PRUEBAS BIOQUÍMICAS

UTILIZACION DE AZUCARES

Los azúcares que vamos a utilizar son:

- GALACTOSA- GLUCOSA- INOSITOL- LACTOSA- MALTOSA- MANITOL- RAFINOSA- RAMNOSA- RIBOSA- SALICINA- SORBITOL- XYLOSA

FUNDAMENTO: Estas pruebas bioquímicas se integran dentro del grupo que estudia la determinación de la capacidad de un microorganismo para utilizar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de cultivo básico, originando un pH ácido. El medio de cultivo lleva incorporado un indicador de color (rojo fenol), de color rojo a pH alcalino y amarillo a pH ácido.

TECNICA: Se siembra con un inóculo espeso. En el caso de querer apreciar la degradación en condiciones de anaerobiosis o cuando se desea estimar si se trata de metabolismo oxidativo o fermentativo, se cubre el medio con 1-2 ml de parafina líquida estéril. Se incuba a 37°C - 24 h.

RESULTADO +: color amarillo del medio, que indica acidez.RESULTADO -: color rosa-rojizo del medio, que indica alcalinidad.

PRUEBA CAMPFUNDAMENTO: La actividad hemolítica de la β lisina estafilocócica sobre los eritrocitos se ve intensificada por un factor extracelular producido por estreptococos del grupo B, llamado factor CAMP. Por lo tanto, cuando ambos productos se encuentran juntos en una placa de agar sangre ovina, se advierte una intensificación de la reacción β hemolítica.

TECNICA: La prueba CAMP se realiza trazando una estría de estreptococos (por identificar) en forma perpendicular a otra estría de una cepa de Staphylococcus aureus conocida como productora de β lisina. Ambas líneas no deben tocarse (figura 22A). Las placas se deben incubar en aerobiosis.

INTERPRETACION: Como se ilustra en la figura 22B, la zona de intensificación de lisisasume la forma de una punta de flecha en la intersección de ambas estrías.

PRUEBA DE LA CATALASAFUNDAMENTO: El peróxido de hidrógeno se forma como un producto terminal oxidativo de la descomposición aeróbica de los azúcares. Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es tóxico para las bacterias, por lo que deben tener el enzima catalasa, que lo descompone a agua y oxígeno.

TECNICA: Seguiremos el método del portaobjetos: Con un asa de platino se recoge una colonia del cultivo puro y se coloca sobre un portaobjetos. Se agrega una gota de Peróxido de hidrógeno al 30% con una pipeta Pasteur.

RESULTADO +: Inmediata formación de burbujas por la liberación de gas.RESULTADO -: No hay formación de burbujas.

CITRATOFUNDAMENTO: Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono para el metabolismo. El medio utilizado incluye citrato como única fuente de carbono y fosfato amónico como fuente de nitrógeno. Las bacterias que metabolicen el citrato, también utilizarán el fosfato amónico, con la consiguiente alcalinización del medio.

TECNICA: Se emplea el medio sólido Citrato de Simmons, con azul de bromotimol como indicador de pH: presenta color amarillo en condiciones ácidas (pH=6), azul en medio alcalino (pH=7.6), y verde en el medio no inoculado (pH=6'9). El medio se prepara en pico de flauta largo, con poca profundidad.

Se inocula únicamente en zig-zag sobre el medio en pico de flauta. Se incuba a 37°C 24 a 48 horas, si bien a veces incluso son necesarios 4 días.

RESULTADO +: Crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta.RESULTADO -: No se observa crecimiento ni cambio de color, apareciendo verde.

COAGULASA EN PORTA ("CLUMPING FACTOR")FUNDAMENTO: Vamos a investigar la capacidad de producción del enzima coagulasa. No se conoce exactamente su mecanismo de acción, aunque va a actuar de alguna forma sobre el mecanismo de coagulación del suero provocando la transformación de fibrinógeno en fibrina, con la consiguiente formación del coágulo.

TECNICA: Se emplea normalmente plasma de conejo.Se coloca una gota estéril de plasma de conejo con anticoagulante (EDTA), y se emulsiona en ella suavemente una suspensión espesa de microorganismos.

