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 ÁREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO 

PROGRAMA ACADÉMICO DE QUÍMICA 

ESPECIALIDAD TECNOLOGÍA AMBIENTAL

GRUPO

QU-304

MATERIA

Microbiología ambiental

TEMAReporte diagnostico microbiologico en sitio alterado Presa Blanca ( Puente 1)

de acuerdo a la norma NMX-AA-042/1-SCFI-2008 y NMX-AA-042/ 1-SCFI-1987.

PROFESOR

Dra. Rosy Rico Mata 

PRESENTAN Ávila Araujo Ilse Verónica

Gómez Navarro María GuadalupeGuerra Navarro Janet Valeria

Rendón Delgado Reyna María Guadalupe

GENERACION 2014-2016

22 DE JUNIO DEL 2015

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AntecedentesLa Presa Blanca se ubica en el estado de Guanajuato en el municipio de León, 

localizado en una altura de 1784 metros sobre el nivel del mar .Tiene una latitud(decimal) de 21.091667 N y la longitud en el sistema decimal es -101.69944 O .

Ilustración 1 Ubicación de la presa blanca, señalando conlos puntos amarillos en el área de muestreo

La creciente actividad industrial en el estado de Guanajuato ha traído consigola generación de grandes cantidades de efluentes (0.35 Hm3 d-1), parte de loscuales se descargan sin tratamiento a los ríos, capta las descargas de aguasresiduales en la presa Blanca y la ciudad de San Francisco.

Debido a esta problemática se tomó la iniciativa de muestrear esta zonacontaminada de la Ciudad de León, Guanajuato. Tomando como referencia un puntoespecífico de este lugar el cual se encuentra con coordenadas en N a 21°05´36.11” yO a 101°42´25.5”.Y a partir de ello  se tomaron muestras de agua y suelo paraposteriormente realizar una serie de análisis microbiológicos.

Ilustración 2: Punto de muestreo deagua

Ilustración 3: Punto de muestreo de suelo 

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Relatoría del muestreo

Comenzamos a alistarnos para nuestro muestreo desde las 8 a.m. del día 11de junio del 2015, recogiendo el material de laboratorio como; los frascos paraguardar las muestras, las cajas Petri con medio de cultivo Agar Bilis Rojo Violeta, la

hielera, hisopos, entre otras cosas.Partimos de la universidad a las 9:30 a.m. con destino al sitio de muestreo queestá ubicado en Presa Blanca en León, Guanajuato, con coordenadas N a21°05´36.11” y O a 101°42´25.5”. 

Llegamos a dicho lugar a las 10:20 a.m., nuestro punto de muestreo estabaubicado en el puente 1. El clima del lugar era soleado con una temperatura de28°C.

Comenzamos bajando el material del camión, para posteriormente empezar a

buscar un punto de muestreo, este punto está ubicado en las coordenadas N a21°05´36.0” y O a 101°42´24.5”. 

Ilustración 4: Partida de la UTL al lugardel muestreo Presa Blanca. 

Ilustración 5: Llegada al lugar demuestreo puente Presa Blanca 

Ilustración 6: Acomodando lascosas para posteriormenteseguir con el muestreo. 

Ilustración 7: Ubicación del punto demuestreo para suelo.

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Siendo las 10:48 a.m. nuestra compañera Reyna Rendón comenzó elmuestreo superficial en la caja Petri ya preparada con Agar Bilis Rojo Violeta,tomando con un hisopo estéril una pequeña muestra y haciendo la siembra en modozig-zag posterirmente la conservamos a 4°C resguardándola en una hieleraespecialmente para microbiología, terminando el muestreo a las 11:00 am.

 A las 11:05 a.m., hicimos un orificio de 30 cm de profundidad en el sueloutilizando una barrena, para hacer la siembra en otra caja Petri con medio de cultivo

 Agar Bilis Rojo Violeta. Nuestra compañera Ilse Ávila Introdujo el hisopo en laprofundidad del suelo, tomó la muestra y repitió el procedimiento de volver asembrar en modo zigzag. Al final se etiquetaron las cajas Petri sembradas de sueloy se conservaron a 4°C. Terminamos de sembrar las muestras de suelo a las 11:15a.m.

Ilustración 8: siembra de la muestra desuelo superficial. 

