PRACTICA:

RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

El recuento diferencial de leucocitos es una parte rutinaria de la biométrica hemática que puede ser útil en la valoración de una infección o inflamación, en la determinación de los defectos de intoxicación posible por sustancias químicas o drogas, en el monitoreo de trastornos sanguíneos como la leucemia, y en los efectos secundarios de tratamientos como la quimioterapia

El conteo de glóbulos blancos puede indicar enfermedades infecciosas e inflamatorias, leucemia y trastornos de la medula ósea.

La clasificación porcentual se hace en base a la afinidad de sus granulaciones a los colorantes y a sus cualidades morfológicas.

La cuenta leucocitaria diferencial es el conteo del número de los distintos tipos de leucocitos. Identifica a los individuos con una mayor susceptibilidad a la infección

La cuenta leucocitaria total circulante se divide en 5 tipos de leucocitos:

Neutrófilos (en banda y segmentados). Su citoplasma es incoloro y tiene múltiples granos color gris; o puede ser multilobulado, que posee cuatro lóbulos nucleares.

Eosinófilos: es redondo u ovalado, el núcleo posee no más de tres lóbulos y en el citoplasma se observa no más de 20 granos color naranja.

Basófilos: se caracterizan por sus grandes granulaciones azul oscuro. Estos gránulos son hidrosolubles.

Linfocitos: Su citoplasma es azul pálido y la cromatina nuclear color púrpura azulado oscuro; casi no posee citoplasma.

Monocitos: su núcleo suele ser arriñonado. Contiene una red de cromatina. El citoplasma se tiñe de un color azul grisáceo y contiene finas granulaciones color rosa.

Valores de referencia:

LEUCOCITOS %

Neutrófilos

Metamielocito Abastonado Segmentado

0-1

3-6

51-67

Linfocitos 21-35

Monocitos 4-8

Eosinófilos 2-4

Basófilos 0-1

HEMOGRAMA DE SCHILLING

El hemograma de Schilling es la clasificación diferencial % de las distintas células blancas.

EXTENSIONES O FROTIS SANGUÍNEO

Una extensión o frotis sanguíneo consiste en recubrir parcialmente un porta con una gota de sangre, de tal manera que las células de ésta se dispongan formando una sola capa de ellas. Esto puede hacerse manual o automáticamente. Lo último se realiza mediante un aparato (spinner) que centrifuga rápidamente el porta con la sangre depositada en su centro. Con este aparato se obtienen unos frotis que presentan una distribución celular muy homogénea.

1. PARTES DE UNA EXTENSIÓN.

1.1. CABEZA.

Es la zona inicial de la extensión.

Es la región más gruesa.

En ella se encuentra una mayor proporción de linfocitos, y los hematíes forman aglomerados (pilas de monedas).

1.2. CUERPO.

Es la zona media del frotis.

Su espesor es el apropiado.

En ella existe una adecuada proporción entre los distintos tipos de leucocitos.

Contiene la "zona ideal" de observación, que corresponde a la porción que limita con la cola.

1.3. COLA.

Es la zona final de la extensión.

Suele tener un aspecto redondeado.

Es la región más fina.

En ella se encuentra una mayor proporción de leucocitos grandes (granulocitos y monocitos), y además. los hematíes están deformados y presentan una tonalidad uniforme.

En su porción terminal suelen ser más abundantes las plaquetas, sobre todo si son grandes.

1.4. BORDES.

Contienen una mayor proporción de leucocitos grandes.

Si están deshilachados, en ellos las células son difíciles de reconocer por estar deformadas o destruidas

2. CARACTERÍSTICAS DE UNA BUENA EXTENSIÓN.

La cabeza ha de estar cerca de uno de los extremos del porta.

La cola debe estar cercana al otro extremo del porta, pero sin llegar a él.

El borde de la cola tiene que estar finamente deshilachado. Ese fino deshilachamiento recibe el nombre de "barbas".

Toda la extensión ha de ser fina y homogénea.