Se pueden colocar en el mismo porta microorganismos de control positivo y negativo.

RESULTADO +: Se observa la inmediata formación de un precipitado macroscópico en forma de aglutinados blancos (grumos).RESULTADO-: Se considera negativo si no se produce la aglutinación en 3-4 minutos.

DNAsaFUNDAMENTO: Empleamos un medio de cultivo cuya característica principal es la de poseer ácido desoxirribonucleico, con objeto de investigar si es hidrolizado por el microorganismo problema, en caso de que posea la enzima desoxirribonucleasa.

TECNICA: Se siembra en el medio Agar DNAsa con una estría central. Se incuba a 37°C - 24 h. Trás el periodo de incubación, se inunda la placa con ácido clorhídrico 1N.

RESULTADO+: Al añadir el ClH, hace que el ADN existente precipite, produciendo con ello un enturbiamiento del medio. Es evidente que donde ya no quedaba ADN por la acción de la DNAsa microbiana, el medio aparecerá transparente. Esto sucederá en la zona contigua al crecimiento, indicando con ello que el microorganismo ha hidrolizado el ácido nucleico.RESULTADO -: El ADN no ha sido despolimerizado, con lo que precipita por el ClH en toda la placa, y no va a haber zona transparente.

HIDROLISIS DE LA ESCULINAFUNDAMENTO: la esculina, un glicósido, es hidrolizada por algunas bacterias, dando como productos de degradación glucosa y esculetina. La esculetina al reaccionar con el hierro forma un complejo de color castaño oscuro o negro.

TECNICA: se emplea un medio que lleva esculina, y al que se han incorporado sales de hierro como indicadores de la presencia de esculitina. El microorganismo se siembra por agotamiento.

RESULTADO +: presencia de color negro/castaño oscuro alrededor de las colonias.RESULTADO -: ausencia de color negro.

DECARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS(ARGININA, LISINA Y ORNITINA DECARBOXILASAS)

FUNDAMENTO: Algunas bacterias (p.e. ciertas enterobacterias) poseen unas enzimas decarboxilasas específicas que son capaces de atacar el grupo carboxilo de determinados aminoácidos, produciendo anhídrido carbónico y una amina, o diamina, con la consiguiente alcalinización del medio. Así:

- La lisina decarboxilasa (LDC) produce, a partir de la L-lisina, cadaverina.- La ornitina decarboxilasa (ODC) produce putrescina.- El aminoácido L-arginina posee un sistema especial de transformación: primero por acción de una descarboxilasa se transforma en un producto intermedio, la agmatina, la cual, por una Arginina dehidrolasa (ADH) pasa a putrescina y urea. Si el microorganismo es productor de ureasa transformará a su vez la urea en amoniaco y anhídrido carbónico.

TECNICA: Se emplea un medio de cultivo con glucosa (medio Moeller), que incorpora el aminoácido en cuestión (arginina, lisina u ornitina). Utilizamos como indicador el púrpura de bromocresol, amarillo en medio ácido y púrpura en medio alcalino. Cuando el medio se inocula con una bacteria capaz de fermentar glucosa, se produce ácido que baja el pH del medio y cambia el color del medio del púrpura al amarillo. La condición ácida estimula la actividad decarboxilasa y si el organismo produce la enzima apropiada (descarboxilasa), el aminoácido es degradado a su correspondiente amina. La formación de estas aminas (cadaverina o putrescina), eleva el pH del medio y hacen que el indicador de pH vuelva a la alcalinidad, cambiando el color del indicador del medio de amarillo a púrpura o violeta. Si el organismo no produce la enzima apropiada, el medio permanece ácido (amarillo).Se inocula el medio de cultivo, y se cubre con 1-2 ml de parafina estéril (para favorecer las condiciones de fermentación). Se incuba a 37°C-24h.

RESULTADO +: color púrpura turbio a púrpura apagado.RESULTADO -: color amarillo claro y brillante.

