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SEMINARIO 1BIOLOGA CELULAR

ORGANIZACIN ESTRUCTURAL Y

MOLECULAR DE LA CLULAMICROSCOPIA Y METODOS DEESTUDIO DE LA CLULA

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Argiope lobata

Homo sapiens

Trypanosoma cruzi

Agaricus campestris

Ginkgo biloba

Xenopus laevis

Los seres vivos presentan una gran diversidad...

Fuji velvia

Escericia coli...incluso dentro del !eino Animal....

...y dentro de los "ertebradosGallus gallus

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Teor#a celular$%cleiden y %c&ann' ()*+,

Todos los seres vivos est-n ormados por una o m-s c/lulas

La c/lula es la estructura m-s simple 0ue posee laspropiedades 0ue caracterizan a los seres vivos

%on capaces de e1traer' transormar y utilizar

la materia y la energ#a almacenada en lasmol/culas 0ue se encuentran en su entorno$metabolismo,

2ueden reproducirse y autoensamblarse'generando copias de s# mismos

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3iveles de organizaci4n de la materia

Las propiedades de los seres vivos resultan

de una serie de niveles de organizaci4nintegrados

SUB-ATMICO

ATMICO

MOLECULAR

MACROMOLECULAR

MACROMOLECULARCOMPLEJO

CELULAR

TISULAR

RGANOS

SISTEMAS DERGANOS

56

72L

E89:

A:

En cada nivel aparecen nuevaspropiedades $;propiedades

emergentes

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SUB-ATMICO

ATMICO

MOLECULAR

MACROMOLECULAR

MACROMOLECULARCOMPLEJO

CELULAR

TISULAR

RGANOS

SISTEMAS DERGANOS

56

72L

E89:

A:

...

( mm (=>*m

( ?m (=>@m

( nm (=>+m

(=>(=m(

Las estructuras de los niveles m-s bajostienen dimensiones muy pe0ueBas.......por eso se utilizan las siguientesunidades m/tricas...

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3ivel de 6rganizaci4n 5elular

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El estudio de las c/lulas

nCcleonucleolo

membrana plasm-tica

mitocondria

!ELAparato de Golgi

!EG

Dltraestructura 7icroscop#a electr4nica

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2rocarionte Eucarionte

3Ccleo Ausente Presente

5itoes0ueleto Ausente Presente

%istema deEndomembranas

Ausente Presente

:i-metro < 1m 1!1 mA:3 C"r#u$%r!Desnu&' C'n ("st'n%s

5romosomas )%r"%s #'*"%s &e un#r'm's'm%

D"st"nt' n+mer' &e#r'm's'm%s,es*e#"e

Endocits> E1ocitocis Ausente Presente

2ared 5elular

Presente S-$' en *$%nt%s.Ce$u$'s%/ 0 'n2's.3u"t"n%/

!ibosomas 4S .5S67S/ 8S .9S 0 :S/

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Dado que las dimensiones de la mayora de las

clulas y de todos los organoides estn por debajodel lmite de resolucin del ojo humano, es necesario

emplear instrumentos para su visualizacin.

l microscopio ptico nos permite ver las clulas ytejidos !"#$ %,&' um(

l microscopio electrnico nos permite estudiar la

ultraestructura de las clulas !ej. visualizar

membranas, organoides, inclusiones y detalles detodos ellos(.!"#$& a ' )ngstroms(

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Un"&%&es &e me&"&% ;ue se ut"$"%r%n en e$ #urs'=

1 mm > 1 ?m . ?m = m"#r-metr'/ 1 ?m > 1 nm . nm = n%n-metr'/ 1nm > 1 @ . @ = An2str'm /

E$ m"#r's#'*"' -*t"#' se %s% en $% ut"$"%#"-n &e $% $u"s"$e

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"uz blanca

Distintas longitudes de onda

*ndas electromagnticas

+e desva en su trayecto al pasar por

medios de distinto ndice de reraccin

)l pasar por compuestos coloreados son

absorbidos determinados rayos

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-artes del microscopio

Est%t"' P"e Br%' P$%t"n%

Tu'

P%rte -*t"#% = Es*e' A*%r%t' &eC'n&ens%&'r I$um"n%#"-n

D"%r%2m%

Oet"' O#u$%r

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archa de rayos

-unto ocal

objeto

"ente biconve/a

-unto ocal

0magen

Distancia 1ocal

objeto

2entro de la lente

"ado de la lente donde

se ubica el objeto

"ado de la lente donde seorma la imagen

je ptico

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*bjeto a una distancia

mayor que la distancia ocal

1ormacin de la imagen

en el objetivo3)lgunos principios de ptica

&(4odo rayo que corre paralelo al eje ptico

5( 4odo rayo que pasa por el punto ocal objeto

"a imagen 3

se orma por "nterse##"-nde rayos3 poreso es re%$4ambin es invertida

2uando atraviesa la lente pasa por el punto ocal

imagen

2uando atraviesa la lente corre paralelo al ejeptico

6( 4odo rayo que pasa por el centro de la lente no se desva al atravesarla

"ente objetivo

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7 -uede considerarse esta lente como el objetivo del microscopio

!en realidad son varias lentes( .

