![FOSFORILACIÓN OXIDATIVA - [DePa] Departamento de ...depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/FosforilacionOxidativa_35344.pdfy aloja a los componentes de la cadena la fosforilaciÓn oxidativa](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/5eb606cf0882961e336d88ce/fosforilacin-oxidativa-depa-departamento-de-depafquimunammxamydarchiverofosforilacionoxidativa35344pdf.jpg)
REGULACION DEL RECEPTOR P2X7 POR FOSFORILACIÓN Mª Elena Hernández Álvarez. Departamento de...
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REGULACION DEL RECEPTOR P2X7 POR FOSFORILACIÓN Mª Elena Hernández Álvarez. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid.
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REGULACION DEL RECEPTOR P2X7 POR FOSFORILACIÓN
Mª Elena Hernández Álvarez.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV.
Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid.
RECEPTOR P2X7
Receptor ionotrópico de ATP.
Proteína de 595 aminoácidos que posee un extremo C-terminal con 239 aminoácidos y un dominio hidrofóbico adicional.
M1 M2
ss ss
Extracelular
Intracelular
N C
Serin/treonin quinasa.
Estructura: - dominio quinasa conservado. - dominio regulador variable.
Se conocen 10 isoformas, que se clasifican en tres subfamilias: convencionales (cPKCs), noveles (nPKCs) y atípicas (aPKCs).
PKC (Protein Kinase C)
Steinberg; 2008
Regulación del receptor P2X7 por PKC
Hung y cols.; 2005
Regulación negativa(A corto plazo)
- La activación de la enzima PKC atenúa la señal de calcio mediada por Bz-ATP.
- Los inhibidores de PKC restauran la señal de calcio.
PKC-γ
Co-inmunoprecipita
Determinar que residuos del receptor P2X7 son susceptibles de ser fosforilados por PKA ó PKC y así esclarecer la regulación de dicho receptor por las quinasas citadas.
OBJETIVOS
SUBCLONAJE DEL RECEPTOR P2X7
Apa IApa I
P CMV
P2X7
eGFP
Neor
KpnI
Apa IApa I
pEGFP-N1-P2X7-EGFPP CMV
P2X7
IRESeGFP
Kanr/Neo
XhoI
SmaI
pP2X7-IRES-EGFP
VALIDACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS PLÁSMIDOS GENERADOS
pP2X7-IRES2-EGFP
pEGFP-N1-P2X7-EGF
500
pA
5 s
BzATP (100 µM)pIRES2-EGFP
0 pA pP2X7-IRES2-EGFP
pEGFP-N1-P2X7-EGF
500
pA
5 s
BzATP (100 µM)pIRES2-EGFP
0 pA
500
pA
5 s
500
pA
5 s
BzATP (100 µM)pIRES2-EGFP
0 pA
Electrofisiología. Registro de las corrientes iónicas de entrada en células HEK-293T transfectadas con los plásmidos pEGFP-N1-P2X7-EGF y pP2X7-IRES-EGFP tras aplicar un pulso despolarizante de Bz-ATP.
VALIDACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS PLÁSMIDOS GENERADOS
Microfluorimetría. Registro de los incrementos de Ca2+ intracelular en células HEK-293T transfectadas con el plásmido pEGFP-N1-P2X7-EGF y el plásmido pP2X7-IRES-EGFP, y estimuladas posteriormente con ATP 1mM y BZ-ATP 100μM.
pEGFP-N1-P2X7-EGF
-100 0 100 200 300 400 500 600 7000,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
Mea
n
cicles
Statistics On Rows of [datafinal]Sheet1!Col(B):Col(C18)ATP
1mM
BzATP
100uM
BzATP
100uM
ciclos
F340
/ F3
80
pEGFP-N1-P2X7-EGF
-100 0 100 200 300 400 500 600 7000,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
Mea
n
cicles
Statistics On Rows of [datafinal]Sheet1!Col(B):Col(C18)ATP
1mM
BzATP
100uM
BzATP
100uM
ciclos
F340
/ F3
80
-100 0 100 200 300 400 500 600 7000,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
Mea
n
cicles
Statistics On Rows of [datafinal]Sheet1!Col(B):Col(C18)ATP
1mM
BzATP
100uM
BzATP
100uM
ciclos
-100 0 100 200 300 400 500 600 7000,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
Mea
n
cicles
Statistics On Rows of [datafinal]Sheet1!Col(B):Col(C18)ATP
1mM
BzATP
100uM
BzATP
100uM
ciclos
-100 0 100 200 300 400 500 600 7000,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
Mea
n
cicles
Statistics On Rows of [datafinal]Sheet1!Col(B):Col(C18)ATP
1mM
BzATP
100uM
BzATP
100uM
-100 0 100 200 300 400 500 600 7000,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
Mea
n
cicles
Statistics On Rows of [datafinal]Sheet1!Col(B):Col(C18)ATP
1mM
BzATP
100uM
BzATP
100uM
-100 0 100 200 300 400 500 600 7000,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
Mea
n
cicles
Statistics On Rows of [datafinal]Sheet1!Col(B):Col(C18)ATP
1mM
BzATP
100uM
BzATP
100uM
ciclos
F340
/ F3
80
P2X7-IRES-GFP
0 100 200 300 400 500
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Mea
n
A
Statistics On Rows of [datafinal]Sheet1!Col(B):Col(C12)
F34
0 / F
380
ciclos
ATP
1mM
BzATP
100uMBzATP
100uM
P2X7-IRES-GFP
0 100 200 300 400 500
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Mea
n
A
Statistics On Rows of [datafinal]Sheet1!Col(B):Col(C12)
F34
0 / F
380
ciclos
ATP
1mM
BzATP
100uMBzATP
100uM
P2X7-IRES-GFP
0 100 200 300 400 500
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Mea
n
A
Statistics On Rows of [datafinal]Sheet1!Col(B):Col(C12)
F34
0 / F
380
ciclos
0 100 200 300 400 500
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Mea
n
A
Statistics On Rows of [datafinal]Sheet1!Col(B):Col(C12)
F34
0 / F
380
0 100 200 300 400 500
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Mea
n
A
Statistics On Rows of [datafinal]Sheet1!Col(B):Col(C12)
F34
0 / F
380
ciclos
ATP
1mM
BzATP
100uMBzATP
100uM
2’
Activador de PKC: PDBu (0.5μM).