Ilustración 9: siembra en zigzag de suelosuperficial 

Ilustración 10: Cavando un unabarrena para hacer el orificio de30 cm 

Ilustración 11: Orifico listopara la siembre a 30 cm deprofundidad de suelo 

Ilustración 12: Siembra a 30 cm deprofundidad. 

Ilustración 13: Término de la siembra de suelo a

profundidad 

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Finalmente a las 12:14 p.m. Guadalupe Gómez tomó la muestra de agua del puente1.

Cuidadosamente se tomó con una jeringa estéril, 1 ml de agua residual,abrimos la caja Petri con el mismo medio de cultivo que las anteriores (Agar BRV) yla sembramos vertiendo el contenido de la jeringa en la caja Petri. Esta siembra fuerealizada por Valeria Guerra

Se terminó de sembrar agua y suelo a las 12:33 pm y se conservó a 4ªC enuna hielera para posteriormente trasladarla al laboratorio de la UniversidadTecnológica de León, siendo las 2:30 de la tarde partimos del lugar de muestreorumbo al laboratorio de la escuela.

Las incubación de las muestras fue a las 3:20 de la tarde esto lo realizo Ilse Ávila, terminando a las 3:30 p.m.

Dando por finalizado un aprendizaje más a las 3:40 pm

Ilustración 14; Punto de muestreo de agua 

Ilustración 15: siembra de la muestra de agua 

Ilustración163: Incubación de las muestras de suelo yagua sembradas 

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Técnica de muestreo

Lista de materiales

Las muestras para el análisis de coliformes fecales se toman en frascos devidrio o bolsas Whirl-pak de 300 mL.

 Agregar 1 gota de solución de tiosulfato de sodio al 1% a cada frasco paramuestra de agua (Nota 1).Se esterilizan los frascos de vidrio en autoclave a 121ºC, 15 lb de presión por

15 minutos, con un capuchón de papel estraza o aluminio cubriendo el tapón hasta elcuello, dicho capuchón no se quitará hasta el momento de tomar la muestra.

Para la recolección de las muestras, se toma la muestra en el centro del canalo colector donde el flujo sea turbulento, se sumerge el recipiente en el agua con elcuello hacia abajo hasta una profundidad de 15 a 30 cm, abrir y enderezar elrecipiente ligeramente hacia arriba, procurando que sea a contracorriente, sedestapa el recipiente y se llena hasta 2/3 partes, se tapa y se retira.

Preservación y conservación de la muestra:

Tabla. Especificaciones de almacenamiento de la muestra

Lista de materiales y herramientas (en campo)

1 Espátula pequeña Piceta1 Pipeta de 1, 5 y 10 mL Plumas10 Hisopos Pico y pala3 Pro-pipetas Termómetro4 Frascos de vidrio(esterilizados)

GPS

5 Cajas Petri. Hielera7 Bolsas / bolsas tipo ziploc HielosBitácora de campo Papel aluminio.Cinta masking-tape Plumón indeleble.

CuerdaPlano del área delmuestreo concoordenadas

EPP (Guantes, cubrebocas,zapatos de seguridad, bata, ylentes)

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Actividades en campo para llevar a cabo el muestreo de microbiología.

1.-Llegar al sitio del muestreo (Presa Blanca)2. Ubicar los puntos de muestreo (suelo y agua)3.-Realizar una siembra superficial de suelo, con un hisopo en una caja Petri conagar bilis rojo violeta, etiquetar y guardar en una bolsa ziploc la caja Petri e introduciren la hielera a 4°C.4.-Realizar una siembra a profundidad de suelo de 30 cm, con un hisopo en una cajaPetri con medio bilis rojo violeta, etiquetar y guardar en una bolsa ziploc la caja Petri

e introducir en la hielera a 4°C.5.- Tomar 1 mL de muestra de agua y distribuir en una caja Petri con medio bilis rojovioleta, etiquetar y guardar en una bolsa ziploc la caja Petri e introducir en la hieleracon un temperatura de 4°C, sin que la caja Petri quede invertida para que la muestrano se derrame.6.- Tomar 600 mL de muestra de agua, en 2 frascos esterilizados, si enjuagar,cuidando que el volumen de agua este a la mitad o tres cuartos del frasco, parapermitir la respiración de los microorganismos, etiquetar y preservar en la hielera a4°C.7.- Tomar 200 g de suelo e introducir en dos frascos esterilizados y preservar en lahielera a 4°C.

Nota 1. Preparación del tiosulfato de sodio al 1%.

