RMN de proteinasRMN de proteinas

• Ahora mas o menos conocemos las tecnicas que se utilizan en la determinacion de redes de acoples (estructura quimica) y distancias internucleares (estructura 3D, conformacion).

• Vamos a ver como se utilizan en el estudio de estructura 3D y preferencias conformacionales de macromoleculas, en particular proteinas. Vamos a tratar de cubrir en dos calses algo para lo que se han escrito muchos libros…

• Hay ciertas cosas que tenemos que mencionar antes de hacer una analisis de las tecnicas de RMN de proteinas:

1) La informacion que obtenemos no es ni mejor ni peor que los datos de rayos-X. Nos da una imagen que puede ser considerada complemetaria a la cristalografica. En ciertos aspectos experimentales es mas rapido que los rayos-X.

2) Una de las razones por las cuales es mas rapido es que no necesitamos cristales. Esto nos da dos ventajas. Primero, no tenemos que esperar por los cristales, y segundo, pode- mos hacerlo aunque la muestra no cristalize (esto se da mucho con peptidos flexibles, oligosacaridos, etc.).

3) Nos da la estructura 3D en agua, que es el solvente donde ocurren las reacciones biologicas (las enzimas y las drogas interactuan en agua).

4) Nos da informacion sobre la dinamica de la molecula. No es una imagen estatica.

Breve resumen de estructura de proteinasBreve resumen de estructura de proteinas

• Antes de ver como determinamos la estructura 3D de una proteina por RMN, vamos a repasar un poco de bioquimica…

• Las proteinas/peptidos estan armados de 20 aminoacidos. Esto nos va a hacer la vida mas facil…

• La estructura quimica de la proteina es la secuencia de aminoacidos que la forman. Siempre la escribimos del NH2

libre al COOH libre:

• Esto es la estructura primaria. Vemos claramente que entre entre cada AA tenemos grupos C=O. Osea, el sistema de espines de cada AA esta aislado del de los otros.

• Por esta razon el espectro 1H de la proteina es, en principio, una superposicion de los espectros de los AA aislados. Sin embargo, hay pequeñas desviaciones de corriemientos qui- micos causadas por una estructura definida, y esto es lo que nos permite estudiarlas por RMN…

N

O

AA3O

AA2 H

NN

O

AA1H

H

H H

H

N

H

residuo

grupopeptidico

Estructura de proteinas (continuado)Estructura de proteinas (continuado)

• La forma en que los residuos de la proteina se organizan lo- calmente es la estructura secundaria. Los elementos mas comunes de estructura secundaria son la -helice y la hoja plegada (paralela o antiparalela):

• Otro elemento importante de estructura secundaria es el bucle (-turn), ya que le permite a la cadena cambiar de direccion:

Las basicas de la RMN de proteinasLas basicas de la RMN de proteinas

• La estructura terciaria es como todo se acomoda (o no) en solucion, o como los distintos elementos de estructura secun- daria se organizan espacialmente entre ellos.

• Lo primero que tenemos que saber es donde aparecen los picos de los 1Hs de los aminoacidos en el espectro:

• Como estan muy cerca unos de otros, despues de 3 o 4 aminoacidos necesitamos hacer espectroscopia 2D para poder resolver las señales.

• Como dijimos antes, no hay conexion entre los distintos AAs: No podemos determinar cual es cual. Para poder determinar la estructura de una proteina por RMN necesitamos saber la estructura primaria de la proteina.

• El primer paso a seguir es asignar todas las señales del espectro 1H a los protones de todos los aminoacidos de la proteina.

Aromaticos

Iminas Amidas HC, , , ... HC

agu

a

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Asignacion de sistemas de espinesAsignacion de sistemas de espines

• Para hacer esto, nos valemos de los espectros 1H 1D (si es un peptido), COSY, y TOCSY. Ya hemos visto como un TOCSY nos permite identificar todo un sistema de espines.

• En proteinas, cada aminoacido nos va a dar una linea inde- pendiente en el TOCSY empezando en el NH y llendo hasta el ultimo proton de su cadena lateral.

• Las unicas excepciones son Phe, Tyr, Trp, e His, donde el sistema de espines de la cadena lateral esta dividido en dos por un carbono cuaternario.