Inhibidor de PKC: Estaurosporina (50nM).
EXPERIMENTOS FARMACOLÓGICOS
PDBu
(0.5μM)
Bz-ATP
(100μM)
Bz-ATP
(100μM)
Bz-ATP
(100μM)
Bz-ATP
(100μM)
Bz-ATP
(100μM)
Bz-ATP
(100μM)
Carbachol
(100μM)
PDBu
(0.5μM)
Estaurosporina
(50nM)
Bz-ATP
(100μM)
Bz-ATP
(100μM)
Bz-ATP
(100μM)
Bz-ATP
(100μM)
Bz-ATP
(100μM)
Carbacol
(100μM)
30’’
20’
Mutación de los sitios putativos de fosforilación por PKA y PKC
Con objeto de estudiar la posible regulación del receptor P2X7 por PKA o PKC, decidimos mutar los sitios susceptibles de fosforilación por estas quinasas.
Las distintas mutaciones puntuales se obtuvieron al intercambiar el aminoácido treonina por alanina en las posiciones 15, 397, 420, 510, 555 y 560 de la proteína.
Tabla 2.Nombre Secuencia del oligonucleótido Mutación generada Quinasa implicada
T15A pP2X7-IRES-GFP fw GTTTTCCAGTATGAGGCGAACAAAGTCACTCGG T15A PKCT15A pP2X7-IRES-GFP rv CCGAGTGACTTTGTTCGCCTCATACTGGAAAAC T15A PKC
T397A pP2X7-IRES-GFP fw GAGCCAAAGCCGGCATTAAAGTATGTG T397A PKCT397A pP2X7-IRES-GFP rv CACATACTTTAATGCCGGCTTTGGCTC T397A PKCT420A pP2X7-IRES-GFP fw GCTACTAGGGAGAGCTCTGCAAGATGTC T420A PKAT420A pP2X7-IRES-GFP rv GACATCTTGCAGAGCTCTCCCTAGTAGC T420A PKAT510A pP2X7-IRES-GFP fw TGCATCACCACCGCAGAGCTGTTCAGG T510A PKCT510A pP2X7-IRES-GFP rv CCTGAACAGCTCTGCGGTGGTGATGCA T510A PKCT555A pP2X7-IRES-GFP fw AGGTGCTACGCCGCCTGGCGCTTCG T555A PKCT555A pP2X7-IRES-GFP rv CGAAGCGCCAGGCGGCGTAGCACCT T555A PKCT560A pP2X7-IRES-GFP fw TGGCGCTTCGGCGCCCAGGACATGG T560A PKAT560A pP2X7-IRES-GFP rv CCATGTGCCTGGGCGCCGAAGCGCCA T560A PKA
Experimentos farmacológicos preliminares con inhibidores y activadores de PKC confirman los resultados obtenidos por Hung.
Las modificaciones del extremo C-terminal del receptor P2X7 modifican tanto la cinética como la amplitud de las respuestas inducidas por él.
CONCLUSIONES
PERSPECTIVAS FUTURAS
Determinar si la funcionalidad del receptor P2X7 se ve regulada por procesos de fosforilación del extremo C-terminal.
Pasos a realizar para comprobar nuestra hipótesis de trabajo:
- Terminar de analizar la influencia de PKC sobre P2X7 mediante una aproximación farmacológica.
- Comprobar si los mutantes generados del receptor P2X7 modifican la cinética de la respuesta inducida al activar dicho receptor.
- Dado que se sabe que la inhibición del receptor P2X7 favorece la diferenciación neuronal, en caso de obtener resultados positivos, se procederá a determinar si la expresión de dichos receptores mutantes puede condicionar la diferenciación de células neuronales.
MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN.
