revisión de aislamiento y purificación enzimática

7/24/2019 revisión de aislamiento y purificación enzimática

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Agradecimientos

A nuestros padres, quienes nos han apoyado con esfuerzo y abnegación para

el emprendimiento de nuestros estudios.



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Dedicatoria

El presente trabajo está dedicado a nuestros amigos, familiares y personas

involucradas en el campo de la biotecnología.



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Contenido1. Introducción.............................................................................................5

2. Generalidades..........................................................................................5

3. CAPÍTUL 1! "#tracción en$i%ática.........................................................&

3.1. '(todos )u*%icos..............................................................................&

3.1.1. Uso de en$i%as +idrol*ticas.........................................................&

3.1.2. Alteración del ,- de la solución..................................................&

3.1.3. Uso de detergentes.....................................................................&

3.1.. Uso de sol/ente orgánicos...........................................................0

3.1.5. Uso de soluciones +i,otónicas.....................................................0

3.2. '(todos *sicos..................................................................................

3.2.1. i4raciones ultrasónicas..............................................................3.2.2. -o%ogeni$ación con a4rasi/os...................................................

3.2.3. -o%ogeni$ación con +o%ogeni$ador Potter"l/e+6e%..............17

3.2.. Largos ,eriodos de %e$clado....................................................17

3.2.5. Adición de ,erlas de /idrio durante el %e$clado.......................11

3.2.8. Congelación9escongelación.....................................................11

. CAPÍTUL 2! Puri:cación en$i%ática......................................................12

.1. '(todos de,endientes del ta%a;o o %asa.....................................12

.1.1. Centriugación...........................................................................12

.1.2. <iltración en gel.........................................................................13

.1.3. 9iálisis o ultra:ltración..............................................................13

.2. '(todos de,endientes de la carga..................................................1

.2.1. Cro%atogra*a de interca%4io iónico........................................1

.2.2. "lectrooresis.............................................................................15

.2.3. "no)ue isoel(ctrico..................................................................15

.3. '(todos de,endientes de la solu4ilidad..........................................18.3.1. Ca%4io en el ,-........................................................................18

.3.2. Ca%4io en la uer$a iónica........................................................18

.3.3. 9ecre%ento en la constante diel(ctrica....................................18

.. '(todos de,endientes de sitios de unión es,ec*:cos.....................1&

..1. Cro%atogra*a de a:nidad.........................................................1&

..2. "lución de a:nidad....................................................................1&

5. CAPÍTUL 3! In%o/ili$ación en$i%ática.................................................10

5.1. Adsorción.........................................................................................10



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5.2. <or%ación de enlaces iónicos..........................................................10

5.3. <or%ación de enlaces co/alentes....................................................1

5.. <or%ación de enlaces cru$ados.......................................................27

5.5. Atra,a%iento...................................................................................27

5.8. "nca,sulación..................................................................................21

8. Conclusiones..........................................................................................21

&. =i4liogra*a.............................................................................................23

1. Introducción



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Las enzimas se encuentran distribuidas ampliamente en los sistemas vivos y

son un factor importante en el crecimiento, el mantenimiento y la propagación

del sistema vivo. De hecho, cualquier alteración en las enzimas puede conducir

a una condición patológica e incluso la muerte. Los primeros días de desarrollo

de la enzimología estaban llenos de controversias relacionadas con su

estructura, naturaleza química y funciones (Kularni y Deshpande, !""#$.

%na vez que se entiende que las enzimas tienen la capacidad de traba&ar en

sistemas libres de c'lulas, se comienza con los intentos para su aislamiento y

purificación. illst)tter y sus colegas entre *+!" y *+! llevaron a cabo los

primeros intentos de purificación de enzimas. Di-on y Kodama intentaron la

purificación de la -antina o-idasa.

La primera enzima para cristalizar la ureasa fue en *+! por /umner. 0sto fue

seguido por la purificación y cristalización de proteasas como tripsina y pepsina

por 1orthrop.

2. Generalidades

0n general la e-tracción y purificación de enzimas es requerida por las

siguientes razones2

• 3ara el estudio de varios aspectos de una enzima en particular.

