Protocolo de Control de Calidad PCC-001Nombres: Daniel Sebastián Parra González (125003); Deisy Fabiola Bastidas Rincón

IntroducciónEl propóleo es un material resinoso que se obtiene de los brotes y exudados de los árboles por las abejas (1). Las abejas lo usan para sellar sus colmenas, que además de ayudar en la protección mecánica de la colmena, tiene un efecto funcional importante. Es bastante probable que sirva para el aislamiento térmico de la colmena, protección frente a parásitos y otros microorganismos, además de que sirve para evitar la descomposición de individuos muertos (2).

El propóleo rara vez se encuentra disponible en su forma pura. Por lo general se obtiene de las colmenas y contiene impurezas de otros productos de abejas. Se usan en preparados medicinales y en cosméticos. Entre sus usos encontramos que es posiblemente eficaz (clasificación III) para herpes labial y herpes genital (en pomadas al 3%, frente a ungüentos de 5% de aciclovir) además de ser posiblemente eficaz para mejorar cicatrización y reducir el dolor e inflamación tras una cirugía oral. Es posible que tenga un efecto benéfico pero existe insuficiente evidencia para hacer una determinación en heridas de cáncer, tuberculosis, infecciones, cáncer de nariz y garganta, mejorar en la función inmune, úlceras, trastornos estomacales e intestinales, resfriado común, heridas, inflamación y quemaduras menores (3).

Composición químicaLos propóleos están conformados por varios tipos de sustancias entre ellas ceras, resinas, bálsamos, aceites aromáticos y etéreos, polen y demás material orgánico. En cuanto a su composición química, está es bastante compleja por el hecho de que depende mucho de la flora local del área donde es colectado, a grandes rasgos las mayores

diferencias las encontramos entre regiones del hemisferio norte (Europa, Rusia, Norte américas) y regiones del hemisferio sur. La mayor diferencia entre estos dos es que en regiones del hemisferio norte existe en general muy poca variabilidad entre muestras ya que las abejas recolectan este material de un tipo de árbol a depender de la región: Populus sp. (Norteamérica) y Betula verrucosa (Rusia). Los propóleos de estas regiones suelen tener un alto contenido en compuestos aromáticos: agliconas de flavonoides, ácidos aromáticos y aceites esenciales (4).

En cuanto a los propóleos obtenidos de regiones del hemisferio sur, al tener una variabilidad alta, pueden tener un mayor impacto en terapéutica. Se han logrado identificar flavonoides, ácidos p-cumáricos prenilados, acetofenonas, lignanos, di- y tri- terpenos, compuestos volátiles con terpenoides, azúcares, hidrocarburos, minerales (Ca, Mg, K, Na, Fe y Zn), arcillas (de tierra) (4). La alta variabilidad en este tipo de material se vuelve un problema en el momento de tener en cuenta la necesidad de tener especificaciones para un correcto programa de control de calidad (QC) que permitan asegurar una efectividad similar lote a lote. Tal vez el mayor problema radica en que es muy difícil conocer realmente (usualmente por estudios de palinología) cuál es el material vegetal del que disponen las abejas para su fabricación.

Control de calidad Se ha de realizar un análisis de ciertos parámetros pertinentes para la evaluación de la aceptabilidad para el usuario (calidad) de un propóleo comparándolo frente a un estándar de materia prima. El producto es una solución hidroalcohólica de propóleos

envasada para su uso como alimento o fitoterapéutico.

En Colombia se encuentran una serie de investigaciones hechas para tratar de conocer como es la composición de la población de propóleos colombiana y como es alterada de acuerdo a la región en Colombia de donde se origina. Pero no se dispone de una norma como tal, en donde se especifiquen los requisitos para el adecuado control de calidad de muestras de propóleo, por eso es necesario hacer esto, haciendo la comparación con las normas ya existentes en otros países, la elección de la norma adecuada depende mucho de la cercanía con Colombia del país donde se obtiene la normativa modelo (presencia en el hemisferio sur, continente, etc.)

Teniendo en cuenta todo esto se va a usar como norma de evaluación de la calidad, la

norma IRAM-INTA–15935 del instituto argentino de normalización (IRAM). Esta norma nos va a proveer con las especificaciones para alcanzar la calidad. Pero se va a usar la norma Rusa RST-RSFSR-317-77 con el fin de poder tener en cuenta algunos aspectos adicionales

Descripción inicialEl propóleo como materia prima en bruto ha de tener unas características o requisitos sensoriales:Aspecto: Es material lipofílico, duro y quebradizo en frio (<15ºC), pero en caliente se comporta como un material suave, flexible y pegajoso (2). Punto de fusión: Su punto de fusión varía entre 60-70ºC. Olor: Un propóleo de calidad posee un olor aromático que tiende a ser picante. Es bastante característico con notas resinosas (balsámicas).Color: tiende a ser variable a depender del área de colección y la edad, puede ser oscuro, sin brillo, con tonalidad desde marrón a un material poco opaco, brillante y

amarillo. Pero suelen verse colores castaños intermediarios (5). Se puede hacer una determinación frente a varios patrones de color.Sabor: Se considera un poco amargo y picante.En cuanto a la caracterización macroscópica se han de describir los aspectos generales relativos a la textura, dureza, gomosidad, residuos de la colmena, astillas, residuos de abejas muertas, presencia de moho, presentación global, densidad y consistencia, informando de todo esto en el momento de inicio de la recepción de la materia prima. (5)

Preparación de la muestra para análisisUna vez obtenida la muestra y pesada, se ha de guardar en un ambiente con baja temperatura, protegida de la luz, si es posible en envases de color ámbar.

Parámetros químicos cuantitativos (6)Humedad: Se determina por gravimetría, método que consiste en secar de 2 a 5g de muestra en una cápsula previamente pesada y tratada en la estufa, y enfriada, en una estufa a 105°C, y llevar a peso constante (dos pesadas sucesivas no deben diferir en más ± 5 mg).Cenizas: Se determinan por gravimetría, método que consiste en calcinar una porción de muestra previamente pesada (~3g) en mufla a 500°C, y llevar a peso constante (dos pesadas sucesivas no deben diferir en más ± 5 mg). Cera: Se determina por gravimetría sobre el residuo de cera obtenido mediante una extracción con n-hexano, en un equipo Soxhlet de 10g de propóleos, durante el tiempo necesario para extracción total, comprobable, de la cera, y posterior destilación del hexano y secado de la cera en estufa a 105°C. Se lleva a peso constante (dos pesadas sucesivas no deben diferir en más ± 5 mg).Resinas: Se determina por gravimetría del residuo de las resinas obtenidas mediante una extracción con alcohol etílico de 96°, en

un equipo Soxhlet de 10g de muestra de propóleos, con posterior destilación del alcohol y secado de la resina en estufa a 105°C. Se lleva a peso constante (dos pesadas sucesivas no deben diferir en más ± 5 mg).Impurezas mecánicas: Se determinan por gravimetría del residuo insoluble que queda en el cartucho del Soxhlet luego de las extracciones de cera (ver Cera), empleando n-hexano, y de resinas (ver Resinas), empleando alcohol etílico, y posterior secado del cartucho en estufa a 105°C. Se lleva a peso constante (dos pesadas sucesivas no deben diferir en más ± 5 mg).Compuestos fenólicos: Se determinan por espectrofotometría de fenoles totales, con el reactivo de Folin-Ciocalteu, trabajando a 765 nm sobre los extractos alcohólicos obtenidos según (ver Resinas), y empleando ácido gálico como patrón.Flavonoides totales: Se determinan por espectros del complejo flavonoide-AlCl3, en medio metanólico, a 425 nm, sobre los extractos alcohólicos obtenidos según (ver Resinas), empleando quercetina dihidratada como patrón.Índice de oxidación: Se mide el tiempo de decoloración de un volumen de 0,05 ml de solución de permanganato de potasio (KMnO4) 0,1 N, agregado a 2 ml de una suspensión acuosa de propóleos (obtenida mediante una extracción de 0,2 g de propóleos con 5 ml de alcohol durante 1 hora, con posterior agregado de 100 ml de agua para análisis y filtrado), y 1ml de solución de ácido sulfúrico al 20%.

Parámetros químicos cualitativosEspectrograma en el UV: Se obtiene el espectrograma en el ultravioleta. A partir de una dilución de los extractos alcohólicos obtenidos según (ver Resinas). Se busca obtener un pico de absorción entre 270-310nmPrueba de acetato de plomo Pb(CH3COOH)2: Se utiliza para la identificación de flavonoides. Se pipetean 2.5ml de extracto

en un tubo de ensayo y se adicionan 7.0 ml. de etanol al 95% y 0.5 ml. de acetato de plomo al 10%. Se agite bien y se deja en reposo por 24 horas. Un precipitado amarillento o una solución turbia, color amarillo opaco es prueba positiva (7).Prueba de NaOH: Se disuelve aproximadamente un gramo de la muestra en un tubo de ensayo con una solución de hidróxido de sodio al 5%, si es positivo a flavonoides se torna color amarillo.Prueba de Mg/HCl: También conocida como prueba de Shinoda, esta se usa para la identificación de flavonoides. En un tubo de ensayo se colocan 2.0 ml de extracto y se adiciona una lámina de magnesio metálico y 0.3 ml. de ácido clorhídrico concentrado. Se deja reposar por 10 minutos. Una coloración anaranjada roja, verde, azul o violeta es prueba positiva (7).Índice de yodo (8): Se coloca una muestra de propóleos de 50mg. En un Erlenmeyer con tapón esmerilado NSH-29, se le agregan 2.5ml de cloroformo y 6.25ml de una mezcla de bromo–yodo, se pone tapón al Erlenmeyer, se humedece con la solución de yoduro de potasio, se agita la solución y se coloca en la oscuridad durante una hora, luego se añaden 5 ml. De solución de yoduro de potasio al 10%, 50ml de agua destilada y 4-7 gotas de la solución de almidón, se agita y se titula con una solución al 0.1% de tiosulfato de sodio hasta que la solución decolore. Al mismo tiempo, y bajo las mismas condiciones, se produce la titulación de la solución de control, que contiene 2.5ml de cloroformo, 6.25ml de bromo-yodo 5ml de agua destilada y 4-7 gotas de solución de almidón.

Indicede yodo=(a−b)∗0.01269

cDonde, A: cantidad de solución de tiosulfato de sodio 0.1N empleada en la titulación de la prueba, B: cantidad en milímetros de la solución de tiosulfato de sodio 0.1N empleada en la titulación de propóleos. C: muestra de propóleos en gramos.

Prueba de cromatografía en capa delgada (TLC) : Se lleva a cabo usando el producto, sembrándolo en conjunto con extracto alcohólico de la prueba de resinas y un patrón de quercetina, se hace en sílica gel con una fase móvil éter de petróleo/acetato de etilo (7:3). Se hace la detección en UV a 366nm y aspersando una solución con ácido sulfúrico a 60% en etanol y calentando a 100ºC (9).

Determinación de contaminantesMetales pesados: Se ha de usar el método II para determinación de metales pesados de la USP (método 231) (10). Ver anexo 7.Determinación de Arsénico: Usar test límite página 861 del FCC (11). Ver anexo 7.Determinación de tetraciclinas, sulfas: Se puede usar el método I para determinación de tetraciclinas de la USP (método 193), este método está basado en identificación en TLC(10). Ver anexo 7.Determinación de Endrín, dieldrin y aldrínDDT, BHC, paratión: Ver anexo 7.PCB: Ver anexo 7.Determinación de n-hexano: Ver anexo 7.Determinación de metanol: Se hace de acuerdo al método de la USP de 1985. Se usa ácido fosfórico, permanganato de sodio, bisulfito de sodio, entonces se compara la coloración antes y después de agregar ácido cromotrópico, además frente a un patrón de metanol.Dietilenglicol: Ver anexo 7.Reactivos a usar:- Alcohol etílico al 96%- n-hexano- Reactivo de Folin-Ciocalteu- Patrón de ácido gálico- Patrón de quercetina- Metanol grado reactivo- Cloruro de aluminio- Solución de permanganato de potasio (KMnO4) 0.1N- Ácido sulfúrico (H2SO4) al 20%- Acetato de plomo (Pb(CH3COOH)2) acuoso al 10%- Hidróxido de sodio al 5%

- Magnesio metálico- Ácido clorhídrico concentrado- Solución mezcla bromo/yodo- Solución de almidón- Solución de tiosulfato de sodio (Na2S2O3) al 0.1- Cloroformo- Bisulfito de sodio- Ácido cromotrópico

Preparación de soluciones:Preparación de la solución 0.1N de permanganato de potasio: A un matraz aforado de una capacidad de 1000ml. Se le agregan 2.3g de permanganato de potasio, se disuelven en 700-800ml de agua destilada y se completa. La solución se pasa a un frasco oscuro y se guarda durante 10-15 días. La solución es efectiva durante 3 mesesPreparación del medio acido (solución de ácido sulfúrico al 20%): En un matraz aforado de una capacidad de 1000 ml se vierten unos 700 ml de agua destilada y 124 ml de ácido sulfúrico con un peso específico de 1.84 g/cm3 y se le añade agua destilada hasta completarPreparación de la solución de acetato de plomo al 10 %: En un matraz aforado de una capacidad de 100 ml se vierten aproximadamente 30 ml de agua destilada y 10 g. De acetato de plomo, se agita y el volumen de agua destilada se lleva hasta completar. La solución es efectiva durante 6 meses Preparación de la solución de hidróxido de sodio al 20%: En un matraz aforado con capacidad de 100 ml se añaden unos 50 ml de agua destilada, se agregan 20 g. De hidróxido de sodio, se agita después de enfriar y se añade nuevamente agua destilada hasta completar.Preparación de las mezclas de cloroformo- acetona: Dos porciones de cloroformo y una de acetona se mezclan en un matraz con tapón esmerilado.Preparación de la solución de ioduro de potasio al 10%: Al matraz aforado con capacidad de 100 ml se le añade 10 g. De

yoduro de potasio se agita y se le agrega agua destilada hasta completar.Preparación de la solución 0.1 n de tiosulfato de sodio: Al matraz aforado con capacidad de 1000 ml. Se le echan 25.0 g. De tiosulfato de sodio y 0.1 g. De carbonato de sodio anhidro y se disuelven en 700 o 800 ml de agua destilada, se añade agua destilada hasta completar, se coloca en un frasco oscuro y se guarda durante 10 días. La solución se mantiene efectiva durante un año.Preparación de la solución de almidón al 0.5%: Una muestra de 0.4 g de almidón se tritura con un poco de agua destilada y la masa obtenida se vierte en un matraz que contenga 100 ml. De agua destilada hirviendo. La solución se decanta y se utiliza la parte superior del decantado para la conservación de la solución se le añaden dos o tres gotas de tolueno. La solución mantiene su efectividad durante un mes.Preparación de la mezcla de bromo – yodo: Una muestra de 13.2 g. De yodo cristalizado se vierte en un matraz aforado de tapa esmerilada con capacidad de 1000 ml, se añade ácido acético glacial y se disuelve en baño maría a temperatura de 60° a 70°C. La solución se enfría, se le añaden 3 ml. De bromo y se le agrega ácido acético glacial hasta completar, la mescla de bromo-yodo se conserva en un frasco oscuro con tapón esmerilado.

Lista de materiales a usar1- Espectrofotómetro UV-Visible2- Balanza de precisión, sensibilidad 0,1 mg3- Estufa para desecación (100 – 105°C)4- Mufla (horno eléctrico)5- Baño maría termostatado6- Cápsulas de porcelana (5)7- Cronómetro (1)8- Tubos de ensayo (30)9- Embudos chicos (6 cm de diámetro) (5)10-Papel de filtro (1 rollo)11-Pipetas de 10, 5, 2 y 1 ml (10 de 1 ml; 5 de 2 ml; 5 de 5 ml y 5 de 10 ml)12-Gradillas (5)

13-Matraces aforados de 100, 50, 25 y 10 ml (5 de 100 ml; y 5 de 50 y 25 ml, 1 de 10 ml)14-Varillas de vidrio (12)15-Fusiómetro16-Equipo de extracción Soxhlet

Especificaciones de control de calidad para M.P. (6)Requisitos sensorialesAroma CaracterísticoColor Amarillo, pardo, verdoso, marrón, rojizo

u otrosSabor Variable, de suave, balsámico, a fuerte y

picanteConsistencia Maleable o rígidoGranulometría HeterogéneaRequisitos físicos y químicos cuantitativosHumedad <10%Cenizas <5%Ceras <35%Impurezas mecánicas <25%Compuestos fenólicos <5% (m/m)Resinas solubles en etanol >35% (m/m)Flavonoides >1% (m/m)Índice de oxidación Máximo 22sRequisitos físicos y químicos cualitativosEspectro UV Pico entre 270-310nmPb (CHCOOH) PositivoNaOH PositivoMg/HCl PositivoAditivos Cero agregadosContaminantesMetales pesados <10ppm (de Pb)Arsénico < 2ppmTetraciclinas, sulfas Ausentes de acuerdo al métodoEndrín, dieldrin y aldrín Ausentes de acuerdo al métodoDDT, BHC, paratión,… <0.2ppmPCB Ausentes de acuerdo al métodoAcondicionamientoEn envases de material apto con funcionalidad y protección adecuada

Especificaciones de control de calidad para extractos de propóleo (12)

Requisitos sensorialesAroma CaracterísticoColor Amarillo, pardo, verdoso, marrón, rojizo u otrosSabor Variable, de suave, balsámico, a fuerte y picanteRequisitos físicos y químicos cuantitativosExtracto seco <10% (m/v)Ceras <35%Resinas solubles en etanol >35% (m/m)Flavonoides >0.25% (m/m)Comp. Fenólicos >0.25% (m/m) (ácido gálico)Índice de oxidación Máximo 22sRequisitos físicos y químicos cualitativosEspectro UV Pico entre 270-310nmPb (CHCOOH) PositivoNaOH PositivoMg/HCl PositivoFormación emulsión en agua PositivoContaminantesMetales pesados <10ppm (de Pb)Arsénico < 2ppmTetraciclinas, sulfas Ausentes de acuerdo al métodoEndrín, dieldrin y aldrín Ausentes de acuerdo al métodoDDT, BHC, paratión,… <0.2ppmPCB Ausentes de acuerdo al métodoN-hexano Ausente de acuerdo al métodoDietilenglicol Ausente de acuerdo al métodoMetanol <0.20mg/LAcondicionamientoEn envases de material apto con funcionalidad y protección adecuadaHigieneEl propóleo y los extractos de propóleo no deben contener sustancias extrañas de ninguna naturaleza.Se ha de cumplir con la norma IRAM 14102, sobre buenas prácticas de manufactura en las industrias de alimentos.EtiquetadoResolución 2266 de 2004 Cumple

Bibliografía

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Anexo 1: Formato para la recogida de datos recepción de la muestra

Recepción de la muestra de propóleoFecha:

Reg001

Fecha de recepción de la muestra

Número asignado a la muestra

Procedencia o remitente del análisis

Descripción de la muestraColor:Opacidad:Olor:Sabor:Textura:Consistencia:Viscoso (Sí/No):Quebradizo (Sí/No):Gomoso (Sí/No):Residuos de la colmena (Sí/No):Astillas (Sí/No):Residuos de abejas muertas (Sí/No):Presencia de moho (Sí/No):Presentación global:Granulometría:Densidad:Consideraciones adicionales:

Comportamiento al calentar muestra (observaciones):

Nombre y firma de los analistas

Anexo 2. Resultados de análisis de materia prima

Registro de resultado de análisisFecha:

Reg002

Cód. Ensayo Resultado Concepto

1A Humedad

2A Cenizas

3A Ceras

4A Impurezas mecánicas

5A Compuestos fenólicos

6A Resinas solubles en etanol

7A Ensayo de flavonoides

8A Índice de oxidación

9A Espectro UV

10A Ensayo con Pb(CHCOOH)

11A Ensayo de NaOH

12A Test de Shinoda

13A Ensayo de Metales pesados

14A Ensayo de Arsénico

15A Ensayo de tetraciclinas, sulfas

16A Ensayo de Endrín, dieldrin y aldrín

17A Ensayo de DDT, BHC, paratión,…

18A Ensayo de PCB

Decisión sobre calidad de la muestra:

Firma de los analistas:

Anexo 3. Resultado de análisis de productoRecepción de la muestra (producto)Fecha:

Reg003

Fecha de recepción de la muestra:

Número asignado a la muestra:

Procedencia o remitente del análisis:

Descripción de la muestraColor:Olor:Sabor:

Cód. Ensayo Resultado Concepto

03B Ceras

05B Comp. Fenólicos

06B Resinas solubles en etanol

07B Flavonoides

08B Índice de oxidación

09B Espectro UV

10B Pb (CHCOOH)

11B NaOH

12B Test de Shinoda

13B Metales pesados

14B Arsénico

15B Tetraciclinas, sulfas

16B Endrín, dieldrin y aldrín

17B DDT, BHC, paratión,…

18B PCB

19B Extracto seco

20B Formación emulsión en agua

21B N-hexano

22B Dietilenglicol

23B Metanol

Decisión sobre la calidad de la muestra:

Nombre y firma de los analistas:

Anexo 4. Formato de cumplimiento con normas de etiquetado

Formato de cumplimiento con normas de etiquetado Reg004Contenido en etiqueta – art. 44-45, 47-48 decreto 2266 de 2004 Concepto

CumpleSi No

Nombre del producto o marca registrada si la hubiereIdioma españolFiguras/diseños en empaque

Nombre común y científico del material vegetalForma farmacéutica

Composición cualitativa y expresión cuantitativa en peso del MV utilizadoContenido neto en el envase

Usos terapéuticos autorizado (tradicional)

Número de registro sanitarioCondiciones de almacenamiento y F.V.Número de loteEstablecimiento fabricante y domicilioDirecto técnicoContraindicaciones /advertenciasCondición de ventaLeyendas

Nombre de marca de producto fitoterapéuticos – art. 46 Dec. 2266/2007

Concepto Decisión sobre la calidad del etiquetado:

Corresponde: SI____ NO ____

Justificación:

Si No

¿Induce a engaño?¿Induce a uso irracional?¿Nombre estrambótico/exagerado?

¿Nombre se presta a confusión?¿Indica expresamente a uso?¿Formado por iniciales o números?¿Se relaciona con creencias religiosas o espirituales?¿Se usan términos prohibidos*?*Tónico, confortativo, vigor, enérgico, vida, extra, súper, mejor, ideal, hermoso, maravilloso y único o los que incluyan la palabra doctor o se refieran a otros títulos o dignidades o sus abreviaturas.

