PCR en Tiempo Real

ADN molde Primers Taq polimerasa dNTPs MgCl2 Buffer Fluorocromo

PCR en Tiempo RealPCR convencional

Ventajas Sensibilidad Cuantificación Monitoreo de todo el procedimiento Disminución del riesgo de contaminación Automatización Amplicones pequeños Amplio rango dinámico Transcripción reversa

• No específico• Curva de disociación• Económico SYBR Green

SYBR Green

• No específico• Curva de disociación• Económico SYBR Green

FAM: fluoresceínaJOE: dimetoxi-dicloro-fluoresceínaTAMRA: tetrametil-rodaminaROX: rodamina X

LUX™ primers

Sondas TaqMan®

Molecular Beacons ®

Sondas Scorpions™

A mayor producto de amplificación mayor

fluorescencia!!!!

Threshold

BasalControl Negativo

Ct

ΔRn

Muestra

Rn

Número de ciclos

• Rn: intensidad de la señal emitida por el reporter normalizada por la emisión del colorante utilizado como referencia pasiva (ROX).

• Threshold: umbral en el que se produce un cambio significativo en la fluorescencia.

• Basal: ciclos iniciales de la PCR (3-15) en los cuales hay cambios mínimos en la emisión de fluorescencia.

• Ct: número de ciclo en el cual la fluorescencia emitida supera el threshold. Está inversamente correlacionado con el log. del núm. inicial de copias.

• ΔRn: magnitud de fluorescencia generada durante la PCR.

Controles endógenos:

β-Actina

rARN 18S

GAPDH

β2-microglobulina

Métodos de cuantificación

• Cuantificación Absoluta

• Cuantificación Relativa a) Método del ΔΔCt: compara los Ct del gen

testeado y del gen de referencia (ΔCt) en cada muestra, y luego se comparan los ΔCt de las muestras experimentales con respecto a los calibradores.

(EFICIENCIA 100%). r= 2 -(ΔCtm-ΔCtc)

r= 2 -(ΔΔCt)

b) (Etarget)ΔCt

target (control-muestra)

r= (Eendógeno) ΔCt

endógeno (control-muestra)

E= 10 [-1/ pendiente]-1

Curva de disociación

• Contenido de GC.• Secuencia y tamaño del amplicón.

Ej. Cuantificación Relativa (SYBR Green) mediante el método del 2 -(ΔΔCt)

Objetivo: medir la expresión de TRalfa en leucocitos PMN de ratas controles e hipotiroideas. Endógeno: beta-actina.

Tejido calibrador: hígado de rata.

Curva de Rango Dinámico TRalfa

Curva de Rango Dinámico Beta Actina

Puesta a punto:

cDNAPrimers

(Calibrador!!!!!)

Target: TRalfa (m y calibrador)

• Master Mix

Endógeno: BetaActina(m y c)

NTC!!!

Ej. Discriminación Alélica (Taqman)

Objetivo: determinar genotipo homocigota o heterocigota para polimorfismo en gen de PPARγ2.

Alelos: Ala12 Pro12

Sonda 1 (FAM)

Sonda 2 (VIC)

Alelo 1

Match

Mismatch

Alelo 2

Match

Mismatch

• Homocigota alelo 1:

• Heterocigota:

• Homocigota alelo 2: