Resistencia a Hongos Fitopatogenos

AgrobiotecnologíaCurso 2008

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y CelularFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

Resistencia a hongos fitopatógenosmediante ingeniería genética

Alejandro Mentaberry

Agrobiotecnología

Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética

SumarioPatógenos fúngicos de importanciaagronómica

Referencias

Modulación de la respuesta oxidativa

Inducción de respuestas defensivas

Expresión de proteínas de defensa deorigen vegetal

Transformación con genes de resistencia

Sobrexpresión de genes que regulanrespuestas defensivas

Expresión de proteínas antifúngicasde otros organismos

Interferencia con el proceso de infección

Detoxificación de toxinas fúngicas

Patógenos fúngicos de importancia agronómica

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Estrategiasde patogenia:necrotrofía

Hongos necrotróficos:Invaden agresivamente los tejidos de la planta y matan a lascélulas para obtener nutrientes mediante toxinas o enzimas.

Tomado de: Redepapa

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Infección deSolanumtuberosum porFusarium spp.

Infección deSolanumtuberosum porAlternaria spp.

Erysiphe cichoracearum

Hongos biotróficos:Parásitos obligados que se nutren de células vivas. Crecenen el espacio intercelular, invadiendo sólo unas pocascélulas con estructuras de absorción llamadas haustorios.Las royas, oídios y mildius están comprendidos dentro deeste grupo de hongos.

Infección de trigo por Erysiphe graminis

Estrategiasde patogenia:biotrofía

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Islotes verdes

Tomado de: Redepapa, APSNet

Infección de Solanum commersoniipor Phytophtora infestans.

Infección de frutos de tomatepor Phytophthora infestans.

Hongos hemibiotróficos:

Se comportan como parásitos biotróficos durante los primerosestadios de la infección. Al avanzar la colonización, el tejidomuere y continúan su ciclo como necrotróficos. Entre ellos, elde mayor importancia agronómica es Phytophtora infestans.

Estrategiasde patogenia:hemibiotrofía

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Tomado de: APSNet

Arriba derecha: Síntomas provocadospor Ustilago maydis en mazorcas demaíz

Abajo izquierda: Infección conGibberella zeae en espigas de cebada

Arriba izquierda: Roya producida porPuccinia polysora en hojas de maíz

Daños causados por hongos fitopatógenos

Necrosis ycolapso de lashojas de papaprovocado porPhytophthorainfestans

Dañoscausadospor hongosfitopatógenos

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Resistenciaa hongosmediantetransgénesis

Tizón tardío dela papa

provocado porPhytophthora

infestans

Lesiones concentricas causadas por Colletotricumgloeosporioides (izquierda arriba) y manchas causadas por

Podosphaera leucotricha (izquierda abajo) en frutos dedurazno. Derecha arriba: Manchas necroticas en papayacausadas por Stemphyliun lycopersici. Derecha abajo:pudrición en pepinos causada por Rhizoctonia solani

Daños causados por hongos fitopatógenos

Infecciónprovocada porSigatoka Negraen plátano(Mycosphaerellamusicola)

Distintosestadios deinfección enVitis viniferapor Guignardiabidwellii

Dañoscausadospor hongosfitopatógenos

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Los apresorios son estructuras fúngicasespecializadas en atravesar la cutícula.

Los haustorios aumentan elintercambio de sustancias entre elhongo y las células del huesped.

Muchos hongos desarrollan estructuras especialespara penetrar y colonizar los tejidos de la planta

Micelio de Peronspora parasiticadesarrollando haustorios en células

de Arabidopsis thaliana (40x)

Gentileza Dr. A. Vojnov

• Prácticas tradicionales de prevención

- Selección de variedades naturalmente resistentes

- Empleo de técnicas de mejoramiento tradicional (introducción de genes de resistencia)

- Rotación de cultivos

- Uso de condiciones de almacenamiento controladas

- Uso intensivo de fungicidas

Introduce costos de producción.Afecta el medio ambiente.Es riesgoso para los operarios.Puede ser neutralizado por el riego o la lluvia.Puede originar fungoresistencia.

El manejo deenfermedadesfúngicas sebasa en lasprácticaspreventivasy en laaplicación defungicidas

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- Las pérdidas económicas debidas al ataque de los hongos fitopatógenos superan los U$S 200.000 millones anuales.- Se invierten anualmente cerca de U$S 6.000 millones en la protección de cultivos contra enfermedades fúngicas.