PRUEBA DE LA HIDRÓLISIS DE LA ARGININALa L-arginina, además de poder ser catabolizada por una decarboxilasa, puede ser directamente transformada por una hidrolasa con el mismo final anterior, la producción de alcalinidad por formación de aminas, aunque los compuestos intermedios sean distintos. Esta transformación la pueden llevar a cabo ciertos microorganismos, como por ejemplo, estreptococos y bacterias relacionadas. Así, la L-arginina, por acción de arginina dehidrolasa, produce Lcitrulina y amoniaco. Esta prueba no debe ser confundida con la ADH descrita en la prueba anterior.

FUNDAMENTO: Se trata de detectar la hidrólisis de la arginina mediante la enzima que transforma este aminoácido en citrulina, con liberación de amoniaco.

TECNICA: Se inocula un tubo de caldo-arginina y se incuba junto a un tubo testigo estéril durante 24 h (en ocasiones 2-7 días). Transcurrido este tiempo se deposita una gota del acultivo sobre un portaobjetos y se añade una gota del reactivo de Nessler, que reacciona con el amoniaco. El desarrollo de un color entre anaranjado y marrón, indica la presencia de amoniaco. El tubo estéril que sirve de control debe ensayarse al mismo tiempo y debe ponerse de color amarillo pálido o no mostrar ninguna reacción coloreada.

RESULTADO +: Color anaranjado-marrón.RESULTADO -: Color amarillo pálido o ausencia de color.

βGALACTOSIDASA (ONPG)FUNDAMENTO: Existen microorganismos con capacidad para degradar la lactosa en 3-4 días, y no en 24 horas. Estos son los denominados "fermentadores tardíos de la lactosa". En este grupo de microorganismos podemos predecir la facultad de fermentar la lactosa demostrando la presencia o ausencia de actividad βGalactosidasa mediante el empleo del compuesto orgánico Orto- nitrofenil-β-D-Galactopiranósido (ONPG), con un enlace similar al de glucosa – galactosa existente en la lactosa. Si se encuentran células positivas para la metabolización activa de la lactosa, el reactivo ONPG incoloro es hidrolizado liberando un compuesto amarillo, el Orto-Nitrofenol.TECNICA: Se siembra en un tubo con aproximadamente 2 ml de solución Ringer. Se añade el disco reactivo de ONPG.Se incuba a 37°C - 24 h.

RESULTADO +: se produce el cambio de color a amarillo.RESULTADO -: continua incoloro.

HIDROLISIS DEL HIPURATOFUNDAMENTO: La hipuricasa es una enzima que produce la hidrólisis del hipurato de sodio, con la formación de benzoato de sodio y glicina.

TECNICA: Se inocula un caldo hipurato con el organismo por investigar, y se incuba durante 20-24 horas. Posteriormente se traspasan 0,8 ml de la parte superior del cultivo a un tubo vacío y se añaden a éste 0,2 ml del reactivo cloruro férrico y se mezcla bien. El cloruro férrico precipita proteínas, hipurato y benzoato; sin embargo, las proteínas y el hipurato se disuelven más fácilmente en exceso de reactivo. Por lo tanto, la persistencia de un precipitado en el caldo hipurato tras añadir un exceso de cloruro férrico indica la presencia de benzoato y, por tanto, una prueba positiva de hidrólisis de hipurato.

RESULTADO +: Presencia de un precipitado en el fondo del tubo.RESULTADO -: Ausencia de precipitado.

INDOLFUNDAMENTO: Por la degradación del triptófano se libera indol, ácido pirúvico, amoniaco y energía. Ese indol puede ser detectado por el empleo de determinados reactivos que dan una reacción de color.

TECNICA: Se emplea un medio con triptófano. Incubación a 37°C - 24 h.Con objeto de visualizar el indol formado debemos añadir 5 gotas del reactivo de Kovacs, directamente al tubo ya incubado, y se agita suavemente. Cuando existe indol, ëste se combina con el aldehido que se encuentra en el reactivo de Kovacs, para dar un color rojo en la capa de alcohol del reactivo de Kovacs.

RESULTADO +: Anillo de color rojo en la superficie del medio.RESULTADO -: Anillo del color del Reactivo de Kovacs (ocre oscuro).

