Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica

Editor: Juan J. Picazo

Coordinador: Raul Ortiz de Lejarazu Leonardo

Ramón Cisterna CáncerJosé María Eiros BouzaAmelia González LópezMª Carmen MarotoTomas Pumarola SuñeJosé Romero Vivas

INDICE 1. Introducción

2. Objetivos

3. Pruebas Diagnósticas y Pruebas de Cribado de Anticuerpos VIH. 3.1. Características 3.2. Tipos de Técnicas Enzimoinmunoanálisis Aglutinación Pruebas de EIA de Membrana (Dot-Blot) Pruebas Fluorimétricas

4. Pruebas de Confirmación 4.1. Confirmación por Técnica de Western Blot 4.2. Confirmación por Técnica de Inmunofluorescencia Indirecta 4.3. Confirmación por Técnica de Radioinmunoprecipitación

5. Reacción de Amplificación Genómica por Reacción en Cadena de laPolimerasa

(PCR) en el Diagnóstico de la infección VIH.

6. Aislamiento Vírico en el Diagnóstico de la Infección VIH.

7. Identificación del Tipo de Infección VIH (VIH-1/VIH-2).

8. Marcadores Séricos Específicos de la Infección VIH. 8.1. Sistema Antígeno p24 - Anticuerpo p24.

9. Expresión de Resultados del Diagnóstico Serológico de la Infección VIH yde los

Marcadores Específicos. 9.1. Pruebas de Diagnóstico. 9.2. Pruebas de Confirmación. 9.3. Marcadores Específicos de VIH.

10. Estrategias en el Diagnóstico Serológico de la Infección VIH. 10.1 Principios Generales. 10.2. Estrategia en la Donación de Sangre/Organos. 10.3. Estrategia en el Diagnóstico de la Infección VIH. Primoinfección VIH. Fase Asintomática de la Infección VIH. Fase Sintomática de la Infección VIH. Monitorización del Tratamiento Anti-retroviral. 10.4. Estrategia en Situaciones Especiales. Embarazo. Recién nacidos de Madres Portadoras. Accidentes con Riesgo de Exposición a VIH. En la Vigilancia de la Infección VIH.

11. Criterios Generales para la Realización de Pruebas VIH.

12. Disposiciones Legales.

13. Bibliografía Seleccionada.

6. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LA INFECCIÓN POR VIH 1998

1. INTRODUCCIONLos virus de la inmunodeficiencia humanatipo 1 y tipo 2 (VIH-l y VIH-2) han sidoclaramente identificados como la causaprincipal del sindrome de inmunodeficienciaadquirida (SIDA).Los VIH constituyen el prototipo demiembros del Género Lentivirus (tabla 1),perteneciente a la familia Retrovindac. Elnombre del género alude al largo período deincubación que transcurre entre la infeccióny la enferrnedad, que puede incluso superarlos 10 años.El genoma de VIH está compuesto porgenes estructurales (env, pal y gag)responsables de la codificación de proteínasque formarán parte de la partícula viral ygenes reguladores que codifican laexpresión de proteínas con funcionesmoduladoras sobre algunas propiedadesbiológicas del virus y de la célula infectada.Las proteínas estructurales son las másfrecuentemente empleadas en eldiagnóstico serológico, bien en forma nativay purificada o como péptidos sintéticos (PS)o péptidos recombinantes (PR) producidosen bacterias y otros microorganismos en losque se ha transferido parte del genoma deVIH.La acción patógena de VIH en el individuoinfectado, resulta de la interrelación entremúltiples factores que influyen en el ciclovital del virus en sí y en la respuesta inmunepor parte del organismo. Aún persistenmuchos interrogantes para tener una ideaclara de los mecanismos de patogenicidadde VIH. Muy esquemáticamente, la infecciónpor VIH se traduce en un estado de latenciay/o persistencia del virus en diversasestirpes celulares del organismo infectado(linfocitos, macrófagos, glia cerebral, célulasprecursoras de la médula ósea, etc.). Con eltranscurso del tiempo, la mayor parte de losindividuos infectados desarrollarán signos ysintomas relacionados con la infección porVIH. De acuerdo con su sintomatología haypropuestos varios tipos de clasificaciónclínica para la infección por VIH, entre lascuales, la que reúne los criterios propuestospor la O.M.S. se recoge en la tabla 2.Las personas infectadas por VIH durante elestadío I son, las que en términosgenerales, se denominan portadoresasintomáticos, aunque existe la posibilidadde que durante la primoinfección por VIH noaparezcan tampoco ni signos ni sintomasclínicos que hagan sospecharla. El

diagnóstico de la infección VIH tienedistintos objetivos, uno de ellos es eldiagnóstico "per se" de personas quesospechan que pueden estar infectadas yrequieren atención médica, consejo nodirectivo y educación sanitaria respecto a suestado. Otro de los objetivos del diagnósticode VIH es la seguridad en las transfusiones,productos hemoderivados y donaciones deórganos de obligado cumplimiento en elámbito territorial español. Finalmente, otrosobjetivos del diagnóstico de la infección VIH,son la aplicación en programas de vigilanciaserológica de esta infección (estudios deincidencia y prevalencia, tendencias engrupos poblacionales, etc.) o en programasde investigación clínica, farmacológica,virológica e inmunológica.El método más comunmente empleado parael diagnóstico de laboratorio de la infecciónVIH se basa en técnicas serológicas quedetectan anticuerpos del virus en el suerode las personas infectadas. De este modose dispone de reactivos para pruebas quepueden ser automatizadas total oparcialmente y aplicarse a un gran númerode sueros. Estas pruebas utilizadas para eldiagnóstico de una persona individualizada,reciben el nombre de pruebas dediagnóstico de la infección VIH, perotambién pueden utilizarse como uninstrumento para desechar o rechazarproductos sanguíneos o biológicoscontaminados, en cuyo caso se denominande cribado. Conviene subrayar, que laestrategia a emplear en el cribadorutinario es distinta a la utilizada para eldiagnóstico individualizado de lainfección VIH.

2. OBJETIVOS1. Establecer la utilidad de cada una de laspruebas que se emplean para el diagnósticoserológico de la infección por VIH y valorarla significación de los resultados obtenidos.2. Determinar los criterios para la elecciónde las pruebas para el diagnóstico yevolución de la infección VIH.3. Recomendar estrategias de utilización depruebas diagnósticas para el diagnóstico yevolución de la infección VIH en unapersona, para la seguridad en donaciones ytransfusiones y donaciones de órganos ypara estudios epidemiológicos y deinvestigación.

3. PUEBAS DIAGNOSTICAS YPRUEBAS DE CRIBADO DEANTICUERPOS VIHDe forma conceptual, denominados pruebasdiagnósticas a las que se emplean de formaindividualizada en el suero de una persona ypruebas de cribado cuando se aplican a unconjunto de muestras y su finalidad no es ladiagnóstica.La eficacia de una prueba diagnósticadepende de su capacidad para señalarcorrectamente la presencia o ausencia de laenfermedad que se estudia.La aplicación de técnicas de cribado tienecomo objetivo detectar la presencia deanticuerpos anti-VIH (Ac VIH) paraevidenciar el estado de infección y sueficacia será tanto mayor cuanto menor seael número de individuos/muestras infectados

que presenten un resultado falso negativo.Por lo tanto, su importancia radica en ser"un primer escalón" en el procesodiagnóstico de la infección. Ello implica untipo de tecnología realizable por la mayoriade laboratoriso y aplicable a un númeroimportante de muestras.

3.1. CARACTERISTICASSensibilidad, Especificidad y ValorPredictivoLa sensibilidad (capacidad de la pruebapara detectar la infección cuando lainfección está presente) y la especificidad(capacidad de la prueba para detectar lainfección cuando la infección está ausente)son los parámetros esenciales para valorarun test que vaya a ser empleado, y secompletan con la expresión matemática delos valores predictivos (VP):

VP de un resultado positivo (VPP)= Número de verdaderos positivos ---------------------------------------------- Número total de positivos de la prueba

VP de un resultado negativo (VPN)= Número de verdaderos negativos ---------------------------------------------- Número total de negativos de la prueba

Este resultado se puede expresar por elcociente obtenido o en forma de porcentaje,multiplicando por cien las expresionesmatemáticas anteriores.En general, a medida que la prevalencia deinfección VIH es alta en una población dada(por ejemplo, ADVP), el valor predictivopositivo tiende a ser elevado y por elcontrario el VPN disminuye. De formainversa, cuando la prevalencia es baja elVPP tiende a ser menor y el VPN eselevado.La prueba de cribado ideal es aquella en laque los valores de sensibilidad yespecificidad son de 100%, es decir, poseela máxima sensibilidad y nunca es negativaen los casos de infección. Actualmente,ninguna de las técnicas disponibles cumpleesta condición y las causas son tantobiológicas como técnicas.Cuando el objetivo del cribado sea laseguridad en el control de productosbiológicos (donaciones de sangre, semen,órganos, tejidos, ect.), el criterio de lamáxima sensibilidad en el prioritario ydeberá optarse por el tipo de técnica cuyovalor se aproxime más al 100%.Cuando el objetivo es el diagnóstico de lainfección, el criterio de la máxima

especificidad es el prioritario; la estimaciónde la prevalencia en el contexto clínico-epidemiológico en el que se encuentra elpaciente será importante para optar porpruebas más específicas con el fin detécnicas de confirmación más complejas ycostosas.Sencillez de EjecuciónCarazterísticas a tener en cuenta de modoque resulten asequibles para la mayoría delos laboratorios.Deberá ser suficiene una mínima dotacióninstrumental y unas buenas prácticas delaboratorio sujetas a los controles de calidadcorrespondientes.Lectura SencillaMejor si es objetiva y con expresión deresultados de forma cualitativa(positivo/dudoso/negativo).