• 3ara la identificación de sustratos y el sustrato específico de la enzima.• 3ara evaluar el papel de diversas coenzimas4cofactores en la velocidad

de reacción.

• 3ara investigaciones como componentes de diagnóstico.

• 3ara propósitos terape5ticos.

• 3ara el desarrollo de sistemas de enzimas inmovilizadas

comercialmente e-plotables para aplicaciones industriales,

fermentaciones y procesos de valor agregado.

• 3ara la li-iviación de minerales de importancia comercial.

• Las enzimas puras tambi'n se emplean en el procesamiento de

alimentos.

• Los estudios de inhibición de enzimas pueden indicar inhibidores

potenciales, que pueden ser utilizados para tratar trastornos metabólicos

y heredables.

Las enzimas extracelulares son más fáciles de aislar que las enzimas

intracelulares

6ndependientemente de la fuente de te&ido, es decir, plantas o animales, lasenzimas e-tracelulares son m)s f)ciles de recolectar. /u recolección



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generalmente no requiere la destrucción de los te&idos y por lo tanto se reducen

los gastos y tiempo requerido para procesos tales como homogeneización o

cualquier otro tipo de procesos (7ordero y 8erdugo, !""$.

Las enzimas vegetales y microbianas son generalmente más baratas

Los te&idos animales son una fuente m)s costosa para la producción comercial

de enzimas. 0sto es principalmente debido a que muchas veces el animal

completo tiene que ser comprado y sacrificado antes de que un te&ido u órgano

específico pueda ser aislado y utilizado como una fuente de la enzima (7astillo

et al., !""9$.

Una amplia gama de métodos está disponible para el aislamiento y

purificación de enzimas

0stos varían de acuerdo con muchos criterios, que incluyen la fuente de laenzima, su disponibilidad, el costo de los procesos, el factor tiempo involucrado

y la disponibilidad de los equipos (/trayer, et al., !""$. 0l aislamiento y

purificación enzim)tica generalmente sigue el siguiente proceso2

• 6dentificación de la fuente de enzimas.

• 3rocedimientos de mane&o generales para e-tractos de origen y crudo.

• :'todos para la e-tracción.

• :'todos para la purificación.

• Desarrollo de ensayos2 cualitativos y cuantitativos.

• 0stabilización y cristalización.• 7riterios de pureza.

• :'todos para la preservación de enzimas aisladas.

3. CAPÍTULO 1 !"tracción en#i$%tica

Los m'todos de e-tracción enzim)tica pueden ser divididos en dos grupos2

m'todos químicos y m'todos físicos.



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3.1. '(todos )u*$icos

3.1.1.Uso de en#i$as +idrol*ticas

/e utilizan deferentes tipos de enzimas como lisozimas, proteasas y lipasaspara remover partículas localizadas en la membrana produciendo la formación

de agu&eros a trav's del cual el líquido intracelular y org)nulos pasan a la

solución (;une y 7ase, !""#$.

3.1.2.Alteración del ,- de la solución

/ometer las c'lulas a un entorno de p< alterado provoca que las proteínas de

la membrana celular se coagulen conduciendo a la formación de poros a trav's

de los cuales el líquido intracelular salga como un homogeneizado (Durs y

=oel, !""#$.3.1.3.Uso de deterentes

Los detergentes rompen la barrera lipídica solubilizando las proteínas e

interrumpiendo la interacción lípido>lípido, lípido>proteína y proteína>proteína.

Los detergentes iónicos desnaturalizan la proteínas y si dividen en detergentes

aniónicos (lauril sulfato sódico, colato sódico, /D/$, y catiónicos (bromuro de

cetil>trimetil>amonio$, por otro lado los detergentes no iónicos preservan

estructura nativa e interacciones de la enzima (?@een, /pam, ?riton$ (Koolmany Aohm, !""B$.

Los inconvenientes que se manifiestan con el uso de los detergentes es que

pueden provocar la desnaturalización total de las proteínas, y adem)s se los

debe remover despu's de la e-tracción.