Los bordes laterales de la extensión deben estar separados de los bordes del porta por 1 mm aproximadamente.

Una extensión normal ha de tener una longitud de las ¾ partes del portaobjetos.

El uso de teñidores automáticos exige la realización de extensiones más cortas que las consideradas normalmente como correctas (con una longitud de la mitad del portaobjetos).

3. DEFECTOS DE UNA EXTENSIÓN.

Excesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud y excesivo grosor. Esto se debe a un inadecuado tamaño de la gota de sangre o/y a un error en la velocidad o/y a un fallo en el ángulo de extensión de la misma.

Presencia de escalones o estrías. Esto está ocasionado por una falta de uniformidad en el deslizamiento de la gota.

Existencia de abundantes zonas redondeadas que carecen de sangre. Esto se produce por la presencia de restos de grasa o de suciedad en el porta.

Extremo final excesivamente dentado.

4. UTILIDAD DE LAS EXTENSIONES.

El estudio de las extensiones sanguíneas es esencial para el análisis morfológico de las células hemáticas y para la realización del recuento diferencial linfocitario (RDL). Además, es imprescindible para la distinción de una auténtica trombopenia de una pseudotrombopenia producida por agregados plaquetarios.

La investigación de las extensiones también es útil para la comprobación de las alarmas que proporcionan los autoanalizadores hematológicos

5. REALIZACIÓN DE UNA EXTENSIÓN SANGUÍNEA.

Las extensiones sanguíneas se llevan a cabo deslizando una porta sobre otro en el que se ha depositado previamente una gota de sangre. Con esto se obtiene una fina capa de células sanguíneas que puede ser adecuadamente observada con el microscopio.

Material necesario

Una lanceta de aplicación manual o automática

Algodón.

Un capilar no heparinizado, si la muestra es sangre venosa anticoagulada, o heparinizado, si la muestra es sangre capilar.

2 portas limpios y libres de grasa. Uno de ellos puede ser normal y el otro ha de ser, preferentemente. esmirilado y biselado (el porta extensor). Para mantener limpios los portas, se deben seguir las siguientes indicaciones:

Lavar los portas con agua y jabón líquido. Aclararlos con abundante agua caliente. Sumergir los portas, durante una hora en una solución de etanol- éter etílico o, simplemente etanol. Volver a aclarar los portas y dejar secar. Por último recordar que siempre debemos tocar los portas por los bordes, de esta forma evitamos manchar las superficies de los mismos con suciedad o grasa procedente de los dedos.

Guantes desechables.

Un rotulador de vidrio.

Reactivos

Un desinfectante: alcohol etílico (etanol) de 70°, o mejor aún, solución alcohólica de povidona yodada.

Solución de etanol-eter etílico en una proporción de 50:50.

Muestra

Sangre capilar no anticoagulada o sangre venosa adecuadamente anticoagulada. La forma correcta de extraer sangre capilar es la siguiente:

Elegir el tercer o cuarto dedo de una de las manos. Desinfectar el pulpejo del dedo selecciondo con un algodón embebido en un desinfectante apropiado. Dejar que el desinfectante se evapore.

Con una lanceta, pinchar firme y rápidamente una cara lateral de este pulpejo. Tras lo anterior con un algodón seco retiramos la primera gota emitida. Presionamos el extremo del dedo, a nivel del lado opuesto al de la punción, hasta obtener la cantidad de sangre deseada. Por último, tapamos el pulpejo con una tirita.

La sangre venosa tiene que haber sido extraída hace menos de 3 horas, ya que pasado este tiempo, se producen unos cambios apreciables en las células, que se manifiestan, al ser teñidas éstas, como alteraciones en su morfología.

Una vez extraída, la sangre venosa ha de ser anticoagulada con EDTA. Para realizar frotis sanguíneos no debe utilizarse sangre anticoagulada con heparina, ya que ésta agrega las células y produce un fondo azul en las extensiones de sangre teñidas con el colorante de Wright.

Hay que tener en cuenta que la sangre capilar contiene más hematíes y leucocitos y menos plaquetas que la sangre venosa.