Pesar 1g de tiosulfato de sodio (Na2S2O3) y disolver en 100 ml de aguadestilada, agitando continuamente hasta su total disolución.

Parámetros

Volumen

de

muestra

Tipo de

recipienteTemperatura

Agente

Preservador

Tiempo de

almacenamientoNorma NMX

ORGANISMOSCOLIFORMES

125 mL

frascos ámbarestériles obolsas whirl-pack o ziploc

4 +/- 1° C N/A No exceder las 24 h NMX-AA-102-SCFI-2006

ORGANISMOSCOLIFORMESTERMOTOLER

 ANTES

125 mL

frascos ámbarestériles obolsas whirl-pack o ziploc

4 +/- 1° C N/A No exceder las 24 hNMX-AA-102-SCFI-2006

Escherichia coli  PRESUNTIVA

125 mL

frascos ámbarestériles obolsas whirl-pack o ziploc

4 +/- 1° C N/A No exceder las 24 hNMX-AA-102-SCFI-2006

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Prueba presuntiva para coliformes totales (NMP)

Preparación de medios de cultivo

Medio de cultivo Caldo Lactosado

Pesar 1.82 g de caldo lactosado y añadir 70 mL de agua destilada. Paraobtener un medio de cultivo de doble concentración.

Pesar aproximadamente 1.69 g de caldo lactosado y añadir 130 mL de aguadestilada. Para obtener un medio de cultivo de concentración sencilla.

Purpura de bromocresol

Se prepara una solución etanolica al 1% (v/v).  

ProcedimientoPara muestras de agua

  Diluir 5 mL de muestra en 45 mL de agua destilada previamente esterilizadaen autoclave a 121°C por 45 min. (1:10).

Para muestras de suelo  Pesar 5 g de suelo y añadirlos a 50 mL de agua destilada previamente

esterilizada.

Lista de Materiales, Equipos y Reactivos

Materiales Equipo Reactivos

15 Campanas Durham Autoclave Caldo lactosado

9 tubos microbiológicos18x150 mm

Incubadora Purpura de bromocresol

3 charolas de aluminio1 Agitador1 Espátula1 Probeta de 100 mLPiceta

Pipeta de 1 mL4 vasos de precipitados de

250 mL1 Matraz aforado de 1000 mL1 Gradilla

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Inoculación del medio

  Preparar 6 tubos de ensayo de 18x15mm con 10 mL de medio de cultivo caldolactosado con concentración 1:2 en cada uno de los tubos.

  Agregar 3 gotas del indicador purpura de bromocresol a los tubos deconcentración simple y 2 gotas a los tubos de concentración doble.

  A cada uno de los tubos introducir una campana Durham.  Posteriormente esterilizarlos a 121° por 45 min y meterlos a incubar en un

periodo de 24h.  Retirar los tubos de la incubadora después del tiempo cumplido.  Inocular en 3 tubos de ensayo con caldo lactosado, tomando un volumen de

10 mL, 1 mL y 0.1 mL de muestra de agua con ayuda de una pipeta estéril.  Realizar el paso anterior pero ahora con la muestra de suelo ya diluida.

Incubación de los tubos

  Incubar los tubos inoculados ya sea a 308± 1K (35± 1°C) o 340± 1K (37±1°C)durante 24 horas.

Examen de los tubos

  Examinar los cultivos de los tubos después de 18 a 24 horas  Considerar como resultados positivos a aquellos que muestren turbidez

debida al crecimiento bacteriano y formación de gas en los tubos internosinvertidos (Durham) junto con producción de ácido si el medio de aislamientocontiene un indicador de pH.

  Re-incubar aquellos tubos que no muestran alguno o todos estos cambios yexaminarlos nuevamente para detectar reaccionan positivas a las 48 horas.

Fundamento de la prueba

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método delNúmero más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupomicrobiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a35°C  1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares.

En la fase presuntiva se utiliza caldo lauril sulfato triptosa con púrpura debromocresol (concentración 0,01 g/l de medio) el cual permite la recuperación de losmicroorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que seancapaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono y campanas de fermentaciónel medio de cultivo para observar la producción de gas. Durante la fase confirmativase emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual esselectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerartanto las sales biliares como el verde brillante.

La determinación del número más probable de microorganismos coliformesfecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y sefundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gascuando son incubados a una temperatura de 44.5  0.1C por un periodo de 24 a 48h. 

