Explicación de TP Nº 2

Reacción en cadena de la

Polimerasa (PCR)

Química Biológica Patológica

Dra. Mariana L. Ferramola

Dra. Gabriela Lacoste

2015

Definición de PCR

� Es la amplificación enzimática de un fragmento de interés

(ADN) localizado entre dos oligonucleótidos (cebadores).

� Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de

interés.

Componentes del sistema de PCR

� ADN molde

� Oligonucleótidos (cebadores o primers)

� Polimerasa termoestable

� Solución buffer

� MgCl2

� dNTPs (dATP; dCTP; dTTP; dGTP)

� H2O

Máster

Mix

Componentes del sistema de PCR: ADN molde

El ADN molde puede ser de cadena sencilla o doble, circular

o lineal. En caso de desear amplificar una secuencia de ARN

se debe utilizar primeramente una transcriptasa reversa.

� Deben tenerse en cuenta los posibles contaminantes

presentes en el ADN molde (CALIDAD), que pudieran

disminuir la eficiencia de reacción :

� Urea

� SDS

� Acetato de sodio

� Agarosa

� Fenol

La CANTIDAD de ADN molde a utilizar depende de la muestra de

partida. Demasiada cantidad de ADN puede inhibir la reacción de PCR.

Componentes del sistema de PCR: ADN molde

El diseño de los primers para una PCR es FUNDAMENTAL.

Longitud

Especificidad

Temperatura de

Hibridación

Contendido

GC

CARACTERISTICAS

Complementariedad de

secuencias

Componentes del sistema de PCR: cebadores

Son los que delimitan la zona de ADN a amplificar y por lo tanto la especificidad.

Son los puntos de arranque de la Taq polimerasa, proveen los extremos 3´-OH

libres.

Reconocer una SECUENCIA UNICA dentro del ADN templado

Especificidad de un primer depende de la LONGITUD del mismo.

SECUENCIA CORRECTA!!

Componentes del sistema de PCR: cebadores

ESPECIFICIDAD

5´

5´

5´

5´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

5´

5´

5´

5´

5´ 3´ 3´ 5´

3´ 5´3´ 5´

5´ 3´

5´ 3´

3´ 5´

(A)

(B)

(C)

(D)

5´ 3´

ORIGIN901 gcagagtacc tgaaacagga agtattttaa atattttgaa tcaaatgagt taatagaatc961 tttacaaata agaatataca cttctgctta ggatgataat tggaggcaag tgaatcctga1021 gcgtgatttg ataatgacct aataatgatg ggttttattt ccagacttca cttctaatga1081 tgattatggg agaactggag ccttcagagg gtaaaattaa gcacagtgga agaatttcat1141 tctgttctca gttttcctgg attatgcctg gcaccattaa agaaaatatc atctttggtg1201 tttcctatga tgaatataga tacagaagcg tcatcaaagc atgccaacta gaagaggtaa1261 gaaactatgt gaaaactttt tgattatgca tatgaaccct tcacactacc caaattatat1321 atttggctcc atattcaatc ggttagtcta catatattta tgtttcctct atgggtaagc1381 tactgtgaat ggatcaatta ataaaacaca tgacctatgc tttaagaagc ttgcaaacac1441 atgaaataaa tgcaatttat tttttaaata atgggttcat ttgatcacaa taaatgcatt1501 ttatgaaatg gtgagaattt tgttcactca ttagtgagac aaacgtcctc aatggttatt1561 tatatggcat gcatataagt gatatgtggt atctttttaa aagataccac aaaatatgca

TTGGCTCCATATTCAATCGGT 5´ 3´

AACCGAGGTATAAGTTAGCCA 3´ 5´

ACCGATTGAATATGGAGCCAA 5´ 3´

ATGGGAGAACTGGAGCCTTC 5´ 3´

Forward Reverse OJO!!!!

Componentes del sistema de PCR: cebadores

La longitud de la secuencia es fundamental para la asociación ESPECIFICIDAD

Por ejemplo:

Hay una probabilidad de ¼ (4-1) de encontrar una A, G, C o T en una

secuencia dada.

Hay una probabilidad de 1/16 (4-2) de encontrar una secuencia de

dinucleótidos.

Hay una probabilidad de 1/256 (4-4) de encontrar una secuencia de

tetranucleótidos.

Si tenemos una secuencia de 17 pb, estadísticamente, esta estará presente

una vez cada 4-17 bases o aproximadamente 17 billones de bases.

LONGITUD IDEAL: 18-24 nt

Muy largos: fallas en el annealing bajo rendimiento

Componentes del sistema de PCR: cebadores

LONGITUD

Depende de la LONGITUD y la COMPOSICION del primer.

T° annealing depende de la Temperatura de melting o fusión (Tm) de los

primers.