Técnica

Con los dedos índice y pulgar de una mano, sujetar un extremo del porta normal (porta soporte), a nivel de sus bordes, y situarlo sobre una mesa. También puede apoyarse, simplemente, el porta soporte sobre el extremo del dedo corazón de la mano que lo sujeta. De esta forma, el porta soporte forma un ángulo con la mesa.

Con un capilar cargado mediante capilaridad de sangre problema, depositar una pequeña gota de ésta (de unos 5 microlitros) en la cara superior de ese porta, a no menos de 2 cm del extremo opuesto al que agarra la mano.

Colocar un extremo del porta esmerilado (porta difusor o extensor) un poco por delante de la gota de sangre y formando un ángulo de 45° con el porta soporte. Es conveniente utilizar siempre el mismo porta extensor, para adaptarlo a esta función.

Desplazar suavemente hacia atrás el porta extensor, hasta que alcance la gota de sangre.

Dejar que la gota se extienda, por capilaridad, a lo largo del extremo del porta extensor que toca el porta soporte.

Antes de que la sangre alcance los bordes de ese extremo, deslizar el porta extensor hacia delante, con un movimiento firme y uniforme, y a una velocidad media. Este deslizamiento debe acabar,

aproximadamente, a 1 cm del extremo final del porta soporte, con un movimiento de ascensión del porta extensor.

Secar rápidamente la extensión, agitándola al aire, para que sus células no se distorsionen.

Escribir el nombre del enfermo, en el porta que soporta la extensión.

Lectura de resultados

A la hora de leer los resultados, se han de tener en cuenta las características propias de una buena extensión y los defectos que puede tener una extensión incorrecta.

COLORACION

1. La tinción de Giemsa es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras

biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las células huéspedes. La coloración de giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se puede emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la técnica de citoconcentración para parásitos sanguíneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parásito principal, con excepción de los trofozoitos jóvenes y el plasmodium falciparum.

2. Tinción de Wright es una tinción de tipo Romanowsky. Es extremadamente importante en el laboratorio de hematología este tipo de tinción, ya que puede obtenerse una cantidad abundante de información a partir del examen de un frotis de sangre periférica bien teñido.

Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B.La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y.

Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico

La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas.

Procedimiento:

1.º. Cubrir el extendido de sangre con 14 gotas de colorante 2.º. Dejar actuar por 1 minuto3.º. Cubrir con igual cantidad de agua destilada y dejar actuar por 4

minutos4.º. Lavar con agua destilada5.º. Dejar secar en posición vertical al medio ambiente

OBSERVAR CON OBJETIVO DE INMERSION PROCEDER AL RECUENTO

PRUEBA DE VRDL

VDRL (por su siglas en inglés, Venereal Disease Research Laboratory) es una prueba serológica realizada en medicina con sensibilidad y especificidad para complementar el diagnóstico de sífilis. La prueba de VDRL comenzó a desarrollarse antes de la Primera Guerra Mundial, con la participación de August von Wassermann y Albert Ludwig Sigesmund Neisser. Modificaciones generales ocurrieron en 1946, las cuales son la base de la prueba actual. Debido a que la prueba del VDRL emplea marcadores indirectos de infección, se le conoce como una prueba para sífilis no-treponemica.

Interpretación

Un VDRL positivo (reactivo), es un parámetro altamente sugestivo de sífilis, pero nunca sinónimo de ésta, por lo que debe evaluarse en combinación con la historia clínica del sujeto y sus antecedentes epidemiológicos.4 Cuando el resultado de la prueba confirmatoria resulta negativo, se considera que el resultado reactivo del VDRL es un verdadero negativo y que el sujeto no se encuentra infectado. Si el resultado de una prueba confirmatoria es positivo, se considera confirmado el diagnóstico de sífilis en el paciente y este debe ser referido para tratamiento.