Tomado de: FAOSTAT, FAO Database

Las enfermedadesde origen fúngicoocasionanfuertes pérdidasproductivas ygrandes gastosen agroquímicos

Consumo promedio de funguicidas(103 Tm; 1990/1998)

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A: Respuesta hipersensible.Célula de mesófilo de lechuga

penetrada por haustorios deBremia lactucae

B: H2O2 en paredes célulares delechuga infectadas por

Pseudomonas syringae

C: Formación de papilas en hojasde cebada infectadas

por Erysiphe graminis

D) Acumulación de proteínas ricasen hidroxiprolina (HRGP)

en pecíolo de Brassicaeinfectado por Xhantomonas

E: Deposición de calosa en hojasde Arabidopsis infectadas

con Peronospora parasitica

F: Formación de lesiones en hojasde tabaco infectadas por TMV

G: Lignificación en hojasde colza infectadas por

Lethosphaeria maculans

H: Formación de tilosasen xilema de cacao

infectado por Verticillium dahlia

I: Inducción del promotorde glucanasa en hojas

de tomate infectadas porCladosporium fulvum

Distintos tipos de respuestas inducibles

Modelo simplificado de la interacciónentre productos de genes R y Avr

Los productosde los genesR y Avrdesencadenanlas respuestasdefensivas delas plantas

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Los genes Avr codifican factores (elicitores específicos)que interaccionan directa o indirectamente con

los productos de los genes R.

Rutasinvolucradasen reaccionesdefensivas

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ACC: ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico; BAG: glucósido del ácido benzoico; BA-2H: ácido benzoico 2-hidroxilasa; CA: ácido cinámico; cGMP: guanosina 5’-monofosfato cíclico; CHS: chalcona sintetasa; EFE: enzimaformadora de etileno; GP: glutatión peroxidasa; GST: glutatión S-transferasa; HMGR: 3’-hidroxi-3-metilglutaril-CoA

reductasa; HO2. : radical hidroxiperoxil; HPDase: hidroxiperóxido dehidrogesa; MAP: proteína activadora de mitosis;

NO: óxido nítrico; OH. : radical hidroxilo; O2.-: radical superóxido; OGA y OGA-R: fragmentos de oligogalacturónido

y receptor; PAL: fenilalanina amonio liasa; Pgases: poligalacturonasas; PM: membrana plasmática; PR: proteínasrelacionadas con patogénesis; SA: ácido salicílico; SA. : radical de ácido salicílico; SAG: glucósido de ácido

salicílico; SIPK: quinasa inducida por ácido salicílico; WIPK proteín-quinasa inducida por heridas.

- Expresión de proteínas de defensa de origen vegetal

- Expresión de proteínas antifúngicas de otros organismos

- Combinación de proteínas antifúngicas

- Sobrexpresión de genes que regulan respuestas defensivas

- Modulación de la respuesta oxidativa

- Inducción de respuestas defensivas

-Transformación con genes de resistencia

- Interferencia con el proceso de infección

Estrategiaspara obtenerresistenciamedianteingenieríagenética

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Estrategias para obtener resistenciaExpresión de proteínas de defensade origen vegetal

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• Proteínas relacionadas a patogénesis (proteínas PR): Proteínas que se inducen frente al ataque de un patógeno. Expresadas individualmente, proveen resistencia parcial. Muestran efectos sinérgicos expresadas en combinación.

• Defensinas: Péptidos pequeños (≅ 5 kDa), ricos en cisteína. Muestran actividad antifúngica in vitro. Extracelulares (PR12).

• Tioninas: Péptidos pequeños (≅ 5 kDa), ricos en cisteína. Antifúngicos y antibacterianos. Son secretadas a vacuolas, cuerpos proteicos y pared celular (PR13).

• Fitoalexinas: Compuestos de bajo peso molecular (no proteicos) con actividad antibacteriana y/o antifúngica. Se sintetizan rápidamente en respuesta a la infección con patógenos o el tratamiento con elicitores.

• RIPs: Proteínas inactivadoras de ribosomas, actúan depurinando el rRNA 28S. Clasificadas en dos tipos (I y II)., El Tipo I suele ser el menos tóxico.

Compuestosqueparticipande lasrespuestasdefensivasde lasplantas

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Expresiónde proteínasde defensade origenvegetal

Familias de proteínas relacionadascon la patogénesis (proteínas PR)

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Proteínas de transferencia de lípidos

Tioninas

Defensinas

Quitinasa clase Vde tabaco

PR-1 de perejil

Peroxidasa de tabaco

Quitinasa de pepino

P69 de tomate

Inhibidor I de tomate

S de tabaco

R de tabaco

P, Q de tabaco

PR-2 de tabaco

PR-1a de tabaco

Miembro tipo

Antifúngica, antioomycete

AntifúngicaPR-14

AntifúngicaPR-13

AntifúngicaPR-12

QuitinasaPR-11

Tipo ribonucleasaPR-10

PeroxidasaPR-9

QuitinasaPR-8

EndoproteinasaPR-7

Inhibidor de proteinasasPR-6

Antifúngica, antioomycetePR-5

AntifúngicaPR-4

QuitinasaPR-3

Glucanasa ß 1→3PR-2

PR-1

CaracterísticasFamilia

Proteínas de transferencia de lípidos

Tioninas

Defensinas

Quitinasa clase Vde tabaco

PR-1 de perejil

Peroxidasa de tabaco

Quitinasa de pepino

P69 de tomate

Inhibidor I de tomate

S de tabaco

R de tabaco

P, Q de tabaco

PR-2 de tabaco

PR-1a de tabaco

Miembro tipo

Antifúngica, antioomycete

AntifúngicaPR-14

AntifúngicaPR-13

AntifúngicaPR-12

QuitinasaPR-11

Tipo ribonucleasaPR-10

PeroxidasaPR-9

QuitinasaPR-8

EndoproteinasaPR-7

Inhibidor de proteinasasPR-6

Antifúngica, antioomycetePR-5

AntifúngicaPR-4

QuitinasaPR-3

Glucanasa ß 1→3PR-2

PR-1

CaracterísticasFamilia

Transformaciónde canolacon un gende quitinasade tabaco

A: canola notransgénica (izquierda)y canola transformadascon un gen de quitinasade tabaco bajo elcontrol del promotorp35S de CaMV a los 14días de crecimiento enun suelo inoculado conRhizoctonia solani

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B: Tasa de mortalidadde plántulas de canolatransgénica (círculoscerrados) y control(círculos abiertos).Los datoscorrespnden a cuatroexperimentosindependientes con 12plantas cada uno

Tomado de: Nishizawa et al. Plant Mol. Biol., 2003.

El gen Gns-1 de arroz esanálogo a genes de glucanasade otros organismos.Su sobrexpresión acelerala aparición de RespuestaHipersensible frentea Magnaporthe grisea.

Sin embargo,la sobrexpresiónno regulada afecta la fisiologíade la planta y provocala aparición espontáneade puntos necróticos(fenotipo lession-mimic)

Expresióndel gen deglucanasaGns-1en arroz

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WT GNS-1

3 mm

WT GNS-1

Co-transformación de Nicotiana tabacum con un gende quitinasa de arroz y un gen de glucanasa de alfalfa

Protección contra Cercospora nicotianaeen plantas transgénicas de tabaco

A: Resistencia a C. nicotianae en plantas detabaco T2 heterocigotas para los genes de

quitinasa y glucanasa. El desarrollo de laenfermedad se midió por el tamaño de las

lesiones en el sitio de inculación con el hongo.

B: Resistencia a C. nicotianae en plantas detabaco T3 homocigotas para los genes de

quitinasa y glucanasa

C: Análisis cuantitativo del efecto protectorde la combinación de transgenes. Eldesarrollo de la enfermedad se mide

como el porcentaje del área con lesionesa los 2 días de la inoculacion con C. nicotianae

D: Severidad de la enfermedad en ensayos deinvernadero. Se muestra la distribución de

lesiones por hojas en plantas control (barrasabiertas) y de una planta transgénica

homocigota para ambos genes (barras sólidas)

Círculos vacíos: plantas control; círculos llenos: dobles transgénicas;círculos divididos: transgénicas para glucanasa o quitinasa

• RIPs (Ribosome Inactivating Proteins)- Son proteínas inactivadoras de la función ribosomal.- Actúan depurinando el ARNr de 28S.

• Fitoalexinas- Compuestos de bajo peso molecular (no proteicos) con actividad antibacteriana y/o antifúngica.- Se sintetizan rápidamente en respuesta a la infección con patógenos o el tratamiento con elicitores.

Otroscompuestosdefensivosfrente apatógenos

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Letucinina

Kievitona

Expresión combinada de genes antifúngicos

Apariencia de plantas transgénicas y control que co-expresan altos niveles de RIP yquitinasa (CHI) a los 18 d de desarrollo en un ensayo de infección con Rhizoctonia solani

Co-transformación de Nicotiana tabacum con genesde quitinasa, glucanasas y RIP de cebada

Tomado de: Jach et al. The Plant Journal ,1995.

InfectadaCHI / RIP

InfectadaSR1

No infectadaSR1

a % de proteína de fluido apoplástico.b Basados en datos de plantas transgénicas transportando las construcciones de 1 solo gen.c % de proteína foliar total.

Reducción de DI esperada y medida para líneastransgénicas que expresan GLU/CHI y RIP/CHI

Tomado de: Jach et al. The Plant Journal ,1995.

0 %

12 %

30 %

Suma

0 %

20 %

10 %

CHI

0 %

5 %

20 %

GLU

Reducción de DI (esperada)b

60 %1,12,0pGJ40-2

49 %0,35,9pGJ40-1

CHIaGLUa

25 %0,10,25pGJ40-3

Reducción de DI (medida)

Nivel de expresiónPlanta

29 %

40 %

0 %

Suma

7 %

14 %

0 %

CHI

22 %

26 %

0 %

RIP


55 %0,50,10pGJ40-2

26 %0,10,005pGJ40-1

CHIcRIPc

50 %0,20,07pGJ40-3



0 %

12 %

30 %

Suma

0 %

20 %

10 %

CHI

0 %

5 %

20 %

GLU


60 %1,12,0pGJ40-2

49 %0,35,9pGJ40-1

CHIaGLUa

25 %0,10,25pGJ40-3



29 %

40 %

0 %

Suma

7 %

14 %

0 %

CHI

22 %

26 %

0 %

RIP


55 %0,50,10pGJ40-2

26 %0,10,005pGJ40-1

CHIcRIPc

50 %0,20,07pGJ40-3



Secuencia peptídica de dos defensinas de rábano. Las líneas de conexión indican puentes disulfuro.

