y del coeficiente de friccin f, que es dependiente del tamao de la molcula, de su forma y de la viscosidad del medio.

Tipos de electroforesis 1. Electroforesis de frente mvil o libre Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U, disueltas en un tampn de pH y fuerza inica adecuados. Se colocan dos electrodos en sendos brazos del dispositivo, entre los que se crea un campo elctrico, provocando que las molculas de protena cargadas emigren hacia los electrodos de polaridad opuesta. Las diferentes protenas se desplazan a velocidades diferentes de acuerdo con sus cargas y coeficientes de friccin respectivos, formndose nubes (o frentes) que se desplazan en la disolucin tampn. Este desplazamiento puede seguirse con diversos sistemas pticos que ponen de manifiesto las sustancias segn se van separando. Para impedir la mezcla por conveccin de las protenas que emigran se necesita un sofisticado aparato y a su vez se precisa el empleo de muestras muy grandes. Esta es la razn por la que la electroforesis de frente mvil ha sido sustituida por la electroforesis de zona.

2. Electroforesis de zona En esta tcnica, la muestra est obligada a desplazarse sobre un soporte slido de papel, celulosa o gel. La pequea cantidad necesaria de muestra permite que las molculas migren en discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de biomolculas cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolucin estabilizada con un medio que sirve de soporte.

2.1 Electroforesis en papel La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una disolucin tampn, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampn. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolucin tampn y en los que se hallan colocados los electrodos. Se conectan los electrodos a una fuente de tensin continua y se aplica una diferencia de potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las molculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuesta formando bandas en el papel. La velocidad de emigracin de una molcula, depende preferentemente de su carga. Completada la electroforesis, se desconecta la fuente de tensin y se secan las tiras sobre una superficie, limpia, seca y lisa (cristal, azulejo, etc.). El revelado se realiza empleando los mismos mtodos que los utilizados en cromatografa sobre papel, mediante la accin de los colorantes adecuados. La electroforesis y la cromatografa en papel tienen ciertas similitudes. Sin embargo, mientras que la electroforesis separa las molculas fundamentalmente en funcin de su carga, la cromatografa lo hace en base a una amplia gama de caractersticas (ejemplos, solubilidad en la cromatografa de reparto, polaridad en la de adsorcin, carga en la de intercambio inico, etc.). La electroforesis en papel se emplea principalmente en la separacin de sustancias de bajo peso molecular como aminocidos y pptidos. La difusin que se produce puede disminuirse aumentando la diferencia de potencial entre los electrodos con lo que se reduce el tiempo de desarrollo. Este tipo de electroforesis se denomina de alto voltaje. El revelador para localizar las sustancias sera la ninhidrina en el caso de pptidos y aminocidos. Las electroforesis en papel tambin pueden hacerse en tiras de acetato de celulosa, que son qumicamente ms homogneas y tienen la ventaja de ser transparentes, con lo que las sustancias a separar, una vez teidas o reveladas, pueden cuantificarse por densitometra. Es muy til en los laboratorios clnicos por su fcil manipulacin y su rpido desarrollo. La principal aplicacin es la separacin de protenas del suero, conocindose el resultado como proteinograma. Las fracciones proteicas del suero que se separan mediante este tipo de electroforesis son la albmina y las globulinas 1, 2, y . El acetato de celulosa se utiliza tambin para separar lipoprotenas. El resultado obtenido se denomina lipidograma. Las fracciones lipoproteicas son denominadas , pre- y . El tampn ms usado es el veronal, a pH 8,6. La separacin se realiza de forma anloga a la de protenas y se produce en unos 30 minutos. Las lipoprotenas, una vez separadas, se localizan tindolas con colorantes que se unen a la fraccin lipdica, como Negro Sudn o Ciba 7B Fat Red. Electroforesis anlogas a las de protenas y lipoprotenas, utilizando como soporte el acetato de celulosa, se han aplicado tambin para la separacin de isoenzimas de la lactato deshidrogenasa y la creatn-quinasa.