Tm= temperatura a la cual la mitad

de las moléculas de primer están

apareadas con el ADN molde.

T°annealing: 5° C por

debajo del Tm más bajo del

par de primers (T°a=al

menos 50°C)

INESPECIFICIDAD

OPTIMA

BAJO RENDIMIENTO O NO

AMPLIFICACION

Los primers no deben tener T°a

muy diferentes entre si (no mas

de 5°C).

T°annealing

Componentes del sistema de PCR: cebadores

TEMPERATURA DE ¨ANNEALING¨

Asegura la unión estable entre el primer y el ADN templado

40-60% CONTENIDO GC

Componentes del sistema de PCR: cebadores

COMPOSICION DEL PRIMER

INTRA-PRIMER: el primer se

pliega sobre si mismo en una

estructura doble cadena

(interfiere con el annealing al

ADN templado).

COMPLEMENTARIEDAD DE SECUENCIAS

INTER-PRIMER: Formación de

dímeros disminuye la

formación de producto por

competencia

Componentes del sistema de PCR: polimerasa

termoestable

Las ADN polimerasas termoestables presentan las siguientes

características:

� Polimerizan en dirección 5’→ 3’.

� Necesitan de un extremo 3’-OH libre para comenzar la

polimerización.

� Incorporan dNTPs por complementariedad en una cadena

que sirve de molde.

� Necesitan la presencia de Mg2+ para funcionar.

� Son capaces de resistir altas temperaturas por períodos

considerables.

Componentes del sistema de PCR: polimerasa

termoestable

ADN polimerasa Vida media

(95ºC)

A) B) C)

Taq (Thermus aquaticus) 40 + - -

Vent (Thermococcus litoralis) 400 - + -

Pfu (Pyrococcus furiosus) 120 - + -

Tth (Thermus thermophilus) 20 + - +

A) AcIvidad exonucleasa 5’ → 3’.B) AcIvidad exonucleasa 3’ → 5’.

C) Actividad de transcriptasa inversa.

Existe una variedad de enzimas con características diferentes, según

la finalidad de la PCR a realizar.

Componentes del sistema de PCR: solución

buffer y MgCl

� Se utiliza un buffer Tris-HCl, de pH 8,4 (tº amb).

� La concentración de MgCl influye directamente en la actividad

de la polimerasa, y es uno de los parámetros a ajustar:

� Si la concentración de Mg2+ es deficiente, ↓ la eficiencia de la

enzima.

� Si la concentración de Mg2+ es excesiva, ↑ la polimerización

inespecífica.

La concentración ideal de MgCl

varía dependiendo de:

Conc de ADN molde de partida.

Conc. y longitud de cebadores.

Conc. de dNTPs.

Long. del amplicón.

Componentes del sistema de PCR: dNTPs

� Generalmente se utilizan concentraciones equimolares de los 4 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).

� Concentraciones mayores a 4mM inhiben la PCR por

quelación de Mg2+.

Protocolo típico de una reacción de PCR.

1º) Desnaturalización inicial (94 – 95ºC; 5 min)2º) Desnaturalización (94 – 95ºC; 30 seg – 1

min)

3º) Hibridación (tº específica para c/par de

cebadores; 30 seg)

4º) Elongación (72ºC; 30 seg – 3 min,

dependiendo del tamaño del amplicón)

5º) Elongación final (72ºC, 5 min)

Los pasos 2, 3 y 4

constituyen un

ciclo de PCR y se

repiten entre 25-

35 veces.

Etapas de un ciclo de PCR.

94ºC

Tm Primers

72ºC

(min)

Etapas de una PCR: Mezcla inicial

Etapas de un ciclo de PCR: Desnaturalización

Etapas de un ciclo de PCR: Hibridación

Etapas de un ciclo de PCR: Elongación

Reacción de PCR: esquema de amplificación

exponencial

Pérdida de eficiencia de PCR

Factores que llevan a la

pérdida de eficiencia de PCR

luego de varios ciclos:

� Disminución de actividad

de la polimerasa.

� Disminución de la

disponibilidad de dNTPs y

cebadores.

� Disminución de la

disponibilidad de Mg2+,

para el funcionamiento de

la enzima.

