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Recomendaciones ISFG en la

interpretación de mezclas Lourdes Prieto Grupo de Medicina Xenómica. Instituto de Ciencias Forenses. Universidade de Santiago de Compostela

Interpretación de perfiles mezcla

• Introducción

• Etapas en la interpretación de una mezcla:

▫ Identificación de la presencia de una mezcla

▫ Asignación de alelos

▫ Determinación del número de contribuyentes

▫ Posibles combinaciones de genotipos

▫ Comparación con muestras de referencia

• Cálculo del LR

• Perfiles LL-DNA

Introducción

• Elementos en la interpretación de mezclas

PRINCIPIOS

(teoría)

PROTOCOLOS

(Validación)

PÁCTICA (entrenamiento

y experiencia)

Recomendaciones ISFG y

publicaciones

Vuestros protocolos

En vuestro laboratorio:

Consistencia entre

analistas

Introducción

¿Qué es la ISFG? • Organización internacional responsable de la promoción del

conocimiento científico en al campo forense

• Fundada en 1968, miembros de 60 países

• Regularmente se forman comisiones de ADN compuestas por expertos que se reúnen para emitir recomendaciones

http://www.isfg.org/

Introducción

• ISFG DNA commissions: ▫ DNA polymorphisms (1989)

▫ PCR based polymorphisms (1992)

▫ Naming variant alleles (1994)

▫ Repeat nomenclature (1997)

▫ Mitochondrial DNA (2000)

▫ Y-STR use in forensic analysis (2001)

▫ Additional Y-STRs - nomenclature (2006)

▫ Mixture Interpretation (2006)

▫ Disaster Victim Identification (2007)

▫ Biostatistics for Parentage Analysis (2007)

▫ Non-human DNA (2011)

▫ Low level DNA (2012)

▫ Mitochondrial DNA (2014)

Introducción


• Introducción







• Cálculo del LR

• Perfiles LLDNA

Etapas en la interpretación de una mezcla

1 • Identificación de la presencia de una mezcla

2 • Asignación de alelos

3 • Identificación del número potencial de contribuyentes

4 • Consideración de todas las combinaciones de genotipos posibles

5 • Comparación con las muestras de referencia

Clayton et al., For.Sci. Int. 1998, 91: 55-70

Identificación de la presencia de una mezcla

• Presencia de más de dos alelos en, al menos, dos loci. ▫ Excepciones: duplicaciones, trisomías y mosaicismos

• Tener en cuenta si las diferencias de altura entre picos son

mayores al 60%: ▫ Normalmente, en perfiles individuales, los heterocigotos presentan áreas o

alturas relativas de mas del 60% (un alelo respecto al otro)

▫ Si existe desequilibrio de heterocigotos puede ser una mezcla

▫ Excepciones: mutaciones en zona de anillamiento de uno de los primers

• ¿Aparecen los stutters demasiado altos? ▫ Si los stutters están por encima del 15-20% puede ser una mezcla

▫ Excepciones: efectos estocásticos por low level DNA, mutaciones somáticas


• Clayton et al. (2004), A genetic basis for anomalous band patterns

encountered during DNA STR profiling. J. For. Sci. 49 (6): 1207-1214

Patrones trialélicos

Tipo 1: La suma de las alturas de

dos de los picos es igual al tercero

(común en D18S51)

Tipo 2: Alturas de pico

equilibradas (común en TPOX y

D21S11)

Patrones trialélicos

• Tipo 1: Suelen ser el resultado de una mutación somática

en un locus heterocigoto durante el desarrollo del individuo.

Se produce una quimera con algunas células con el alelo

original y otras con el mutado.