Anexo 5. Lista de verificación de materiales

Lista de verificación de materiales Reg005Reactivos OK Equipos - Materiales OKAgua purificada (PW) Espectrofotómetro UV-Visiblen-hexano Balanza de precisión, sensibilidad 0,1 mgCloroformo Estufa para desecación (100 – 105°C)Alcohol etílico al 96% Mufla (horno eléctrico)Metanol grado reactivo Baño maría termostatadoHidróxido de sodio al 5% Papel de filtro (1 rollo)Ácido sulfúrico (H2SO4) al 20% Embudos chicos (6 cm de diámetro) (5)Ácido clorhídrico concentrado Tubos de ensayo (30)Solución de permanganato de potasio (KMnO4) 0.1N

Cápsulas de porcelana (5)

Solución mezcla bromo/yodo Cronómetro (1)Solución de tiosulfato de sodio (Na2S2O3) al 0.1

Pipetas de 10, 5, 2 y 1 ml (10 de 1 ml; 5 de 2 ml; 5 de 5 ml y 5 de 10 ml)

Solución de almidón Gradillas (5)Reactivo de Folin-Ciocalteu Matraces aforados de 100, 50, 25 y 10 ml (5

de 100 ml; y 5 de 50 y 25 ml, 1 de 10 ml)Acetato de plomo (Pb(CH3COOH)2) acuoso al 10%

Varillas de vidrio (12)

Magnesio metálico FusiómetroCloruro de aluminio Equipo de extracción SoxhletBisulfito de sodioÁcido cromotrópicoPatrón de ácido gálicoPatrón de quercetinaMarcar con x en la casilla de verificación si se encuentra disponible.

Anexo 6. Pruebas a envase

TITULO  IVDEL ENVASE, ETIQUETAS Y EMPAQUES 

DE LOS PRODUCTOS FITOTERAPÉUTICOS 

Artículo 42. Del envase de los productos fitoterapéuticos. El envase de los productos objeto del presente decreto deberá estar fabricado con materiales que no produzcan reacción física o química con el producto y que no alteren su potencia, calidad y pureza. Cuando por su naturaleza, los productos fitoterapéuticos lo requieran, el envase se protegerá de la acción de la luz, la humedad y otros agentes atmosféricos o físicos.

Anexo 7. Información sobre procedimientos para el control especiales. Determinación de pesticidas- Determinación de Endrín, dieldrin y aldrín.

Se hace básicamente por medio de cromatografía de gases (CG), se ha de tener en cuenta que en principio el propóleo es una matriz analítica muy compleja. Se ha de pesar muy precisamente un gramo de material, en un vaso de extracción y se extrae con 30mL de hexano y acetona con la ayuda de un agitador de vórtice por 5minutos, luego se centrifuga a 5000 rpm por 5 minutos y se toman 10mL del sobrenadante claro y se concentran en un frasco cónico hasta 0.5-1.0mL en un rotavapor por debajo de 50ºC. Se ha de tomar un cartucho de extracción en fase sólida (SPE) de florisil, y se le ha de poner el extracto concentrado y se le añaden 6mL de una mezcla acetato de etilo/hexano (2:8 v/v) que se ha de usar como solvente de elución. Los eluatos se recolectan en tubos y se secan con una corriente de nitrógeno. Una vez se han redisuelven en hexano se filtran por una jeringa con un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0.45µm y se determinan por CG acoplada a un detector de captura electrónica (ECD). Se han de tener en cuenta los siguientes parámetros de elución por la columna (13):

- DDT, BHC, paratión (organoclorados)Se toman 10g de propóleos y se mezclan con 200mL de mezcla acetona y agua (1:1) por cinco minutos en una mezcladora. La mezcla se ha de extraer con 10mL de diclorometano, 3mL de NaCl saturado y 50mL de agua en un embudo de decantación. La capa orgánica se coloca en sulfato de sodio anhidro y se repite un par de veces con 10mL de diclorometano. Tras la filtración es necesario lavar el sulfato de sodio con tres porciones de 10mL de diclorometano, se concentra la muestra hasta 2mL con la ayuda de un rotavapor a 38ºC. Para la remoción de impurezas se hace una CCD que consiste de 0.5g de sílica gel, 5g de mezcla con carbón activada y sílica gel (1:15) y 1g de sulfato de sodio anhidro. Los residuos de pesticidas son eluidos de la columna usando una mezcla de 250mL de diclorometano, tolueno, acetona (100:2:2). El eluato se recoge en un matraz de 500mL y entonces fue concentrado hasta 2mL usando un rotavapor a 38ºC.Se añaden 5mL de n-hexano y se re-evapora hasta sequedad en un rotavapor, se transfieren cuantitativamente en un matraz volumétrico usando n-hexano y finalmente hasta 50mL.Esta solución es la que se inyecta en CG-ECD o CG-PID. Si se usa FID, se usa como FM nitrógeno, hidrógeno y aire seco, en un sistema a 240ºC (14).