[AD

N]

Nº de ciclo

Fase lag

Fase

exponencial

Fase de

meseta

CONDICIONES PARA MEJORAR LA ESPECIFICIDAD

Mg2+

[dNTPs]

Tiempo de los

ciclos

Número de ciclos

[primer]

T° annealing

DISMINUIR AUMENTAR

TIPOS DE PCR SEGÚN LA MUTACION A DETECTAR

GRANDES DELECIONES

• PCR Multiplex

• GAP-PCR

• MLPA

MUTACIONES PUNTUALES Y DELECIONES PEQUEÑAS

• PCR-RFLP• Mutagenesis mediada por

PCRAlelo-Específicas:• PCR-MAS• PCR-ARMS/MARMS• PCR-ASOPlataformas:• PCR-OLA

MUTACION O POLIMORFISMO DESCONOCIDO

(Métodos de barrido)

• PCR-SSCP• PCR-DGGE

Es la amplificación, en un único tubo, de múltiples fragmentos de

una determinada secuencia.

Elección correcta de pares de primers que deberán dar lugar a

fragmentos de diferente tamaño, que deberán ser fácilmente resueltos

en una única línea de corrida de un gel.

Los primers usados son alelo-específicos.

Mutaciones puntuales. Ej fibrosis cística.

PCR-MAS

WT (139 pb), ΔF508 (136 pb), G542X (174 pb) y N1303K (240 pb)

N M N M N M N M - -P1 P2 P3 P4

Análisis del gen de la distrofina por PCR multiplex, detección de deleciones.

Los números superiores corresponden a cada pacientes. Los números de la

derecha corresponden a los exones amplificados. N: Control normal con

todos los exones. Paciente 2 presenta deleciones en los exones 50 y 52.

Paciente 1 presenta deleciones en los exones 50, 47 y 52. Paciente 10

presenta deleción en el promotor Pm. Paciente 7 presenta deleción en el

exón 52. Paciente 4 presenta deleción en los exones 3 y 6. Paciente 5

presenta deleción en los exones 43, 13 y 47.

Grandes deleciones. Ej: Distrofia muscular de Duchenne.

PCR-MULTIPLEX

Se amplifica el fragmento de interés por PCR.

El ADN amplificado es sometido a desnaturalización por calor o

agentes químicos como la formamida y luego se enfría rápidamente en

hielo (cambio brusco de temperatura)

Estos fragmentos se someten a electroforesis en geles de

poliacrilamida nativos (no desnaturalizantes).

Durante la electroforesis, los fragmentos de ADN adoptan una forma

tridimensional específica de acuerdo a su secuencia de nucleótidos, de

esta manera cada fragmento presenta una conformación única.

PCR-SSCP

Single strand conformation polymorphism

Debido a esto, la movilidad electroforética dependerá de la

conformación tridimensional que adopte el fragmento.

La sola presencia de una sola base de diferencia entre fragmentos de

ADN es suficiente para que los mismos adopten diferentes

conformaciones y migren en posiciones diferentes durante la

electroforesis.

PCR-SSCP

Single strand conformation polymorphism

PCR-SSCP

Single strand conformation polymorphism

PCR-DGGE

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

Se amplifica el fragmento de interés por PCR.

Los amplicones son separados en un gel de poliacrilamida

desnaturalizante (gradiente de urea y formamida) Si se desnaturaliza

con gradiente de temperatura, la técnica se denomina TGGE.

Durante la corrida, los amplicones se desnaturalizan parcialmente

(formando una estructura en forma de Y) a una concentración

específica del agente desnaturalizante y detienen su migración en el gel.

Los fragmentos con diferentes puntos de desnaturalización, lo que

dependerá de su secuencia de ADN, migrarán a diferentes posiciones.

Denaturing gradient gel electrophoresis analysis of DNA from 21 members of the Danish kindred with the French-Canadian Trp66-Gly m utation of the low-density

lipoprotein receptor gene.

Henrik Nissen et al. Circulation. 1995;91:1641-1646

simple complejo

20%

80%

PCR-DGGE

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

CONTROLES DE PCR

Control negativo

� Tubo extra en el cual se colocan todos los reactivos utilizados en la mix de PCR,

excepto ADN.

� Si en esta muestra hay amplificación significa que en algún reactivo hay restos

de ADN o de producto de PCR que está contaminando la reacción.

Control interno

� Consiste en la amplificación de un gen no relacionado con la secuencia de

interés, cuya expresión no varía y además debe expresarse en todas las células

(ej: GAPDH, actina, 28S). El control interno siempre debe amplificarse, es decir,

el amplicón siempre debe visualizarse luego de la electroforesis.

� Es un fragmento diferente de la secuencia blanco que se incluye en el mismo

tubo de reacción y se amplifica simultáneamente con la secuencia diana

� Este amplicón no debe competir en la amplificación del producto de interés y

debe ser posible discriminarlo del mismo (tamaño diferente).

� Se utiliza como un indicador de buena extracción de ADN, calidad de las

muestras y calidad de la reacción de PCR, ya que da una idea de la presencia de

inhibidores de la reacción y de la calidad del ADN y si la reacción de PCR fue

correcta o fallida.

CONTROLES DE PCR

Negative samples