• Tipo 2: Suelen ser el resultado de un evento de duplicación

localizado, de una aneuploidía cromosómica o de

reordenamientos cromosómicos



• Estudios teóricos sobre la posibilidad de mezclas con un máximo de dos alelos por

marcador (Gill et al., 1998, Ninth International Symposium on Human

Identification. N = 212.000, sólo 4 mezclas mostraron 1 o 2 alelos para los 6 loci,

pero la mezcla puede sospecharse por el desequilibrio de heterocigotos)

Número de alelos para 6 loci en mezclas de dos contribuyentes


• La cantidad de ADN influye en la detección de mezclas

• Una mezcla sólo puede detectarse si el componente minoritario está

por encima del ruido de fondo

• Normalmente el umbral es 1:10

• Problemática de las cuantificaciones: no selectiva, cuantificación en

conjunto de la mezcla y por tanto la cuantificación del ADN del

contribuyente minoritario en mezclas desequilibradas está sobre-

estimada


Drop-out a bajas

concentraciones debido a

efectos estocásticos

Mezcla 1:1 a diferentes

cantidades de ADN

1ng

0,3ng

0,1ng


Mezcla anterior pero 1:3, a

diferentes cantidades de

ADN

1ng

0,3ng

0,1ng

Drop-out a bajas

concentraciones debido a

efectos estocásticos

El efecto es más acusado en

el perfil minoritario

• Criterios de evaluación en general:

▫ Tipo de muestra (ej. Resto óseo)

▫ ¿es lógico encontrarnos una mezcla en la muestra que se está

analizando?:

Tener en cuenta dónde estaba asentada la muestra (ej.: picaporte)

Tener en cuenta el tipo de delito (Ej.: agresión sexual, reyerta)

Tener en cuenta otra información adicional (persona transfundida)

▫ Valorar los resultados de Quantifiler Duo/Trio y amelogenina (sólo en

mezclas hombre-mujer)



Perfil individual

Posible mezcla

ISFG recomienda >60%

cuando DNA > 500pg

En muestras LL-DNA los

heterocigotos pueden aparecer

<60% debido a efectos estocásticos


• Introducción







• Cálculo del LR

• Perfiles LLDNA

Asignación alélica

• Los límites de detección nos orientan: ▫ ¿qué es un alelo real?

▫ ¿qué es un heterocigoto real?

▫ ¿qué es un stutter?

Señal 3 veces superior a la

desviación std del ruido

Equilibrio de

heterocigotos

Típicamente >60%

Stutters por debajo del

15%

Asignación alélica

• Determinación de un pico como un alelo real:

▫ Muchos labs usan «Picos reproducibles con alturas superiores a 50 rfu»

▫ Bajo ruido en la línea base

▫ Número de ciclos en la PCR recomendado por el kit

• Tamaño coincidente con ladder (0.5bp)

• La mayoría de artefactos se identifican fácilmente

▫ Pull ups, dye blobs, etc

• Pero los stutters son productos alélicos, por lo que su

identificación como artefactos es más complicada:

▫ Los stutters asociados al perfil mayoritario pueden ser equivalentes a la

altura del perfil minoritario y por tanto ser indistinguibles

Asignación alélica: stutters

• Determinación de stutters n-4:

▫ Normalmente, el 5-15% del alelo real en loci STR tetranucleotídicos

n-4

stutter

product

Deleción causada por slippage en

la hebra copiada (abajo)

GATA GATA GATA

CTAT CTAT CTAT 3’

5’

1 2 3

CTAT CTAT

5 6

1 2 3

GATA

5

4

C T A

T

Alelo real (tetranucleotide repeat)


• Determinación de stutters n+4:

▫ Ocurre menos frecuentemente (<2%) – su detección depende de la

sensibilidad del análisis (debajo del ruido de fondo)

Alelo real (tetranucleotide repeat)

n+4

stutter

product

GATA GATA

CTAT CTAT CTAT 3’

5’

1 2 3

1

2’

2

Inserción causada por slippage

de la hebra copia (arriba)


• Stutters n+4pb:

▫ Su presencia está relacionada con el exceso de muestra en la PCR

▫ Generalmente representan el 4% del alelo progenitor


• El porcentaje de stutter puede variar en

los siguientes dos casos:

▫ Muestras low level DNA

▫ Exceso de ADN

• Determinación de stutters:

▫ Un alelo real puede encontrarse en posición

stutter

▫ En caso de duda, considerarlo como un alelo real

e incluirlo en la valoración estadística


• ¿Stutter elevado o mezcla de dos componentes?