7"a lecha verde!objeto( es equivalente a una estructura del preparado.

7"a lente objetivo tiene distancias ocales menores que las distancias1ocales del ocular

ntonces .....

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"ente

objetivo "ente ocular

6( 4odo rayo que pasa por el centro de la lente no se desva alatravesarla

&(4odo rayo que corre paralelo al eje ptico

2uando atraviesa la lente pasa por el punto ocal imagen.

"a imagen se orma por*r'0e##"-nde rayos3por eso es"rtu%$

1ormacin de la imagen del ocular3

5(-ara obtener la imagen deben *r'0e#t%rselos rayos

"a imagen de la lente objetivo

cae dentro de la distancia objeto

ocal del .ocular

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"ente

objetivo "ente ocular

"a imagen es mayor, virtual e invertida

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2lculo del aumento

l aumento o magniicacin se obtienemultiplicando la magniicacin del objetivo porla del ocular.

jemplos3

*cular y objetivo seco dbil.3 6%8 multiplicopor 6%8$ 6%%8.

*cular y objetivo seco uerte3 6%8 multiplico

por 9%8$ 9%%8. *cular y objetivo de inmersin3 6%8 multiplico

por 6%%8$ 6%%%8.

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"mite de resolucin.LR/s la distancia mnimaque debe haber entre dos puntos de un

objeto para que se visualicen como separados

l "# del ojo humano es de %,6mm

D

+i estos dos puntos estn separados por una

distancia menor de %,6 mm se vern comoun solo punto

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0ndice de reraccin !0#( de un medio3

#elacin entre la velocidad de la luz en un determinado medio: 3 vidrio( y la velocidad de la luz en el vaco.

)0#

;0D#0*

2uando un rayo luminoso

pasa de un medio de menor0# a uno de mayor 0# se

apro/ima a la lnea normal

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)0#

;0D#0*

2uando un rayo luminoso pasa

de un medio de mayor 0# a uno

de menor 0# se aleja de la lneanormal

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Lm"te &e Res'$u#"-n .LR/ del microscopio pticoDepende de

7 la longitud de onda utilizada ! F7?m .m"#r's#'*"' O*t"#'(

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"a rmula de "# tiene un signiicado sico3

+eAala3 6( l "# es directamente proporcional a

"a < !a mayor < implica mayor "# y a menor

*bjetivo

>

)ceite de inmersin

&(n

tilizando aceite de inmersin

n $6.'&

l rayo entra dentro de la lente

objetivo y contribuye en la

ormacin de la imagen

)ire n$6

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Hepatocitos observados con el MO. Tcnica deH&E.

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Epitelio intestinal observado con el MO. Tcnica decoloracin H&E.

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4ipo de icroscopios pticos segEn

el nEmero de oculares

onoculares

Finoculares

4rinoculares !generalmente el tercer ocular

es para adaptar una cmara otogrica, de

video o una salida de seAal que puede ir a

un )nalizador de 0mgenes.

4ipos de microscopios pticos segEn

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4ipos de microscopios pticos segEn

iluminacin3

2ampo claro

2ampo oscuro

"uz polarizada

2ontraste de ase 2ontraste dierencial de intererencia !*ptica

?omarsGy(

1luorescencia

2onocal 0nvertido.

De proyeccin.

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icroscopio de campo oscuro +e ilumina el objeto de orma oblicua usando un condensador

especial. +lo la luz que impacta oblicuamente al objeto entraal objetivo.

mpleo de objetivos de baja )? !H6.6(

-ermite visualizar objetos que pueden ser de dimensin menorque la resolucin que corresponde a la )? si la intensidad deluz es elevada.

l objeto se ve brillante sobre ondo oscuro.

+e ven contornos o bordes, no se ve estructura interna.

+irven para ver objetos que con campo claro no se ven poralta de contraste.

;entaja3 -ueden distinguirse, aunque no resolverse, estructurasque no se distinguen con el * comEn. -ueden visualizarse

clulas vivas

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Microscopio de contraste de fase

Convierte las cambios de fase en variaciones de intensid

Diafragma anular y placa de fase en el obetivo !anillotransparente".