- La mayoría de las defensinas vegetales presentan actividad antifúngica.- Su actividad estaría dada por la formación de poros en las membranas o por la alteración de la distribución de cargas.- Otras defensinas son capaces de inhibir α-amilasas, sugiriendo un rol en la defensa frente a insectos.

Los péptidos antimicrobianos poseen una estructurasimilar en moluscos, insectos, plantas y mamíferos

Tomado de: Thomma et al. Planta, 2002.

Defensinas

Las defensinas son péptidos pequeños ricos encisteína que se acumulan durante la germinaciónde las semillas y en el transcurso de reacciones

defensivas de planas en crecimiento. Constituyenla versión vegetal de los péptidos líticos

involucrados en la respuesta innata en animales.

Ensayo in vivo para estimar la potencia de la defensinaAFP2 de rabanito. En presencia de la defensina las

hifas no se elongan y aparecen deformes e hinchadas

3 µg/mlRs-AFP2

H2O (control)

Agrobiotecnología

Resistenciaa hongosmedianteIngeniería genética

Liberación de compuestos antifúngicos porsemillas de rabanito en germinación

En la posición 1 se aplicó 1 µg de Rs-AFP1; en la posición2 se aplicaron semillas intactas de rabanito; en la posición

3 se aplicaron semillas con una incisión en su cubierta.Para el ensayo se usó el hongo Pyrenophora triticirepentis

A: Ensayo con agar control; B: Ensayo con agarcomplementado con 50 µg/ml de pronasa E; C: Ensayocomo en A, pero autoclavando la defensina Rs-AFP1y las semillas; D: Ensayo con agar complementado

con 100 µM de ácido abscísico

Inmunolocalización de defensinas Rs-AFP de semillaA: sección teñida con Amido Black para proteínas totales. El haz

vascular se observa en el centro del hipocótilo;B: Inmunolocalización de Rs-AFPs.

Barras: 1 mm. C: cotiledón; E: endosperma; H: hipocótilo;SC: cubierta de la semilla

Las defensinas se sintetizan abundantementedurante la germinación de las semillas

Tomado de: Kawata et al. JARQ, 2003.

Sintransformar

Transgénica Control sininocular

Ensayo de infección con Pyricularia griseaSobrexpresiónde unadefensinade Brassicaoleracea enOryza sativa

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- Las tioninas se encuentran en el endosperma, tallos,raíces y en hojas etioladas o estresadas de muchasespecies vegetales.

-Son tóxicas para las bacterias gram-positivas o gram-negativas, hongos, levaduras y varios tipos de célulasde mamíferos.

-Su efecto tóxico requiere la interacción con fosfolípidosde membrana cargados negativamente, seguido por laformación de poros o la interacción con dominiosespecíficos de la membrana.

-Es posible que la interacción con ciertos fosfolípidosinvolucrados en la transducción de señales altere elmetabolismo en células de mamíferos.

Las tioninasson proteínasde bajo pesomolecularcon actividadantimicrobiana

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α-hordotioninade cebada

Tomado de: RCSB/Protein Data Base Código: 1WUW

Sobrexpresiónde la tioninaThi1.2 enArabidopsisthaliana

Ensayos de infección con Fusarium oxysporium

Ecotipo resistenteUk-4

Ecotipo Col- 2transgénico

Ecotipo Col- 2sin transformar

Tomado de: Epple et al., The Plant Cell, 1997.

Crecimiento normal deFusarium oxysporium

matthiolae en Col-2 sintransformar

Enrollamiento enCol-2 transgénica

Hiperramificaciónen Col-2

transgénica

Agrobiotecnología


Ensayos de resistencia a Peronospora parasítica

Se introdujo el gen pnAMP-h2 de Pharbitis nilen tabaco, bajo el promotor constitutivo 35S. Estegen codifica un péptido de la familia de la heveína.

Tomado de: Koo et al. Plant Mol. Biol., 2002.

