Quiz 1. Mencione 3 caractersticas de una muestra

para ser clasificada como muestra apta para ser procesada 2.En general, en una inmunoflorescencia como se debera ver una muestra negativa y una positiva?

LABORATORIO DE VIROLOGASemana 12: Prctica 9: Inmunofluorescencia. (Adenovirus)

Adenovirus

DIAGNSTICO DE VIRUS RESPIRATORIOS

Diagnstico de Virus Respiratorios

Diagnstico clnico(Dx) Anamnesis (sgnos, sntomas, antecedentes) Exploracin fsica

Dx presuntivo (ej IRA)

Diagnstico por laboratorioSe busca: La deteccin, identificacin y tipificacin del agente etiolgico

Como?Pruebas Directas: Evidencian el antgeno (agente infeccioso)Cultivo. Gold Standard Imnunofluorescencia Directa (kits)

Inmunoensayos en placa o membrana (ELISA Directa )Pruebas moleculares (PCR-hidridacin)

Pruebas Indirectas: Evidencian presencia de anticuerposPoco tiles (dependiendo de la muestra) Pruebas de ms de un paso

MUESTRAS

Perodo ideal para tomar muestraLas mejores muestras por lo general son las que se obtienen en un estadio temprano de la enfermedad (durante los primeros tres a cuatro das de evolucin), cuando el virus se excreta en concentraciones relativamente elevadas y todava no se ha unido con anticuerpos. Transcurridos 7 das o ms habitualmente no vale la pena tomar muestras para realizar un diagnstico de Infecciones respiratorias.

Muestras adecuadas (criterios)

Tomado de http://www.saludhoy.com/imagen/image%20nin/Articulos/farif1.jpg

Toma de muestraVirocult o Sistema similarContiene: Esponjita con medio de cultivo adecuado: Medio Stuart con estabilizante (Protena). Conservacin: T a menos de 20oC (mximo 48hs) -70C.

oPara Fluorescencia: Se usa el sedimento. Conservacin: -20C. oPara Cultivo: Transvasar el sobrenadante a un medio apropiado ej BHI suplementado (Antibiticos + Antimicticos). Conservacin: -70C.

Las muestras que se reciben en el laboratorio se deben determinar como:Muestras Aptas Para Ser Procesadas (MAPSP)

Criterios para establecer la aptitud de la muestra

Muestras No Aptas Para Ser Procesadas

Procesamiento de la Muestra: Celularidad Obtencin de un sedimento rico en clulas

Recuento < 10 clulas 10 15 clulas

Celularidad MME Aceptable No apropiada

15 25 clulas> 40 clulas

BuenaExcelente

Apropiada

LA TCNICA

Inmunofluorescencia Es una tcnica de laboratorio empleada para identificar

anticuerpos o antgenos especficos. La identificacin de los anticuerpos por lo general se

realiza en la sangre (suero).

Inmunofluorescencia

Fluorocromos Los fluorocromos son molculas que al ser

excitadas con la energa de una determinada longitud de onda son capaces de emitir energa de una longitud de onda mayor.

FITC

Mtodos directos Vs. indirectos

LECTURA DE RESULTADOS

Deteccin viral: Positivo

Control negativo del paciente Muestra (pte) +Ac de ratn normal Buena celularidad

Positivo en el mismo paciente Muestra (pte) +Acs monoclonales virus Buena celularidad

Deteccin viral: Negativo

Control negativo del paciente Celularidad adecuada

Screening negativo en el mismo paciente Muestra (pte) +Acs monoclonales virus celularidad adecuada

Deteccin viral: MME

Control negativo del paciente Pocas clulas (restos)

Screening negativo en el mismo paciente Baja celularidad (Restos)

Reporte de la Prueba Celularidad adecuada Muestra homognea

Controles de la prueba Control negativo del paciente

Informe de muestras positivasLa positividad de la prueba se determina por la presencia de tres o ms clulas intactas que presenten fluorescencia, en la preparacin respectiva. Aunque no siempre se encuentran patrones especficos en las pruebas, los patrones descritos a continuacin pueden ser de cierta ayuda:

RSV: fluorescencia en el citoplasma de la clula. Las tinciones citoplasmticas se ven punteadas con pequeas inclusiones. Influenza A y B: Fluorescencia nuclear, citoplasmtica o ambas. La tincin nuclear brilla uniformemente. La citoplasmtica es generalmente punteada con inclusiones largas. Parainfluenza tipo 1, 2 y 3: Fluorescencia en el citoplasma, es punteada con inclusiones irregulares. Adenovirus: Fluorescencia nuclear, citoplasmtica, o ambas, la tincin brilla uniformemente. Las clulas tienden a redondearse.

Pozo 1

Muestra muy escasa (MME)

Pozo 2

Pozo 3

Pozo 4

Pozo 5

Pozo 6

Pozo 7

CN

Screening

Pozo 1

Muestra no homognea

Pozo 2

Pozo 3

Pozo 4

Pozo 5

Pozo 6

Pozo 7

CN

Screening

Pozo 1

IFI negativa

Pozo 2

Pozo 3

Pozo 4

Pozo 5

Pozo 6

Pozo 7

CN

Screening

Control negativo paciente 1 Control positivo para VSR

La prueba: IFD EJEMPLOCelularidad adecuada Muestra homognea

Controles de la pruebaControl negativo del paciente Screening del paciente Reporte: IFD negativa

OKOK Negativo

PROCEDIMIENTO

Procedimiento: Toma de muestra

Con la ayuda de un bajalenguas estril, realizar un raspado de la parte posterior de la farnge; detrs de la vula, acercando el hisopo lo ms que se pueda a la nasofarnge (clulas mucosa virus).