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Prueba confirmativa para coliformes totalesPrueba de gas en Caldo Bilis Verde Brillante

Lista de Materiales, Equipos y Reactivos

Materiales Medio de cultivo Equipo18 campanas Durham Peptona Balanza analítica18 tubos de 18 x 150mm

Lactosa Incubadora

1 Agitador de vidrio Bilis Ox dehisdratado Parrilla

1 EspátulaVerde Brillante ensolución acuosa 1%

Potenciómetro

1 Gradilla Agua destilada Autoclave2 Matraz Erlenmeyerde 250 mL2 Pipeta de 10 mL

1 Pro-pipeta3 Charolas de aluminio1 Probeta estéril1 Vaso de precipitado1 Aza de nicromo1 Mechero Bunsen

Preparación del Medio Caldo Bilis Verde Brillante:1. Disolver 10 g. de peptona en 500 mL de agua destilada. 2. Agregar 20 g de bilis Ox deshidratada en 200 mL de agua destilada.3. Ajustar el pH entre 7,0 y 7,5.4. Completar a aproximadamente 975 mL con agua destilada. 5. Agregue 10 g. de lactosa.6. Ajuste el pH a 7,4. 7. Agregue 13 mL de la solución al 1% masa de verde-brillante y complete a

1000 mL con agua destilada. 

Procedimiento:1. Distribuir volúmenes de 10 mL de Caldo Lactosado Bilis Verde Brillante en los

tubos de prueba conteniendo un tubo de Durham invertido.  2. Esterilizar a 121 por 15 min. 3. Inocular una azada en los tubos con Caldo Bilis Verde Brillante de los cultivos

positivos de la prueba presuntiva con Caldo Lactosado. 4. Incubar 48 h a 37 °C. 

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Fundamentación 

de la prueba

En este medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para eladecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivosque inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepciónde coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable.

Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa conproducción de ácido y gas.

Es por eso que este medio está recomendado para el recuento de coliformestotales y fecales, por la técnica del número más probable  

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Prueba de la producción de indol (PROY-NMX-AA-042-SCFI-2005)Para confirmar la presencia de E. colli  presuntiva.

Preparación del medio para la producción de indol

 Agua de triptona.

Hay algunas peptonas que dan resultados satisfactorios a 37°C pero no sonsatisfactorias para la prueba de indol. A 44°C, se ha encontrado que la triptona essatisfactoria y por lo tanto es la que se recomienda.

Disolver los componentes (20,0 g de Triptona y 5,0 g de Cloruro de sodio(NaCl) en agua y ajustar a pH 7,5. Distribuir en volúmenes de 5 mL y colocar enautoclave a 115°C durante 10 min

Reactivo de Kovac’s para Indol: 

Disolver el aldehído en alcohol. Añadir el Ácido concentrado con cuidado.Proteger de la luz y almacenar a 4°C.

Nota 3: El reactivo debe tener una coloración entre amarillo claro y café claro;algunas muestras de Alcohol Amílico son insatisfactorias y dan una coloración oscuracon el Aldehído.

Lista de Materiales, Equipos y Reactivos

Materiales Equipo Reactivos

1 matraz Erlenmeyer de250 mL

 Autoclave 20,0 g de Triptona

3 tubos microbiológicos Incubadora5,0 g de Cloruro de sodio(NaCl)

2 charolas de aluminio Parrilla1000 mL de aguadestilada

1 Agitador Reactivo Kovacs

1 Espátula5,0 g 1,4dimetilaminobenzaldehído(C6H4 [H(CH3)2] CHO).

2 Probeta de 100 mL 75 mL Alcohol amílico(CH3 (CH2) 4CH)

1 Piceta25 mL Ácido clorhídricoconcentrado (HCL)

1 Gradilla2 vasos de precipitado100 mL

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Procedimiento1. Preparar el agua triptona como se indica en la parte de preparación del

medio para la producción de indol.2. Añadir 20 mL de agua triptona a 3 tubos microbiológicos y tomar con un

asa de nicromo una muestra del tubo de Agar Bilis Verde Brillante incubado

anteriormente y sembrarla en el agua triptona.3. Incubar los tubos de agua de triptona para detectar la formación de indol a44.0°C ± 1 °C durante 24h.