- Determinación de bifenilos policlorinados (PCB): Se toman 5 gramos de muestra y se extraen por medio de un Soxhlet por 6 horas con 100mL de hexano. Los 5 gramos se colocan en 25mL de agua destilada y se agitan con 4

Parámetro Valor Parámetro ValorGas portador Nitrógeno T. inyección 260ºCFlujo 1.0mL/min T. detector 290ºCMake-up 20mL/min Programación de

temperatura100ºC por 1min.100-230ºC a 8ºC/min230ºC por 5min.230-2901C 10ºC/min290ºC por 10 min

Modo inyección Splitless

porciones sucesivas de 10mL de hexano, se hace partición con acetonitrilo y tras hacer dilución del acetonitrilo con agua se hace la extracción nuevamente con hexano y se lleva a un cartucho de SPE con florisil. La determinación en últimas se hace con CG acoplada a ECD (Ni63) en una columna de vidrio (1800x4mm di), temperatura isotérmica a 240ºC (15).

Determinación de metales- Metales pesados:

La prueba descrita a continuación corresponde a la prueba <231> de USP30/NF25. Para preparar el estándar se toma una alícuota de 2mL de solución estándar de plomo1 (20µg de plomo), se ha de transferir a un tubo de comparación de color de 50 mL y diluye con agua hasta 25 mL. Usando un medidor de pH o un papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, se ajusta con CH3COOH 1N o NaOH 6N hasta un pH entre 3,0 y 4,0; se diluye con agua hasta 40 mL y se mezcla. Se puede tomar para esta determinación 1g de propóleo y se le agrega ácido sulfúrico hasta humedecer y se incinera cuidadosamente a baja temperatura y se carboniza por completo, se agregan 2mL de HNO3 y 5 gotas de H2SO4 y se calienta con cuidado hasta que no se produzcan más humos blancos, se incinera en una mufla, a una temperatura de 500-600ºC hasta que el carbón se haya quemado completamente. Se enfría y se agregan 4 mL de HCl 6N, se cubre y se digiere en un baño de vapor durante 15min., se remueve la tapa y se evapora lentamente hasta sequedad en un baño de vapor. Se humedece el residuo con 1 gota de HCl, se agrega 10 mL de agua caliente y se digiere durante 2min. Se agrega, gota a gota, NaOH 6N hasta que la solución sea alcalina al papel de tornasol, se diluye con agua a 25 mL y se ajusta con CH3COOH 1N a un pH entre 3,0 y 4,0, empleando un papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo. Se filtra si fuese necesario, se enjuaga el crisol y el filtro con 10 mL de agua, se combina el filtrado y el enjuague en un tubo de comparación de color de 50 mL, se diluye con agua a 40 mL y se mezcla. Posteriormente a cada uno de los tubos preparados se les agregan 2mL de la solución buffer de acetato de pH 3.5, se agregan luego 1.2mL de tioacetamida-glicerina básica, se diluye con agua hasta 50mL se mezcla y se deja en reposo por 2minutos y se hace la comparación de la opacidad de cada una, la preparación de prueba no puede ser más oscura que la del estándar.La siguiente prueba se basa en la normativa para el control de calidad de fitoterapéuticos de la OMS, en esta se toman 200-250g de la muestra de propóleo, se pesa muy precisamente, y se colocan en un crisol de sílice adecuado y se añade la mezcla para hacer la digestión (HNO3 (1000g/L)/HClO4 (1170g/L) 2:1), se tapa y se pone en una mufla, se calienta suavemente hasta 100ºC y se mantiene a esta temperatura por 3 horas, entonces se calienta hasta 120ºC y se mantiene a esta temperatura por dos horas, se aumenta la temperatura muy lentamente hasta 240ºC, tratando de que no se den pérdidas por lo violento de la reacción. Se disuelve el residuo inorgánico seco remanente en 2.5mL de HNO3 (~1000g/L) y se usa para la determinación de metales pesados. Se pueden usar mediciones voltamétricas para realizar la determinación, siempre comparando con patrones y controles (16).