3.2. TIPOS DE TECNICASEnzimoinmunoanálisisLa detección de Ac VIH con técnicas de EIAes el método más empleado en laactualidad. De ellas existen distintosprincipios en la detección de los anticuerpos(indirecto, competitivo, "sandwich" ycaptura). La progresiva calidad en laelaboración de los antígenos (Ag), hacen de

este tipo de técnicas las más indicadas silas condiciones instrumentales dellaboratorio lo permiten.Los términos 1ª, 2ª y 3ª generación seutilizan según la fuente del Ag y el formatode la prueba. Los ensayos de 1ª generaciónutilizan lisado viral obtenido en lineascelulares de linfocitos T humanos. Lasreactividades inespecíficas debidas aanticuerpos contra el sustrato celularobligan, en general, a que estas técnicasutilicen diluciones elevadas de los suerospara evitar falsos positivos y dicho procederdisminuye la sensibilidad de estas pruebas.Poseen sin embargo una gran capacidad decaptación de cualquier tipo de Ac VIHpresente en la muestra. El formato decaptura en el que el lisado viral es ligado poran anticuerpo monoclonal fijado a la fasesólida es mas específico que el indirecto.Las pruebas de 2ª y 3ª generación utilizancomo Ag proteínas recombinantes (PR) opéptidos sintéticos (PS). Son muy sensiblesy los resultados son más reproducibles, alutilizar un Ag más normalizado y purificado.Con los tes de 2ª y 3ª generación utilizancomo Ag proteínas recombinantes (PR) opéptidos sintéticos (PS). Son muy sensiblesy los resultados son más reproducibles, alutilizar un Ag más normalizado y purificado.Con los test de 2ª generación y formatocompetitivo se ha conseguido laespecificidad más elevada. El tipo"sandwich" es utilizado en las pruebas de 3ªgeneración, que son actualmente las mássensibles, aunque su especificada es menorque la de los test de 2ª generación,extremos que deben ser obtenidos encuenta a la hora de escoger una prueba.Existen reactivos comercializados con losAg y formatos citados para la detección deAc VIH-I y Ac VIH-1 +2.Para la detección específica de Ac VIH-2solamente disponemos de EIA con PS olistado viral y formato indirecto.AglutinaciónEstas pruebas están basadas en laaglutinación de Ag de VIH que previamenteha sido fijado a particulares susceptibles deaglutinar en presencia de suero quecontenga Ac VIH.Este tipo de pruebas comenzarón adesarrolarse a mediados de los años 80como alternativa a los EIA. Pueden utilizarpartículas de gelatina o partículas de látex, ycomo Ag, lisado viral, PS o PR.Son técnicas de manejo muy sencillo,rápidas, de lectura visual, apenas requiereninstrumentación y pueden adaptarse a ungran número de sueros.

Su sensibilidad parece comparable al EIA,pero su grado de especificidad es muchomenor.Son las técnicas indicadas para utilizar enlaboratorios con escasa dotacióninstrumental o que manejan un númeroreducido de muestras.

Pruebas de EIA de Membrana (Dot-Blot)En estas pruebas los Ac VIH se detectanpor un método inmunoenzimático. El Agestá fijado a tiras de nitrocelulosa y estáformado por PR o PS de uno o ambos virus.La mayoría de las pruebas rápidas dedetección de anticuerpos emplean esteprincipio. Tienen lectura visual y norequieren instrumentación y su sensibilidady especificidad aún no estánsuficientemente evaluadas. Su ventaja yprincipal indicación es la posibilidad deidentificación entre los dos tipos de virus ysu mayor inconveniente es un elevadocoste.

Pruebas FluorimétricasHan sido las últimas en incorporarse a laoferta diagnóstica (a partir de 1990). Losantígenos específicos están ligados amicroparticulas y el indicador de la reacciónes un fluorocromo que actúa como sustrato.La fluorescencia emitida durante la reacciónes medida por un flurómetro. Tiene por tantolectura objetiva y requiere un nivel deinstrumentación similar a las técnicas deEIA. Dada su reciente introducción en elmercado, hay poca experiencia y aunque laposibilidad de automatización y elprocesamiento de gran número de muestrasson muy ventajosas, es necesario estudiarsu sensibilidad y valorar el coste deincorporación las de forma rutinaria.En la tabla 3 se resumen las principalescaracterísticas de las pruebas comentadas.

4. PRUEBAS DE CONFIRMACIONEstas pruebas tienen como objetivoconfirmar los resultados obtenidos por laspruebas diagnósticas utilizando técnicas confundamentos distintos y más específicos.Por lo general, se utilizan para laconfirmación de sueros positivos, pero endeterminados casos pueden emplearse paracontinuar sueros negativos, dada su mayorsensibilidad en muchos casos.Existen diferentes pruebas de confirmación,entre ellas, las más utilizadas son lasbasadas en la inmunoelectrotransferencia oWestern Blot (WB), la inmunofluorescencia

indirecta (IFI) y la radioinmunoprecipitación(RIPA) (tabla 4).

4.1. CONFIRMACION POR TECNICA DEWESTERN BLOTLa técnica de inmunoelectrotransferencia,más comúnmente denominada "westernblot" (WB), es una de las más ampliamenteutilizadas para confirmar resultadospositivos en las pruebas de depistaje de AcVIH, ya que permite una discriminaciónpuntual de las especificidades dereactividad de anticuerpos frente a lasdistintas proteínas del virus.Las tiras de nitrocelulosa en las que se hantransferido las proteínas del virus contienen,generalmente, casi todas las proteínasestructurales del VIH, algunas proteinasprecursoras de aquellas, y además otrosantígenos celulares contaminantes queproceden de las células infectadasempleadas para la obtención del Ag vírico(tabla 5). Algunas tiras de WBcomercializadas para VIH- 1 incluyen,además, algún péptido sintético,correspondiente a glicoproteínas específicasde VIH-2, a efectos de identificación de lainfección VIH con una sola tira de reactivo.La técnica de WB consiste, básicamente, enla incubación de una de esas tiras con elsuero problema durante un tiempo queoscila entre 2 a 4 horas hasta 18 horas, traslo cual se revela la presencia de anticuerposfrente a las diferentes proteinas del virusmediante reacciones inmunoenzimáticas dedistinta configuración dependiendo delfabricante. El resultado es la aparición debandas coloreadas de mayor o menorintensidad, en el lugar de la tira denitrocelulosa en el que están situadas lasproteinas del VIH contra las cuales existenanticuerpos en el suero problema.Existen diferentes comercializaciones de latécnica que pueden variar en la carga ycalidad del Ag presente en las tiras, tipo ymétodo de revelado y tiempo de incubacióncon el suero. Dada la finalidad de estaprueba, los WB de tiempo de incubaciónlargo (16-18 horas) deberían utilizarse enlos casos de muestras especialmenteconflictivas.La lectura e interpretación de los resultadospor WB debe hacerse siguiendo unaspautas como las que se resumen en la tabla6. En primer lugar, Se identificarán, por suposición en la tira, comparádolas con elcontrol positivo, las bandas especificas dereactividad (gp160, gp120, p66, p55, p51,etc.), a continuación puede ser útil asignarun valor de reactividad a cada banda (2:

reactividad franca, 1: reactividad débil odudosa, o: ausencia de reactividad) yanotarlo de forma individualizada. Aunque latécnica no es cuantitativa, el laboratoriopuede, de esta forma, archivar losresultados de forma más detallada, aunquelas tiras se hayan deteriorado o eliminado.La lectura automatizada debe realizarse pordensitometría; los métodos de análisis deimagen por ordenador (scanner) precisanaun anteriores evaluaciones.Existen distintos criterios de positividad parael WB (tabla 7), de ellos parece el másadecuado el propuesto recientemente por laOMS que resulta el más sensible cuando semanejan sueros de muy variadaprocedencia poblacional. Adoptando estecriterio un suero es considerado positivocuando presenta reactividad al menosfrente a 2 glucoproteínas de las tres queposee el virus (gp160, gp120 y gp4l). Lossueros negativos no deberán mostrarreactividad frente a ninguna de las proteínaspresentes en la tira. Finalmente los suerosse denominan indeterminados por WBcuando, existiendo reactividad frente a unao más proteínas, no cumple el criterio depositividad adoptado.Los criterios de positividad más restrictivosse traducen en una falta de sensibilidadpara confirmar sueros en sujetos positivoscon signos o síntomas de enfermedadligada a la infección VIH ya que en losenfermos de SIDA se produce unadesaparición de las bandascorrespondientes a p24, p31, y p55. Sinembargo, dichos criterios aplicados apoblación de bajo riesgo no hacen perder laserisibilidad al WB, que llega a ser del 100%sin merma de la especificidad. Con el WBpueden darse falsos negativos, posibilidadque debe tenerse en cuenta en individuoscon factores de riesgo o signos de infecciónVIH y en casos de exposición reciente alvirus.En los WB indeterminados se observanfrecuentemente reactividades clínicas frentea una banda del core viral (p24, p55 y p66)y en otras ocasiones frente a componentescelulares contaminantes de las tiras denitrocelulosa o epítopos no víricos queaparecen en el procedimiento demanufacturación del WB, permitiendo laexposición de zonas parcialmentedesnaturalizadas de aquellas proteinas. Sehan descrito WB indeterminados enpersonas con factor reumatoide, lupuseritematoso, bilirrubinemias elevadas,anticuerpos contra el sistema HLA y enpacientes hemodializados, y otras causas

(tabla 8). En otros casos la indeterminaciónen el WB de VIH-1 puede ser causada porinfección por VIH-2 u otros retrovirus (HTLV-I, HTLV-II).En los sueros indeterminados, elseguimiento debe prolongarse al menosdurante 6 meses para verificar si existe uncambio en el patrón de anticuerpos hacia lapositividad o por el contrario desaparecenlas bandas detectadas inicialmente. Laspersonas con resultados persistentementeindeterminados al cabo de 6 meses, enausencia de factores de riego, síntomas ohallazgos clínicos compatibles con lainfección VIH, deben considerarse negativaspara Ac VIH. Sin embargo, no deberíandonar sangre, plasma, semen u órganos ydeberán ser informadas correcta yverazmente sobre el significado de susituación, ofreciéndoles disponibilidadclínica y sanitaria ante la posible ansiedadque pueda ocasionárseles. En algunoscasos pueden estar indicadas nuevasentrevistas clínicas y un seguimiento masprolongado en el que se incluyan otrosanálisis de confirmación (RIPA), evoluciónde la función inmune e incluso descartaruna infección VIH en su pareja sexual,solicitando la cooperación y consentimientode ésta.En conclusión, la técnica de WB es unaprueba de confirmación que en el momentoactual es fácilmente adaptable alaboratorios de equipamiento medio, que notengan un excesivo número de muestraspara confirmar y que requiere un ciertoentrenamiento para su interpretación ylectura.

4.2. CONFIRMACION POR TECNICA DEINMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTALa inmunofluorescencia indirecta (IFI) esuna técnica rápida, sencilla y de bajo coste,susceptible de ser empleada como primeratécnica de confirmación en sueros conpruebas diagnósticas (EIA) claramentepositivas y en poblaciones con factores deriesgo y sumamente útil para laboratoriosque precisen confirmar gran número desueros.La confirmación por esta técnica estábasada en la demostración de anticuerposfrente a células infectadas por VIH, por estemotivo, los resultados sólo puedenexpresarse como positivos o negativos y nopermite especificar de forma concreta otrasreactividades.Como Ag se utilizan linfocitos humanosinfectados y fijados sobre portaobjetos. Paraevidenciar posibles reacciones entre

anticuerpos no específicos presentes en lamuestra y el substrato celular utilizado esnecesario incorporar como sistema decontrol células no infectadas. Si existe"doble reactividad" frente a las células queexpresen Ag y las células control, elresultado es ilegible, dado que no puedeatribuirse la positividad a los anticuerposespecíficos pero tampoco descartar supresencia.La lectura se efectúa con microscopio de luzultravioleta y los resultados dependenmucho de la calidad del microscopio y laexperiencia del observador para identificarlos patrones de fluorescencia citoplásmica yde membrana que corresponden a lapresencia de anticuerpos específicos. Elgrado de subjetividad en la lectura y ladificultad en la normalización y control delAg utilizado (distintas lineas celulares,fijación en portaobjetos en diferentesmomentos de la infección celular, estado deconservación, etc.) afectan a lareproductibilidad de la técnica.Las células infectadas expresan grancantidad de Ag correspondiente a distintosmomentos de la infección celular, por lo queesta técnica detecta todo tipo de Ac VIH,pero precisa la existencia de nivelessuperiores a los detectados por el WB. Enlos reactivos comerciales el Ag es VIH-1pero existe reactividad cruzada con VIH-2por lo que no resulta útil para diferenciar losdos tipos de infección. Las dilucionesseriadas del suero problema nos permitenexpresar los resultados indicando el títuloobtenido. Esto es especialmente útil cuandose desea comparar niveles de Ac VIH, comoes el caso de suero/LCR del mismopaciente cuando se sospecha infección VIHdel SNC.El mayor rendimiento de la técnica seobtiene con muestras EIA positivaspertenecientes a personas con prácticas deriesgo. No es aconsejable utilizarla en laconfirmación de hemodonaciones, enmuestras con resultado EIA positivo débil nien muestras de personas que están en uncontexto epidemiológico de bajaprevalencia, aunque las pruebas de cribadohayan sido claramente positivas.Los resultados IFI con patrones atípicos,reactividades inespecíficas o negativos conpruebas de cribado positivas, deberánprocesarse con una segunda pruebaconfirmatoria generalmente WB.

4.3. CONFIRMACION POR TECNICA DERADIOINMUNOPRECIPITACIONEsta técnica esta basada en lademostración de Ac VIH en el suero, que enpresencia de proteinas víricas marcadasradioactivamente conduce a la formación deinnunocomplejos. Es la técnica dereferencia. La elaboración del Ag requierecondiciones de alta seguridad, ya que serealiza mediante cultivo del virus en líneacelular de linfocitos humanos y posteriormarcaje radioactivo. El virus complejomarcado se obtiene del sedimento celular(Ag con alta expresión de glicoproteínas ysus precursores) y del sobrenadante delcultivo, más rico en proteínas enzimáticas ycodificadas por el gen gag.La reacción Ag-Ac es previa a cualquier acualquier manipulación del Ag lo que,además de una elevada sensibilidadproporciona una gran especificidad. Loscomplejos proteína viral-anticuerpoespecífico son separados por técnicaselectroforéticas según su peso molecular yse ponen en evidencia mediante laimpresión del marcaje radioactivo en placafotográfica, obteniendo un patrón de bandassimilar al del WB. Dada la complejidad de latécnica, las condiciones obligatorias deseguridad biológica y de manejo desustancias radioactivas y la manualidad detodo el proceso, esta técnica está reservadaconcretamente al ámbito de:1.- Investigación de muestras problemáticasen las que no se pueda establecerdiagnóstico de infeción mediante lastécnicas convencionales de confirmación.2.- En la elaboración de paneles de suerodestinados a sistemas de control de calidad,tanto de reactivos como de "sueros patrón".3.- En la diferenciación serológica con finesde investigación, de la infección VIH-1 yVIH-2 cuando las reactividades cruzadasden patrones mixtos en las técnicas de WBy Dot-Blot.

5. REACCION DE AMPLIFICACIONGENOMICA POR REACCION ENCADENA DE LA POLIMERASA (PCR)EN EL DIAGNOSTICO DE LAINFECCION VIHLa base de este diagnóstico reside en lademostración de parte del genoma vírico apartir de muestras de sangre periférica.Existen ciertos casos en los que estastécnicas, basadas en la reacción en cadenade la polimerasa (PCR) logran undiagnóstico más rápido y precoz de lainfección VIH en situaciones en las que el

diagnóstico clásico serológico puede tardaren confirmarse: recién nacido de madresinfectadas por VIH o con antecedentes deriesgo de infección VIH durante el embarazoy en sujetos con períodos ventana máslargos del habitual. Otras situaciones en lasque esta técnica o variantes de la mismapueden ser de utilidad son la demostraciónde infecciones por VIH-2 con serologíano concluyente, infecciones dobles porVIH-1 y VIH-2 más recientemente ladetección de mutaciones específicasasociadas a la resistencia a losantivíricos.El grado de estandarización de estaspruebas, así como la disponibilidad dereactivos es desigual. Existen reactivoscomercializados para PCR diagnóstica deVIH-1 y no existen por el momento paraVIH-2 o para el resto de indicacionesdiagnósticas descritas en el párrafo anterior.Aunque esta técnica se ha mostrado enalgunos casos superior al diagnósticoserológico, la falta de criteriosinternacionalmente aceptados para lavalidación de resultados discordantes con laserología, unido a las consideracionesanteriores hace su aplicación debarealizarse con una escrupulosaconsideración del contexto clínico en cadacaso individualizado.