Mezcla 1:3

29-30 y 28-30

Mezcla 10:1

29-30 y 28-30

En muchas ocasiones no tenemos criterio para decidir si un pico en posición

stutter es realmente un stutter, o un alelo, o una mezcla de ambos

Asignación alélica: Hb

• Equilibrio de heterocigotos ▫ En perfiles individuales Hb>60%

▫ Identifiler, 1ngr ADN, 28 ciclos

Asignación alélica: Hb

• Hb>60% no se cumple en muestras con escaso contenido en ADN

FGA-22 FGA-25 Hb Media

1692 1517 0,90

0,69

(0,23) 1915 864 0,45

1239 909 0,73


992 260 0,26

0,49

(0,36) 1422 419 0,29

895 805 0,90


- 66 0

0,37

(0,32) 54 107 0,50

130 219 0,59

John Butler


• Introducción







• Cálculo del LR

• Perfiles LLDNA

Determinación del número de contribuyentes

• En general:

▫ Si no hay más de 4 alelos por locus: al menos dos contribuyentes

▫ Si no hay más de 6 alelos por locus: al menos tres contribuyentes

▫ Si hay más de 6 alelos por locus: no se puede determinar el número de

contribuyentes

• Atención a mezclas formadas por individuos emparentados:

▫ Dos contribuyentes y ningún locus con más de 3 alelos

Pero puede que el fiscal o la defensa nos

propongan otro nº de contribuyentes

Determinación del número de contribuyentes

• El número de alelos observados por locus depende del nivel de

heterocigosidad y polimorfismo del propio marcador

Número de alelos observados en mezclas formadas por dos contribuyentes

Buckelton et al. (2007), Towards understanding the effect of uncertainty in the number of contributors to

DNA stains. FSI:Genetics 1: 20-28


• Introducción







• Cálculo del LR

• Perfiles LLDNA

Posibles combinaciones de genotipos

• Dos posibles abordajes:

• Contemplar todas las posibilidades: «unconstrained conditional method» (ISFG,

2006) o «unrestricted method» (SWGDAM, 2010)

• Contemplar sólo las combinaciones más probables: «constrained conditional

method» (ISFG 2006) o «restrictedd method» (SWGDAM 2010)

• Si se contemplan sólo las combinaciones más probables es necesario separar los componentes de la mezcla: «deconvolution»

• Podemos realizar esta tarea con distintas metodologías manuales o con la ayuda de software: • M. Bill et al. Forensic Sci. Int. 148 (2005) 181–189 (Pendulum)

• P. Gill et al. Forensic Sci. Int. 91 (1998) 41–53

• T. Clayton et al. Forensic Sci. Int. 91 (1998) 55–70

• M.W. Perlin et al. Am. J.Hum.Genet. 57 (1995) 1199–1210.

• M.W. Perlin et al. J. Forensic Sci. 46 (6) (2001) 1372–1377

Posibles combinaciones de genotipos

• Mezclas de dos contribuyentes sin restricciones

4 alelos

A-B C-D

A-C B-D

A-D B-C

C-D A-B

B-D A-C

B-C A-D

3 alelos

A-A B-C

B-B A-C

C-C A-B

A-B A-C

B-C A-C

A-B B-C

B-C A-A

A-C B-B

A-B C-C

A-C A-B

A-C B-C

B-C A-B

2 alelos

A-B A-B

A-A A-B

A-A B-B

A-B B-B

A-B A-A

B-B A-A

B-B A-B

(Clayton et al., For. Sci. Int. 1998; 91: 55-70)

En azul: combinación recíproca


• Introducción







• Cálculo del LR

• Perfiles LLDNA

Comparación con muestras de referencia

• En este momento es cuando se debe comparar el perfil mezcla con

las muestras de referencia. No hacerlo con anterioridad (si no se

va a utilizar LR semicontínuo)

• Muestras de referencia

▫ ¿hay sospechoso?:

Algunos laboratorios no analizan si no hay sospechoso

Es útil analizar para comparar con la base de datos nacional

▫ ¿hay víctima?:

Puede ser útil para eliminar su contribución alélica

Si los contribuyentes están muy desequilibrados suele ser muy útil


• Introducción







• Cálculo del LR

• Perfiles LLDNA

Cálculo del LR

Establecimiento de las hipótesis:

• Dos contribuyentes:

▫ Hp: la mezcla procede de la víctima y el sospechoso

▫ Hd: la mezcla procede de la víctima y otro individuo al azar de

la población de interés no emparentado con el sospechoso

• Formulación del LR:

▫ Marcadores con 1 sólo alelo

▫ Marcadores con 2 alelos



High template DNA:

Sin drop-out

Sin drop-in

Cálculo del LR

• 1 alelo

a

LOD

Evidencia

a

Sospechoso

a

Víctima

LR=Pr(𝐸𝑣𝑖𝑑𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎|𝐻𝑝)

Pr(𝐸𝑣𝑖𝑑𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎|𝐻𝑑)=Pr(𝐸𝑣𝑖𝑑𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎|𝑉+𝑆)

Pr(𝐸𝑣𝑖𝑑𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎|𝑉+𝑈)

𝐍𝐮𝐦𝐞𝐫𝐚𝐝𝐨𝐫: 𝐏𝐫(𝐄𝐯𝐢𝐝𝐞𝐧𝐜𝐢𝐚|𝐕 + 𝐒)=1 • Porque la probabilidad de obtener esa mezcla de alelos

si la muestra es una mezcla entre el ADN de la víctima

y del sospechoso es 1

𝐃𝐞𝐧𝐨𝐦𝐢𝐧𝐚𝐝𝐨𝐫: 𝐏𝐫(𝐄𝐯𝐢𝐝𝐞𝐧𝐜𝐢𝐚|𝐕 +U) • Un donante desconocido debe explicar los alelos de la mezcla que no son explicados por

la víctima, y no debe mostrar alelos que no aparezcan en la mezcla

En este caso, el único posible genotipo del donante

desconocido es: a-a (fa)2

LR = 1 / (fa)2

Cálculo del LR

• 2 alelos

a

Sospechoso

a

Víctima







𝐃𝐞𝐧𝐨𝐦𝐢𝐧𝐚𝐝𝐨𝐫: 𝐏𝐫(𝐄𝐯𝐢𝐝𝐞𝐧𝐜𝐢𝐚|𝐕 +U) • Posibles genotipos del donante desconocido:

• ab 2 fa fb

• bb fb2

LR = 1 / 2 fa fb + (fb)2

a

LOD

Evidencia

b

b

Cálculo del LR

• 3 alelos








• ab 2 fa fb

• ac 2 fb fc

• bb fb2

LR = 1 / 2 fa fb + 2 fb fc + (fb)2

a

Sospechoso

b

a

LOD

Evidencia

b c

a

Víctima

c

Cálculo del LR

• 4 alelos




𝐍𝐮𝐦𝐞𝐫𝐚𝐝𝐨𝐫: 𝐏𝐫(𝐄𝐯𝐢𝐝𝐞𝐧𝐜𝐢𝐚|𝐕 + 𝐒)=1 • Porque la probabilidad de obtener esa mezcla de

alelos si la muestra es una mezcla entre el ADN

de la víctima y del sospechoso es 1


• ab 2 fa fb

LR = 1 / 2 fa fb

a

Sospechoso

b c

Víctima

d

a

LOD

Evidencia

b c d


• Introducción







• Cálculo del LR

• Perfiles LLDNA

Perfiles LLDNA (LTDNA)

High template DNA

• Los epgs reflejan la composición de la muestra

• No drop-out

• No drop-in

• Hb≥0.6

Low Level DNA

• Los epgs no reflejan la composición de la muestra:

• Drop-out

• Drop-in

• Stutters

• Hb<0.6

• Cantidad limitada de ADN

• Puede ocurrir drop-out y drop-in

• El perfil de ADN puede no representar de forma precisa

los perfiles de la(s) personas que depositaron la

muestra ▫ Interpretado de forma diferente bajo las hipótesis de la defensa

y del fiscal

¿QUÉ ES UN PERFIL LOW LEVEL-DNA ?

Efectos estocásticos: ¿qué son?

• Supongamos que tenemos un extracto de ADN con

volumen = 50 ul que contiene el ADN de sólo 7 células

• Supongamos que el donante es heterocigoto

• Habrá 7 copias del alelo A y otras 7 del alelo B.

• Tomamos una alícuota de 25uL

• ¿Cuántos alelos habremos cogido?