3.1.4.Uso de sol/ente or%nicos

Las membranas son bicapas lipídicas y los solventes org)nicos apropiados

como acetona, cloroformo, 'ter, etc., son a menudo empleados para disolver



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los lípidos conduciendo a la formación de poros, entonces el citoplasma de la

c'lula fluye hacia fuera como un homogeneizado crudo (Lodish, et al., !""$.

3.1.5.Uso de soluciones +i,otónicas

La suspensión de c'lulas en soluciones hipotónicas conduce a la absorción de

agua y su inflamación que conduce a una presión de turgencia que es lo

suficientemente grande para hacer que las c'lulas estallen. 3or lo general, se

emplean soluciones de sacarosa o soluciones de K76 (/u)rez, !""$.

3.2. '(todos *sicos

3.2.1.iraciones ultrasónicas

Las c'lulas se someten a vibraciones ultrasónicas que resultan en su

destrucción y la formación de un homogeneizado.



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3.2.2.-o$oeni#ación con arasi/os

Los te&idos vegetales o te&idos microbianos con pared celular son a menudo

sometidos a homogenización con un material abrasivo tal como al5mina o

arena. 0l cizallamiento y la tensión provocan la ruptura de la pared celular que

conduce a la colección del líquido c'lular como un homogeneizado crudo.

/istemas de mortero mano de mortero simples o mezcladores y molinos se

utilizan para lograr los resultados deseados (Kularni y Deshpande, !""#$.

3.2.3.-o$oeni#ación con +o$oenei#ador Potter!l/e+e$

0l homogeneizador 3otter>0lveh&em se compone de un tubo de vidrio que

enca&a perfectamente en un pistilo de teflón que est) conectado a un motor de

alta velocidad. 0l te&ido para ser homogeneizado se pica y mezcla con la

cantidad apropiada de solución isotónica y despu's se somete a



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homogeneización a una velocidad muy alta (apro-imadamente "" rpm$

durante apro-imadamente 9 a *" minutos (Kularni y Deshpande, !""#$.

3.2.4.Laros ,eriodos de $e#clado

Las c'lulas, cuando son sometidas a largos períodos de mezclado se rompen

debido a las fuerzas mec)nicas de choque contra las paredes de la batidora

generando un crudo (/u)rez, !""$.

3.2.5.Adición de ,erlas de /idrio durante el $e#clado

La adición de perlas de vidrio o arena se emplea a menudo para aumentar el

cizallamiento mec)nico que hace el proceso m)s eficaz. C menudo se utilizan

mezcladores aring en el proceso. C veces tambi'n se emplean instrumentos

con los a&ustes de velocidad (/u)rez, !""$.



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3.2.6.Conelación8esconelación

0sto se basa en el hecho de que al congelarse las mol'culas de agua forman

el hielo que se e-panden en m5ltiples tamaos y causan tensión en la

membrana celular que conduce a su destrucción. La descongelación que

provoca la fusión del hielo que conduce a la formación de un homogeneizado

crudo (:uoz, !""*$.

4. CAPÍTULO 2 Puri9cación en#i$%tica

%na vez que se obtiene el homogeneizado crudo, el ob&etivo de un

procedimiento de purificación debería ser para aislar una enzima de inter's con

el m)-imo rendimiento posible. Cdem)s, la preparación debe poseer la



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capacidad m)-ima de la cat)lisis. 0n otras palabras, debe estar libre de

contaminación de otras proteínas inactivas y activas.

Los m'todos de purificación enzim)tica pueden ser clasificados de acuerdo a

diferentes propiedades de la enzima de inter's como el tamao o masa, carga,

solubilidad y sitios de unión específicos (Kularni y Deshpande, !""#$.

4.1. '(todos de,endientes del ta$a:o o $asa

0stos m'todos dependen del principio general de que las mol'culas

sedimentan a diferentes velocidades dependiendo de su tamao o masa.

