Pruebas bioqumicas

IndolIntroduccinEl indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de m.o.

PrincipioLa prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs descrito ms adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Medios y reactivosCaldo triptofanoPeptona o digerido pancretico de casena2 gCloruro de sodio0,5 gAgua destilada100 ml

Reactivo de KovacsAlcohol amlico o isoamlico150 mlp-dimetilaminobenzaldehdo10 gHCl conc.50 ml

Procedimiento Inocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo.

InterpretacinEl desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva.

ControlesEscherichia coli: positivoKlebsiella pneumoniae: negativo (mayora de las cepas)

Rojo de Metilo - Voges-Proskauer (RM VP)PrincipioUna de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta.El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia

Medios y reactivosCaldo RM/VPPeptona7 gGlucosa5 gFosfato dipotsico5 gAgua destilada1 L

pH = 6,9 0,1

Indicador de pH rojo de metiloRojo de metilo0,1 g en 300 mL de etanol 95Agua destilada200 ml

Revelador VPalfa-naftol (solucin al 5% en etanol 95)Solucin de KOH al 40% en agua destilada

ProcedimientoInocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a 35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 mL del caldo a un tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos.

InterpretacinLa prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. ferment la glucosa por la va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona.

ControlesRM positivo, VP negativo: Escherichia coliRM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes

Utilizacin de CitratoIntroduccinLa utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias.

PrincipioLa utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.