Quimioluminiscencia e Inmunofluorescencia

Quimioluminiscencia

• La quimioluminiscencia se produce cuando una reacción química genera una especie electrónicamente excitada, que emite luz cuando vuelve al estado fundamental o que transfiere su energía a otra especie que, posteriormente, da lugar a una emisión. (Skoog et al, 2001)

Skoog et al (2001), Principios de Análisis Instrumental 5ta. Edición. Editorial Mc. Graw Hill. Madrid España

Aplicaciones analíticas

• Estos métodos generalmente tienen una elevada sensibilidad, ya que en ausencia de ruido, se miden bajos niveles de radiación.

Análisis

• Para aumentar la selectividad del analito se determinan primero los que no participan en la reacción.

• Es común llevar a cabo una reacción enzimática previa, donde el analito a determinar es el sustrato y los productos de la reacción enzimática se detectan por quimioluminiscencia.

Caso Clínico: Detección del VIH

• ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent assay), pruebas de aglutinación y análisis dot-blot son las más utilizadas, especialmente el ELISA que también se denomina análisis inmunoenzimático (abreviado, EIA).

Prueba de ELISA

• El antígeno puede proceder del lisado viral de un cultivo (como en los primeros EIA disponibles que se llamaron de 1ª generación) o bien de proteínas recombinantes o péptidos sintéticos de 10-50 aminoácidos específicos del VIH (que se han calificado como EIA de 2ª. y de 3ª. generación). Según su diseño para reconocer la presencia de anticuerpos se habla fundamentalmente de cuatro tipos de EIA diferentes: indirecto, competitivo, tipo sandwich y de captura. Los dos últimos suelen ser los más sensibles y específicos; dentro de los primeros los indirectos son más sensibles que los competitivos y éstos mas específicos que aquellos.

Proceso

• La muestra, suero normalmente, se enfrenta en un soporte, generalmente un pocillo de una placa de microtitulación, a un componente vírico que actúa como antígeno. Si en el suero existen anticuerpos específicos, éstos se unen con el antígeno formando un complejo que se pone en evidencia mediante una reacción enzimo-cromática que puede ser visualizada a simple vista o medida con un fotómetro. Por lo general, en las técnicas ELISA no competitivas, la muestra es positiva cuando se desarrolla color.

Inmunoflourescencia

Luminiscencia o fotoluminiscencia: Almacenar energía luminosa y liberarla posteriormente como energía luminosa

Fosforescencia: Períodos de almacenamiento largo con emisión mucho después de cesada la excitación

Fluorescencia: Períodos de almacenamiento cortos 10-7 – 10-9 seg y emisión

Propiedad de algunas sustancias

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Fluorescencia

Es el resultado de un proceso en tres etapas que ocurre en algunas moléculas (fluoróforos)

Diagrama Jablonski

1°: Excitación: se entrega un fotón de energía por una fuente externa a un fluoróforo que absorbe, pasando a un estado electrónico excitado S1’

3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite, lo que permite el retorno al fluoróforo al nivel S0. A causa de la disipación de energía durante el estado excitado, la energía de este fotón es menor.La diferencia de energía es llamada “Stokes shift” (hνEX – hνEM) que es fundamental para la sensibilidad de las técnicas de fluorescencia, ya que la emisión del fluoróforo permite distinguirse del background.

2°: Duración del estado excitado: existe por un período de tiempo finito (típicamente 1-10 x 10-9 segundos), sufre cambios conformacionales y puede interaccionar con su ambiente molecular. Consecuencias: La energía de S1’ es parcialmente disipada produciendo un estado excitado relajado desde el que se emite la fluorescencia; no todas las moléculas inicialmente excitadas del estado 1 vuelven al estado S0 por fluorescencia, existen otros procesos.


Espectro de Fluorescencia

El mismo fluoróforo puede ser repetidamente excitado y detectado. Para moléculas poliatómicas en solución las transiciones electrónicas son reemplazadas por un espectro de energía llamado espectro de excitación de fluorescencia y de emisión. El ancho de banda del espectro es un parámetro importante para cuando dos fluoróforos son detectados simultáneamente.

El espectro de emisión de fluorescencia es independiente de la longitud de onda a la cual se excita. La intensidad de emisión es proporcional a la amplitud del espectro de excitación a la longitud de onda de excitación.

La intensidad de la señal depende de los mismos parámetros que la absorbancia, aunque también de la fuente de excitación (comúnmente un láser de ion argón, longitud de 488 nm) y de la eficiencia de recolección del detector.

Para una intensidad satisfactoria de fluorescencia es preciso que se utilicen como excitadoras radiaciones de longitud de onda correspondientes a los máximos de absorción del fluoróforo.Los espectros de absorción y de fluorescencia de un fluoróforo en general están próximos ( más cortas y más largas respectivamente). Esto es importante en la elección de los filtros.