Clgunos de los m'todos empleados con frecuencia incluyen2

4.1.1.Centriuación

Las grandes mol'culas tales como enzimas pueden ser sedimentadas por las

altas velocidades (hasta E"","""g$ generadas por una ultracentrífuga. Cunque

la velocidad a la que cualquier enzima en particular se sedimenta depende de

una variedad de factores, incluyendo el tamao y la forma de la mol'cula y la

viscosidad de la solución, se encuentra que en general, cuanto mayor sea el

peso molecular, mayor es la tasa de sedimentación. 0ste m'todo no se utiliza

ampliamente en procedimientos de purificación para separar una enzima de

otra porque sólo un volumen pequeo (unos pocos mL$ puede ser tratado

dentro de una ultracentrifugadora. /in embargo la centrifugación esampliamente utilizada para eliminar el material insoluble precipitado en el curso

de aislamiento, por e&emplo, para eliminar los desechos de c'lulas despu's de

la homogeneización o para recoger la enzima que ha sido precipitada por la

adición de sales (/trayer, et al., !""$.

4.1.2.;iltración en el

;iltración en gel o cromatografía de permeación en gel es un m'todo de

separación que depende del tamao molecular. 0l m'todo tambi'n se conoce

como tamiz molecular, o cromatografía de e-clusión molecular. /u e-celente



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reproducibilidad, comparativamente corto tiempo y equipo relativamente barato

hace que sea el m'todo de separación m)s ampliamente utilizado

0n una columna con perlas de gel o gr)nulos de vidrio poroso se pone un

solvente para que las mol'culas sean separadas. /i la mezcla de mol'culas de

diferente tamao se coloca en la parte superior de una columna, las mol'culasgrandes pasan a trav's de los espacios intersticiales entre las perlas. 0sto es

porque los poros del gel tienen un di)metro m)s pequeo de lo que se necesita

para que las mol'culas grandes puedan entrar. 3or lo tanto, las mol'culas

grandes se mueven hacia deba&o de la columna con poca resistencia. Las

mol'culas pequeas sin embargo pueden entrar en los poros y son por lo tanto

eliminadas de manera efectiva del flu&o del disolvente de elución (Lodish, et al.,

!""$.

Las t'cnicas utilizadas son la cromatografía de columna o cromatografía en

capa fina.

4.1.3.8i%lisis o ultra9ltración

%na membrana de di)lisis, tal como el celof)n puede ser usado para separar

las proteínas o mol'culas globulares con un peso molecular de alrededor de

!", """ Dalton. 0l tamao de poro puede ser cambiado por diversos

tratamientos mec)nicos y químicos. 0l m'todo se utiliza de manera rutinaria

para separar pequeas mol'culas org)nicas, sales y disolventes org)nicos a

partir de los e-tractos crudos. La capacidad de mane&o de volumen es

generalmente ba&a. 0l proceso no se puede emplear para separar una enzima

de otra (/trayer, et al., !""$.

La ultra filtración por otro lado es una modificación del procedimiento de

di)lisis en la que pequeas mol'culas y iones pasan a trav's de una

membrana de di)lisis ba&o la influencia de la presión aplicada (por lo general

gas nitrógeno a B atm. de presión$. 0sto conduce a la concentración de la



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solución de enzima, que es 5til en la reducción del volumen de la muestra de

e-tracto durante el procedimiento de purificación.

4.2. '(todos de,endientes de la cara

0stos m'todos dependen del hecho de que las enzimas puedan tener cadenas

laterales cargadas que dan a la mol'cula una carga neta y que la movilidad de

la mol'cula cargada ba&o un campo el'ctrico depende de las cargas estas

llevan. Clgunos de los m'todos utilizados habitualmente incluyen los siguientes2

4.2.1.Cro$atora*a de interca$io iónico

0l intercambio de iones puede ser definido como el intercambio reversible de

iones en solución, con iones, electrost)ticamente unidos a un medio de soporteinerte. La fuerza de la atracción electrost)tica a su vez depende de la carga

relativa, el radio de los iones hidratados, y el grado de las interacciones no

enlazantes.