6. AISLAMIENTO VIRICO EN ELDIAGNOSTICO DE LA INFECCIONVIHEl aislamiento del VIH sigue siendo hoy endía una técnica de referencia, aunque suempleo quede restringido a laboratorios bienequipados.Supone el cultivo del virus a partir demuestras clínicas que contengan virus libreso células infectadas. En la mayoría de loscasos se utilizan linfocitos de sangreperiférica separados mediantecentrifugación en gradiente de Ficoll. Loslinfocitos del paciente se cultivan a 37ºC enatmósfera de 5% de CO² en mediosordinarios (RPMI 1640 y 20% de suero deternera fetal) adicionados de interleucina-2junto con linfocitos de donante sanopreviamente estimulados con un mitógeno(fitohemaglutinina). Semanalmente seañaden linfocitos estimulados de donante,manteniendo estas condiciones de cultivodurante 4 semanas. La detección delcrecimiento vírico se puede realizarmidiendo la actividad retrotranscriptasa enlos sobrenadantes, por detección deantígenos específicos del virus (p24

principalmente) o bien mediante lademostración del efecto citopático en formade sincitios o células gigantes formadas porla fusión de células infectadas; que tienenglucoproteina de la envoltura del VIH en susuperficie; con otras células contigüas.A pesar de que las muestras más comunespara aislamiento son linfocitos de sangreperiférica y líquido cefalorraquídeo (LCR), elVIH ha podido aislarse de gran número dehumores orgánicos entre los que seincluyen el plasma, suero, secrecionescervicales, semen, saliva, leche materna,lágrimas, orina, líquido alveloar, órganos detrasplante y tejido cerebral.El aislamiento es la técnica de referenciafinal para cualquier otra técnica y esobligado cuando se pretende establecer elfenotipo de VIH (cepas inductoras de sincitioo no; IS/NIS), la actividad in vitro deantivíricos y puede servir de referencia de lacantidad de virus presente en la muestra delpaciente. Sin embargo, el aislamiento deVIH presenta, como principal inconveniente,la necesidad de laboratorios con complejossistemas de contención biológica (nivel P3),pero además, podría plantear la dificultad deseleccionar tan sólo aquellas, con mayorcapacidad para su crecimiento invitro,disminuyendo, por tanto, su posibleimportancia como marcador de eficaciaterapéutica o como técnica demonitorización de la aparición de variantesdel virus resistentes a los anti-retrovirales.

7. IDENTIFICACION SEROLOGICADEL TIPO DE INFECCION VIH (VIH-1/VIH-2)Actualmente, la identificación serológica delos Ac VIH, en una persona infectada, nodebe plantear ninguna dificultad en nuestromedio.En España, la casi totalidad de individuosdiagnosticados serológicamente yconfirmados, lo están por VIH-1, por tanto,cualquiera de las pruebas de confirmaciónbasadas en reactividad diferenciada frente alas proteínas del virus (WB, RIPA) puedenservir para identificar el tipo de infecciónVIH.El contexto epidemiológico debe orientar eldiagnóstico de infección VIH-2. En el ámbitode la tecnología EIA, una buenacombinación es la utilización de un EIAindirecto (VIH 1 y 2) un EIA competitivo(VIH-1). Una positividad elevada en elprimer test y negativo o débilmente positivoen el segundo test, es muy sugerente deinfección por VIH-2.

La confirmación de una infección por VIH-2,se debe realizar en sueros reactivos en laspruebas de diagnóstico y no confirmados oindeterminados en el WB de VIH-1,comprobando en WB para VIH-2 sureactividad siguiendo las pautasmencionadas anteriormente con el criteriode la OMS (reactividad al menos frente ados glicoproteinas: gp140, gp105 o gp36).Existen pruebas que vehiculan en tiras denitrocelulosa péptidos sintéticoscorrespondientes a los epítopos deglicoproteínas de VIH-1 (generalmentegp41) y de VIH-2 (generalmente gp36), lautilización de las mismas puede servir paraaportar más datos y ayudar a laidentificación de infecciones VIH-2 con máscerteza.El mayor problema de identificación loconstituyen los sueros en los que se apreciadoble reactividad frente a VIH-1 y VIH-2 enlas pruebas serológicas. En dichos casos lareactividad doble puede estar causada porla existencia en el WB de reactividadcruzada frente a proteínas del "core" y frentea las glicoproteinas de envoltura(consideradas más específicas). En estoscasos puede estar indicado utilizar pruebasde péptidos sintéticos realizando dilucionesde la muestra y observando frente a cual delos péptidos desaparece la reactividad.Sugiriendo así, que la identificación lo espor el tipo de VIH frente al cual persiste laposibilidad tras la dilución de la muestra. Apesar de lo espuesto los casos decoinfecciones por VIH-1 y VIH-2 pueden serde díficil confirmación desde el abordajeserológico y precisarán pruebas dediagnóstico directo, (como las deamplificación genómica especifica, cultivo oambas) que permitan una documentaciónmás fiable de la doble infección, que esbastante infrecuente. En el entorno europeolos países con más casos documentados deinfección VIH-2 son Portugal, Francia yBélgica.En España, desde hace algunos años sehan documentado infecciones por VIH-2principalmente en inmigrantes africanos yesporádicamente en sujetos españoles. Enalgunos de los sueros de dichos casos seha obervado que puede haber una ciertareactividad en las pruebas de VIH-1 y unalectura superficial del WB podría confundir apersonas poco habituales a esta prueba deconfirmación.En conclusión, la identicación de infecciónpor VIH-2 se aconseja sólo en los casos dereactividad repetida en pruebas dediagnóstico y con resultados indeterminados

frente a VIH-1 en pruebas de confirmación oen individuos con antecedentes decontactos sexuales con personas deantiguas colonias portuguesas, de paísesafricanos o con prostitutas de esos países.Las pruebas de péptidos sintéticos puedenayudar a la identificación serológica de lainfección VIH en dichos sueros.

8. MARCADORES SERICOSESPECIFICOS DE LA INFECCION VIH.En la actualidad existen marcadores séricosque permiten una mejor caracterización dela infección VIH, uno de ellos lo constituyeuna de las proteínas estructurales del corede VIH-1, de 24 kd de PM, denominadaproteína p24 ó Agp24. Esta proteínaaparece como consecuencia de lareplicación del VIH en el organismo y puededetectarse en distintos momentos de lainfección, constituyendo así otra importanteayuda diagnóstica. Así mismo, en el cursode la infección VIH, se producenanticuerpos específicos contra dichaproteína que sufren variaciones a lo largodel tiempo. Ambos marcadores séricos sonespecíficos de la infección VIH y su manejoconjunto pueden facilitar el mejorseguimiento de los individos infectados porVIH.

8.1. SISTEMA ANTIGENO p24 -ANTICUERPO p24En la actualidad, existen diversas técnicascomerciales que utilizan el principio de EIAen triple "sandwich" para la detección de Agp24. Las muestras clínicas en las que puederealizarse la detección son: suero, plasma yLCR.Dada la existencia de falsos positivosdeberá confirmarse mediante una reacciónde bloqueo de la muestra con suero anti-p24.La sensibilidad de los reactivos actualespermite la detección de cantidades queoscilan entre 10 a 50 pg/ml o más de Agp24. Se puede hacer una semi-cuantificación de dicho Ag utilizando suerosen cantidades conocidas de p24. Lasmuestras pueden almacenarse a 4ºCdurante una semana y más tiempo a -20ºCó -70ºC.Este antígeno puede desnaturalizarse, porello, se recomienda para el almacenamientoprolongado temperaturas de -70ºC. Paraeste tipo de ensayos deben rechazarsemuestras turbias, hemolizadas orepetidamente congeladas ydescongeladas. La sensibilidad de esta