AGAR KLIGLERFUNDAMENTO: Determinar la capacidad de un organismo de utilizar los hidratos de carbono glucosa y lactosa incorporados a un medio de crecimiento, con producción o no de gases, junto con la posible producción de ácido sulfhídrico.Se utiliza un medio de agar inclinado que contiene dos hidratos de carbono: Lactosa en una concentración al 1% y Glucosa al 0'1%. Algunos microorganismos utilizarán ambos azúcares, otros solo la glucosa y otros ni glucosa ni lactosa. La utilización puede ser con producción o no de gases, y se producirá aeróbicamente (en el pico de flauta) y anaeróbicamente (en el fondo del tubo). Por tanto, los resultados que pueden obtenerse serán los siguientes:

1º Utilización sólo de la glucosa: Aparecerá el pico de flauta alcalino y la capa profunda ácida. El pico de flauta es alcalino (color rojo), lo que indica que se ha producido la degradación aeróbica de la glucosa. Después de 18-24 h de incubación, la baja concentración de glucosa (0'1%) ha sido consumida por completo y el organismo comienza a utilizar las peptonas del medio con objeto de obtener los nutrientes precisos para su crecimiento. Sin embargo, en la capa profunda se observa un color amarillo debido a la degradación anaeróbica de la glucosa, más lenta que la aeróbica, dando lugar a productos ácidos más estables que hacen que el pH permanezca ácido a las 24 h.Por tanto, si la lectura se efectuara a las 12 h, aparece color amarillo en todo el tubo. Si la lectura se efectuara a las 48 h, aparecería color rojo en todo el tubo.

2º Utilización de glucosa y lactosa: Como hemos mencionado anteriormente, la lactosa se encuentra en el medio en una concentración del 1%, es decir, 10 veces mäs que la glucosa.Esto hace que en 24 h se habrá consumido aeróbicamente la glucosa, pero no toda la lactosa, momento en que se iniciaría el consumo de peptona, existiendo por tanto todavía una condición ácida. Si este tubo se leyera a partir de las 48 h, el pico de flauta se habría vuelto alcalino por deplección de la lactosa y consiguiente utilización de las peptonas.

3º No utilización ni de glucosa ni de lactosa. Como estas bacterias son incapaces de tomar sus nutrientes de los hidratos de carbono, acuden a la peptona que contiene el medio. Si la utilizan

tanto anaeróbica como aeróbicamente, todo el tubo aparece de color rojo. Si solo la utilizan aeróbicamente, el pico de flauta aparece alcalino y el resto sin cambios.En resumen, con respecto a los azúcares, el agar Kligler puede interpretarse de 4 maneras, teniendo en cuenta que el primer término corresponde al pico de flauta y el segundo al fondo del tubo:

1. Alcalina/Acida (Rojo/Amarillo): Solamente es utilizada la glucosa.2. Acida/Acida (Amarillo/Amarillo): Son utilizadas la glucosa y la lactosa.3. Alcalina/Alcalina (Rojo/Rojo): No es utilizada la glucosa ni la lactosa. Se utilizan las peptonas.4. Alcalina/Sin cambio (Rojo/Granate): No son utilizadas glucosa ni lactosa. Se utilizan las peptonas aeróbicamente.

Además de estas reacciones, podemos investigar la aparición de gas como producto terminal del metabolismo de los hidratos de carbono. Dicho gas aparecerá en forma de burbujas en el fondo del tubo, que pueden llegar incluso a desplazar al medio de cultivo.

También podemos investigar la producción de sulfhídrico en el medio. Para ello el medio contiene 2 indicadores: citrato férrico amónico y tiosulfato de sodio. En principio la bacteria reacciona con el tiosulfato para dar lugar a sulfhídrico, que es incoloro. Éste después reacciona con iones férricos, dando lugar a sulfuro ferroso, que da un precipitado negro insoluble.

TECNICA: La inoculación se hace a partir de una colonia de cultivo puro, inoculando zig-zag en el pico de flauta y por picadura en la capa profunda (figura 23).Se incuba a 37°C de 18-24 h, ni antes ni después.