La t'cnica emplea generalmente columnas de intercambio iónico. <ay dos tipos

de intercambiadores de iones, intercambiadores de aniones e intercambiadores

de cationes. 0l medio es un medio de soporte inerte que est) unido

covalentemente a un grupo funcional positivo (intercambiador de aniones$ o a

un grupo funcional negativo (intercambiador catiónico$. Los iones

electrost)ticamente unidos al intercambiador se conocen como contraiones(Durs y =oel, !""#$.

0sta t'cnica es muy 5til en la separación de compuestos cargados e incluso

compuestos no cargados que se pueden marcar con un grupo cargado o una

varianza de p<.

4.2.2.!lectrooresis

La electroforesis es la migración de partículas o mol'culas cargadas en un

medio ba&o la influencia de un campo el'ctrico aplicado. ?ras la suspensión en

un disolvente acuoso casi todas las partículas incluyendo biomol'culas tales



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como enzimas adquieren cargas positivas o negativas. La adquisición de tales

cargas depende de la naturaleza de la partícula4mol'cula y el disolvente.

0stos grupos determinan la densidad de carga neta de la mol'cula proteica, lo

que hace que se mueva en un campo el'ctrico en una dirección, y a una

velocidad dependiente de la seal y la cantidad de esta densidad de carganeta. 6ncluso si dos mol'culas tienen la misma carga, no pueden migrar &untos

porque si hay diferencia en sus pesos moleculares tendr)n diferente cargo2

relación en masa (Lodish, et al., !""$.

4.2.3.!no)ue isoel(ctrico

0n la t'cnica del enfoque isoel'ctrico, por otro lado, un gradiente de p< estable

est) dispuesto, el p< aumenta gradualmente de )nodo a c)todo. %na proteína

se introduce en este sistema en un punto donde el p< es inferior a su punto

isoel'ctrico, la cual poseer) una carga neta positiva y migrar) en la dirección

del c)todo. Debido a la presencia del gradiente de p<, la proteína migrar) a un

ambiente de valores de p< sucesivamente m)s altos, que a su vez, influenciar)

en la ionización y carga neta de la mol'cula. ;inalmente la proteína se

encontrar) con un p< en el que su carga es cero y se detendr) la migración.0ste es el punto isoel'ctrico de la proteína (Kularni y Deshpande, !""#$.

4.3. '(todos de,endientes de la soluilidad

La solubilidad de un compuesto en un disolvente dado depende del equilibrio

de las fuerzas entre soluto y soluto y aquellas entre soluto y disolvente. /i elprimer caso predomina, el compuesto ser) insoluble en cambio si el segundo



P á g i n a | 1&

de afinidad2 (*$ la cromatografía de afinidad utiliza la afinidad, en la etapa de

adsorción de la enzima de inter's, a un intercambiador de iones y (!$ la elución

de afinidad utiliza la especificidad en la etapa de desorción, las cuales son

descritas brevemente a continuación2

4.4.1.Cro$atora*a de a9nidad

La t'cnica e-plota la capacidad de especificidad, la unión no covalente de

enzimas con otras mol'culas llamadas ligandos. La mayoría de las veces un

sustrato an)logo (una mol'cula que se aseme&a al sustrato pero no causa

reacción fructífera$ específico para la enzima de inter's se une a una matriz

sólida e inerte (como agarosa$. 7uando la mezcla se carga en la parte superior

de la columna, sólo la enzima deseada se unir) al an)logo de sustrato

inmovilizado y deber) retardar. ?odas las otras enzimas y proteínas pasar)n

aba&o y hacia fuera de la columna (Durs y =oel, !""#$.

4.4.2.!lución de a9nidad

0s una t'cnica complementaria a la cromatografía de afinidad. /e utiliza con

mezclas de enzimas parcialmente purificadas y es m)s venta&osa que la

cromatografía de afinidad pues2 se eliminan las reacciones comple&as de unión

del an)logo de sustrato y las columnas son m)s baratas porque los

intercambiadores de iones son m)s baratas que las matrices de afinidad (Durs

y =oel, !""#$.

5. CAPÍTULO 3 In$o/ili#ación en#i$%tica

%na nueva dimensión se aadió al desarrollo de enzimología con los avances

en las t'cnicas que permiten la inmovilización enzim)tica en una matrizinsoluble sin ning5n efecto adverso sobre sus actividades.



