Práctica: Práctica: Práctica: Práctica: Reacción en Cadena de la Reacción en Cadena de la Reacción en Cadena de la Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR) Polimerasa (PCR) Polimerasa (PCR) Polimerasa (PCR)

Dra. Diana OrtizCátedra de Inmunología

Escuela de Medicina José María Vargas - UCV

Genoma:“Es la totalidad de la información genética que posee unorganismo en particular y que codifica para él.En humanos, el genoma consiste de 23 pares de cromosomas”

Alelo:“Diferentes formas o variantes de una gen”

Genotipo:“Conjunto particular de alelos para todos los genes portados porun individuo”

GenotipificaciónGenotipificaciónGenotipificaciónGenotipificación::::

Determinación del genotipo de un individuo.

Algunos conceptos

Un poco de historia…

1953

Para determinar la estructura tridimensional o disposición espacial de las

moléculas de ADN, se hace incidir un haz de rayos X sobre fibras de ADN y se

recoge la difracción de los rayos sobre una película fotográfica. La película se

impresiona en aquellos puntos donde inciden los rayos X, produciendo al

revelarse, manchas. El ángulos de difracción presentado por cada una de las

manchas en la película suministra información sobre la posición en la molécula

de ADN de cada átomo o grupo de átomos. Mediante esta técnica de

difracción de rayos X se obtuvieron los siguientes resultados:

1. Las bases púricas y pirimidínicas se encuentran unas sobre otras, apiladas a

lo largo del eje del polinucleótido a una distancia de 3,4. Las bases son

estructuras planas orientadas de forma perpendicular al eje (Astbury,

1947).

2. El diámetro del polinucleótido es de 20 °A y está enrolladlo

helicoildalmente alrededor de su eje. Cada 34°A se produce una vuelta

completa de la hélice.

3. Existe más de una cadena polinucleotídica enrollada helicoidalmente

(Wilkins et al., 1953, Franking y Gosling, 1953).

Estudios de difracción por rayos X del ADN

Rosaling Frankling

Estudios de difracción por rayos X del ADN

Watson (23 años) y Crick (34 años)Laboratorio Cavendish, Cambridge,

Inglaterra 1953.

Descripción de la estructura y propiedades fisicoquímicas del ADN.

Premio Nobel 1962 junto con Maurice Wilkins (colega

de Franklin)

Duplicación semiconservativa del ADN

1957

Meselsson y Stal

El Código Genético

Diagnóstico Microbiológico

Detección rápida y la caracterización de patógenos específicos

Identificación demicroorganismos

Características fenotípicas.Caracterización bioquímica.

Identificación demicroorganismos Identificación genotípica .

Avances en Biología Molecular

Hasta el siglo pasado

Identificación Características

Tradicional fenotípicas

- Habilidad para crecer en un medio determinado

- Resistencia a los antimicrobianos

- Propiedades bioquímica

Identificación de distintas especies de microorgani smos

Menor número de características observables

No cultivables

Tasa de mutación elevada mayor variabilidad genética

Flexibilidad en la adquisición de material genético

Influencia ambiental más pronunciada

En microorganismos

… Limitaciones

Identificación de distintas especies de microorgani smos

Ventajas el ADN

� Biomolécula muy fuerte

� Fácil de manipular

� Se puede obtener de diferentes fuentes.

Diagnosticar e investigar múltiples procesos patológicos

al nivel más fundamental.

Consideraciones

� ¿ Qué organismos se pueden analizar?

� ¿ Cuáles son los tipos de muestras clínicas que sepueden utilizar?

� ¿ Si las pruebas moleculares disponibles incluyenlos criterios de alta sensibilidad y especificidad,rapidez, simplicidad, y relevancia clínica?

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

EXTRACCIÓN DE ADN

� El éxito en la obtención de ácidos nucleicos depend e de:� Inhibición de las endonucleasas que degradan a los á cidos

nucleicos.

� Eliminación de las proteínas.

