PROTEINAS DE MEMBRANA EXTERNA DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 DE Brucella ovis Y OTROS FACTORES DE...

PROTEINAS DE MEMBRANA EXTERNA DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 DE Brucella ovis

Y OTROS FACTORES DE VIRULENCIA EN Brucella spp.

Paola Andrea Caro-Hernández PhD.

Brucella melitensis

Brucella suis

Brucella abortus

Brucella canis

Brucella ovis Brucella neotomae

Brucella ceti

Brucella pinnipedialis

Brucella microti

GÉNERO Brucella spp.

Brucella inopinata

Herida de implante mamario

LA LA ENVOLTURAENVOLTURA CELULAR DE CELULAR DE BrucellaBrucella spp. spp.

PME

Extraido de: Int J Microbiol. Haag AF., et al (2010)

OMPs

Profundizar en el estudio de las proteínas homólogas de la familia Omp25/Omp31 para establecer el papel que juegan en la virulencia de Brucella ovis y su potencial como antígenos protectores o de diagnóstico.

OBJETIVOOBJETIVO

B. ovisB. ovis Cepa virulenta que no presenta

cadenas O Las OMPs podrían tener mayor

relevancia en el proceso infeccioso

Omp31bOmp31b

Omp25bOmp25b

Omp25dOmp25d

Omp25Omp25cc

Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)

Omp25Omp25

Omp31Omp31

Extraido de: Salhi et al. (2003)

PRESENCIA DE LAS OMPS DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 EN EL GÉNERO Brucella

omp31omp31 omp31bomp31b omp25omp25 omp25bomp25b omp25omp25cc

omp25domp25d omp22omp22

B. melitensisB. melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B. abortusB. abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B. suisB. suis ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++B. neotomaeB. neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++B. ovisB. ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B. canisB. canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B. B. pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B. cetaceaeB. cetaceae(mayoría de cepas)(mayoría de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B. cetaceaeB. cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ -?-?

Microbes and Infection 6: 821–834 Vizcaíno N., et al 2004

FRAGMENTO DE ADN DE 15.1 Kb AUSENTE EN B. ovis

Extraído de: Microbes and Infection 6: 821–834 Vizcaíno N., et al 2004

Obtención de cepas mutantes y complementadas en B. ovis PA

Obtención de anticuerpos policlonales en conejo Detección inmunológica mediante Western blot

∆omp22

Cepas kanr, sacs y ampr

RECOMBINACIÓN HOMOLOGA DOBLERECOMBINACIÓN HOMOLOGA DOBLE

DenominaciónDenominación Genotipo Genotipo relevanterelevante

∆∆omp31omp31 omp31, kanomp31, kanrr

∆∆omp25omp25 omp25omp25:: :: kankanrr

∆∆omp25comp25c omp25c, kanomp25c, kanrr

∆∆omp25domp25d omp25d, kanomp25d, kanrr

∆∆omp22omp22 omp22, kanomp22, kanrr

pNV22-1(9347 pb)

sacB

omp22inactivado

kan r

Amp

r

2

RsrII StuI

omp22

1

Cromosoma de Cromosoma de B. ovisB. ovis PA PA

Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)

2 1

kan r

CEPAS MUTANTES TRANSFORMADAS CON EL GEN SILVESTRE

DenominaciónDenominación

∆∆omp31-omp31-ComCom


∆∆omp25c-omp25c-ComCom

∆∆omp25d-omp25d-ComCom


C/u de los gen silvestre omp25/omp31B. ovis clonados en el vector

pBBR1MCS-4pBBR1MCS-4

amp r

omp25/omp31

LacZ


pNV31b-compNV31b-com

omp31b

amp r

pNV 998-10pNV 998-10

kan r

omp25b

Gen omp31b B. abortus clonado en pBBRMCS-4

Fragmento de ADN de 15kb B. melitensisclonado en pBBRMCS-2

PA omp31b-Com PA 998-10(Vizcaíno et al., 2004)