Expresiónde un péptidoantimicrobianode Pharbitis nilen tabaco

Agrobiotecnología


Línea transgénica Línea control

Estrategias para obtener resistenciaExpresión de proteínas antifúngicasde otros organismos

Agrobiotecnología


Expresióndel gen deendoquitinasadeTrichodermaharzianum

Resistencia a Alternaria alternata de plantas de tabacotransformadas con un gen de endoquitinasa

de Trichoderma harzianumSíntomas de enfermedad a los 15 días de la inoculación y actividad de

endoquitinasa en extractos de hojas de líneas transgénicasrepresentativas. La actividad endoquitinasa se expresa como pmoles

de 4-metilumbiliferona liberados de 4-metilumbeliferil-β-D-N-N’-N”-triacetilquitotriosa/min/µg de proteína

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A) Plántulas cultivadas por 5 díasen agar

1: controles sin patógeno2: controles infectados3: plantas transgénicas sin patógeno4: plantas transgénicas con patógeno

B) Plantas transgénicas y controlescultivadas en suelo infestadocon Rhizoctonia solani. Las plantasmás erguidas son transgénicas (cajasde la derecha). En la esquina inferiorizquierda se muestran plantas controlno infectadas. Las cajas centrales y lasuperior izquierda corresponden acontroles no transgénicos infectados

Tomado de: Lorito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998.

Expresión de quitinasa de Trichoderma harzianum

Resistencia a Rhizoctonia solani en plantas transgénicas

A

B

1 2

3 4

Resistencia a Rhizoctonia solani de plantas de tabaco transformadas con un gen de endoquitinasade Trichoderma harzianum. Se grafica el crecimiento de las plantas entre 14 y 30 días en un sueloinfectado por R. solani. El crecimiento está expresado como porcentaje de la altura obtenida en

suelo no infectado, el que se tomó como 100%. Las plantas control se indican con flechas.

Expresión del gen de endoquitinasade Trichoderma harzianum

Resistencia de plantas de tabaco y de papa transformadas con el gen de endoquitinasade Trichoderma harzianum a Botrytis cinerea y Alternaria solani, respectivamente

A: tamaño de las lesiones (mm2) producidas en plantas de tabaco control y transgénicasa los 10 y 14 d de la inoculación con B. cinerea. B: número de lesiones observadasen plantas de papa control y transgénicas a los 9 d de la inoculación con A. solani

Expresión del gen de endoquitinasade Trichoderma harzianum

Tomado de: Nakajima et al..Plant Cell Report. 1994.

Ensayo de infección de plantas de tabacocon Erysiphe cichoracearum

- También se ha observado resistencia a Erysiphe heraclei y a Alternaria dauci en plantas de zanahoria transformadas con el mismo gen.- La misma línea transgénica muestra resistencia a. Pseudomonas syringae pv. tabaci.

Transformaciónde plantasde tabacocon el gende la lisozimahumana

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Transgénica WT

Esquema radial de la magainina,péptido obtenido de Xenopus laevis

Tomado de: Matsuzaki, Biochimica et Biophysica Acta,1998.

Modelo de acción de péptidos tipomagainina en asociación con la membrana

Las glándulas dorsales de los anfibiosson una fuente rica en péptidos antimicrobianos

Los péptidoslíticos se uneninicialmente ala membranaplasmática (A),En etapassucesivas,forman porosen la misma (B)ydesestabilizanla estructurade la bicapalipídica (C) .

Tomado de: De Gray et al.,Plant Physiol., 2001.

Ensayo de infección con Colletotrichum destructivum

También se observó actividad in vitro contra Aspergillusflavus, Fusarium moniliforme, y Verticillium dahliae.

Expresióndel péptidoMSI-99, encloroplastosde tabaco

TransgénicaControl

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Halo de inhibicióndel crecimientode Pseudomonassyringae pv tabacialrededor dediscos de hoja.4: Líneatransgénica.WT: planta sintransformar.

Respuestaa Phytophthoranicotianaede plantasde dos semanasde edad,de las mismaslíneas.

Expresióndel gen deesculentinade Ranaesculentaen tabaco

Tomado de: Ponti et al. Biochem. J,. 2003.

wt 4

wt 4

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Actividad antifúngica in vitro de sarcotoxina 1Ade Sarcophaga peregina

(A) Supresión del crecimiento de micelios por sarcotoxina 1A (20 h de incubación a 28ºC).(B) Efecto de sarcotoxina 1A en el crecimiento hifal de Rhizoctonia solani (12 h de

incubacción). (C) Pérdida electrolítica aumentada del micelio de R. solani tratado consarcotoxina 1A (medido en dextrosa de papa tras 1 h de incubación). (D) Pérdida de la

integridad de membrana del micelio el tratamiento con sarcotoxina 1A (16 h de incubación).

Resistencia aumentada contrapatógenos fúngicos en la línea

transgénica PSS41

A: Brotes control (35S::GUS) yPSS41 (derecha) inoculadoscon Rhizoctonia solani (luegode 2 d de inoculación).B: Sección transversal de loscotiledones infectados.C: Acumulación inducida desarcotoxina por inoculaciónfúngica.D: Resistencia aumentadacontra la infección de R. solanien brotes de PSS41.E: Resistencia aumentadacontra la infección de Pythiumaphanidermatum en brotes dePSS41.F: Síntomas suprimidos por lainfección de Pseudomonasnicotianae en plantas PSS41.