• Con suerte podemos asignar todas las señales a amino- acidos, pero lo mas probable es que nos queden algunas sin asignar porque esten solapadas. Si pasa esto necesitamos mas dimensiones y/o proteina marcada (mas luego…).

• De cualquier manera, una vez que todos los sistemas de espines estan identificados, tenemos que ‘atarlos’ unos a otros y determinar su posicion en la estructura primaria.

• Tenemos dos formas de hacer esto. Una es el metodo de asignacion secuencial, y el otro el metodo de cadena principal.

• Los dos metodos se basan en que hay correlaciones NOE caracteristicas de 1Hs del residuo i a los de residuos (i ± n).

Patrones NOE caracteristicosPatrones NOE caracteristicos

• Las mas simples de identificar son correlaciones interesi- duales y secuenciales, que corresponden con NOEs entre protones de un residuo a protones de residuos (i ± 1):

• Aparte de estos, regiones de estructura secundaria definida van a dar NOE caracteristicos. En -helices y hojas :

N

O

AA3O

AA2 H

NN

O

AA1H

H

H H

H

N

H

dNdNN

dd, d, …

dN, dN, …

d

i+4i+3

i+2

i

i-1

C

N

C

N

N

C

N

C

d(i)N(j)

d(i)(j)

dN(i)N(j)i+1

d(i, i+3)

dN(i, i+3)

dNN(i, i+3)

dN(i, i+4)

Asignacion secuencialAsignacion secuencial

• En el metodo de asignacion secuencial tratamos de atar sis- temas de espines por medio de conectividades NOE secuen- ciales (de un residuo a residuos i + 1 y/o i - 1).

• La idea es elejir un residuo cuyas señales esten bien resuel- tas en el TOCSY y despues buscar en el NOESY correlacio- nes NOE secuenciales de sus protones a protones en otros sistemas de espines.

• Estas son generalmente correlaciones dNN, dN, and dN. En este momento tambien podemos buscar correlaciones d

para establecer la identidad de los residuos aromaticos, Asn, Arg, Gln, etc…

• Despues de encontrar esos, volvemos al TOCSY para identi- ficar a que residuo corresponden las correlaciones que vimos en el NOESY. Esos protones van a estar en residuos i ± 1.

• Hacemos esto hasta que se nos acaban los residuos (i.e., hasta que llegamos a una punta de la cadena peptidica), o hasta que tenemos mucho solapamiento.

• Como podemos tener muchos puntos de partida y direccio- nes, el metodo se ‘valida’ a si mismo automaticamente.

• Se han propuesto varios algoritmos para hacer esto de forma computarizada. Cada uno de estos metodos tiene pros y con- tras, pero todos requieren de un usuario ‘capaz’…

Asignacion secuencial (continuado)Asignacion secuencial (continuado)

• Esto lo podemos ver en un diagrama simple (no encontre nada muy lindo entre lo mio…).

• Digamos que estamos miarando cuatro lineas en el TOCSY que corresponden a Ala, Asn, Gly y Leu. Tambien sabemos que tenemos Ala-Leu-Gly en el peptido, y no en otro orden.

• En el TOCSY vemos todos los espines. En el NOESY tene- mos correlaciones intraresiduales ( ) e interesiduales ( ) que nos permiten determinar que residuos contiguos en la cadena peptidica.

TOCSY NOESY

Leu

AlaAsn

Gly

NH

HC

Leu

AlaAsn

Gly

NH

HC

Metodo de cadena principalMetodo de cadena principal

• Este metodo fue propuesto por Wüthrich (el abuelo del RMN de proteinas y ganador del Nobel en Quimica del 2003 por su trabajo en el area). Ya hemos visto que regiones de estructu- ra secundaria definidas dan patrones de NOE regulares.

• ¿Qut tal si, en vez de hacer la asignacion secuencial y perder tiempo en regiones que tengan estructura indefinida, nos concentramos en buscar estos patrones de NOE regulares?

• Esto es exactamente lo que hace este metodo. Buscamos patrones de NOE ciclicos, que se dan generalmente cuando tenemos estructura secundaria definida.