técnica es menor que la de la detección deAc VIH. El hallazgo oscila desde un 4% parasujetos seropositivos asintomáticos hasta el70% de los pacientes de SIDA. En LCR losporcentajes de detección pueden variardesde 0% en asintomáticos al 55% enpacientes de SIDA.En el curso de la infección por VIH seproduce una antigenemia primaria p24 conun aclaramiento posterior que puede serdebido, entre otros factores, a la formaciónde inmunocomplejos por la aparición de Accirculantes anti-p24. Según esto, laaparición de dicho Ag en el curso de lainfección sería el resultado de una mayorreplicación vírica que puede llevar a unexceso de Ag y producir el aclaramiento deAc p24 observando en el SIDA. En laactualidad hay descritas técnicas sencillaspara disociar inmunocomplejos p24 yevaluar la cantidad libre y combinada deeste Ag.La detección de Ag p24 tiene diferentesgravados de utilidad clínica según lafinalidad que se persiga. La aparición de Agcirculante libre y su persistencia esmarcador de mal pronóstico y de progresiónde la infección, y suele correlacionar biencon otros marcadores no específicos comoel cociente de linfocitos CD4/CD8, laelevación de beta-2-microglobulina yneopaterina y los linfocitos totales. Losniveles elevados de antigenemia p24 seasocian con distinta frecuencia a ladesaparición de Ac p55 y Ac p24 tambiénde mal pronóstico. Por otra parte, lapresencia de p24 puede demostrarse enLCR en diferentes estadíos de la infección,como expresión de la multiplicaciónneurológica del virus.La detección de Ag p24 para diagnóstico enel período ventana es de menor utilidad ydebería reservarse sólo ante signos clínicoscompatibles con la primoinfección en casode exposición conocida o sospechada.Aunque existen referencias sobre detecciónde p24 antes de la seroconversión, tanto enasintomático expuestos al virus, como enenfermos en el estadío I, en la mayoría delos casos la antigenemia primaria dura 1 o 3semanas durante el período ventana queprecede a la seroconversión VIH.En los casos pediátricos la detección de Agp24 confirmada es indicativo de infección ypuede agilizar el diagnósitico. Ya que ladetección de IgM anti-VIH en recién nacidosde madres infectadas es de variable utilidady la IgG que presentan puede ser detransferencia materna en el 25% de loscasos, de producción propia en la misma

proporción o de la coexistencia de ambas,debido a que el tiempo de aclaramiento delos anticuerpos maternos puede ser superiora los 18 meses. Los métodos que permitendefinir dichas situaciones son laboriosos, enalgunos casos se dan falsos negativos porpruebas de EIA que resultan positivasmediante WB o pruebas más sensibles Enestos casos la detección de Ag p24 libre oen inmunocomplejos ofrece una alternativadiagnóstica más asequible. Esta técnicaserológica, sin embargo, es menos sensibleque el cultivo o la detección poramplificación genética (PCR).En los casos tratados con quimioterapiaantivírica específica para VIH la detección ycuantificación de p24 sirve para controlar laeficacia terapéutica del fármaco empleado ycomo marcador adicional para lamonitorización del paciente.La detección de Ac p24 se realizahabitualmente mediante técnicas de EIA, lamayoría de estas utilizan péptidosrecombinantes o sintéticos de p24. Engeneral son algo menos sensibles que otrastécnicas cualitativas como el WB perotienen la ventaja de permitir una semi-cuantificación del título de dichosanticuerpos. No es una prueba deconfirrnación, su fin es exclusivamentecomo marcador cronológico de la infecciónVIH.Cualquier laboratorio con un equipamientode tipo medio, habituado al empleo detécnicas de diagnóstico basadas en elprincipio inmunoenzimático puede realizareste tipo de determinaciones. En algunoscasos pueden presentarse falsos positivosen la detección de Ac p24 debido areacciones heterogéneas con diversosantígenos. Por esta razón y dada sufinalidad como marcador de evolución, noes aconsejable hacer este tipo dedeterminación sin la confirmación previa dela infección VIH en un individuo.

9. EXPRESION DE RESULTADOSDEL DIAGNOSTICO SEROLOGICODE LA INFECCION VIH Y DE LOSMARCADORES ESPECIFICOSLa demostración confirmada de anticuerposfrente a VIH en una persona es significativode infección por dicho virus. Dadas lascaracterísticas biológicas del mismo, dichaspersonas deberán ser consideradas a todoslos efectos como portadores del virus y portanto potencialmente transmisoras de VIHpor los mecanismos actualmentereconocidos. De la misma forma cuando no

exista esa evidencia confirmada de AcVIH, no podrán considerarse portadorasdel virus, aunque si concurren en dichaspersonas factores de riesgo, deberánaconsejarse la realización de pruebasadicionales.Por lo anteriormente expuesto resulta muyimportante que los resultados de laspruebas serológicas de diagnóstico de VIHse expresen de forma clara y precisa paraevitar situaciones diagnósticas confusas yansiedad innecesaria en los individuos a losque se les realizan las pruebas serológicas.

9.1. PRUEBAS DE DIAGNOSTICOLos resultados de estas pruebas deberánexpresar con claridad si el suero es positivoo reactivo para Ac VIH-1 o VIH-2, indicando,en los casos en que se utilice una pruebarápida (latéx aglutinación, dot-blot, etc.), lanaturaleza de la misma. Asimismo, laexpresión en unidades arbitrarias o enunidades de valor de corte añadida a laexpresión cualitativa en las técnicas de EIA,indican una mayor o menor reactividad de lamuestra con respecto al valor de corteobtenido y no una expresión numérica de lacantidad de anticuerpos presentes en elsuero. En los resultados positivos y en losdébilmente reactivos se indicará lanecesidad de confirmar dicha reactividad.En los casos en que el laboratorio no realicepruebas confirmatorias adicionales, deberáindicarse la necesidad de confirmar elresultado de la prueba de cribadomediante otras técnicas.

9.2. PRUEBAS DE CONFIRMACIONLos resultados de estas pruebas expresarande forma inequívoca si el sujeto es positivoo negativo para Ac VIH. En los casos desueros con resultados no interpretables oindeterminados en estas pruebas, seexpresará claramente que la presencia deAc VIH no ha sido confirmada,recomendándose en dichos casos unseguimiento serológico y remisión denuevas muestras para confirmación porotras técnicas, esto es de especialaplicación para los resultados ilegibles en laconfirmación por IFI. En los casos de WBindeterminados deberán expresarse lasreactividades observadas con objeto depoder interpretar correctamente elseguimiento.

9.3. MARCADORES ESPECIFICOS DE VIHLos resultados de las pruebas de Ag p24deberían expresarse como positivas yconfirmadas por bloqueo. Es deseable la

semi-cuantificación y su expresión en elinforme, dados los fines para los que estándestinadas.En los casos en los que dicha se solicitecomo ayuda en el diagnóstico precoz dela infección VIH en indiviudosseronegativos o con WB indeterminadosdeberá indicarse la necesidad de realizarpruebas de anticuerpos seriadas parallegar al diagnóstico serológicodefinitivo.Las pruebas de Ac p24 deberían expresarsede forma semi-cuantitativa (título, unidades,etc.) para poder ser objeto de seguimiento.

10. ESTRATEGIAS EN ELDIAGNOSTICO SEROLOGICO DE LAINFECCION VIH:10.1. PRINCIPIOS GENERALESEn la actualidad, existen diferentes tipos detécnicas de detección de anticuerposespecíficos VIH. La selección de la técnica ocombinación de técnicas más apropiadadependerá de: a) objetivo de la prueba; b)sensibilidad y especificidad de las técnicas autilizar y c) la prevalencia de la infecciónVIH en la población estudiada.Objetivos de la Determinación deAnticuerpos VIHLa determinación de anticuerpos VIH serealiza con cuatro objetivos fundamentales:a) Cribado de los donantes de sangre,órganos, semen y óvulos.b) diagnóstico de la infección VIH.c) vigilancia seroepidemiológica de lainfección VIHd) investigación.Sensibilidad y Especificidad delDiagnósticoLas técnicas de detección de anticuerposcon un elevado nivel de sensibilidad son lastécnicas de elección en el cribado dedonantes de sangre, óganos, semen yóvulos. Aquellas técnicas con un elevadonivel de especificidad serán las técnicas deelección en el diagnóstico de la infecciónVIH.Valores Predictivos del DiagnósticoLa probabilidad de que una técnica dedetección de anticuerpos VIH determine concerteza el verdadero estado de infección deun individuo, varía de acuerdo con a laprevalencia de infección VIH en la poblaciónde estudiada. Así, a mayor prevalencia deinfección mayor probabilidad de que unresultado positivo signifique que el pacientese halla realmente infectado, es decir, latécnica poseerá un elevado valor predictivo

positivo (VPP). Sin embargo, poseerá unvalor predictivo negativo (VPN) menor.Estrategias en la Determinación deAnticuerpos VIHEn la actualidad, la O.M.S., recomienda tresestrategias que confieren un máximo deexactitud por un coste mínimo (tabla 9). Laestrategía más apropiada, a cada situación,dependerá del objetivo de la prueba y de laprevalencia de infección VIH en lapoblación.Estrategia I: determinación de anticuerposmediante un único EIA o una técnicarápida/sencilla.Estrategia II: todas las muestras reactivasen una primera técnica, son realizadas denuevo en una segunda técnica de principioo preparación antigénica diferentes. En casode falta de reactividad del suero en lasegunda técnica el resultado se consideraránegativo.Estrategia III: todas las muestras reactivasen la segunda técnica de la estrategía II,son ensayadas de nuevo con una terceratécnica diferente a las anteriores. En casode falta de reactividad del suero en latercera técnica es obligado realizar unwestern blot.En las estrategias II y III, la prueba utilizadaen primer lugar debe poseer la máximasensibilidad y la utilizada en segundo lugardebe poseer la mayor especificidad.

