Producción de proteínas recombinantes en cél eucariotas

• Problemas que suelen aparecer cuando proteínas eucarióticas se expresan en cél procariotas– inestables– sin actividad biológica– contaminantes procarióticos

Sistemas de expresión eucariotas

• Para eliminar los problemas de expresión en procariotas, se han desarrollado sistemas de expresión eucariotas– Esp. importantes para proteínas terapéuticas– Necesidad de que tengan idénticas

propiedades a la proteína natural : bioquímicas biofísicas funcionales

Sistemas de expresión eucariotas

• Cuál es la diferencia?– Modificación post-traduccional de la mayoría

de las proteínas eucariotas – Cél procariotas no pueden realizar estas

modificaciones

Modificaciones post-traduccionales

– Formación de uniones disulfuro correctas– Clivaje proteolítico del precursor inactivo– Glicosilación- agregado de residuos de azúcar– Alteración de aminoácidos en la proteína

• fosforilación• acetilación• agregado de grupos sulfato• Agregado de ácidos grasos

Sistemas de expresión en levaduras: ventajas

– Organismo unicelular– Bien caracterizadas genética y fisiológicamente– Promotores fuertes disponibles– Plásmido natural (2µm) – Eucariotas, ocurren modificaciones post-

transduccionales– Segregan algunas proteínas– No patógeno

Vectores de levaduras

• YIp: integrativos

- una copia integrada a un cromosoma

• YEp: episomales

- ori 2m (alto número de copias)

• YCp: centroméricos-ARS, CEN (1 o 2 copias por cél)

Todos tienen marcador de auxotrofia y son shuttle

Vectores episomales

– Son ampliamente usados– A menudo inestables en cultivos a gran escala

(>10L)

– Estrategia - alterar las condiciones de crecimiento para estabilizar el vector episomal

• usar cepas mutantes que requieren nutrientes específicos.– Leucina, Triptofano, Histidina

• el gen que provee el fenotipo salvaje se encuentra en el plásmido episomal

Promotores de levaduras

Promoter Status

Acid phosphatase PHO5 InducibleAlcohol dehydrogenase I ADH I ConstitutiveAlcohol dehydrogenase II ADH II InducibleGalctokinase GAL 1 InducibleMetallothionein Cup 1 InduciblePhosphoglycerate kinase PGK ConstitutiveTriose Phosphate isomerase TPI Constitutive

Sistemas de expresión en levaduras: desventajas

– Inestabilidad de plásmidos en gran escala• Vectores episomales

– Superglicosilación de glicoproteínas• 100+ residuos manosa vs. 8-13 normal• puede alterar la actividad de la proteína

– Proteínas secretadas quedan atrapadas en periplasma (entre la membrana y la pared celular)• se usan señales peptídicas

Soluciones a los problemas en sistemas de expresión en levaduras

• Levaduras modificadas genéticamente para llevar a cabo glicosilación = humanos– Science Vol 301, p1244-1246 (29 Aug

2003)• Deleción de genes de glicosilación de

levaduras• Agregado de genes de glicosilación humanos

Soluciones a los problemas en sistemas de expresión en levaduras

• Usar otro tipo de levaduras– Pichia pastoris– Hansenula polymorpha– No sólo Saccharomyces cerevisiae

• Usar otros eucariotas– Cél de insectos– Cultivos de cél de mamíferos