Actividad antifúngica in planta de sarcotoxina 1Ade Sarcophaga peregina

Infection assays with Fusarium solani

A: Control no transgénico; B: Transformado con el gen de lisozima; C: transformadocon el gen de dermaseptina; D: transformado con el gen de AP24 y el gen de lisozima;E: transformado con el gen de AP24, el gen de lisozima y el gen de dermaseptina; F:control no transformado no inoculado.

Plantas de Solanum tuberosum transformadas con genesde dermaseptina, AP24 y lisozima

AA B C

D E F

Ensayos de infección con Fusarium solani

3D 12 3D 7 3D 8 Ap 17 Ap 35 Ap 48 Ap 60 Banda55

Banda59

Banda80

Casa23

Casa 8 Wt

Controles H2O

0

100

200

300

400

500

Vol (

mm

)

Lineas

Controles H2O Infectadas

Ensayos de infección con Fusarium solani

Plantas de Solanum tuberosum transformadas con genesde dermaseptina, AP24 y lisozima

Estrategias para obtener resistenciaExpresión de genes relacionados con laregulación de la respuesta frente a patógenos

Agrobiotecnología


Expresiónde genesrelacionadoscon laregulación dela respuestaa patógenos

El gen NPR1 coordina varios tiposde respuesta de defensa

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Adapado de: McDowell and Doffenden, Trends in Biotechnolgy, 2003.

Tomado de: Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998.

Sobrexpresión del gen NPR1 en Arabidopsis thalianay ensayos de resistencia a Peronospora parasitica

Línea transgénica 35S-NPR1-H

WTConidióforosConidióforos

Control no transgénico

Transformaciónde arroz conel gen MK1 deCapsicum annum

La transformaciónde Oryza sativa conel gen de la proteínaquinasa activada pormitógenos (MK1)de Capsicum annumincrementa laresistencia aMagnaporthe grisea

La secuencia de laproteína codificadapor el gen MK1 poseeun 92% de identidadcon la proteín-quinasa inducida porheridas (WIPK) detabaco.

Tomado de: Da-Eun et al., Mol. Cells, 2004.

0 6 12 24 48 72 96 0 6 12 24 48 72 96

0 6 12 24 48 72 96 0 6 12 24 48 72 96

Wt M2

M18 M19

PR1a

PR1b

PR10

PR1a

PR1b

PR10

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Wt M2 M18 M19

Estrategias para obtener resistenciaActivación general de las defensas de la planta

Agrobiotecnología


• Elicitores- Son compuestos capaces de promover las respuestas de defensa de las plantas, aún en ausencia de patógenos.- Varios de ellos, como los oligogalacturonatos y las oligo-N-acetil-glucosaminas, son activos

en diversas especies vegetales; otros poseen actividad específica (por ejemplo, β-criptogeína).

• Expresión en plantas transgénicas- La planta transformada debe poseer receptores adecuados para el reconocimineto del elicitor.- Es preferible la expresión bajo promotores inducibles por la presencia o la acción del patógeno.- Si la expresión es regulada por el promotor adecuado, es posible desencadenar una respuesta frente a un patógeno no reconocido habitualmente por la planta.

Expresiónde elicitores

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También se observó resistencia a Thielaviopsis basicola,Erysiphe cichoracearum y Botrytis cinerea

Expresiónen tabaco delelicitor criptogeínade Phytophthoracryptogea bajoel promotorhsr203J induciblepor patógenos

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Fenotipos inducidos en líneas de tabaco transformadas al infiltrar las hojas con Phytophthora parasitica var. nicotianae.

Necrosis local en hojas.

Inoculaciones:a) Phytophthoraparasitica var. nicotianae virulenta.b) Phythophthora cryptogeaavirulenta (HR). c) Tratamientocon criptogeína pura.d) Agua.

Transgénicas XPR24

E8 E6 b12 E10E8 E6 b12 E10Wildtype

Tomado de: Keller et al., The Plant Cell,1999.

ab

c d

ab

cd

ab

c d

ab

cd

WT XPR24

Estrategias para obtener resistenciaTransformación con genes de resistencia

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El ciclo útil de un gen de resistencia dura entre 8 y 12 años

El uso continuado de cultivos portadores de genes Rpuede originar la aparición de patógenos resistentes

Adaptado de Adugna, Asian Journal of Plant Sciences, 2004

¿Cómo evitar la aparición de resistencia?

La introducción de varios genes R en la misma línea simplifica el manejo agronómico.

El uso de múltiples líneas transgénicas permite utilizar un fenotipo homogéneo.

Un cultivo homogéneo favorece la aparición de resistencia.

El uso de variedades con distintas resistencias aumenta la heterogeneidad.

Luego se evaluóla adquisiciónde resistenciaen las líneastransgénicas enensayoscontrolados.