Colocar el hisopo en un vial plstico, el cual debe contener 1 ml de PBS o un medio apropiado para el transporte y mantenimiento de las partculas virales presentes.

Procedimiento: Toma de muestra

Cierre el vial y aplicar vortex durante 30 segundos. Tome el palito del hisopo y trate de recuperar de l lo ms que pueda de muestra (clulas).

Descarte el hisopo en un recipiente adecuado.

Procedimiento Centrifugar a 4 C a 1.900 rpm por 10 minutos para

separar en dos fases: Sobrenadante

Sedimento celular

Virus Agregar el sobrenadante en un vial estril bien identificado, tapando rpidamente y cuidando evitar cualquier contaminacin. Mantener a 70oC CULTIVO

Clulas + Virus El sedimento (botn celular) ser usado para realizar la INMUNOFLUORESCENCIA

Procedimiento: Lavado Descartar el sobrenadante en hipoclorito CON CUIDADO,

dejar 100 l de sobrenadante y realizar vortex (distribucin homognea de las clulas). Si hay mucosidad en la muestra: Resuspender el botn celular

con 1 mL de PBS 1X usando el vortex. Centrifugar a 4 C a 1.900 rpm por 10 minutos para separar en dos fases. Descartar el sobrenadante en un recipiente con Hipoclorito.

Procedimiento: Montaje de las lminas Limpiar (alcohol antisptico) y marcar las laminas.1PD Grupo X

2

Tomar 12 L del sedimento y servir en pozo 1 y 2 Dejar secar las lminas (puede ayudarse por ejemplo con el flujo de aire de la

cmara) o de un ventilador. Introducir las lminas bien secas en acetona fra (guardada a 20oC) por 10

minutos.

Sacar las lminas y djelas secar.

Procedimiento: Inmunofluorescencia Preparar la cmara hmeda (para no dejar secar la muestra, NO dejar

excedente de agua) y atemperar los reactivos (conjugado: At + FITC). Colocar una gota del conjugado en cada

pozo (No tocar la muestra).

Incubar en la cmara hmeda a 37 oC por 30 min.PD Grupo X

1

2

Eliminar el excedente de conjugado

sobre papel secante (SUAVEMENTE, perpendicular la lamina, dejar rodar).

Colocar la lmina en el tarro de lavado con PBS tween (detergente para

eliminar exceso de conjugado) Agitar 3 min (dependiendo de la mucosidad inicial).

Procedimiento: Inmunofluorescencia Sacar la lamina y adicionar PBS-tween sobre

la misma pero no apuntar directamente sobre los pozos. Secar el excedente con papel secante en la

margen de los pozos (Cuidado NO tocar las muestras).

Dejar secar la lamina (3-5 min).

Realizar el montaje:

Colocar una gota de montaje de fluido Colocar la laminilla encima Retirar el excedente con papel secante

Procedimiento: Lectura de lminas Ubicar el microscopio de fluorescencia en el objetivo 20x. De esta

manera se puede tener una idea de la cantidad de clulas en cada preparacin as como de la distribucin celular. Para la lectura de la fluorescencia y su reporte el objetivo a usar es 40x.

Clulas de la mucosa infectadas con virus (Verde) Clulas de la mucosa (Rojas)

Negativo

Positivo

La prueba: IFDMontaje de reaccinLminas Control (Lminas testigo) Pozo del paciente + control negativo (Ab ratn no expuesto al Agente + Azul de Evans) Pozo del paciente + Anticuerpo contra el agente (+ Azul de Evans)

Identificacin bajo el Microscopio Celularidad adecuadaDistribucin homognea

Control negativo adecuadoResultados del test con Anticuerpos contra el agente

Ejercicio Panel RespiratorioBsqueda de ms de un agente por muestra. 9 Pozos: Misma muestra fijada en todos los pozosPozos 1 7: Anticuerpos distintos por pozo. Anticuerpos contra un solo agente. Pozo 8: Control negativo: Anticuerpos de ratn no expuesto a ningn agente. Pozo 9: Screening: Anticuerpos aadidos del pozo 1 al 7, juntos en un solo tubo.

Pozo 1

Reporte la IFD del paciente DJPozo 3 Pozo 4 Pozo 5

Pozo 2

Pozo 6

Pozo 7

CN

Screening

Control negativo paciente 1

Pozo 1

Reporte la IFD del paciente SDPozo 3 Pozo 4 Pozo 5

Pozo 2

Pozo 6

Pozo 7

CN

Screening

Pozo 1

Reporte la IFD del paciente AMPozo 3 Pozo 4 Pozo 5

Pozo 2

Pozo 6

Pozo 7

CN

Screening

Pozo 1

Reporte la IFD del paciente AMPozo 3 Pozo 4 Pozo 5

Pozo 2

Pozo 6

Pozo 7

CN

Screening

Control negativo paciente 1

Pozo 1

Reporte la IFD del paciente TRPozo 3 Pozo 4 Pozo 5

Pozo 2

Pozo 6

Pozo 7

CN

Screening

Control negativo paciente 1

Pozo 1

Reporte la IFD del paciente ESPozo 3 Pozo 4 Pozo 5

Pozo 2

Pozo 6

Pozo 7

CN

Screening

Control negativo paciente 1