• Cuando encontramos estos patrones de NOE, tratamos de correlacionarlos con fragmentos de la estructura primaria de la proteina/peptido. Es ideal para hacer por computadora:

- El programa primero busca -helices (busca correlaciones

d(i, i+3), dN(i, i+3), dNN(i, i+3), dN(i, i+4), etc…).

- Despues que elimina todos los picos correspondienes a helices, busca hojas (regiones en que las conectividades son de cosas que estan alejadas una de otra en la estructu- ra primaria).

- Despues de eliminar estos, busca bucles y regiones de es- tructura indefinida.

Estructura secundaria y terciariaEstructura secundaria y terciaria

• A pesar de que el metodo de cadena principal encuentra patrones de estructura secundaria, el fin es identificar los residuos en el espectro (i.e., asignar sistemas de espines). Todavia hay que buscar la estructura secundaria/terciaria.

• Si usamos el metodo de cadena principal, ya tenemos casi todo el trabajo hecho (casi el 90 %), porque las regiones de estructura secundaria definida (-helices, hojas ) ya las tenemos identificados.

• Si usamos el metodo secuencial tenemos casi todos los NOE entre el residuo i e i + 1 y i - 1, o de rango corto. Solo nos queda buscar correlaciones NOE de rango medio (i + 2, 3, y 4) y de rango largo (> i + 5).

• La cantidad y tipo de NOEs de rango largo obviamente de- pendera de la estructura secundaria/terciaria del peptido.

• Estos NOEs son agrupados en tablas. Se les asigna un valor dependiendo de la intensidad de la correlacion (i.e., el volu- men del cross-peak) usando una referencia interna de inten- sidad, como ser un NOE entre 1Hs del CH2 de una Phe).

• Como en las macromoleculas podemos tener distintos pro- cesos de relajacion compitiendo, los NOEs no tienen un valor unico. Generalmente los agrupamos como fuertes, medios, y debiles.

• Luego vamos a ver como los convertimos a ‘distancias’ ...

Lo que el NOE nos dice y lo que no nos diceLo que el NOE nos dice y lo que no nos dice

• Ahora tenemos casi todo: Los sistemas de espines identifi- cados, sus NOEs secuenciales, medios, y largos medidos, y sus intensidades tabuladas.

• A esta altura vamos a tener algunos conflictos en las asig- naciones. En particular, hay casos en los cuales vamos a ver ciertos NOE pero no otros que ‘tendrian’ que estar alli…

• Esto es debido a que los NOE no solo dependen de la dis- tancia entre dos protones, pero tambien de la dinamica entre ellos (osea, el grado de movimiento de uno con respecto al otro). Esto va a ser importante en peptidos chicos, porque en estos casos tenemos mucha movilidad en las cadenas late- rales y en el esqueleto peptidico.

• Lo mas importante a tener en cuenta siempre es que no ver un NOE no significa que dos protones esten a mas de 5 Å.

• A su vez, un NOE puede surgir de un promedio de confor- meros del peptido. Podemos ver algo como NOE medio (1.8 a 3.3 Å), cuando en realidad es una mezcla de NOE fuerte (1.8 a 2.7 Å) y ausencia de correlacion:

Real: Aparente:

dij > 6 Å

dij < 3 Å dij ~ 3 Å

Acoples y angulos diedrosAcoples y angulos diedros

• Hasta ahora hemos visto como usar algunos datos de RMN para obtener parametros estructurales usados en la determi- nacion de estructuras 3D de macromoleculas en solucion.

• En particular, los NOE nos permiten determinar distancias aproximadas entre protones cercanos. Son muy utiles si los vemos entre protones que estan en residuos que esten dis- tantes uno de otro en la estructura primaria.

• Sin embargo, los NOE no nos permiten, en general, decir na- da acerca de la conformacion de enlaces con libre rotacion. Para determinar esto podemos usar acoples 3J que se obser- van en peptidos (o azucares, ADN, y ARN). Se pueden usar acoples 3J/2J homo/heteronucleares, pero nos vamos a con- centrar en el acople 3J homonuclear.