Peter Gill

Efectos estocásticos: ¿qué son?

• Si repitiéramos la operación infinitas veces obtendríamos

los siguientes resultados:

Peter Gill

Efectos estocásticos: ¿qué son? • Tras la extracción: ▫ tomamos una alícuota para cuantificar ▫ otra para diluir ▫ otra para la PCR

• La PCR no es 100% eficaz, pero esto tiene menos efecto que la toma de alícuotas

• Todo esto da lugar a diferentes resultados:

Peter Gill

Efectos estocásticos: ¿cómo influyen?

Los efectos estocásticos producen: • Drop-out de loci: no se observan alelos en un locus

• Desequilibrio de heterocigotos (diferencias en la altura de los dos

alelos de un heterocigoto)

• Drop-out alélico: no se observa uno de los alelos en un heterocigoto (es el desequilibrio llevado al extremo)

• Aumento de stutters: el porcentaje (en altura o área) respecto al alelo real está incrementado

• Drop-in alélico: 1 o 2 alelos extra procedentes del ambiente del lab, de reactivos o de plásticos

• Diferencias entre duplicados de la misma muestra, debido a: ▫ Diferencias en el número de moléculas de partida en los replicados ▫ Diferencias inducidas por la variabilidad en la PCR

• Se necesita un marco de interpretación que pueda

aplicarse a todos los tipos de muestras: ▫ High template DNA

▫ Low template: incertidumbre sobre la composición de la

muestra debido a los efectos estocásticos

Efectos estocásticos: ¿cómo influyen

en la interpretación?

Los expertos pueden formular proposiciones que serán

evaluadas dentro del marco del LR

Veremos cómo se puede modificar la aproximación clásica del

LR para tener en cuenta los datos inciertos debidos a

condiciones LL-DNA

LR binario

• Inclusión: Match

LR = 1/2(freq10)(freq14)

Suspect Evidence

• Exclusión: No match

LR = 0/2(freq11)(freq11.3)

Evidence Suspect

En las próximas diapositivas veremos que…

• Si usamos LR no es necesario decidir exclusión / inclusión

• NO ES NECESARIO QUE LAS MUESTRAS DE REFERENCIA Y LA

MEZCLA COINCIDAN EN TODOS LOS ALELOS

• Gill and Buckleton, A universal strategy to interpret DNA

profiles that does not require a definition of low-copy-

number, FSI Genet. 4 (2010) 221-227

• Nuevas recomendaciones ISFG (2012) sobre low level DNA

LR binario

• Pero ¿que ocurre cuando tenemos dudas?

• Lo que hacemos habitualmente es intentar análisis adicionales (minis, otros kits, etc)

• Eliminar un marcador dudoso de un perfil es un error (es como si el LR = 1 para ese marcador)

• ¿Cual es el valor del LR en esta situación?

Evidence Suspect

LR binario

• Hasta ahora, este tipo de resultados se trataban de la siguiente forma:

▫ Sospechoso 10-14

▫ Mancha 14-14

• Ninguno de estos métodos tiene en cuenta la NO coincidencia en el

numerador, se continúa asumiendo que hay match bajo Hp

• Buckleton et al., 2006 ha demostrado que la regla 2p no es siempre

conservadora (no siempre está a favor de la defensa)

Regla 2p

LR = 1/2fr(14)

LR = 1 / 2fr(14)fr(1-14) +

fr(14)2

Evidence Suspect

• Este hallazgo no es neutral (LR ≠ 1)

• En casos de parentesco no eliminamos el marcador que no es

compatible, contemplamos la posibilidad de mutación

• Hoy en día se pueden incorporar otro tipo de probabilidades en el

LR: probabilidad de drop-out, de drop-in, etc. (el numerador del

LR ya no será 1 ó 0, sino un número entre 0 y 1)

Cálculo de LRs en

muestras

problemáticas

Evidence Suspect

• ISFG recommendations 2012

• Desde el punto de vista del fiscal (Hp) esta situación sólo puede

explicarse si el alelo b ha sufrido drop-out y el alelo a no ha sufrido drop-

out. No hay drop-in.