#magen intermedia formada por interferencia de todos lorayos

$% long onda de dif' anula $ long onda de dif' suma

(entaa' estudio de clulas vivas.

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Microscopio de interferencia

) *e +acen visibles las diferencias de velocidad ,uesufren losrayos luminosos al atravesar un obeto transparente'como

diferencias de intensidad o de coloracin.) -specto de relieve.) u/ blanca polari/ada !polari/ador".) Divisin del rayo en dos +aces paralelos !prisma decuar/o") Colector de rayos) -nali/ador) #nterferencia entre ambos +aces' diferencias de fasese

convierten en diferencias de intensidad y cambios de

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icroscopio de polarizacin

2onsta de3

n polarizador3 est debajo del condensador.

n analizador3 ncima de las lentes objetivos.

2uando estos estn cruzados no hay transmisin de luzpolarizada.

#otar el objeto para encontrar el brillo m/imo o mnimo.

ibras colgenas, ibras musculares estriadas, mielina,

cristales

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-ropiedades de la luorescencia

"as molculas luorescentes absorben la luz deuna determinada longitud de onda y emiten luz deotra longitud de onda ms larga. +i un componentede este tipo es iluminado a su longitud de ondaabsorbente y visualizado a travs de un iltro queslo permita pasar la luz de longitud de onda iguala la de la luz emitida, el componente aparece

brillante sobre un ondo oscuro. "a intensidad y elcolor de la luz es una propiedad caracterstica de lamolcula luorescente utilizada

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icroscopio conocal

-ermite que slo observemos el plano que

est situado en el punto de oco del sistema

ptico eliminando, de orma ptica a travsde un diaragma o IpinholeI, la luz

proveniente de los planos que estn uera de

oco. ste principio u descrito por insGyen los aAos '%, pero es a partir de los J%

cuando se empieza a e/tender su uso.

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7icrootogra#a electr4nica de un epatocitonCcleonucleolo!EGmitocondiasDltraestructura 7icroscop#a electr4nica

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El estudio de las c/lulas

nCcleonucleolo

membrana plasm-tica

mitocondria

!ELAparato de Golgi

!EG

La mayor#a de los estudios sobre la isiolog#a celularre0uieren para su an-lisis el aislamiento del componente

celular a ser analizado

Fraccionamiento subcelular

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Fraccionamiento subcelular

5onjunto de m/todos y t/cnicas 0ue tienen como objetivoobtener racciones puras o enri0uecidas de un determinadocomponente celular.

ETAPAS

(> !uptura de las c/lulas

Sonicacin.Consiste en la aplicacin e!lt"asonios a !na s!spensin cel!la"# Laintensa a$itacin p"o!cia est"!%e las&e&'"anas cel!la"es#

Uso e detergentes(!e sol!'ili)an las&e&'"anas cel!la"es#

Homogenizadores.Se "o&pen las c*l!lascon la a%!a e !n *&'olo "otato"io (!e se

a+!sta pe",ecta&ente a las $"!esas pa"ees e!n t!'o e c"istal especial#

omogenato celular

nCcleos

mitocondrias

microsomas

ribosomas

citosol

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vacorefrigeraci

Fraccionamiento subcelular

ETAPAS

> %eparaci4n de componentes

La separaci4n de part#culas uorganelas 0ue no presentan unatendencia a sedimentar

espont-neamente' re0uiereaumentar la uerza gravitatoriaa trav/s de la centriugaci4n .

Centr"u2%#"-n

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Fraccionamiento subcelular

ETAPAS

> %eparaci4n de componentes

centr#ugarotor

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Fraccionamiento subcelular

ETAPAS

> %eparaci4n de componentes

La velocidad de sedimentaci4n de cada part#culaLa velocidad de sedimentaci4n de cada part#culaes proporcional a su tamaAo,

es proporcional a la densidad de la partculaaumenta al incrementarse la uerza

gravitatoria

5entriugaci4n dierencial5entriugaci4n dierencial

7ediante centriugacionescorrelativas y crecientes en

velocidad' se logranseparar los principales

componentes celulares

sobrenadante

sedimento o;pellet

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Fraccionamiento subcelular

omogenato pelletc/lulas enteras'nCcleos.

1Jg1K

JgK

8Jg1(

1Jg5(

pelletmitocondrias'

lisosomas'pero1isomas

pellet

microsomas

pellet

ribosomas'grandes macromol/culas

por centriugaci4n dierencial

sobrenadantecitosol

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Gradiente de sacarosa

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Fraccionamiento subcelularpor centriugaci4n dierencial

54mo se conirma el ;/1ito< de la t/cnica

:eterminando actividades enzim-ticas

espec#icas de una organela

"eriicando la morolog#a mediantemicroscop#a electr4nica