2.2 Electroforesis en gel Un gel es un estado intermedio entre el slido y el lquido. Este tipo de electroforesis se halla entre los mtodos ms resolutivos y convenientes empleados en la separacin de macromolculas. Los geles de uso ms generalizado son: poliacrilamida y agarosa. stos poseen poros de diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de traslado y molculas trasladadas durante el proceso electrofortico.De esta forma, la separacin no se produce slo por las diferentes cargas de las molculas, sino tambin por las diferencias de tamao. Los geles estn formados por un reticulado de polmeros (constituyendo una red enmaraada) y el lquido intersticial en el que se encuentra inmerso esta red. Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden agrupar en dos categoras: Electroforesis en gel en una dimensin (continuo o discontinuo) Electroforesis en gel de poliacrilamida.Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada en el tamao del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxicidad.

Electroforesis en geles de gradientes.El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentracin de archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamao del poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona donde el tamao de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el lmite del poro no se produce una migracin apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones ms estrechas, adems de incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentracin fija. (Diapositiva n 9)

Electroforesis en geles de agarosa.La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel est constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos.

Isoelectroenfoque.Esta tcnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH.Las molculas anfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del rango.Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran hacia el ctodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH ms bajos que su punto isoelctrico tendrn carga negativa y migraran hacia el nodo. La migracin les conducir a una regin dnde el pH coincidir con su punto isoelctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta forma las molculas anfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su punto isoelctrico con el pH.

Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional) Segn las aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en una prctica o experimento, se utilizar un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles discontinuos mejoran la resolucin de la electroforesis pues se consigue agudizar las bandas en gran medida por el uso de esta tcnica conocida como electroforesis a pH discontinuo que precisa de dos geles y dos tampones diferentes. La PAGE-nativa se utiliza para separar protenas en condiciones no desnaturalizantes, por tanto, en funcin de la carga intrnseca de las mismas. La SDS-PAGE es muy til para calcular el peso molecular de una protena concreta ya que separa las protenas segn su tamao. El isoelectroenfoque es un tipo de PAGE en una dimensin que se basa en la separacin de molculas de acuerdo a sus diferentes puntos isoelctricos. La electroforesis en gel en dos dimensiones combina el isoelectroenfoque (primera dimensin) con la SDS-PAGE (segunda dimensin). Es una tcnica muy resolutiva, y el mejor mtodo analtico para separar protenas que existe hoy en da.

3. Electroforesis capilar Aunque la electroforesis en gel en sus diversas formas resulta un mtodo comn y efectivo para la separacin de molculas, el proceso de separacin puede durar varias horas, siendo difcil de cuantificar y automatizar. La tcnica aqu presentada se lleva a cabo en el interior de tubos capilares (110 m de dimetro). Estos capilares disipan el calor rpidamente permitiendo la aplicacin de campos elctricos elevados, reduciendo as los tiempos de separacin.

Factores que Afectan a la ElectroforesisFactores del Campo Elctrico Potencial Elctrico, V, en VoltiosVoltaje normal: 10 500 V Intensidad de Corriente, i, en Amperios Relacionadas por la ley de OhmV = i R , R: resistencia, en ohmiosCondiciones ambientales TemperaturaAumenta con el paso de corriente (Efecto Joule).

Caractersticas del soporte Efectos de adsorcin, friccin y tamizado.Propiedades de las molculas de la muestra Carga y tamao (relacin carga/masa).Mayor e cuanto mayor sea la carga neta y menor el tamao.Factores de la disolucin PHDetermina la carga de las molculas.Tiende a variar por hidrlisis en los electrodos.Siempre se utiliza un tampn. Fuerza inicaAfecta a la conductividad elctrica.Influye en el tamao efectivo de las molculas.

Tratamiento PostelectroforesisNecesario para la deteccin y anlisis de resultados Tratamiento del soporte Fijacin: Precipitacin mediante cidos (actico, tricloroactico) o por deshidratacin (metanol) TincinNo especficaPara protenas: azul coomassi, negro amido, rojo Ponceau.Para cidos nucleicos: bromuro de etidio (fluorescente).EspecficaImplica la utilizacin de anticuerpos Decoloracin Anlisis de las bandasCuantificacin por densitometra

Soluciones para la electroforesis 1. Tampn veronal/veronato sdico Veronal/veronato sdico, pH 8,6

1 litro (g)1 litro (g)

Veronal (cido dietilbarbitrico) 1,8415,45

Veronal sdico 10,402,76

Agua destilada Hasta 1 litroHasta 1 litro

2. Tampn acetato/veronal Acetato/veronal, pH 8,6

1 litro

Veronal sdico 10 g

Acetato sdico 6,5 g

HCl 0,1 M 64,5 ml

Agua destilada Hasta 1 litro

Soluciones de colorantes utilizados en las tinciones 1. Solucin de negro amido Negro Amido

1 litro

Metanol 450 ml

cido actico 100 ml

Negro amido 6,0 g

Agua destilada 450 ml

2. Solucin de azul de bromofenol Azul de bromofenol

100 ml

Metanol 100 ml

Bicloruro de Hg A saturacin

Azul de bromofenol 100 mg

3. Solucin de azocarmin B Azocarmin B

100 ml

Azocarmin B 10 g

Metanol (50%) 90 ml

cido actico 10 ml

Aplicacionescidos nucleicosEn los cidos nucleicos la direccin de migracin es del electrodo negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azcar-fosfato. En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hlice) la velocidad de migracin es inversamente proporcional a su tamao. En fragmentos simples de ADN (una sola cadena) y ARN, dichas molculas tienden a plegarse de forma compleja y a migrar de forma ms complicada, segn la estructura terciaria formada tras el plegamiento.Sin embargo, compuestos que puedan romper los enlaces de puente de hidrgeno, como el hidrxido de sodio o la formamida, son empleados para desplegar las molculas plegadas y permitir que la velocidad de migracin dependa nicamente del tamao y no de la estructura formada tras el plegamiento.

ProtenasPor otra parte, las protenas no tienen una estructura predecible como los cidos nucleicos, y por tanto sus velocidades de migracin no son similares entre ellas. Incluso puede que no migren ni al aplicar una fuerza electromotriz (al encontrarse en su punto isoelctrico). En estos casos, las protenas se desnaturalizan mediante la adicin de un detergente como el dodecilsulfato sdico/dodecilfosfato sdico (SDS/SDP).Estos detergentes son agentes reductores que rompen los enlaces disulfuro, separando a la protena en sus sub-unidades y adems le otorgan una carga neta negativa que les permite migrar a travs del gel en relacin directa a su tamao, ya que la cantidad de cargas negativas que se unen a la protena depende del tamao de sta, existiendo una relacin masa/carga similar. Adems, la desnaturalizacin hace que pierdan su estructura terciaria y por tanto su velocidad de migracin es proporcional al tamao y no a su estructura terciaria. As, los ms grandes se desplazan ms lentamente.Revelado y visualizacinCuando se ha completado la electroforesis, las molculas ms pequeas han llegado al nodo. Entonces se puedenrevelarmediante la adicin de un colorante especfico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los cidos nucleicos, o la plata, para las protenas. Asimismo se emplean otros mtodos para visualizar la separacin de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografa de la placa bajo dicha luz. Tambin, si las molculas contienen tomos radiactivos se puede efectuar una autorradiografa.Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirn separaciones paralelas. Cada separacin mostrar distintas bandas correspondientes a cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dar un solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o ms componentes.Las bandas en diferentes separaciones paralelas que estn a la misma distancia del principio significa que contienen molculas que han atravesado el gel a la misma velocidad.Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de molculas de tamao conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamao. La distancia a la que se encuentra la banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo del tamao de la molcula.

Fragmentos de ADN teidos en bromuro de etidio tras una electroforesis en un gel de agarosa

Protenas teidas con Coomassi tras una electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida

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Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Docente: Dr. HUGO SEGAMI SALAZAR