• Estos incluyen 3JN, que nos da informacion acerca de la

conformacion del esqueleto peptidico (), y 3J, que esta re-

lacionado con la conformacion de la cadena lateral ():

N

N

O

H

H

HH

H

AA

3JN

3J

3JN

3J

Acoples y angulos diedros (continuado)Acoples y angulos diedros (continuado)

• Como vimos, la constante de acoplamiento 3J esta relacio- nada con el angulo diedro por la ecuacion de Karplus.

• Como vimos antes, la ecuacion es una suma de cosenos, y dependiendo de la topologia (H-N-C-H or H-C-C-H) tenemos distintos parametros:

• Los parametros han sido derivados de moleculas rigidas y datos de rayos-X. Graficamente:

3JN = 9.4 cos2( - 60 ) - 1.1 cos( - 60 ) + 0.4

3J = 9.5 cos2( - 60 ) - 1.6 cos( - 60 ) + 1.8

3JN = 9.4 cos2( - 60 ) - 1.1 cos( - 60 ) + 0.4

3J = 9.5 cos2( - 60 ) - 1.6 cos( - 60 ) + 1.8

- 60

3 J (

Hz)

Acoples y angulos diedros (…)Acoples y angulos diedros (…)

• ¿Como medimos las 3J? Si tenemos pocos aminoacidos, directamente del 1D. Tambien las podemos medir de espe- ctros HOMO2DJ, o de espectros tipo COSY de alta resolu- cion (MQF-COSY y E-COSY).

• El problema mas grande de la ecuacion de Karplus es que

introduce ambiguedades. Si tenemos acoples 3JN menores

de 4 Hz y los pongo en la grafica vemos que podemos tener hasta 4 valores posibles para el angulo :

• En estos casos podemos hacer dos cosas. Una es tratar de determinar la estructura usando solo NOEs y despues confir- mar lo que nos da con los acoples J. Esto anda bien, pero estamos ‘tirando’ informacion util…

9.4

0.0

5.0 ~ -60 ~0 ~110

4.0

~170

- 60

Acoples y angulos diedros (…)Acoples y angulos diedros (…)

• Otra cosa que se puede hacer es usar solo los angulos que son mas comunes que conocemos de estructuras de rayos-X. Para , los angulos ‘estandar’ tienen valores ne- gativos de ~ -60 y ~ -170). Usando rangos:

• Para las cadenas laterales tenemos also similar, pero en este caso hay que elegir entre tres posibles rotameros (como en

etano…). Como se pueden medir dos acoples 3J (hay 2

protones ), nos permiten elegir el conformero adecuado:

3JN < 5 Hz -80 < < -40

3JN> 8 Hz -150 < < 170 (-190)

3JN < 5 Hz -80 < < -40

3JN> 8 Hz -150 < < 170 (-190)

N

N

N

C’

C’

C’H

H

H

H1 H2

CH1

H2

H1C

H2

C

3J1 < 5

(o vice versa)3J2

> 8

3J1 < 5

(o vice versa)3J2

> 8

3J1 ~ 3J2 < 5

3J1 ~ 3J2 < 5

Introduccion al modelado molecularIntroduccion al modelado molecular

• Ahora tenemos casi toda la informacion estructural que pode- mos sacar por RMN de nuestra muestra: tablas de NOEs con distintas intensidades (distancias), constantes de acople 3J, y rangos de angulos derivados de los acoples 3J.

• Tenemos que ver como usar toda esta informacion para ob- tener una ‘imagen’ de la molecula en solucion.

• Contrario a los rayos-X, con los que ‘vemos’ la densidad electronica de la molecula y pueden ser considerados como un metodo directo, con RMN solo obtenemos informacion in- directa acerca de la estructura, y esta informacion la dan unos pocos atomos (basicamente los 1Hs…).

• Por lo tanto nos valemos de un modelo teorico para repre- sentar a la macromolecula. En general, esto es un modelo molecular generado por computadora.

• Este puede tener distintos grados de complejidad:

- ab initio: Solo considera orbitales atomicos/moleculares y resolvemos la ecuacion de Schröedinger. No necesita pa- rametros. Computacionalemte caro (10 - 100 atomos).

- Semiempirico: Usamos algunos parametros para represen- tar a los orbitales atomicos/moleculares (100 - 500 atomos).