� Separación del ácido nucleico del resto de los comp onentes.

FUENTES DE ADN

� Gotas de sangre seca� Semen� Tumores� Cabellos� Tejidos Antiguos� Raspados bucales� Sangre Periférica (Más frecuente)

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN

• Cantidad de material• Número de copias de las moléculas de ADN• Cantidad de tejido

• Condiciones en las que se encuentra el material (fresco, congelado, fijado)

• Contaminantes e interferentes en el material biológico.

SELECCIÓN DEL MÉTODOSELECCIÓN DEL MÉTODOSELECCIÓN DEL MÉTODOSELECCIÓN DEL MÉTODO

� Fuente de ADN

� Cantidad

� Aplicación posterior

� Calidad requerida

� Conservación a largo plazo

� Costo

� Volumen de trabajo

«Caseros»:- Cloroformo-

fenol-isoamil

alcohol.

- Calentamiento

Comerciales: - Estuches «kits»

ADN:ADN:ADN:ADN:TotalTotalTotalTotalPlasmídicoPlasmídicoPlasmídicoPlasmídico

EXTRACCIÓN DE ADN CON PROTEINASA K A PARTIR DE BIOPSIASEXTRACCIÓN DE ADN CON PROTEINASA K A PARTIR DE BIOPSIASEXTRACCIÓN DE ADN CON PROTEINASA K A PARTIR DE BIOPSIASEXTRACCIÓN DE ADN CON PROTEINASA K A PARTIR DE BIOPSIAS

1.- Incubar las biopsias con 100 ul de Buffer Lisis ( Tris- HCl 10 mM, pH: 8.0 + 0.1% Sarcosina ) + proteinasa K ( 1000ug/ml) a 55 °C por tres horas o toda la noche a 50° C.

2.- Agregar igual volumen de Cloroformo: Fenol: Cloroformo: Fenol: Cloroformo: Fenol: Cloroformo: Fenol: IsoamilIsoamilIsoamilIsoamil alcoholalcoholalcoholalcohol, centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos.

3.- Tomar la fase acuosa y transferirla a otro tubo y agregar igual volumen de cloroformo, mezclar por inversión y centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos.

5.- Tomar la fase acuosa y transferirla a otro tubo. Agregar 1/10 volúmenes de acetato de amonio o de sodio 3M y el doble de volumen de etanol absoluto frío. Mezclar suavemente por inmersión y dejar precipitando toda la noche a –20°C.

Al día siguiente:Al día siguiente:Al día siguiente:Al día siguiente:

6.- Centrifugar a 14.000 rpm durante 20- 30 minutos.

7.- Descartar el sobrenadante y colocar los tubos en posición invertida en una estufa a 37°C por 20.

8.- Resuspender el pellet en 50 ul de agua destilada libre de nucleasas.

9.- Guardar los tubos a –20°C hasta el momento de su uso.

Métodos «Caseros»Métodos «Caseros»Métodos «Caseros»Métodos «Caseros»

Estuches comerciales

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ARN

EXTRACCIÓN DE ARNEXTRACCIÓN DE ARNEXTRACCIÓN DE ARNEXTRACCIÓN DE ARN

1.- a)Tejidos: b) Monocapa de células: c) Células en suspensión: TRIZOL

2.- Fase de separación: Incubar por 5 minutos a 15-30ºCAñadir cloroformo frío Agitar vigorosamente por 30 segDejar reposar 10 minutosCentrifugar a 14.000rpm por 15 min. a 4ºC. Se obtienen 3 fases: Acuosa: (ADN, ARN), Proteínas, Orgánica.Recuperar la fase acuosa:Por cada ml de Trizol agregar 500µl de isopropanol fríoInvertir suavementeDejar precipitando toda la noche a –20ºCCentrifugar a 14.000rpm por 10 min. a 4ºCSe forma el pellet, descartar el isopropanol