• Podemos calcular la probabilidad de que esto ocurra

• No hay necesidad de definir exclusión / inclusión

SOSPECHOSO = ab

EVIDENCIA = aa

MATCH?

Cálculo de LRs en muestras problemáticas


• Definiciones para drop-out: ▫ Probabilidad de drop-out en heterocigotos: d

La probabilidad de que ambos alelos sufran drop-out será d2

▫ Probabilidad de drop-out en homocigotos: D D ≤ d2 pero los consideraremos iguales

• Definiciones para no drop-out: ▫ En heterocigotos: 1 – d

La probabilidad de que ninguno de los dos alelos sufra drop-out será (1-d2)

▫ En homocigotos: 1 - D

• Definiciones para drop-in y no drop-in: ▫ Probabilidad de drop-in: c, pero siempre multiplicada por la

frecuencia del alelo que consideramos que es drop-in. ▫ Probabilidad de no drop-in: 1 - c

• Hp: el perfil de la evidencia procede el sospechoso,

dando por hecho que no hay drop-in (PrC=0):

▫ El alelo a no ha sufrido drop-out: 1 - d

▫ El alelo b ha sufrido drop-out: d

(1 – d) * d

Cálculo de LRs en muestras problemáticas: ejemplo sin

considerar drop-in (Caso B de Haned et al., 2012)

suspect evidence

d = prob. de que un alelo

sufra drop-out

• Hd: el perfil procede de otro (no hay drop-in). Posibilidades: ▫ Si el otro es aa:

Los aa aparecen en la población con frecuencia a2

No ha ocurrido drop-out en ninguno de los dos alelos: 1 – d2

▫ Si el otro es aQ, siendo Q cualquier alelo excepto a

(es decir su frecuencia es 1-fa): Los aQ aparecen en la población con frecuencia

2a(1-a) El alelo a no ha sufrido drop-out: 1- d El alelo Q ha sufrido drop-out: d

SOSPECHOSO = ab

EVIDENCIA = aa

aa

No drop-out

aQ

No drop-out de a

Drop-out de Q

Cálculo de LRs en muestras problemáticas: ejemplo sin considerar

drop-in (Caso B de Haned et al., 2012)

• Hp: la evidencia procede el sospechoso:

• Hd: la evidencia procede de otro:

SOSPECHOSO = ab

EVIDENCIA = aa

aa

No drop-out

aQ

No drop-out de a

Drop-out de Q +


(1 – d) * d

fa2 (1 - d2) + 2faf(1-a) (1 – d) d

• Gill and Buckleton, FSI Genet. 4 (2010) 221-227

Suspect

Crime stain Match??

No dropout Drop-inDrop-out

Suspect

Crime stain Match??


Suspect

Crime stain Match??


SOSPECHOSO = ab

EVIDENCIA = ax

• Desde el punto de vista del fiscal (Hp) esta situación sólo puede

explicarse si el alelo b ha sufrido drop-out y el alelo x es un drop-in

• Podemos calcular la probabilidad de que esto ocurra

• No hay necesidad de definir exclusión / inclusión


• Hp: el perfil procede el sospechoso: ▫ El alelo a no ha sufrido drop-out: 1 – d

▫ El alelo b ha sufrido drop-out: d

▫ El alelo x es un drop-in: c fx

• Hd: el perfil procede de otro al azar no relacionado ▫ Si el otro es ab

▫ Si el otro es ax

▫ Si el otro es aa

▫ Si el otro es xx

▫ Si el otro es aQ

▫ Si el otros es xQ

▫ Si el otro es QQ

▫ Si el otro es QQ’

SOSPECHOSO = ab

EVIDENCIA = ax

Suspect

Crime stain Match??


Suspect

Crime stain Match??


Suspect

Crime stain Match??



• En LRs binarios, los analistas se ven forzados a tomar decisiones

subjetivas sobre los alelos por debajo del umbral.

ALLELE 13 IS

PRESENT

ALLELE 13 IS

NOT

PRESENT

LET’S

USE

LRMIX!!

• En el método semi-continuo, que tiene en cuenta la probabilidad

de drop-out, no es necesario tomar decisiones arbitrarias,

evitando la subjetividad y promocionando así la estandarización

de resultados.

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