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0-isten varias venta&as al usar enzimas inmovilizadas por e&emplo, las enzimas

pueden reutilizarse y usarse de manera continua, reduce el costo de

procesamiento, me&or recuperación del producto, eficiencia del tiempo,

estabilidad de la enzima, me&or control de cat)lisis, eficiencia en los procesos y

sistemas de diagnóstico r)pidos (Crroyo, *++$.

:uchos m'todos han sido usados para la inmovilización de enzimas, algunos

m'todos importantes son descritos a continuación.

5.1. Adsorción

La adsorción est) mediada por enlaces iónicos, enlaces hidrofóbicos o puentes

de hidrógeno. La agitación de la enzima con una resina de intercambio iónico

puede causar su adsorción. ?ambi'n se puede hacer mediante cambios en el

p<, fuerza iónica de la solución o alterando la concentración.

0l proceso es venta&oso ya que, es simple y de ba&o costo, requiere

tratamientos suaves, se puede aplicar en c'lulas enteras, así como enzimas

aisladasH sin embargo, hay algunas desventa&as que incluyen, la enzima unida

se puede li-iviar durante el cambio en el p<, y si el sustrato tiene una carga

similar puede interferir con la unión de la enzima (=arcía, et al., !""B$.

5.2. ;or$ación de enlaces iónicos

/e utiliza una matriz de soporte que tenga un grupo iónico adecuado o, a su

vez las mol'culas inertes son etiquetadas con un residuo iónico adecuado que

permite la unión de la enzima con la matriz. (/i la enzima lleva una carga

positiva, entonces la matriz debe llevar cargas negativas para asegurar la unión

iónica$. 0sta es tambi'n una t'cnica de superficie.

Las venta&as de la t'cnica incluyen, mayor especificidad, menor contaminación,

incluso me&or distribución a lo largo de la superficie o sección transversal de la

columna. Las desventa&as son, requerimiento de materiales de soporte

específico, alto costo de las columnas, la susceptibilidad de las mol'culas

cargadas puede interferir con la unión iónica (Ichoa, et al., !"**$.



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5.3. ;or$ación de enlaces co/alentes

0s la t'cnica m)s ampliamente utilizada. La enzima se une a las mol'culas de

soporte a trav's de enlaces covalentes, mediante la activación del polímero

con un grupo reactivo. Los materiales utilizados como matriz incluyen, celulosa,

agar, agarosa, u otros polímeros. Las cadenas laterales de amino)cidos

contienen grupo hidro-ilos y aminos que se unen con el soporte o el reactivo

utilizado como puente.

La t'cnica tiene las siguientes venta&as2 la unión es específica, hay poco o

nada de elución, hay una amplia variedad de soportes, materiales de matriz y

agentes puente. Las desventa&as de la t'cnica incluyen2 el procedimiento

requiere de mucho traba&o, los costos son altos, los procedimientos son

complicados, requieren ambientes severos y son difíciles de replicar (Ichoa, et

al., !"**$.

5.4. ;or$ación de enlaces cru#ados

Las enzimas pueden unirse alternadamente a un soporte mediante el uso de un

reactivo bifuncional que se une al polímero por un lado y la enzima de inter's

en el otro. 0l reactivo act5a como un puente entre el polímero y la enzima. 0l

agente preferido es el glutaraldehído sin embargo tambi'n se utilizan otros



P á g i n a | 27

reactivos como adipimato de dimetilo. ?ambi'n se ha utilizado alternativamente

la copolimerización con proteína inerte como la alb5mina (Kularni y

Deshpande, !""#$.

5.5. Atra,a$iento

0l m'todo se basa en el atrapamiento de las enzimas o c'lulas completas

dentro de los polímeros de matrices insolubles. La enzima se incorpora dentro

de la matriz, a diferencia de la unión superficial en la t'cnica de adsorción. La

enzima se mezcla inicialmente con la solución del monómero y luego se activa

la polimerización durante la cual la enzima queda atrapada dentro de la matriz

formada. La polimerización puede efectuarse mediante reacciones químicas,

cambio en el p<, o cambio en la temperatura (Crroyo, *++$.