10.2. ESTRATEGIA EN LA DONACION DESANGRE/ORGANOSCon el objetivo de disminuir al máximo elriesgo de transmisión de la infección VIHmediante sangre transfundida,hemoderivados, semen, óvulos u órganoscontaminados, desde 1987 es obligatoria ladetección de anticuerpos VIH en todas lasunidades a transfundir y en suero dedonantes de semen, óvulos u órganos. Estoha obligado a que los Bancos de Sangreincluyan protocolos de cribado para localizary desechar las unidades presumiblementecontaminadas.La técnica de cribado indicada es aquellaque presenta la máxima sensibilidad y tengaposibilidades de automatización con lafinalidad de obtener resultadosreproducibles de forma rápida y procesar ungran número de muestras al mismo tiempo.Actualmente, son las técnicas deenzimoinmunoanalisis (EIA) de 2ª y 3ªgeneración que incorporan antígenos deVIH-l y VIH-2 las que cumplen estosrequisitos de forma más satisfactoria.Aunque en sentido estricto los Bancos deSangre realizan sus competencias

localizando y desechando aquellasunidades con pruebas de cribadoclaramente positivas o con valores próximosal punto de corte de la prueba (zona gris)(figura 1), su intervención debe comprender,además, los aspectos siguientes: a) envióde la muestra para confirmación deldiagnóstico y b) localización del donante,explicación de la anormalidad analítica yderivación a la consulta correspondiente.Mención especial merece la detección depatrones serológicos con EIA positivo/zonagris/negativo (según el reactivo utilizado) ywestern-blot con patrón indeterminado enpoblación sin antecedentes de exposición aVIH. Estudios de seguimiento de hasta 5años y de investigación de presencia delvirus (detección de ácidos nucleicos,aislamiento) indican que no existe relaciónentre este patrón y la infección VIH, enausencia de antecedentes de riesgo. Sinembargo, en esta situación, la obligación esdesechar la bolsa de sangre y lasrecomendaciones más aceptadas son: a)explicar al donante el hallazgo analítico; b)derivación a consulta donde puedarealizarse una historia clínico-epiderniológica, exploración, seguimientoserológico con muestras analizadas enparalelo a los 3 y 6 meses y explicación delcuadro analítico y consejo y c) en caso depatrón indeterminado mantenido en elwestern-blot, parece oportuno que lapersona deje de ser donante de sangre.

10.3. ESTRATEGIA EN EL DIAGNOSTICODE LA INFECCION VIHEn la actualidad, prevalece la hipótesis deque el VIH, desde el momento en quepenetra en el organismo humano, proliferade una forma continua, aunque avelocidades diferentes según el estadíoevolutivo de la infección. Se distinguen tresfases: a) primoinfección; b) asintomática, devarios años de duración, y c) sintomática,que clínicamente se corresponde con elcomplejo relacionado o el SIDA.Primoinfección VIHUna vez el VIH penetra en el organismohumano, por los mecanismos detransmisión actualmente reconocidos, iniciauna replicación activa a consecuencia de lacual se desarrolla el cuadro clínico de laprimoinfección, que suele ser asintomática obien su sintomatología es tan leve que suelepasar desapercibida. No obstante, tambiénpuede manifestarse como un síndromemononucleósico asociado o no a unameningitis o meningoencefalitis aguda osubaguda de tipo linfocitario, o una

neuropatía central o periférica o unadepresión transitoria de la inmunidadcelular. Las técnicas de PCR cualitativapueden detectar en esta fase al VIH. Sucuantificación durante este momento de lainfección permite valorar la evoluciónposterior de la misma. Durante esta fase yno antes de las 3-6 semanas después delcontagio ("período ventana"), la infecciónpuede ponerse de manifiestoserológicamente mediante la detección delos antígenos del virus, concretamente delantígeno p24 libre, por técnicas deenzimoinmunoanálisis (EIA). La aparición deanticuerpos suele acontecer alrededor delos 2-4 meses después de la exposición alvirus, y salvo en raras ocasiones, persistirándurante toda la vida. A medida que aumentael título de anticuerpos específicos frente alas proteínas de envoltura y de core, seproduce una disminución paulatina de laconcentración sérica de antígeno p24 librehasta su total negativización en las técnicasde EIA, pero con frecuencia en los niños yocasionalmente en los adultos coexistentítulos altos de antígeno y de anticuerpo.La estrategia diagnóstica ante la sospechade primoinfección VIH incluiránecesariamente la detección de anticuerpostotales y antígeno p24 libre en sangre conlas siguientes consideraciones:1) Un resultado negativo frente a los dosmarcadores citados de infección VIH puedeser debido a: a) la ausencia de infección ob) el paciente está en el "periodo ventana".En ambas situaciones se procederá a larealización de determinaciones seriadas deanticuerpos y de antígeno a las 2 y 4semanas y a los 3 y 6 meses para confirmarla ausencia o presencia de infección VIH.2) Un resultado de anticuerpos negativo conpresencia de antígeno p24 libre en sangre,es indicativo de infección reciente,probablemente durante las 8 semanasanteriores. Se procederá a realizardeterminaciones seríadas de anticuerpos yantígeno siguiendo la pauta indicada en elpunto anterior.3)Un resultado de anticuerpo positivo conausencia de antígeno libre circulante, esdiagnóstico de infección VIH completamenteestablecida.Fase Asintomática de la Infección VIHEsta fase se caracteriza por la presencia deanticuerpos y ausencia de antígeno p24libre, o presencia intermitente, nomantenida, de dicho Ag. Esta fase puededurar años manteniendo dicho perfil sérico.Los diferentes estudios de seguimientolongitudinal de pacientes infectados indican

que la probabilidad de que la infecciónprogrese hacia estadíos más avanzados esbaja en los primeros estadíos másavanzados es baja en los primeros 2-4 añosde infección y aumenta considerablementea partir de los 5 años, siendo de casi el 60%a los 10 años de haberse producido lainfección y sin que, aparentemente, parezcahaber diferencias importantes entre losdistintos subgrupos importantes afectados.Los niveles de antígeno y anticuerposvarían enormemente entre individuos. Si elmédico que sigue a un paciente infectadopor VIH decide emplear marcadores séricosespecíficos víricos, debe conocer que sonnecesarios los test seriados paraconfirmar una tendencia.Así, lospacientes, en esta fase de la infección porVIH, deben monitorizarse para detectarcambios en el perfil serológico y establecerun pronóstico de evolución de la infección.Un descenso en el título de anticuerpos anti-p24 y/o la positivación del antígeno p24 libreen, por lo menos, dos muestrasconsecutivas, son un indicador deprogresión de la infección.En el momento actual no existe unarecomendación de amplio concenso sobrela cronología de detección de estosmarcadores en la fase asintomática, por ellosu determinación debe ser realizada en elcontexto clínico individualizado teniendo encuenta otros parámetros clínicos.Fase Sintomática de la infección VIHEsta fase se inicia a consecuencia de unaumento de la actividad replicativa del virusy se carazteriza por la positividad mantenidadel antígeno p24 libre por técnicas de EIA,asociada, en un 60-70% de los casos, a undescenso en los niveles de anticuerpos anti-p24 manteniéndose positivos losanticuerpos frente a las proteínas deenvoltura, y con una importante disminuciónde los linfocitos CD4(+).Clínicamente se manifiesta por la apariciónde una grave alteración del estado general,infecciones oportunistas, ciertos tipos deneoplasias o de trastornos neurológicos,cuyo grado de evolución se clasifíca segúnlos criterios de la O.M.S. (tabla 2 y 2 bis). Elpronóstico vital a partir de este momento,aún con tratamiento específico antivírico es,en las mejores estimaciones, del 50-75% alos 365 días. La edad, el sexo, la actividadde riesgo a través de la cual se adquirió lainfección y la forma de presentación (reflejoindirecto del grado de inmunosupresión)influyen en el pronóstico.Monitorización de Tratamiento Anti-retroviral

Los pacientes en tratamiento anti-retroviral,presentan disminuciones de los niveles ensuero del antígeno p24 libreestadísticamente significativos. El uso dePCR cuantitativa es en la actualidad elmétodo recomendado para la monitorizaciónde tratamiento antirretroviral. En Enero de1997 la secretaría del Plan Nacional sobreel SIDA elaboró unas directrices que serecogen a continuación y en las tablas 10 y11.