B. ovis PA COMPLEMENTADA CON omp31b y omp25b

(Caro-Hernández P., et al 2007)

Expresión de las OMPs DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 en E. coli

OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES FRENTE A LAS OMPS

DE LA FAMILIA Omp25/Omp31

INÓCULOcélulas

suspensión D. O. = 6

Adyuvante Incompleto de

Freund

1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA

1ª inoculación 2ª inoculación 3ª inoculación

Obtención de suero

Sin adyuvanteAdyuvante

Completo de Freund

Punción cardiaca

Intradérmica Subcutánea Subcutánea

IPTGE. coli

Adsorción de sueros


Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc

Omp25Omp25dd

Omp2Omp222

B. ovis PAB. ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- ++B. ovis PA 25b B. ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++

B. ovis PA 31b B. ovis PA 31b comcom

++ ++ ++ -- ++ -- ++

WESTERN BLOT


PAPEL DE LA FAMILIA PAPEL DE LA FAMILIA Omp25/Omp31Omp25/Omp31 EN LA EN LA VIRULENCIA DE VIRULENCIA DE B. ovis PAB. ovis PA

Evaluación de virulencia en ratones BALB/c de los mutantes B. ovis PA en los genes de la familia omp25/omp31 de

EVALUACIÓN DE VIRULENCIA EN EL MODELO

DEL RATÓN BALB/c

Vía de InoculaciónVía de Inoculación IntraperitonealIntraperitoneal

Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFC/ratón UFC/ratón

Ratones BALB/cRatones BALB/c 35 ratones/cepa 35 ratones/cepa

Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio

Ratones sacrificadosRatones sacrificados

1, 2, 3, 5, 7, 9 y 11 p.i.1, 2, 3, 5, 7, 9 y 11 p.i.

n=5n=5


ANÁLISIS DE LA IMPLICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 EN LA

VIRULENCIA DE B. ovis

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

S e m a n a p .i.

log

UF

C/b

az

o

B. o v is P A

B. o v is ∆ o m p 2 5

B. o v is ∆ o m p 2 5 c

Análisis estadístico PLSD de Fisher


0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Semana p.i.

log

UF

C/b

azo

B. ovis PA

B. ovis ∆omp31




0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Semana p.i.

log

UF

C/b

azo

B. ovis PA

B. ovis ∆omp25d

B. ovis ∆omp22




LAS PROTEÍNAS Omp25 y Omp22 INFLUYEN EN LA CAPACIDAD INVASIVA Y DE PROLIFERACIÓN

CÉLULAS HELA MACRÓFAGOS MURINOS J774A.1

Microbes and Infection 10:706-710 Martín-Martín., et al (2008)

INFECCIÓN DE INFECCIÓN DE BrucellaBrucella spp. EN MACROFAGOS spp. EN MACROFAGOS

Extraido de: Int J Microbiol. Haag AF., et al (2010)

S-LPS dependiente de la activación de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3-K) y no

induce la activación del macrófago

Microbes and Infection 12:246-251 Martín-Martín., et al (2010)

La entrada de B. ovis y B. canis en el macrófago es independiente de la activación de P13-K

SR-A

TRÁFICO INTRACELULAR DE Brucella spp.

virB,

OMP25, OMP22Sistema de Secreción Tipo 4 (T4SS)

Codificado por vir

El sistema regulador de dos

componentes BvrR/BvrS

La proteína BacA

Los periplasmáticos glucanos ciclicos ß-1,2 (CßGs),

Han demostrado estar involucrados en supervivencia dentro de los fagocitos en modelos animales

Martin-Martin ., Et al (2010) (2012)

Extraido de: . Med Microbiol Immunol. 198(4):221-38 R. Martin Roop II., et al (2009)

Microbes and Infection 12:246-251 Martín-Martín., et al (2010)Infection and Immunity 1783-1793 Martín-Martín., et al (2012)