Las venta&as del atrapamiento son2 es un procedimiento sencillo, requiere poca

instrumentación, se basa en tratamientos leves, no inactiva la enzima, no crea

ninguna restricción en las enzimas. Las desventa&as del m'todo son2 se

pueden crear impedimentos est'ricos para grandes sustratos que interfieren

con la velocidad de reacción, en los casos en que los geles se compacten

puede afectar a la actividad en un grado menor, en algunos casos los poros de

la matriz son lo suficientemente grandes y se puede producir la elución de la

enzima.



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5.6. !nca,sulación

Las enzimas son muchas veces encerradas dentro de estructuras

membranosas que permiten la entrada de sustratos y la salida de productos, y

adem)s las enzimas no son capaces de pasar a trav's de ellas. Diversos

materiales como el nylon, silicatos, nitrato de celulosa, fosfolípidos o liposomas

se pueden utilizar para la fabricación de materiales de encapsulación.

La t'cnica tiene las venta&as siguientes2 el proceso es simple, es barato,

proporciona un )rea superficial grande con respecto a volumen, no requiere

aparatos costosos e instrumentación. Las desventa&as son las siguientes2 las

enzimas pueden no ser estables, no se puede utilizar en gran escala (Crroyo,

*++$.

6. Conclusiones

Las enzimas se encuentran en todos los sistemas vivos y se las ha utilizado

desde que se encontró que pueden funcionar fuera de las c'lulas.

0l uso de enzimas tiene diversas aplicaciones entre las principales tenemos2

diagnóstico de enfermedades, propósitos terap'uticos, aplicaciones

industriales, fermentaciones procesamiento de alimentos, entre otros.

La e-tracción de enzimas e-tracelulares es m)s sencilla porque la enzima es

e-cretada al medio y no se necesita de procesos para la destrucción de te&idos.

=eneralmente las enzimas vegetales y microbianas son m)s baratas que las

enzimas de origen animal.

3ara la producción de una determinada enzima generalmente se usa el

siguiente proceso2 identificación de la fuente de enzimas, procedimientos de

mane&o generales para e-tractos de origen y crudo, m'todos para la e-tracción,

m'todos para la purificación, desarrollo de ensayos2 cualitativos y cuantitativos,



P á g i n a | 22

estabilización y cristalización, criterios de pureza y m'todos para la

preservación de enzimas aisladas.

Los m'todos de e-tracción enzim)tica pueden ser divididos en m'todos

químicos (uso de enzimas hidrolíticas, detergentes, disolventes org)nicos,

soluciones hipotónicas y alteración de p<$ y m'todos físicos (vibracionesultrasónicas, homogenización, congelación$.

Los m'todos de purificación enzim)tica pueden dividirse dependiendo de las

propiedades de la enzima de inter's como el tamao o masa, carga, solubilidad

y sitios de unión específicos.

0ntre los m'todos de inmovilización enzim)tica m)s comunes tenemos a la

adsorción, formación de enlaces iónicos, covalentes y cruzados, atrapamiento y

encapsulación, que incrementan el n5mero de aplicaciones del uso de

enzimas.

&. <iliora*a

• Crroyo, :. (*++$. 6nmovilización de enzimas. ;undamentos, m'todos y

aplicaciones. Crticulo recuperado * de septiembre !"*E de2

http244@@@.fbioyf.unr.edu.ar4evirtual4pluginfile.php4*"EE4modJresource4con

tent4*4Cne-o!"6nmov.pdf

• 7astillo, et al. (!""9$ Fiotecnología ambiental. 0ditorial ?'bar2 :adrid>

0spaa.



P á g i n a | 23

• 7ordero, 3. 8erdugo, L. (!""$. Cpuntes de Fioquímica <umana.

%niversidad de 7uenca. ;acultad de 7iencias :'dicas. 0cuador.

• Durs, <. =oel, =. (!""#$. uímica org)nica e-perimental. 0ditorial

Aevert'. Farcelona>0spaa

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revisión de aislamiento y purificación enzimática

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