UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPASFACULTAD DE CIENCIAS QUMICASCAMPUS IV.LICENCIATURA EN QUIMICO FARMACOBIOLOGO

LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA II

PRACTICA N 1SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS

EQUIPO N.3 INTEGRANTES:

GABRIELA C. MONTOYA BRISEOGERARDO JUAREZ ALFAROKEILA ALEXANDRA RUIZ CORDEROFLOR DE MARIA SANCHEZ LOPEZDARINEL VAZQUEZ GARCIA

CATEDRATICO: LUIS HUMBERTO ROSALES FURUKAWA

6 SEMESTRE GRUPO A

TAPACHULA DE CORDOVA Y ORDOEZ CHIAPAS A 14 DE MARZO DEL 2014.

INTRODUCCIN

Un antibitico ha sido definido como una sustancia qumica producida por un microorganismo capaz de inhibir el desarrollo de otros microorganismos. Los antibiticos modificados por manipulaciones qumicas aun se consideran como tales. Un agente antimicrobiano es activo contra los microorganismos y puede ser producido en forma natural por microorganismos o sintticamente en el laboratorio. El trmino agente quimioterpico ha sido empleado para referirse a agentes antimicrobianos sintticos o no y tambin se refiere a agentes que actan contra clulas humanas como inmunomoduladores y drogas antitumorales. Los trminos agente antiviral y agente antimictico son trminos ms especificos, incluidos dentro de la categora ms general de agentes antimicrobianos. (1)El xito de un antimicrobiano depende de su toxicidad selectiva que debe matar el microbio patogeno causando el menor dao posible en el husped. El grado de toxicidad selectiva se puede expresar como dosis teraputica, o nivel del frmaco necesario para el tratamiento clnico de una infeccin determinada; y la dosis txica, o nivel de frmaco al que el agente se vuelve excesivamente txico para el husped. El ndice teraputico es el cociente entre la dosis txica y la dosis teraputica. Cuando mayor es el ndice teraputico, mejor es el antimicrobiano.El espectro de eficacia vara considerablemente segn los frmacos. Muchos son frmacos de espectro reducido, que slo son eficaces contra una gama pequea de patogenos. Otros son frmacos de amplio espectro y atacan a muchas clases diferentes de patgenos. Los frmacos pueden clasificarse tambin basndose en el grupo general de microorganismos contra el que actan: antibacterianos, antimicoticos, antiprotozoarios y antivirales.Los antimicrobianos pueden ser sintetizados por microorganismos o fabricados por procedimientos qumicos independientes de los microorganismos. Algunos de los antibiticos ms frecuentes empleados son naturales, es decir, sintetizados en su totalidad por una bacteria u hongo. Por lo contrario, varios antimicrobianos importantes son totalmente sintticos, por ejemplo: sulfamidas, trimetoprima, clorafenicol, ciprofloxacino, isoniazida y dapsona. Muchos antivirales y antiprotozoarios son sintticos. Los antibiticos semisinteticos son antibiticos naturales modificados mediante la adicin de grupos qumicos que le hacen menos susceptibles a la inactivacion por patgenos como la ampicilina, la carbenicilina y meticilina.Los antimicrobianos, como los desinfectantes, pueden ser bactericidas o bacteriostaticos.Un agente bacteriostatico inhiben el crecimiento de forma reversible y un agente bactericida es aquel que mata el patgeno, su actividad depende de la concentracin, y a concentraciones bajas pueden ser slo bacteriostaticos.Concentracin mnima inhibitoria proporciona cierta idea de la eficacia de un agente antimicrobiano. Concentracin minima inhibitoria es la concentracin ms baja de un frmaco que impide el crecimiento de un determinado patogeno. La concentracin mnima letal es la concentracin ms baja de un frmaco que mata al patgeno. Un frmaco bactericida mata al patgeno a niveles solo dos o cuatro veces superior a la concentracin mnima inhibitoria, mientras que un agente bacteriostatico mata a concentraciones mucho mayores. (2)

MTODO DE DISCO DIFUSINEste es un metodo cualitativo, que se caracteriza por ser facilmente estandarizable y que esta indicado para microorganismos no exigentes de crecimiento rapido. Partiendo de una muestra clinica siempre se debe realizar un cultivo puro para poder comenzar el estudio de la sensi- bilidad antibiotica. Para esto se utiliza la tecnica de aislamiento en placas que contengan un medio adecuado para la cepa en estudio (al cual ademas se le deben otorgar las condiciones atmosfericas especificas de esa cepa). El antibiograma por disco difusion basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores, es uno de los metodos que el NCCLS recomienda para la determinacion de la sensibilidad bacteriana a los antibioticos.Indicaciones: el antibiograma esta indicado en las siguientes situaciones:los antimicrobianos mas habituales.