3.- Lavado de ARN:Lavar con 1 ml de etanol frío al 75% (diluido con agua con DEPC)MezclarCentrifugar a 7500g (aprox. 6000rpm) durante 5 min 4.- Descartar el etanol5.- Resuspender en 30µl de agua libre de DNAasa y RNAasa

---- Tratar todo con extremas condiciones de esterilidad y puntas con filtro.Tratar todo con extremas condiciones de esterilidad y puntas con filtro.Tratar todo con extremas condiciones de esterilidad y puntas con filtro.Tratar todo con extremas condiciones de esterilidad y puntas con filtro.---- El etanol al 75% debe está diluido con agua con DEPC.El etanol al 75% debe está diluido con agua con DEPC.El etanol al 75% debe está diluido con agua con DEPC.El etanol al 75% debe está diluido con agua con DEPC.---- Trabajar todo en frío.Trabajar todo en frío.Trabajar todo en frío.Trabajar todo en frío.

Determinación de absorbanciaDeterminación de absorbanciaDeterminación de absorbanciaDeterminación de absorbancia

Cuantificación: Cuantificación: Cuantificación: Cuantificación: una unidad de absorbancia a 260nm = 50 µg por ml de ADN doble hebra de en una cubeta de

1cm de camino óptico.

Pureza: Pureza: Pureza: Pureza: Abs 260/ Abs 280 = 1, 8 – 2 (alto grado de pureza de ADN)

< 1,8 alto grado de contaminación con proteínas

CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSCUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSCUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSCUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSMÁS UTILIZADAS

Hibridación con sondas de ácidos nucleicos

Amplificación de blancos

RT- PCR

Multiplex PCR

Nested PCR

PCR

PCR en tiempo real

Amplificación de BlancosReacción en Cadena de la Polimerasa

� Desarrollada en 1985.

� Permite replicar pequeñascantidades de ADN.

� Se basa en la actividad de laenzima ADN polimerasa defabricar una cadena de ADNcomplementaria a otra yaexistente.

Componentes de una PCR

Aplicaciones practicas más comunes de la PCR

Diagnóstico de

Enfermedades Hereditarias

� Aislar y marcar segmentos de ADN� Seleccionar sitios de mutación� Terapia genética� Complementa la clonación

� Leucemia mieloide crónica� Cáncer de cervix uterino y el VPH� Cáncer de Córnea� Todo tipo de oncogenes

� Drepanocitosis� Talasemia� Fibrosis quística� Hemofilia

Investigación

Diagnóstico delcáncer

� VIH

� Hepatitis

� Identificación de una muestra de sangre, semen o cabello.

Diagnóstico de

Infecciones

Patología Forense

Antropología

RT- PCR

� Amplifica blancos de ADN.

� Detección de las infecciones por virus de ARN.

� Detección de las especies de Mycobacterium .

� Determinación de la terapia antimicrobiana.

5´ 3´

5´3´

3´

3´

3´

3´

5´

5´

5´

5´

5´ 3´

5´ 3´

5´ 3´

Síntesis cDNA con laTranscriptasa reversa

RNAm

cDNA

cDNA con los reactivosde PCR

Amplificación del cDNA

SecuenciaciónMicroorganismo

Secuenciación

Genoma

Banco de genes

bioinformática

Pruebas en animales

Ensayos clínicos

Desarrollo de nuevos agentesTerapéuticos y/o vacunas

Métodos para la Identificación de losProductos Amplificados

Electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida.

Transferencia del ADN • Southern Blot• Dot Blot y Slot Blot

Sistemas de Detección con híbridos marcadoscon digoxigenina.

Electroforesis en gel de Agarosa1 2

43

TRANSFERENCIA DEL ADN

� Fenotipo de Adherencia localizada está

correlacionado con ECEP.

� Inducen el fenotipo de adhesión- destrucción.

� Las cepas ECEP presentanun plásmido de 50 a 70 Mda(FAE) y el gen cromosomaleaeA.