Clonado del gen RB de Solanum bulbocastanum

Se transformaronplantas susceptibles(Solanum tuberosum cv.Katahdin) con distintassecuencias de ADNgenómico provenientesde una especie(Solanumbulbocastanum)resistente al patógenoPhytophthora infestans.

El fenotipo deresistenciapuede utilizarsepara clonarnuevos genesde resistencia

Tomado de: Song et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003.

Agrobiotecnología


1. Variedades de cebada susceptibles (S), medianamenteresistentes (MR) y resistentes (R).

2. El transgen se hereda según patrones mendelianos. A partirde un transgénico heterocigota, se obtienen descendientessusceptibles (S) y resistentes (R).

Tomado de: Horvath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003.

Latransformaciónde variedadesrelacionadascon genes Rpermite acelerarel proceso demejoramiento

Resistencia a la roya del tallo (Puccinia graminis)en cebada mediante introducción del gen Rpg1

Agrobiotecnología


Gol

den

Prom

ise

Mor

ex

Che

vron

Gol

den

Prom

ise

trans

géni

ca

S MR R S R

Gol

den

Prom

ise

Mor

ex

Che

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Gol

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Prom

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trans

géni

ca

S MR R S R1 2

Estrategias para obtener resistenciaModulación de la respuesta oxidativa

Agrobiotecnología


Modulaciónde larespuestaoxidativa

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) cumplenvarios roles de importancia en la defensa de la planta

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Resistenciaa hongosmedianteingeniería genética Adaptado de: Buchanan et al. Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.

BA.2H: dehidrogensa delácido benzoico

¿Cómo lograrlo?

- Inhibiendo enzimas detoxificadoras de H2O2 (catalasa, ascorbato peroxidasa).

- Introduciendo enzimas productoras de H2O2

Ejemplo: glucosa oxidasa (GO).

- Es importante considerar que un incremento excesivo de H2O2 puede resultar perjudicial para las células vegetales.

Es posibleaumentarlos nivelesendógenosde H2O2en la planta

Agrobiotecnología


COH

(CHOH)4

CH2OH

+ O2

COOH

(CHOH)4

CH2OH

+ H2O2

GOCOH

(CHOH)4

CH2OH

+ O2

COOH

(CHOH)4

CH2OH

+ H2O2

GOCOH

(CHOH)4

CH2OH

+ O2

COOH

(CHOH)4

CH2OH

+ H2O2

GO

Tomado de: Wu et al., Plant Physiol. 1997.

Transformaciónde Solanumtuberosum conel gen deglucosa oxidasade Aspergillusniger

Ensayo de infección con Verticillium dahliae

El hongo ataca las raíces y el sistema vacular. Las plantas notransformadas (Rus. Bur) o transformadas con el vector vacío(17227-1) exhiben síntomas severos. Las líneas transgénicas

(22587-43 y 22587-9) resultan resistentes. La foto fue tomada alos 40 días de la inoculación

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Hojas de plantas de papa transformadas con el gen GOinoculadas con esporangios de Phythophtora infestans. Lafotografía está tomada a los cuatro días de la inoculación

Transformaciónde papa conglucosa oxidasade Aspergillusniger bajoun promotorconstitutivo

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Estrategias para obtener resistenciaInterferencia con la patogénesis

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Los elicitores pueden ser moléculas producidas por el patógenoo productos de degradación de la planta: el modelo PG/PGIP

1: Las poligalaturonasas (PG)secretadas por la hifa del hongointeraccionan con los inhibidoresde poligalacturonasas (PGIP)presentes en la pared celular.

2: Se liberan oligogalacturónidosque interaccionan con un receptorhipotético presente en la membranade la célula vegetal.

3: La transducción de la señalproducida a partir de esta interacciónprovoca la liberación de compuestosde defensa, incluidos los PGIPs.

4: La quitinasas, glucanasasy fitoalexians son secretadaspor la planta.

5: La hifa del hongo invasores atacada por los compuestosdefensivos.

Interferencia con el proceso de infección

Adaptado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.

Colonización por Botrytis cinerea en plantas de tomate controly transgénicas. Experimentos por duplicado inoculando conidias

de las cepas de B. cinerea B05.10 (infectiva; mitad izquierda de lashojas) y ∆Bcgp (no infectiva; mitad derecha de las hojas).

Sobrexpresiónde unaproteínainhibidorade poli-galacturonasade peral enplantas detomate

Tomado de: Powell et al., MPMI, 2000.Agrobiotecnología


Planta transgénicaB05.10 ∆Bcpg1

Planta controlB05.10 ∆Bcpg1

• Expresión de oxalato decarboxilasa- Se ha asociado el oxalato a la patogenicidad de Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia rolfsii, y Sclerotinia ceptivorum.

- Aunque no se conoce exactamente su función, podría actuar quelando el calcio de la pared celular (pectato de calcio) o adecuando el pH para favorecer la acción de enzimas celulolíticas.