FRECUENCIA DE REALIZACIÓN DE LACARGA VÍRICA.Obtención de la muestra vasal enpacientes sin tratamiento antirretrovíricoprevio:Es muy recomendable realizar dosdeterminaciones vasales separadas por 2 a4 semanas, en ausencia de procesosinfecciosos, vacunaciones o patologíaintercurrente. Dado que las técnicas soncomplejas y la posible sobrecarga de loslaboratorios con esta determinación, podríaplantearse la alternativa de una muestravasal única, al menos en las etapas inicialesde su introducción.Monitorización en los pacientes sinindicación de tratamiento antirretrovírico:Si un paciente no es tratado conantirretrovíricos, sería recomendable sumonitorización con carga vírica cada 4 ó 6meses (simultáneamente con recuento delinfocítos CD4), a menos que presente algúndato clínico de progresión de enfermedad.Monitorización en los pacientes que haniniciado recientemente tratamientoantirretrovírico:Si se dispone de muestra vasal previa altratamiento y el paciente ha comenzado conantirretrovírico, tal como se recoge en elDocumento del Consejo Asesor Clínico(C.A.C.) en su 3ª edición de noviembre de1.996, se recomienda una determinación alos 2 meses cuando la pauta es de dosanálogos de nucleosidos, y a los 3 ó 4meses si la combinación incluye un inhibidorde proteasa. Tal como se especifíca endicho documento, esta determinación puederealizarse a los tres meses,independientemente de la pauta utilizada, siello facilita el seguimiento periódico de lospacientes.Monitorización de los pacientes entratamiento prolongado conantirretrovíricos:En un paciente tratado con antirretrovíricosde forma estable se recomienda unadeterminación de carga vírica cada cuatromeses, a menos que presente algún dato

clínico de progresión. Si en un paciente serealiza un cambio terapéutico en función desus datos clínicos inmunológicos ovirológicos, tal como se especifíca en elapartado nº 4 y en el documento del C.A.Cantes citado, se recomienda unadeterminación previa de carga vírica, a losdos meses cuando la pauta es de dosanálogos de nucleósidos, y a los 3 ó 4meses si la combinación incluye un inhibidorde proteasa. Tal como se refierepreviamente puede realizarse de una formauniforme a los 3 meses,independientemente de la pauta utilizada, siello facilita el seguimiento periódico de lospacientes.

10.4. ESTRATEGIAS EN SITUACIONESESPECIALESEmbarazoLa transmisión vertical de la infección VIHes la responsable de más del 80% de loscasos de SIDA en niños menores de 1 añode edad.El número creciente de mujeres infectadasque se hallan en edad fértil, conjuntamentecon el importante aumento porcentual de lainfección VIH por transmisión heterosexual,ha supuesto un importante incremento delSIDA en la poblacion infantil. Actualmente laprobabilidad de transmisión vertical del VIH,a partir de una madre seropositiva, es del13-20% en los países europeos.La determinación de anticuerpos VIH en lasmujeres embarazadas se justifica por : a)posibilidad de interrupción del embarazo; b)modificación de la conducta obstétricadurante el parto, para evitar al máximo elriesgo de transmisión perinatal y c) medidasde atención al recién nacido.La recomendación mas ampliamenteaceptada es realizar determinación deanticuerpos VIH en la mujer gestantecuando existan prácticas de riesgo. Sinembargo, los datos recientes demuestranque la identificación de la embarazada conprácticas de riesgo, presentes o pasadas,puede fallar, bien porque ésta no seidentifica como adicta a drogas por víaparenteral o no es consciente del riesgo dela transmisión heterosexual por contactossexuales previos con individuosseropositivos. En este sentido, estudiosrecientes demuestran, que hasta un 25% delas mujeres embarazadas VIH(+),desconocían haber estado expuestas a unriesgo de infección VIH. por ello, puede serconveniente ofrecer esta prueba en elcontrol serológico de la gestación. Esimportante que esta oferta se acompañe del

consentimiento informado de laembarazada y de una adecuada informaciónsobre la transmisión del virus. Laimplantación definitiva de este cribadoserológico en un Area de Salud debieraprecederse de un estudio tipo de pruebaanónima no relacionada u otro que informede la seroprevalencía existente,ya que enmuchas zonas de nuestro país talimplantación no va a ser, probablemente,necesaría.Unicamente en aquellas mujeresseronegativas que presenten prácticas deriesgo persistentes se repetiráperiódicamente la determinación, teniendosiempre en cuenta que se ha descritotransmisión en casos que presentabanresultados indeterminados en western blot.La determinación de anticuerpos VIH en lasparejas que acuden a clínicas de esterilidadpara fecundación asistida, se deberárealizar por razones obvias.Recién Nacidos de Madres PortadorasLa terapia anti-retroviral instauradaprecozmente en el tratamiento de lainfección congénita, disminuyo el riesgo deaparición de infecciones oportunistas,incrementando, incluso, la supervivencia delniño infectado. Así, la detección precoz dela infección es especialmente importante Sinembargo, se halla dificultada por: a)presencia de anticuerpos específicos entodos los recién nacidos de madreseropositiva, a consecuencia de unatransferencia pasiva de las IgG anti-VIH dela madre; b) persistencia de los anticuerposmaternos por encima de los 10 meses deedad; c) resultados falsamente negativos,durante los tres primeros meses de vida, encaso de infección perinatal y d) infecciónVIH en ausencia de seroconversión, debidoa una importante hipogammaglobulinemia, aconsecuencia de una disfunción de loslinfocitos B.La estrategia de diagnóstico serológico enlos hijos nacidos de madre seropositivaincluirá necesariamente la detección deanticuerpos totales VIH y antígeno p24 libreen sangre:1) La presencia de infección VIH en elrecién nacido se caracteriza por: a) Lapersistencia de anticuerpos VIH por encimade los 18 meses de edad; b) aparición, ensueros seriados, de nuevas bandas dereactividad en el Western Blot, a pesar deque su valor es inferior al anterior marcador;c) presencia de antígeno p24 libre ensangre. Este marcador de actividadreplicativa del virus, suele asociarse conuna evolución rápida de la infección hacía

estadios sintomáticos. El principal problemaen la determinación de antígeno p24 radicaen que no se positiviza hasta que losanticuerpos anti-p24 del tipo IgG de lamadre disminuyen o desaparecen desangre, como consecuencia de la formaciónde inmunocomplejos antigeno-anticuerpocirculantes no detectados por las técnicasde EIA. En ésta situación el tratamiento delsuero para disociar los inmunocomplejos(acidificación, guanidina, etc.) puede ser degran ayuda y d) La disminución del nivel deanticuerpos anti-p24 seguido de un aumentode éstos, en el transcurso de uno o dosmeses, podrá correlacionarse con la pérdidade anticuerpos maternos y la producciónpropia, de los mismos, por parte del niñoinfectado por vía vertical.Las dificultades derivadas de importanteretraso en el diagnóstico de la infección VIHen los recien nacidos de madre seropositiva(18 meses), hace necesario la utilizaciónfutura de otros marcadores de infección noserológicos, como cultivo o amplificacióngenética (PCR).Accidentes con Riesgo de Exposición aVIH.La infección VIH en el Personal Sanitario,como resultado, aparentemente, de unaccidente percutaneo con jeringuillascontaminadas, o de un contactomucomembranoso con sangre osecreciones contaminadas, ha supuesto unmotivo de preocupación en el Ambitosanitario. El riesgo de infección VIH a partirde un accidente percutaneo es del 0,1-0,7%mientras que a través de una exposiciónmucomembranosa el riesgo no se hayasuficientemente bien determinado, sinembargo, es claramente inferior al anterior.Es necesario, por tanto, la adopción deprotocolos de diagnóstico serológico para elpersonal sanitario con exposición accidentala VIH.Protocolo de Actuación Después de unaExposición Accidental a ProductosBiológicos ProbablementeContaminados:Se podrá considerar como criterio deinclusión en protocolo de seguimiento encaso de accidentes percutáneos omucomembranosos con:-Fuente con infección VIH conocida.-Fuente Conocida VIH(-): En caso de dudarazonable de exposición reciente o pordecisión individual del sanitario accidentado.-Fuente Desconocida con Antecedentes dePrácticas de Riesgo.

-Fuente Desconocida sin Antecedentes dePrácticas de Riesgo: Decisión individual delsanitario accidentado.El protocolo de segumiento serológico delaccidentado incluirá:1º. Determinación de anticuerpos VIH en elmomento del accidente, que en caso de serpositivos son indicadores de infecciónanterior no asociada a la exposiciónaccidental.2º. A las 2 y 6 semanas: Determinación deantígeno-p24, cuya positivización en unindicador de infección. Un resultadonegativo no aporta ninguna información.3º. A los 3 meses: Determinación deanticuerpos específicos, que en el caso deser positivos son indicadores de infección.4º. Si el resultado anterior fuera negativodeberá repetirse la determinación deanticuerpos a los 6 meses.5º. A los 12 meses: Si la determinación deanticuerpos se mantiene negativa puedeasegurarse que no ha habido transmisión deVIH a través de la exposición accidental.Existe controversia sobre la necesidad deuna última determinación a los 18-24 mesesde la exposición.En la Vigilancia de la Infección VIHEn los estudios de seroprevalencia, elmarcador de infección VIH deberá ser ladetección de anticuerpos específicos VIH,cuya determinación se realizará de acuerdocon la prevalencia de infección VIHesperada en la población objeto de estudio(tabla 9).