- Mecanica Molecular: Usamos un potencial parametrizado simple tipo masa-y-resorte (todo lo demas…).

Modelado molecular (continuado)Modelado molecular (continuado)

• Aca estamos lidiando con proteinas (miles de atomos), osea que usamos mecanica molecular (MM).

• El corazon de la MM es el campo de fuerza (force field) o las ecuaciones que describen la energia del sistema en fun- cion de las coordenadas xyz. En general es una suma de distintos terminos de energia:

• Cada termino depende de una forma u otra con la geometria

del sistema. Por ejemplo, Een, o potencial de enlace del sis- tema (bond stretching), es:

• Las distintas constantes (Kbs, ro, etc., etc.) son los parame- tros del campo de fuerza, y se obtienen a partir de datos ex- perimentales (rayos-X, microondas) o calculos a alto nivel de teoria (ab initio o semiempiricos).

• Distintos campos de fuerza incluyen distintos terminos, y necesitamos uno que tenga aquellos que representen bien a nuestro sistema (proteinas).

Etotal = EvdW + Een + Ean + Etor + Eelec + …Etotal = EvdW + Een + Ean + Etor + Eelec + …

Een = i Keni * ( ri - roi )2Een = i Keni * ( ri - roi )2

Incorporacion de datos de RMNIncorporacion de datos de RMN

• Lo bueno de los campos de fuerza para MM es que si tene- mos una funcion que relacione nuestros datos experimenta- les con las coordenadas xyz la podemos sumar directamen- te a la ecuacion del potencial total del sistema.

• Esto es lo que hacemos con los datos derivados de RMN. Para NOEs usamos rangos de distancias en vez de valores unicos porque podemos tener otros fenomenos de relajacion en juego, y/o promediado de NOEs:

• La funcion de energia potencial relacionada con estos rangos es una funcion cuadratica de base plana:

• Cuanto mas lejos este la distancia calculada en el modelo te- orico (rcalc) del rango determinado experimentalmente, mas

grande la penalizacion. Estas son restricciones de NOE.

ENOE = KNOE * ( rcalc - rmax )2 si rcalc > rmax

ENOE = 0 si rmax > rcalc > rmin

ENOE = KNOE * ( rmin - rcalc )2 si rcalc < rmin

ENOE = KNOE * ( rcalc - rmax )2 si rcalc > rmax

ENOE = 0 si rmax > rcalc > rmin

ENOE = KNOE * ( rmin - rcalc )2 si rcalc < rmin

NOE fuerte 1.8 - 2.7 ÅNOE medio 1.8 - 3.3 ÅNOE debil 1.8 - 5.0 Å

NOE fuerte 1.8 - 2.7 ÅNOE medio 1.8 - 3.3 ÅNOE debil 1.8 - 5.0 Å

Incorporacion de datos de RMN (continuado)Incorporacion de datos de RMN (continuado)

• De manera similar podemos incluir restricciones en el rango de angulos o constantes de acoplamiento:

• Graficamente, las funciones tienen este aspecto:

EJ = KJ * ( Jcalc - Jmax )2 si Jcalc > Jmax

EJ = 0 si Jmax > Jcalc > Jmin

EJ = KJ * (Jcalc - Jmin )2 si Jcalc < Jmin

EJ = KJ * ( Jcalc - Jmax )2 si Jcalc > Jmax

EJ = 0 si Jmax > Jcalc > Jmin

EJ = KJ * (Jcalc - Jmin )2 si Jcalc < Jmin

Rcalc, calc, o Jcalc

E

0

rmin

min

Jmin

rmax

max

Jmax

E(Kcal/mol)

Optimizacion de estructurasOptimizacion de estructuras

• Ahora tenemos todas las funciones incluidas en el potencial de la molecula, incluyendo interacciones covalentes (enlace, angulos, y torsiones), no covalentes (vdW, electroestatica), y restricciones NOE y 3J derivadas de RMN.

• Para obtener un modelo estructural del peptido decente hay que minimizar la energia del sistema, lo que implica encon- trar un conforermo de baja energia (o el de mas baja energia) o una familia de conformeros de baja energia.