MTODO DE DILUCION Las primeras determinaciones se realizaron empleando una cantidad considerable de tubos con caldo de cultivo, a los cuales se le colocaban diluciones crecientes de antibioticos con el mismo fundamento que el descrito para el metodo de dilucion en agar. Este procedimiento se denomino macrodilucion en caldo. Esta metodologia es muy engorrosa, por la cantidad de material y de manipulaciones necesarias para su realizacion. La aparicion de un sistema de inoculacion multiple para placas de agar popularizo el metodo de dilucion en agar, en el que cada placa, con una cierta concentracion de antimicrobiano, permite inocular simulta- neamente un gran numero de microorganismos. La utilizacion de micropipetas y de placas de microtitulacion facilito la utilizacion del metodo de microdilucion en caldo; en la actualidad se han popularizado los metodos automatizados comerciales de microdilucion en caldo, fa- cilmente integrables en sistemas semiautomaticos de lectura e interpretacion de resultados, pero con el grave inconveniente del incremento de su costo. Dentro de estos describiremos la macrodilucion en caldo.

METODO DE GRADIENTE ANTIBIOTICO (E-TEST)Este es un metodo cuantitativo. El principio de este metodo es una expansion de la tecnica de difusion en disco. En el metodo E-test podemos, mediante lectura directa, determinar la CIM. Consiste en una tira de plastico no poroso de 6 cm de largo por 5 mm de ancho que incorpora un gradiente predefinido de antimicrobiano equivalente a 15 diluciones. El protocolo para preparar el inoculo es el mismo que para la difusion en disco. Siguiendo el metodo de difusion, una vez inoculado la placa de agar con el microorganismo, se coloca la tira de E-test sobre su superficie, produciendose de forma inmediata una difusion del antibiotico desde el soporte hasta el agar, creandose de este modo a lo largo de la tira un gradiente exponencial de las concentraciones del antimicrobiano. Tras la incubacion de las placas, se puede observar una zona de inhibicion elipsoidal y simetrica. Despues de la incubacion la CIM sera el valor donde la elipse corta la tira. Las tiras deben conservarse a menos de 20C y deben estar protegidas de la humedad. Antes de usarse se deben atemperar a temperatura ambiente durante por lo menos 30 minutos. Las placas de Petri con el medio de MH y la forma de sembrado es la misma que en el metodo de disco difusion. Luego se colocan las tiras sobre la superficie del agar. Se debe dejar absorber el inoculo de 10 a 15 min para asegurar que la superficie del agar este completamente seca antes de aplicar las tiras. Debemos asegurarnos que la tira contacte completamente con la superficie del agar. No se deben mover las tiras una vez que han sido colocadas, ya que el antibiotico empieza a difundir rapidamente. Cuando se usa una placa de Petri de 100 mm depositar solo una tira por placa y poner la tira en el centro de la placa, si se usa una de 150 mm no se deben colocar mas de 6 tiras. Se incuba durante 16 a 20 hs a 37C o segun los requerimientos optimos de la cepa bacteriana en estudio. Si colocamos la tira al reves no se observa elipse de inhibicion, ya que el gradiente de concentraciones se situa solo sobre una de las caras de la tira. Se considera como un metodo alternativo para el estudio cuantitativo de la sensibilidad antimicrobiana del que cabe destacar su sencillez y buena correlacion con la tecnica estandar de dilucion en agar para el estudio de la CIM, que se detalla mas adelante. (3)

OBJETIVO

Aislar e identificar el microorganismo patgeno. Determinar la resistencia bacteriana. Conocer a que antibitico es sensible un determinado microorganismo.

METODOLOGIA

Toma de muestra1. Sentar al paciente2. Pedirle que coloque su cabeza hacia atrs 3. Iluminar bien la cavidad orofarngea y con un abatelenguas bajar la lengua para facilitar el acceso a la parte posterior de la faringe. 4. Con un hisopo de dacrn o de rayn con mango de plstico, hacer un raspado firme, haciendo girar el hisopo, en las reas daadas que deben verse hipermicas, purulentas o necrticas y tambin en las membranas formadas sobre las lesiones o de las manchas de Koplic. 5. Evitar tocar la lengua, la vula o los carrillos. 6. Introducir el hisopo con la muestra en un tubo con tapn de rosca que contenga el medio de transporte adecuado a la etiologa que se sospeche.