- Determinación de ArsénicoSe toman 10-20 g de muestra, pesados exactamente, en un vaso de Kjeldahl de capacidad 800-1000mL. Se añaden 10-25mL de agua y 25-50mL de ácido nítrico (1000g/L) y entonces se añaden cuidadosamente 20mL de ácido sulfúrico (18M). Se calienta cuidadosamente, de manera que no se forme espuma y se añade gota a gota hasta que toda la materia orgánica esté destruida. Esto se da cuando no hay mayor oscurecimiento de la solución y esta se aclara formando vapores de trióxido de azufre. Se enfría y se añaden 75mL de agua y 25mL de oxalato de amonio (25g/L). Se calienta

1 Se ha de utilizar nitrato de plomo para su preparación

nuevamente hasta que no se observen más vapores de SO3. Se enfría y se transfiere con ayuda de agua a un matraz volumétrico de 250mL. Se ha de utilizar un aparato especial que consta de un generador de arsina, equipado con una unidad depuradora y un tubo de absorción con juntas cónicas estándar o juntas de rótula esférica de vidrio (10). Se pone algodón impregnado con acetato de plomo en la unidad depuradora, se pone también una pieza de bromuro de mercurio que sea lo suficientemente grande para cubrir las aperturas. Se pone una alícuota (25-50mL) de la solución a ser probada y se añade 1g de KI y 10g de Zn granulado y se ajustan todos los tubos. Se espera que a 40ºC en el test se obtenga gas, pero la temperatura puede subirse a voluntad, es bastante importante que el HgBr2 se mantenga seco. El patrón de este ensayo es 10mL de ácido hidroclórico estañado y 1mL de arsénico diluido en 50mL de agua, este patrón es 10µg de arsénico(16).

Determinación de antibióticos- Determinación de tetraciclinas, sulfas

Se toman 2g de polvo de muestra y se extraen con 100mL de un buffer EDTA disódico-McIlvaine2 mediante el uso de agitación mecánica en un matraz Erlenmeyer a 50°C durante 4 h. Entonces, la solución después de la extracción se decanta en un tubo de centrífuga de plástico de 100mL y se centrifuga durante 10 min a 5000 rpm para mayor limpieza. Si es posible se puede hacer la extracción de una manera asistida por ultrasonido. Se ha entonces de poner el sobrenadante en un cartucho para SPE Oasis HLB equipado con un reservorio (precondicionado con 5mL de metanol y 10mL de buffer de extracción, se lava el cartucho con 10mLde metanol y se seca apropiadamente). Se ha de eluir con 10mL de acetato de etilo. Se ha de transferir el eluato de acetato de etilo, a un cartucho de ácido carboxílico (previamente acondicionado con 5 ml de acetato de etilo y lavado con 10 ml de metanol y secado apropiadamente). Se eluye con 4 ml de una mezcla de ácido oxálico 0,01 M (pH 4,0) y acetonitrilo (6:4v/v), y el eluato se evapora hasta 2 ml con una corriente de nitrógeno a 45ºC. El extracto final se filtra a través de un filtro de nylon de 0,2µm directamente en un vial de HPLC. Se ha de usar una columna C-18m 5µm, 4.6x250mm. Se usa una fase móvil isocrática con ácido oxálico 0.01M, metanol y acetonitrilo (70:10:20 v/v/v). La temperatura de la columna a 30ºC y flujo de FM de 1.0mL/min, además con el detector UV entre 275 y 350nm (17).

Determinación de otras impurezas- Determinación de n-hexano

Esta prueba aplica para extractos, en esta se toman cerca de 2mL de extracto de propóleo y se disuelven en 100mL de PW, en un vial para SPE con septo de goma se añaden 20µL de cloroformo con una jeringa a 105ºC por 45 minutos, se mide el peso del residuo y se toma una alícuota de 0.25mL de la muestra de vapor y se coloca en el cromatógrafo de gases, se inicia la separación. Las condiciones de CG son las siguientes(18):Parámetro Valor Parámetro ValorGas portador Helio T. inyección 60ºCFlujo 25mL/min T. detector 290ºCMake-up No Programación de

temperaturaIsotérmico40ºC por 8min.Modo inyección Splitless

2 El cual es un buffer compuesto de citrato y fosfato con un pH final de 3.1. Se hace una solución 1:1 de ácido cítrico con 4.11mL de Na2HPO4 0.2M y 15.06mL de ácido cítrico 0.1M.

Se han de utilizar estándares adecuados con índices de Kovats bien definidos. El detector usado en este caso es de ionización de flama (FID).

- Dietilenglicol: Se toman 2mL de extracto de propóleo y se disuelven en 100mL de PW, se inyecta en la cámara de inyección, esta se encuentra a 260ºC, en modo Split, se usa en la columna una temperatura de 100ºC, la temperatura del espectrómetro de masa (MS) a 300ºC, se usa como gas portador nitrógeno (3.5mL/min) e hidrógeno (30mL/min). La columna es de sílice fundida SPB-1 (19).