- Se ha reportado que la presencia de oxalato decarboxilasas interfiere con el proceso de

infección.

La acumulaciónde oxalatose asocia a lapatogenicidadde varios hongosfitopatógenos delgéneroSclerotinia

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Molécula de oxalato

Los paneles superior e inferior muestran lesiones formadas a los 2 y 5 d de lainoculación con Sclerotinia sclerotiorum. S4 y S6 son líneas transgénicas. Las hojasenfermas muestran crecimiento del micelio, formación de lesiones y amarillamiento.

Expresión del gen de oxalato decarboxilasadel hongo Collybia velutipes en plantas de tomate

Sobrexpresión del gen de la enzima oxalato decarboxilasa (OXDC)en plantas de tomate bajo el promotor 35S de CaMV.

Tomado de: Kesarwami et al., J.Biol. Chemistry, 2000.

Control S4 S6

2 d.

p.i.

5 d.

p.i.

Control S4 S6

2 d.

p.i.

5 d.

p.i.

micelio

- La respuesta hipersensible (HR) se asemeja a la muerte celular programada (PCD) de mamíferos.

- Es posible que algunos hongos necrotróficos operen utilizando los mecanismos de muerte celular de la propia planta.

- Se han investigado en plantas los efectos de genes inhibidores de apoptosis provenientes de especies no vegetales, entre ellos, Bcl-2 y Bcl-xl humanos, CED-9 de nematodos, Op-IAP y p35 de baculovirus.

Existen genesantiapoptóticosque puedeninterferircon el procesode necrotrofía

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Expresión de proteína antiapoptóticap35 de baculovirus en tomate

Respuesta de raíces in vitro de tomate frentea la toxina AAL del hongo necrotrófico

Alternaria alternata (arriba) y de plantasresistentes, susceptibles y transgénicas

frente a la inoculación con el hongo eninvernadero (derecha). Asc: Planta controlresistente; asc: planta control susceptible;

p35: planta transgénicaLincoln et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002.

asc/asc sin toxina p35 sin toxina

asc/asc con toxina p35 con toxina

asc/asc sin toxina p35 sin toxina

asc/asc con toxina p35 con toxina

Tres frutos de un líneasusceptible (asc-asc,izquierda) y dostransgénicas con distintosniveles de expresión,inoculadas con conidiosde Alternaria alternata(centro y derecha).

Expresióndel gen p35de baculovirusen tomate

Medida del diámetrode las lesionesproducidas en el ensayo.asc/asc: líneasusceptiblep35-9 y p35-62: líneastransgénicas

Tomado de: Lincoln et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002.

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Estrategias para obtener resistenciaDetoxificación de toxinas fúngicas

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Detoxificaciónde eutipinamedianteuna enzimareductoraaislada deVigna radiata

• La eutipina [4-hidroxi-3-(3-metil-3-butene-1-inil) becil aldehído] es unatoxina producida por Eutypa lata, agentecausal de una grave enfermedad de lasvides

• Las vides resistentes al hongo tienenla capacidad de reducir eutipina aeutipinol, el cual no es tóxico

• Se aisló una aldehído reductasa-NADPH dependiente de Vigna radiata(VR-ERE) que es capaz de reducireutipina

• Se transformaron callos de Vitisvinifera con este gen y se expresó laenzima en forma constitutiva

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Expresión de VR-ERE en callos transgénicos de Vitis viniferaActividad de la enzima reductora de eutipina en callos no transgénicos

(WT) y en tres líneas transformadas con el gen VR-ERE


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Resistencia a eutipina en diferentes líneas de callostransgénicos transformados con el gen VR-ERE

Los callos control y transgénicos se cultivaron en presencia deconcentraciones crecientes de eutipina. El peso del tejido se determinó a las

4 semanas de cultivo. Cada punto representa 40 duplicados


Agrobiotecnología


Referencias 1. McDowell, J.M. and Woffenden, B.J. Plant diseaseresistance genes: recent insights and potential applications.Trends in Biotechnology, 21:178-182, 2003.2. Punja, Z.K. Genetic engineering of plants to enhanceresistance to fungal pathogens - a review of progress andfuture prospects. Canadian Journal of Plant Pathology, 23:216-235, 2001.3. Stuivers, M.H. and Custers, J.H.H.V. Engineering diseaseresistance in plants. Nature, 411:865-868, 2001.4. Ribeiro do Vale, F.X. Concepts in plant disease resistance.Fitopatología Brasileira, 26: 577-589, 2001.5. Melchers, L.S. and Stuiver, M.H. Novel genes for disease-resistance breeding. Current Opinion in Plant Biology, 3:147-152 2000.6. Honée, G. Engineered resistance against fungal plantpathogens.European Journal of Plant Pathology, 105:319–326, 1999.

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Resistencia a Hongos Fitopatogenos

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