Rodamina 6GRodamina B

Fluoresceína

Isotiocianato fluoresceína

Fluoróforos

Generalmente son compuestos heterocíclicos o hidrocarbonos poliarómaticos: moléculas rígidas

(varios niveles a los cuales pueden ser excitados; en el retorno, al no rotar no emite calor y sí luz)

Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y excitación característicos; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitación pero distinto espectro de emisión, se pueden medir dos características al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores).


Inmunofluorescencia

Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo después este

conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de

microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es

positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el

microscopio de inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o

una enzima que cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia

Clínica (Diagnósticos)

Investigación (inmunohistoquímica, inmunofluorescencia)

Utilidades


Elección de marcado para inmunoensayos

Marcado Método de detección

Ventajas Desventajas

Enzimático sustratos cromogénicos

detectados por abs

Vida media alta. Alta sensibilidad

Múltiples pasos. Enzimas endógenas

Biotina Avidina/ Estreptavidina

acoplada a marcadores

Vida media alta. Alta sensibilidad

Detección universal

Múltiples pasos. Biotinas endógenas.

Fluorescencia Excitación en UV y emisión en el

visible detección en micro fluorescencia

Vida media alta Alta resolución

Autofluorescencia quenching

Método enzimático Método fluorescenciaSensibilidad

Resolución


Inmunofluorescencia directa

Inmunofluorescencia indirecta

Antígenos

Antígenos

Anticuerpo 1° Anticuerpo 1°

Anticuerpo 2°

Ventajas

Desventajas

Se necesitan pocos pasos

Menos problemas de background

Posibilidad de doble marcación

Menor sensibilidad (nec. mucho Ac 1º)

Señal poco amplificada

Es necesario purificar el Ac

El Ac puede perder afinidad

Se necesitan muchos pasos de tinción

Con ag múltiples se necesita que los Ac 1º sean de distintas especies

El mismo anticuerpo conjugado se utilizan para distintas reacciones

Son comerciales

Se evita la disminución de afinidad del Ac 1°

Utiliza un solo anticuerpo Utiliza un 2° anticuerpo conjugado


Inmunofluorescencia de superficie

Inmunofluorescencia citoplasmática

- Lavado de células

-Bloqueo con suero normal de la especie del Ac 2°

- Agregado de Ac 1° e incubación

- Lavados

- Agregar el Ac 2° conjugado a fluorocromo e incubar

- Lavados

- Resuspender el pellet

- Hacer el frotis en porta

- Secar y fijar con metanol frío 30’

- Lavado de células

-Resuspender el pellet y hacer frotis

- Secar y fijar con metanol frío 30’

-Hidratar los portas en PBS 30’

-Bloqueo con suero normal de la especie del Ac 2°

- Agregado de Ac 1° e incubaciónen cámara húmeda

- Lavados en Koplin

- Agregar el Ac 2° conjugado a fluorocromo e incubar en cámara húmeda

- Lavados

-Montar con PBS

Importante: Permeabilizar

Tb se fija con formamida y se permeabiliza con Tritón X100


Caso Clínico

• ESTUDIO SEROLOGICO POR INMUNOFLUORESCENCIA DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EN COSTA RICA

• LILIANA REYES, A. BONILLA, T. MOYA y MISAEL CHINCHILLA

• Departamento de Parasitología, Facultad de Microbiología y Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales, Universidad de Costa Rica.

Metodología• Se analizaron 1.073 sueros obtenidos por punción venosa de

pacientes (470 hombres y 603 mujeres), atendidos en la consulta externa de diversas clínicas de Costa Rica, de estudiantes de la provincia de Limón y de la Facultad de Microbiología de la Universidad de Costa Rica. Un 19% correspondía a personas menores de 9 años, pero la mayoría de las muestras (47%) fueron pacientes entre 20 y 39 años (Tabla 1).

• El antígeno para IF se obtuvo de epimastigotos de T. cruzi (cepa CR-4), cultivados en medios de Schneider. La técnica de IF se realizó según Camargo, utilizando anti-IgG humana marcada con fluoresceína (SBL National Bacteriological Laboratory, Sweden, molar F/P ratio = 4,3, Lot N° SH 803905-1). Se consideraron como positivas aquellas muestras con títulos de 1:32 o más.

Resultados

• La Tabla 2 muestra un porcentaje de positividad de 2,1% en la población general. La mayor positividad se presentó en la provincia de San José con 3,6% seguida de Guanacaste con 1,9%, encontrándose la menor (0,8%) en Heredia. Las provincias de Alajuela, Cartago y Limón presentaron 1,2% de positividad, mientras que en Puntarenas se obtuvo un 1,5% de pacientes positivos.

• De los veintitrés pacientes positivos 15 eran mujeres y 8 varones. Con respecto a la edad, nueve se hallaban entre los 10 a 20 años, once eran mayores de 30 años y los dos restantes tenían entre 20 y 30 años.

Quimioluminiscencia e Inmunofluorescencia

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