4. Después del tiempo transcurrido, añadir de 0.2 a 0.3 mL de reactivo deKovac’s al tubo de agua de triptona

5. Los resultados positivos se muestran por el desarrollo de un anillo de colorrojo después de agitar suavemente que denota la presencia de indol. Un resultadonegativo se muestra amarillo. Un resultado variable puede ocurrir cuando se muestraun color naranja.

Nota.- La detección de E. coli   presuntiva se considera una evidenciasatisfactoria de contaminación fecal. Sin embargo, pueden efectuarse mayorespruebas para la confirmación de E. coli  si se considera necesario.

Fundamentación de la prueba

La prueba de indol  es una prueba bioquímica realizadaen especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romperel indol del aminoácido triptófano.  Esta división molecular es lograda por una seriede enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama confrecuencia triptofanasa.

El indol es generado por una desaminación reductiva del triptófano a través de

la molécula intermediaria ácido indol-pirúvico. Las triptofanasas catalizan la reacciónde desaminación, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molécula detriptófano. Los productos finales de la reacción son el indol, ácido pirúvico, amoníaco (NH3) y energía.  Como coenzima de la reacción se requiere al fosfato depiridoxal. 

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Prueba de oxidasa (PROY-NMX-AA-042-SCFI-2005)

Prueba confirmativa para E. coli  presuntiva

Lista de Materiales, Equipos y Reactivos

Material y equipo Materiales ReactivosHorno de aire caliente paraesterilización con calor seco

1 Membranafiltrante

Reactivo deoxidasa

 Autoclave.1 Pinzas debordes lisos

Clorhidratado detetrametil-p-fenilendiamina

Incubadora 1 Gotero Agar nutritivo

Medidor de pH. 1 Varilla de vidrio

Equipo para filtración con membrana 2 Papel filtro

1 Cajas Petri

Preparación de agar y reactivo oxidasa

Agar nutritivo

El agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina paratodo tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece sólido incluso a relativas altas

temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en lasuperficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas.

El agar nutritivo contiene normalmente (p/v):1

  0,5 % de peptona; 

  0,3 % de extracto de carne/extracto de levadura;

  1,5 % de agar; 

  0,5 % de cloruro de sodio; 

  agua destilada;

  pH casi neutro (6,8) a 25 °C. 

Reactivo oxidasa

  Clorhidratado de tetrametil-p-fenilendiamina 0,1 g

  Agua para aforar a 1 000 mL

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Este reactivo no es estable y por consiguiente debe prepararse para serutilizado en pequeñas cantidades cada vez que se necesite.

Procedimiento

Llevar a cabo la prueba de la oxidasa con subcultivos puros de organismosfermentadores de lactosa, desarrollado en medio de Agar Nutritivo, de la siguientemanera:

1. Colocar dos o tres gotas de reactivo de oxidasa preparado recientemente enun papel filtro colocado sobre una caja Petri;

2. Con una varilla de vidrio de punta redonda, untar una pequeña porción delcrecimiento sobre el papel filtro preparado.

Considerar la aparición de un color azul-morado profundo en un lapso de 10segundos como una reacción positiva 

Fundamentación de la prueba

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. Lareacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo-oxidasa queactiva la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular queproduce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúapor tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora deelectrones. Por lo general, el sistema citocromo-oxidasa sólo se encuentra en los

organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algúnmicroaerófilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa.

Se investiga la presencia del enzima citocromo-oxidasa en la bacteria enestudio.

Básicamente es la detección de la enzima oxidasa, muy útil en la identificaciónde bacterias Gram (-). La reacción de la oxidasa se debe a la presencia del sistemade citocromo-oxidasa, la cual activa citocromos reducidos por oxígeno molecular, porla transferencia de un aceptor al estado terminal del sistema de transferencia de

electrones. 

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Referencias

  Fuente: Tomasini Ortíz, A. C. (s/f). Serie autodidáctica de medición de lacalidad del agua. Recuperado de:http://www.conagua.gob.mx/CONAGUA07/Noticias/Bactereologicos.pdf  

  Primus laboratorios de México (2014). Muestreo microbiológico de agua.

Recuperado dehttp://www.primuslabs.com/spanish/services/guia_de_muestreo_para_aguas.pdf  

  Serrano, B. (2009). Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ªed. Facultad de Química, UNAM. México.

  Escolá Rives, M. (2002). Métodos de análisis microbiológicos de los alimentos.España. Editorial Díaz de Santos.