Elaboracin de las placas con medios de cultivo7. Pesar la cantidad precisa utilizable para cada uno de los medios (sal y manitol, gelosa sangre, Mueller Hinton )8. Colocar lo pesado de los medios en un matraz, agregarle agua hasta disolver correctamente todo.9. Una vez disuelto colocarle su tapn y meterlo a esterilizar.10. Vaciar el contenido de los medios en sus respectivas cajas Petri, tratando de evitar contaminacin alguna con ayuda de los materiales necesarios para poder evitar alguna contaminacin (guantes y cubre bocas)11. Esperar que nuestros medios solidifiquen y meterlo a la estufa a una temperatura de 37c ( por 24 horas).Elaboracin de caldo nutritivo.12. Pesar la cantidad precisa utilizable para elaborar el caldo nutritivo13. Colocar lo pesado del medio en un matraz, agregarle agua hasta disolver correctamente todo.14. Una vez disuelto colocarle su tapn y meterlo a esterilizar.15. Vaciar el contenido del medio en cada uno de los tubos (3.5ml), tratando de evitar contaminacin alguna con ayuda de los materiales necesarios para poder evitar alguna contaminacin (guantes y cubre bocas) y colocarle su tapn elaborado previamente.16. meterlo a la estufa a una temperatura de 37c (por 24 horas).

Aislamiento de nuestra cepa

17. Una vez tomada nuestra muestra realizar el sembrado necesario en los medios ya elaborados para la identificacin de la cepa.18. Elaboracin de nuestra identificacin macroscpica de nuestra cepa.19. Realizacin de nuestra identificacin microscpica de nuestra cepa, con ayuda de una tincin.

Preparacin de la suspensin estndar de turbidez 0.5 de Macfarln20. Aadir 0.5 ml de una solucin 0.048 mol/L de BaCl2 (1.175% w/v BaCl2.2H20a 99.5 ml de H2SO4 0.18 mol/L (0.36 N) y mezclar completamente.21. Comprobar la densidad de la suspensin en un espectro fotmetro empleando cubetas de paso de luz de 1 cm. La absorbancia a 625 nm debe estar en un rango de 0.08 a 0.13.22. Distribuir la suspensin en tubos del mismo tamao que los utilizados para realizar el inoculo de estudio. Sellar los tubos.Llegar a la turbidez de nuestro tubo patrn de macfarln23. Adicionar cuidadosamente cepa a un tubo con solucin salina, mezclar correctamente.24. Verificar que nuestro tubo se parezca a nuestro patrn y tenga la misma turbidez.

Dilucin en tubo25. Preparar nuestra solucin madre de nuestro medicamento empleado, y tomar 3.5ml y vaciarlo en el primer tubo de nuestro caldo nutritivo, se mezclaba correctamente.26. Realizar lo mismo que el punto 20 pero tomando de ese tuvo 3.5ml y vaciarlo al segundo tuvo y as consecutivamente.27. Adicionar a cada uno de los tubos con ayuda de un asa parte de nuestra cepa que se obtuvo en el tubo de macfarln.28. Incubar durante 24 horas a 37c.

Antibiograma29. Sembrar y estriar con ayuda de un isopo completamente estril nuestra sepa empleada30. Colocar con ayuda de una pinza nuestro antibiograma.31. Incubar y leer a las 18 horas.32. Medir el halo formado por el medicamento

RESULTADOS

MORFOLOGIA MACROSCOPICA. En agar sal y manitol se sembr staphylococcus aureus y obtuvimos la siguiente morfologa colonial

Forma de la coloniaCircular

BordesEntero

Elevacion de la coloniaConvexa

SuperficieLisa

ConsistenciaCremosa

ColorAmarillenta

MORFOLOFIA MICROSCOPICA. Despues se realizo una tincion Gramm y el resultado fue positivo

Se observa como cocos Gram positivos dispuestos en racimos.

Realizamos la prueba de la coagulasa dando esta positiva. Se realizaron diluciones en tubo

En los mtodos de dilucin en caldo, base de casi todos los mtodos utilizados en la actualidad, se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que sostendr el desarrollo del microorganismo.Los agentes antimicrobianos se preparan en "soluciones madre" concentradas y luego se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas.En esta practica preparamos nuestra solucion madre de nuestro antibiotico y tomamos 3.5ml y se vacio en el primer tubo de nuestro caldo nutritivo, a esos 3.5ml lo tomamos como referencia. Para esto hubo inhibicin en todos los tubo hasta en la mas baja concentracin.