Escherichia coli Enteropatógena(ECEP)

APLICACIONES DE LA PCR•Detección del gen cromosomal eaeA y FAE deEscherichia coli

Análisis de la Presencia del GenCromosomal eaeA. Línea 1: PM;Línea 2: Control Negativo;Línea 3 y 4: Cepas ECEP.

Análisis de la Presencia del Factor de Adherencia . Línea 1: PM; Línea 2: Control Negativo; Línea 3: Controlpositivo;Líneas 4, 5 y 6: Cepas ECEP.

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6

400 pb

1000 pb

DetecciónMicroscópica

Carece de sensibilidad y especificidad.

Microscopia directa

No permite distinguir entre MTB y las (MNTB).

Necesidad de utilizar pruebas diagnósticasespecíficas para el inicio de un tratamiento

específico en forma rápida y oportuna.

Identificación Por cultivo

Requiere hasta cuatrosemanas.

DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS

DETECCIÓN DE Mycobacterium tuberculosisPOR PCR

� Se puede detectar a partir de:sangre, LCR, líquido pleural,esputo, lavadobronquioalveolar, orina ybiopsia.

� Se pueden identificar muestras con concentraciones de menos de 500 bacilos/ml.

VirusPapilomaHumano

Cáncer de Cuello Uterino

Incidencia25.54% 3000 nuevos

casosCada año

Edad entre25 y 64 años

DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VPH

Tipos de VPH más comunes

Lesiones Tipos de VPH más comunes

Verrugas comunes de mano

2, 4

Verrugas plantares 1, 2, 4

Verrugas planas cutáneas

3, 10

Verrugas genitales 6, 11

NIC, SCC cervical 16, 18

Otras neoplasias anogenitales

16, 18

NIC = Neoplasia intraepitelial cervical; SCC = Carcinoma de células escamosas

Tipo de Muestra

� Hisopado uretral� Hisopado cervical� Biopsia

Procesamiento de la Muestra

� Lisis Alcalina

� Amplificación

� Multiplex

Detección:� Primers MY09/ MY11

Tipificación:�Enzimas de Restricción

Multiplex PCR.

� Alto Riesgo : 16, 18 y 31

� Bajo Riesgo : 6 y 11

1 2 3 4 5 6 7

Detección de VPH medianteLa RCP.

Tipificación del VPH utilizandoEnzimas de restricción.

Visualización del Producto Amplificado

Foto.- Detección y Tipificación del VPH:

Línea 1: PM; Línea 2 y 3:ADN de pacientes;

Línea 4 y 5 : Control Positivo (multiplex).

144 pb (tipo 11)

263 pb (tipo 6)

360 pb (tipo 33)

401 pb (tipo 18)

601 pb (tipo 16)

1 2 3 4 5

Multiplex PCRDetección del gen cagA de H. pylori

• Bacilo gram- negativo.

• Coloniza la mucosa gástrica

• Infección está influenciada por :la susceptibilidad genética delhospedador, por factoresambientales y por la virulenciade la cepa infectante.

1 2 3 4 5 6 7 8

600bp

Figure 1. PCR amplification of m1/m2 region of the

vacA gene. Lane 1: ladder, lane 2 -6 DNA samples from

strains, lane 7: positive control, lane 8: negative control.

Figure 3. PCR amplification of urec gene. Lane 1: ladder,

lane 2 -11 DNA samples from strains, lane 12: negative

control, lane 13: positive control.

294 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura No. 8 .- Análisis deHelicobacterpyloricon MPCR. Línea 1: Marcador de PM;Línea 2:Control Positivo; Líneas 3- 7: ADN dePacientes;Línea 8: Control Negativo.

Cag A ( 348 pb )UreaC ( 315 pb )Flagelina ( 152 pb )16S ( 110 pb )

Fig.No.9.-Análisis deHelicobacter pylori conMPCR. Línea 1: Marcador de PM; Líneas 2-4:ADN de Pacientes; Línea 5 : Control Positivo ;Línea 6: Control Negativo.

1 2 3 4 5 6