Cualquier enfermedad por treponemas causa un VDRL positivo: sífilis, frambesia, pinta, bejel, fiebre recurrente, leptospirosis, enfermedad de Lyme y otras borreliosis. Resultados reactivos también resultan con otras enfermedades infecciosas, como tuberculosis, lepra, neumococo, endocarditis infecciosa, mononucleosis infecciosa, neumonías virales, sarampión, varicela, paludismo y tripanosomiasis.3

Algunas enfermedades no infecciosas que pueden producir un VDRL reactivo incluyen las anemias hemolíticas autoinmunes, enfermedades del colágeno, síndrome antifosfolipídico primario, ciertas inmunizaciones y el embarazo.4 Los falsos positivos, por lo general, no superan los títulos de dilución de 1/8; y pueden ser transitorios o permanentes, según persistan, o no, más de 6 meses.

El resultado no reactivo (negativo) tampoco descarta sífilis, porque durante el período de incubación de la enfermedad y hasta 15 días después de la aparición del chancro sifilítico, aún no se han producido anticuerpos. Adicionalmente, en pacientes con títulos muy altos de anticuerpos anticardiolipina (1 ó 2 % de los pacientes con sífilis) se observa una reacción prozónica que causa falsos negativos.

Durante el embarazo, especialmente en el último trimestre, se produce paso de la inmunoglobulina G a través de la placenta, de manera que una serología positiva en el recién nacido no permite diferenciar entre el traspaso pasivo de anticuerpos maternos y la infección verdadera del recién nacido.

Valores normales

Un examen negativo es normal y significa que no se detectaron anticuerpos contra la sífilis. La prueba de detección es más probable que sea positiva en la sífilis secundaria y latente. Durante la sífilis primaria y terciaria, el resultado del examen puede ser falso negativo.

El examen con resultado positivo puede indicar que usted tiene sífilis. Si el examen es positivo, el siguiente paso es confirmar los resultados con examen FTA-ABS, que es un examen más específico para la sífilis.

La capacidad del examen VDRL para detectar sífilis depende de la etapa de la enfermedad. La sensibilidad del examen para detectar la sífilis se acerca al 100% durante las etapas intermedias y es menos sensible durante las etapas más tempranas y tardías.

[

PRUEBA DE WIDAL

La reacción de Widal, es un test basado en el principio de aglutinación antigeno- anticuerpo, fue desarrollada por Georges Fernand Isadore Widal, Medico francés, para el diagnostico serológico de la fiebre tifoidea. Debido a la baja especificidad de esta prueba debe ser interpretada en el contexto clínico del paciente.

La aglutinación se considera como una reacción en 2 etapas. Cuando se añade el Ag al suero se produce una combinación fisicoquímica en la que el Ac se fija a la superficie del Ag; va seguido de una aglutinación en presencia de solución salina. El grado de aglutinación depende de la composición de la solución salina y de la temperatura de la reacción (7).

BASES INMUNOLÓGICAS DE LA REACCIÓN DE WIDAL:

La reacción de Widal demuestra la presencia de anticuerpos aglutinantes (aglutininas) contra los antígenos H (flagelar) u O (somático) de la Salmonella typhi en el suero de los pacientes con fiebre tifoidea.

Los anticuerpos contra el antígeno O aparecen luego de 6 a 8 días de iniciada la enfermedad y desaparecen posteriormente entre 3 y 6 meses. Los anticuerpos contra el antígeno H aparecen a los 8 a 12 días, alcanzando títulos más elevados con respecto a los anti-O y

pueden persistir por más de 1 año. Los anticuerpos contra el antígeno Vi aparecen más tardíamente, a la tercera semana, sin embargo lo hacen en títulos bajos 1:10-1:20 con respecto a los previos (3,6).

Interpretación de los resultados

El título del suero es la dilución más alta que muestra aglutinación frente al Ag.

En el curso de la enfermedad se produce un aumento en el título de aglutininas contra los antígenos somático (O) y flagelar (H), lo que alcanza un mínimo durante la 3ra semana. Un aumento del título al cuádruple o mayor en ausencia de inmunización contra la fiebre tifoidea durante las últimas 4 a 6 semanas, debe considerarse sospechoso de infección.

Sin embargo, el clínico no puede esperar este tiempo para establecer un tratamiento, por lo cual se debe considerar la posibilidad de esta entidad con un título aislado determinado, mas los datos clínicos, pues ningún título aislado puede considerarse diagnóstico.

En los individuos no vacunados es significativo un título igual o superior a 1/160 para los Ag O y H; pero en los vacunados, estos títulos pueden aumentar hasta 4 veces en el curso de enfermedades febriles no relacionadas con la fiebre tifoidea, por lo que no debe utilizarse la serología como único método de diagnóstico. La técnica inicial de Widal se ha sustituido por una técnica más precisa que investiga por separado las aglutininas O y las H aparecidas en el suero como respuesta a la estimulación creada por los antígenos (Ag) somáticos O y flagelares H de la salmonella. Los títulos altos frente al Ag O significan infección en la fase aguda; los títulos altos frente al Ag H corresponden a la fase de convalecencia.

En general, se recomienda tener en cuenta la fiebre tifoidea con títulos Anti-O=1:160-200 y/o H =160-200 en zonas endémicas; en zonas no endémicas se debe pensar con títulos más bajos Anti-O =1:50-100. Además, debemos saber que una reacción negativa no excluye el diagnóstico de fiebre tifoidea en el contexto de un cuadro clínico compatible.

Esta prueba tiene sensibilidad moderada (negativa en el 30% de los casos demostrados mediante cultivo), y además carece de especificidad (muchas cepas de Salmonella no tifoideas tienen antígenos H y O con reacción cruzada; en la cirrosis se observa producción inespecífica de anticuerpos, con falsa reacción positiva) (8,9).

Limitaciones de la reacción de Widal

La importancia de la aglutinación de Widal radica en ser un método serológico, rápido, barato, y ampliamente conocido para el diagnóstico de la fiebre tifoidea; sin embargo, tiene grandes limitaciones por reacciones antigénicas cruzadas con otras bacterias (principalmente enterobacterias, incluyendo Salmonellas no typhi),

parásitos, virus y hongos, llevando con frecuencia al clínico a sobrediagnosticar síndromes febriles como fiebre tifoidea (10).

Como ejemplo de estos falsos positivos, se ha descrito en fiebre paratifoidea por Paratyphi A, títulos Anti-O y Anti-H =100 en un 53 y 22% de los pacientes, respectivamente (11).

En pacientes con malaria, estudiados en Nigeria, con hemocultivos negativos para Salmonella typhi, se encontraron reacciones de Widal positivas con títulos 1:40, 1:80, y 1:160 en el 85, 12, y 3% de los casos, respectivamente (12). En la India, se reportó test de Widal con títulos >1:100 en el 12, 17 y 24% de pacientes con malaria por Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum con bajas parasitemias, y altas parasitemias, respectivamente (13,14). En Surat, se evidenciaron títulos Anti-O y Anti-H en el 15 y 10% de los pacientes con malaria, respectivamente, informando que cuatro semanas después estos fueron negativos (15).

Dentro de las limitaciones de la reacción de Widal, se debe tener en cuenta que hasta un 50 y 33% de los pacientes con fiebre tifoidea no tratada no presentan el aumento característico en los títulos Anti-O y tienen negatividad en los títulos Anti-H, respectivamente (16).

En un estudio realizado en Vietnam se reportó que el 17 y 33% de los pacientes con fiebre tifoidea y hemocultivos positivos tenían títulos Anti-O y Anti-H =100, respectivamente. Otro elemento a considerar es la presencia de Anti-O y Anti-H en la población sana, lo cual está determinado principalmente por la prevalencia de salmonelosis en una comunidad determinada

Procedimiento:

1/20

1/40 1/80 1/160

1/320

Control +

Control -

Suero (ul) 80 40 20 10 5 I gota I gotaAntigeno I

gota

I gota I gota I gota

I gota

I gota I gota

Aglutinación

- + + + +

Resultado - sospechoso

sospechoso

+ +