RESULTADOS: El orden en que deben ser leidas las pruebas es: 1º Glucosa; 2º Lactosa;3º Gas; 4º Sulfhídrico. Ejo: G+L-G+SH-.Glucosa +: color amarillo en el fondo del tubo.Glucosa -: color rojo en el fondo del tubo.Lactosa +: color amarillo en el pico de flauta.Lactosa -: color rojo en el pico de flauta.Gas +: aparición de burbujas en el medio, incluso con desplazamiento del mismo del fondo del tubo.Gas -: no se aprecian burbujas.SH2 +: color negro en la capa profunda.SH2 -: no se aprecia color negro.

LECITINASAFUNDAMENTO: Determinar la presencia del enzima lecitinasa. Para ello empleamos un medio rico en lecitina, como pueda ser un medio nutritivo enriquecido con yema de huevo.

TECNICA: Se siembra en placa haciendo una doble estría central, como en el caso de la DNAsa. Incubación a 37°C - 24 a 48 h.

RESULTADO +: Se formará un halo más claro alrededor de la zona de crecimiento microbiano debido a la degradación de la lecitina por el microorganismo.RESULTADO-: No existe halo opaco alrededor de la zona de crecimiento microbiano.

MOTILIDADFUNDAMENTO: Queremos investigar si un microorganismo es móvil o no. Para ello se emplea un medio semisólido (con Agar al 0'2%), en el que la bacteria móvil difunda lo más rápidamente posible.

TECNICA: La inoculación se debe hacer por picadura en el centro del medio de cultivo con el asa de picadura hasta una profundidad de 1,2 a 1,5 cm.Incubación a 22°C a 37ºC - 24 h.

RESULTADO +: Aparece una turbidez que se difunde por todo el tubo.RESULTADO -: Se produce una línea de crecimiento limitada a seguir la línea de siembra, mientras que el medio que la rodea se mantiene claro.

NITRATOSFUNDAMENTO: Determinar la capacidad de un organismo de reducir el Nitrato a Nitritos o N2 libre. Este proceso de reducción tiene lugar generalmente en condiciones anaeróbicas, en las cuales el microorganismo obtiene el Oxígeno del Nitrato.

TECNICA: Empleamos el medio caldo con nitrato, distribuido a razón de 2 ml por tubo.Se inocula y se incuba a 37°C - 24 h.Antes de hacer la interpretación debemos añadir los reactivos al medio: 1 ml de α-naftol y 1 ml de ácido sulfanílico.

RESULTADO +: color rosado a rojo intenso, lo que indica la presencia de nitritos en el medio por reducción de los nitratos. Es decir, estos colorantes detectan la presencia de nitritos en el medio.

En caso de que no se desarrolle color, no damos la reacción negativa, pues únicamente indica que no hay nitritos en el medio, pero pudo haberlos, y haber pasado a nitrógeno libre por la acción del microorganismo. Para ello se utiliza el método de reducción por el zinc, añadiendo directamente al tubo una pizca (20 mg) de polvo de zinc, que produciría el paso de nitratos a nitritos en caso de que el microorganismo no lo hubiera hecho anteriormente.

RESULTADO +: Si no se desarrolla color es porque había ausencia de nitritos en el medio. Es decir, el microorganismo redujo el nitrato a nitrito, y luego redujo nuevamente el nitrito, que por ello ha desaparecido.

RESULTADO -: color rosado a rojo intenso: el nitrato presente no ha sido reducido por el organismo, sino que ha sido el zinc el que lo ha reducido.

PRUEBA DE OXIDACION-FERMENTACION DE LA GLUCOSAFUNDAMENTO: La fermentación es un proceso en que el aceptor final de electrones es un compuesto orgánico, que proviene de la propia degradación del substrato inicial.La respiración es un proceso en que el oxígeno es el aceptor final de electrones.El hecho de que la fermentación sea un proceso anaeróbico no implica en absoluto que no pueda desarrollarse en presencia de oxígeno: las bacterias disponen de él, pero no lo utilizan para degradar la glucosa.