• En una funcion con la cantidad de variables que tenemos en un peptido esto es laborioso, porque tenemos una super- ficie de n dimensiones (cada uno de las variables que esta- mos optimizando). Para y en un disacarido:

• Tenemos picos (maximos) y valles (minimos) de energia.

Optimizacion de estructuras (continuado)Optimizacion de estructuras (continuado)

• Minimizar la funcion implica ‘bajar’ en la (hiper)superficie de energia de la molecula. Para esto neceitamos calcular las derivadas CRA xyz (las variables) de todos los atomos:

• Esto nos permite ver como vamos ‘para abajo’ para todas las variables, y por lo tanto determinar que direccion hay que tomar para minimizar la energia del sistema.

• La minimizacion solo ‘baja.’ Podemos tener muchos minimos locales en la superficie, y si solo usamos minimizaciones el sistema puede quedar atrapado en uno de estos. Esto es lo que sucede en proteinas, donde tenemos cientos de grados de libertad (considerando solo enlaces con libre rotacion…).

• En estos casos necesitamos otros metodos para encontrar el minimo de energia. Uno de estos metodos es la dinamica molecular (DM).

• Como tenemos la funcion potencial del sistema, le podemos dar energia (por ejemplo, ‘elevar’ la temperatura) y ver como evoluciona. Un aumento de temperatura implica mas energia cinetica y la posibilidad de superar barreras energeticas.

Etotal Etotal> 0 Etotal < 0 Etotal

xyz xyz

Etotal Etotal> 0 Etotal < 0 Etotal

xyz xyz

Dinamica molecular y enfriamineto simuladoDinamica molecular y enfriamineto simulado

• En las DMs ‘calentamos’ el sistema a una temperatura fisica- mente ‘razonable,’ ~ 300 K. La energia por mol a esta tempe- ratura es ~ RT, donde R es la constante de Boltzmann (por mol). Si hacemos los numeros, esto es ~ 0.5 Kcal/mol.

• Esto puede ser suficiente para ciertas barreras, pero no para otras que seguramente vamos a tener en el sistema. Para estos casos necesitamos un metodo de busqueda conforma- cional mas drastico, como ser el templado simulado.

• ‘Calentamos’ el sistema a temperaturas ridiculamente altas (2000 K), y despues lo dejamos enfriar lentamente. La idea es que este proceso permite que el sistema pase por barre- ras energeticas considerables, y al enfriarse produzca con- formeros estables y de baja energia.

Conformeros‘calientes’

Conformeros‘frios’

T

Tiempo (generalmente ps)

Geometria de distanciaGeometria de distancia

• Otro metodo compleatmente diferente a la DM y al TS es la geometria de distancias. Vamos a presentar solo lo que nos da pero no como funciona.

• Basicamente, randomizamos las coordenadas xyz de los atomos del peptido dandoles limites altos y bajos por fuera de los cuales los atomos no pueden estar. Aca incluimos los enlaces y las restricciones de RMN.

• Esto nos da una matriz de distancias limite, que es optimi- zada por medio de un algoritmo SIMPLEX (desigualdades de trinagulos), lo que se conoce como suavizado de la matriz. Las estructuras que salen de esto no estan optimizadas, y generalmente las mejoramos por DM y/o minimizacion.

• Este esquema da un resumen de como los distintos metodos hacen que la estructura se mueva en la superficie de energia potencial del sistema:

ME

DMTS GD

Presentacion de resultadosPresentacion de resultados

• La idea es samplear el espacio conformacional al que la proteina tiene acceso bajo los efectos de las restricciones estructurales que obtuvimos de los NOE y los acoples.

• Las estructuras que obtenemos por estos metodos que no muestren violaciones grandes de las restricciones que inclu- imos se dicen ser consistentes con los datos de RMN.

• Como ninguna de estas estructuras se puede descartar, lo que hacemos es presentarlas como un set de estructuras de baja energia superimpuestas en las regiones mas rigidas:

• En esta solo mostramos los atomos pesados del esqueleto peptidico. A pesar de que no lo buscamos, la flexibilidad de ciertas regiones indica una falta de restricciones NOE, y refleja que esa parte de la molecula es flexible en solucion.

N-termini

C-termini