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

Los genes que codifican para la familia Omp25/Omp31 se encuentran conservados en el género Brucella, sin embargo, varias diferencias importantes en su secuencia de ADN fueron encontradas entre la especies. Este polimorfismo podría estar involucrado en la diferencia de virulencia y preferencia de hospedador existente entre las especies de Brucella

Los sueros obtenidos en conejo frente a las PME de la familia Omp25/Omp31 de Brucella spp. han permitido determinar que las proteínas Omp31, Omp25, Omp25c y Omp22 se sintetizan en B. ovis PA. Por el contrario, las proteínas Omp31b y Omp25b no se han detectado en esta bacteria, resultados esperados teniendo en cuenta observaciones previas a nivel del ADN, pero sí se han detectado en la cepas de B. ovis PA complementadas con genes Omp31b y Omp25b funcionales, lo que comprueba su antigenicidad.

A pesar de que Brucella spp. no posee los típicos factores de virulencia, presenta factores de virulencia especializados como son: LPS, cadenas O, OMPs, BacA, T4SS, BvrR/BvrS, (CßGs)

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

El papel de las proteínas Omp31, Omp25 y Omp25c en la virulencia en ratón de B. ovis PA parece poco relevante. Sin embargo, no se puede descartar su implicación en el establecimiento de un proceso infeccioso en carneros, aspecto que sería interesante evaluar.

Las proteínas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B. ovis en ratón, por lo que sería interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B. ovis en carneros y también su implicación en la virulencia de otras especies del género Brucella.

Omp25Omp25 31

21,5

kDa MP

Suero anti-Omp25 y AcM anti-Omp25

B. ovis PA

Δomp25 Δ25-Com

Omp25Omp25

Vet Microbiol. 28; 137 (1-2): 74-82. (2009) Martín-Martín AI, Caro-Hernández P, Sancho P, Tejedor C, Cloeckaert A, Fernández-Lago L, Vizcaíno N. (2009). Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species.

Infect Immun. 75 (8): 4050-61 (2007). Role of the Omp25/Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino

31

kDa

21,5

Suero anti-Omp25b

PA Δ25c Com

Omp25bOmp25b Omp25c Omp25c

MP

Suero anti-Omp

31 25 25b 25c

PA 998-10 (omp25b)

Omp25b


WESTERN BLOT

21,5

31

kDa

Suero anti-Omp25cMP

Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c

Omp25

Δ25 ComPA Δ25cCom

Omp25

Omp25c presenta 2 bandas entre 27.5 29.5 a 30.5 kDa y debido a la similitud de antigenicidad se observa la banda de 25.9 KDa de la proteína Omp25


WESTERN BLOT

31

21,5 B. ovis PA Δomp31

Suero anti-Omp31 y AcM anti-Omp31

MPkDa

Δ31-Com

Omp31Omp31Omp31 Omp31

Vet Microbiol. 28; 137 (1-2): 74-82. (2009) Martín-Martín AI, Caro-Hernández P, Sancho P, Tejedor C, Cloeckaert A, Fernández-Lago L, Vizcaíno N. (2009). Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species.

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31

kDa

21,5

Suero anti-Omp31bMP

PA Δ31

Omp31

Omp31bOmp31bOmp31b Omp3

1Omp31

31Com

31b Com

PA

AntiOmp31


WESTERN BLOT

Suero anti Omp22 purificada

PA Δ22 Com E. coli /Omp22

C(-)

Omp22Omp22

Vet. Microbiol 137:74-82, Martín-Martín AI., et al (2009)


WESTERN BLOT

Haag AF, Myka KK, Arnold MF, Caro-Hernández P, Ferguson GP. Importance of Lipopolysaccharide and Cyclic β-1,2-Glucans in Brucella-Mammalian Infections. Int J Microbiol. 2010;2010:124509. Epub 2010 Dec 1.

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