Tubo de McFarland Se preparo una suspensin bacteriana de mcfarland para un control. Se realiz el tubo 0.5 de mcfarlad. La turbidez nos da una concentracin de inoculo bacteriano de 1.5x 108 UFC/mL. (Unidades formadoras de colonias).Por ultimo se realiz otro tubo agregandole solucin salina y se inoculo con la cepa staphylococcus aureus hasta llegar a la turbidez comparando con el tubo 0.5 de mcfarlad.

Antibiograma. Se sembr en la placa de Mller Hilton por sembrado de csped y se coloc el antibiograma.

El resultado del antibiograma fue el siguiente.AGENTE ANTIMICROBIANOPOTENCIA DEL DISCDiametro de zona de inhibicion(mm)punto del corte CIM equivalente(ug/ml)

susceptible inetermedia resistente

Cefalotina (CF)30 g--------- -------------- si

Levaflaxacina (LEV) 5 g27mm ------------- ------------

Eritromicina (E)15 g--------- 8mm -----------

Ampicilina (AM)10 u--------- 11mm -----------

Tetraciclina (TE)30 g--------- 9mm -----------

Trimetoprim- sulfametaxazol (SXT)25 g21mm ------------- -----------

Cefotaxima (CTX)30 g---------- ------------- si

Gentamicina (GE)10 g14mm ------------ ----------

Cefuroxima (CXM)30 g---------- ------------- si

Cefepime (FEP)30 g---------- 10mm ----------

Dicloxacilina (DC) 1 g---------- ------------- si

Penicilina (PE)10u---------- ------------- si

Esta es una cepa: staphylococcus aureus.

DISCUSION

En el laboratorio de microbiologa se apoyan los qumicos para realizar un adecuado diagnstico y tratamiento de los pacientes que padecen alguna enfermedad ocasionada por un microorganismo patgeno. Par esto se basa en tcnicas adecuadas para identificar al organismo patgeno y pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. Para obtener un buen resultado y dar un diagnostico certero, es indispensable no cometer errores, entre estos existen varios factores que influyen desde una toma correcta d la muestra, un sembrado en los medios de cultivo adecuado y la correcta de susceptibilidad antimicrobiana.En la realizacin de estas pruebas el equipo utilizo una muestra de exudado farngeo y se aisl en el medio de cultivo adecuado, posteriormente se realiz el anlisis de la morfologa macroscpica y microscpica, tambin se incluy la prueba de la coagulosa y catalasa dando las dos positivas, de eta manera concluimos que la bacteria aislada era staphilococcus aureus. Se realiz la prueba del antibiograma y resulto ser sensible a los antibiticos, levoflaxacino, trimetroprim con sulfametoxazol y tetraciclina. Por lo contrario fue resistente a los dems antibiticos, pero esto no indica que la sensibilidad que presenta en la prueba tendr el mismo efecto en el paciente ya que es una prueba in vitro y las condiciones del medio y factores cambian dentro del organismo del paciente. Dicha prueba no puede determinar CMI ya que es una prueba cualitativa, para esto se emplean otras tcnicas como dilucin en tubo con un determinado antibitico a diferentes concentraciones. Nuestro equipo utilizo la cefotaxima, ya que es de amplio espectro y efectiva en bacterias gram positivas, con un mecanismo de accin de inhibicin de la sntesis de la pared celular. Los resultados obtenidos no fueron satisfactorios ya que hubo inhibicin en todos los tubo hasta en la mas baja concentracin, pudo deberse a la mala dilusion en los tubos o al realizar la suspensin comparando con el estndar 0.5 de Mc Farland no era la turbidez correcta, o simplemente la bacteria era muy sensible a la cefotaxima. Al no haber crecimiento en los tubos no se procedio a resembrar en gelosa sangre para determinar la CMB.

CONCLUSINAl realizar la prctica concluimos que es importante una buena toma de muestra y el adecuado aislamiento de un M.O para el anlisis requerido. Como tambin la prueba de susceptibilidad microbiana nos ayuda a determinar la dosis adecuada que requiera un paciente para su tratamiento y determinar la resistencia microbiana a determinado antibitico.

BIBLIOGRAFA(1) manual de prcticas, universidad nacional autonoma de mexico. Http://dentizta.ccadet.unam.mx/instrumenta/contenido/practicas/antibiograma/index.htm (2) microbiologa quinta edicin prescott harley klein editorial mcgraw- hill. Interamericana pgina. 871-877(3) r. Taroco, v. Seija, r. Vignoli mtodos de estudio de la sensibilidadAntibitica http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/bactecefa36.pdf (4) allen; janda; koneman; procop; schreckenberg; woods. 2006. Diagnstico microbiolgico. 6 edicin. Editorial mdica panamericana. Madrid. Espaa.(5) Murray Patrick, Microbiologa Mdica, 6a edicin editorial panamericana.