TECNICA: Se inoculan 2 tubos de caldo glucosado con indicador de pH (rojo fenol), que en condiciones básicas es rojo mientras que a pH ácido es amarillo. Uno de ellos se cubre con 1- 2 ml de parafina fundida estéril con objeto de conseguir condiciones de anaerobiosis.Se incuba a 37°C durante 24 a 48 h.

RESULTADO +: viraje del indicador dando color amarillo del medio que indica acidificación por degradación de la glucosa:

a) Si es en los 2 tubos: Fermentación.

OXIDASAFUNDAMENTO: La prueba de la oxidasa está basada en la presencia en la bacteria del enzima citocromo oxidasa.

TECNICA: Empleamos un bastoncillo estéril, uno de cuyos extremos está impregnado con un reactivo (N,N,N',N'-tetrametil -p-phenilenediamina dihydrochloride). Este extremo del bastoncillo se pone en contacto con una colonia del microorganismo y se esperan unos minutos.

RESULTADO +: Las colonias que producen citocromo oxidasa hacen que el reactivo pase a un color púrpura oscuro.RESULTADO -: No se produce cambio de color del reactivo.

ROJO DE METILOFUNDAMENTO: Se trata de una prueba para detectar la producción de ácidos fuertes (láctico, fórmico y acético) a partir de la fermentación "ácido-mixta" de la glucosa. Se consideran rojo de metilo positivos sólo aquellos microorganismos que puedan mantener un pH ácido bajo, tras una incubación prolongada (24-48 h) contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio. Se basa simplemente en el empleo de un indicador de pH (Rojo de Metilo) para determinar la concentración de iones Hidrógeno (pH) presentes cuando un organismo degrada la glucosa.

TECNICA: Tras la inoculación en caldo glucosafosfato, se incuba a 37°C - 24 h. Después de la incubación, para llevar a cabo la interpretación, se añade el reactivo Rojo de metilo: unas 5 gotas. El resultado se interpreta inmediatamente: con un pH inferior a 4'4 el reactivo permanece rojo, y con un pH superior a 6 vira a color amarillo. Con un pH entre 5 y 5'8 se producen diferentes tonalidades de anaranjado.

RESULTADO +: color rojo del medio.RESULTADO -: color amarillo o cobrizo en la superficie del medio.

UREAFUNDAMENTO: La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposición de los compuestos orgánicos. Por su acción desdobla la urea, liberando 2 moléculas de amoniaco.Empleamos un indicador de pH, el rojo fenol, con color amarillo en medio ácido y rosado en medio alcalino.

TECNICA: Se emplea un medio agar base con un 20% de urea. Hay que tener la precaución de no calentar, pues la urea se descompone con el calor. Por ello, este medio se debe esterilizar por filtración. Se incuba a 37°C - 24h.

RESULTADO +: color rojo rosado del medio, que indica alcalinización por el amoniaco tras el desdoblamiento de la urea.RESULTADO -: color amarillo anaranjado del medio.

VOGES PROSKAUER (Prueba de la Acetoína)FUNDAMENTO: Esta prueba bioquímica permite determinar la presencia de acetil- metil-carbinol en los cultivos. Este compuesto es un producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa, concretamente de una fermentación particular, denominada butilenoglicólica, la cual predomina en ciertas bacterias.

TECNICA: Inoculación con un inóculo poco denso en caldo glucosa fosfato. Se incuba a 37°C durante 24-48 horas. Una vez finalizado el periodo de incubación y para proceder a la lectura de la prueba bioquímica, se añaden los reactivos:

1º En primer lugar, 0'6 ml de una solución de α-naftol al 5% en alcohol etílico absoluto, que actuará como intensificador del color, lo que aumenta la sensibilidad de la reacción sin pérdida de su especificidad.

2º Después se añaden 0'2 ml de una solución alcalina (KOH al 40% o NaOH al 40%).Este álcali, en presencia de acetil-metil- carbinol se oxida a diacetilo, dando un color rosado- salmón.A continuación debe agitarse suavemente el tubo, dejándolo reposar durante 10-15 minutos antes de interpretar la reacción.

RESULTADO +: color rojo-rosado en la superficie del medio (presencia de acetoina).RESULTADO -: no existe cambio de color.