11. CRITERIOS GENERALES PARALA REALIZACION DE PRUEBAS VIH.La realización de pruebas VIH y lascircunstancias que la rodean, hacennecesario establecer unos criteriosgenerales para su utilización:A)DEL CENTRO SANITARIO1. Consentimiento Informado. Cada CentroSanitario debería disponer de un"Documento de Consentimiento Informado"que deberán firmarlo el médico y elpaciente.2. Confidencialidad. Los resultados deberántransmitirse de forma que no se vulnere elprincipio de confidencialidad.3. Consejo y Educación Sanitaria antes ydespués de la indicación y realización deuna prueba de diagnóstico de la infecciónpor VIH.4. Indicaciones Legales. En la actualidad, larealización de pruebas VIH es obligatoria enla donación de productos biológicos de

origen humano, así como también porindicación judicial en caso de violación.B) DEL LABORATORIO DEMICROBIOLOnGIA CLINICA1. Confidencialidad. Los resultados deberántransmitirse de forma que no se vulnere elprincipio de confidencialidad.2. Normas de Buena Práctica.

12. DISPOSICIONES LEGALESResolución de 6 de septiembre de 1985de la Subsecretaría de Sanidad yConsumo, por la que se declara obligatoriala prueba de detección de anticuerpos frenteal virus asociado a la linfadenopatía/tipo IIIde virus linfotrópico T humano (LAV/HTLV-III) asociado al Síndrome deInmunodeficiencia Adquirida, por lasindustrias fraccionadoras de plasma y losfabricantes e importadores dehemoderivados. (BOE de 10 de Septiembrede 1985).Resolución de 20 de Marzo de 1987 de laSubsecretaría de Sanidad y Consumo,por la que se establece el procedimiento y ladocumentación necesaria para obtenerautorización de los reactivos, para realizarpruebas de detección de marcadores deinfección por virus humanos de la familiaRetroviridae, entre ellos las pruebas deselección de anticuerpos frente a los virusasociados al Síndrome deInmunodeficiencia Adquirida (SIDA) y ladetección de los antígenoscorrespondientes a los mismos. (BOE de 28de Marzo de 1987).Resolución de 11 de Septiembre de 1989de la Subsecretaria de Sanidad yConsumo, por la que se regula larealización de procesos de investigacióncontrolada de reactivos para la detección demarcadores de infección por virus humanosde la familia Retroviridae, entre ellos losasociados al Síndrome deInmunodeficiencia Adquirida (SIDA). (BOEde 16 de Septiembre de 1989).Orden Ministerial de 18 de Febrero de1987 del Ministerio de Sanidad yConsumo, sobre pruebas de detección deVIH en las donaciones de sangre. (BOE de20 de Febrero de 1987).Orden Ministerial de 24 de Junio de 1987del Ministerio de Sanidad y Consumo,sobre pruebas de detección anti-VIH enmateria de obtención, extracción, trasplante,injerto o implantación de órganos humanos.(BOE de 14 de Julio de 1987).Orden Ministerial de 15 de Junio 1988 delMinisterio de Sanitaria y Consumo, para

la coordinación de actuaciones y control delVIH en las intervenciones médicas para laobtención y recepción de semen. (BOE de24 de Junio de 1988).Real Decreto 478/1993 de 2 de Abril por elque se regulan los medicamentos derivadosde la sangre y plasma humano. (BOE de 7de Mayo de 1993).Real Decreto 1854/1993 de 22 de Octubre,por el que se determinan con caráctergeneral los requisitos técnicos y lascondiciones mínimas de la hemodonación ybancos de sangre. (BOE del 20 Noviembrede 1993).

13. BIBLIOGRAFIA SELECCIONADA1.- Brun-Vezinet PC. Methodesdiagnostiques de l'infection par VIH. En:Montaignier L, Rozenbaum W, GluckmanJC, eds. SIDA et infection par VIH. Paris,Flammarion, 1989; 145-157.

2.- Campos JM. Laboratory methods forearly detection of human immunodeficiencyvirus type 1 in newborns and infants. Cli.Microbiol. Rev. 1992; 5:238-247.

3.- Center for Disease Control. Interpretationand use of the Western blot assay forserodiagnosis of human immunodeficiencyvirus type I infections. MMWR 1989; 38:1-74.- Consortium for Retrovirus SerologyStandardization. Serological diagnosis ofhuman immunodeficiency virus infection byWestern blot, JAMA 1988; 260:674-679.

5.- Hammer S, Crumpacker C, D'Aquila R,Jackson B, Lathey S, Livnat D andReichelderfer P. Use of virologic assays fordetection of human immunodeficiency virusin clinical trials: recommendations of theAIDS Clinical Trials Group VirologyCommittee. J.C1in.Microb. 1993; 31:2557-2564.

6.- The European Collaborative Study.Mother to child transmission of HIV infection.Lancet 1988; 3:381-395.

7.- Fahey JL, Taylor J, Detels R, et al. Theprognostic value of cellular and serologicmarkers in infection with humanimmunodeficiency virus type 1. N. Engl. J.Med. 1990; 322:166-172.

8.- Harry DJ, Jennings MB, Yee J, CarlsonJR. Antigen detection for humanimmunodeficiency virus. Clin. Microbiol. Rev.1989; 2:241-249.

9.- Hollinger PB, Bremer JW, Myers LE, etal. Standardization of Sensitive HumanImmunodeficiency Virus CocultureProcedures and Establishment of aMulticenter Quality Assurance Program forthe AIDS Clinical Trials Group. J, Clin.Microbiol. 1992; 30:1787-1794.

10.- Jackson JB, Balfour RH. Practicaldiagnostic testing for humanimmunodeficiency virus. Clin. Microbiol. Rev.1988; 1:124-138.

11.- Jacobson MA, Bachetti P, Kolokathis A,et al. Surrogate markers for survival inpatients with AIDS and AIDS relatedcomplex treated with zidovudine. Br. Med. J.1991; 302:73-78.

12.- Kelinman S, Fitzpatrick L, Secord K etal. Follow-up testing and notification of anti-HIV Western blot atypical (indeterminant)donors.Transfusion 1988; 28:280-282.

13.- Levy JA. Pathogenesis of humanimmunodeficiency virus. Microbiol. Rev.1993; 183- 289.

14.- Nishanian P, Huskins KR, Stehn S, etal. A simple method for improved assaydemonstrates that HIV p24 antigen ispresent as immune complexes in most serafrom HIV-infected individuals. J. Infect. Dis.1990; 163:21-28.

15.- Soriano V. Gutierrez M, Tuset C,Martinez-Zapico R, Ortiz de Lejarazu R,

Aguilera A, Codina G, Gonzalez A, Ulloa F,Leal M, Fernandez JL y Grupo Español parael estudio del VIH-2. Estudio multicéntricode la infección por el virus de lainmunodeficiencia humana tipo 2 (VIH-2) enEspaña (1991). Med.Clin.(Barc) 1993;100:531-535.

16.- Ortiz de Lejarazu R, Eiros JM,Rodriguez-Torres A. Diagnóstico de lainfección por el virus de lainmunodeficiencia humana. Enf. Infec. yMicrobiol. Clin. 1991; 9:Spl.1 18-31.17.- Phair JP, Wonsky S. Diagnosis ofinfection with the human immunodeficiencyvirus. J. Infect. Dis. 1989; 159:320-323.

18.- Pumarola T. El síndrome de laininunodeficiencia humana. En: Prats G. ed.Enfenmedades Infecciosas (MonografíasMedicine). IDEPSA sa, Barcelona 1992; 53-73.

19.- WHO. AIDS. Proposed WHO criteria forinterpreting results from Western blot assaysfor HIV-1, HIV-2 and HTLV-IIHTLV-lI. Wkly.Epidem. Rec. 1990; 65:281-283.

20.- WHO. Global Programme on AIDS.Recommendations for the selection and useof HIV antibody rest. Wkly. Epidem. Rec.1992; 67:145-1 52.

21.- Olajide O. HIV- 1 indeterminateWestern Blot results: Implications fordiagnosis and subject notification.Clin.Microb.Newslet. 1992; 14:121-126

TABLA 1CLASIFICACION DE LOS RETROVIRUS HUMANOS*

FAMILIA RETROVIRIDAEGENERO SUBGENERO/ESPECIEONCOVIRUS DE MAMIFEROSTIPO BONCOVIRUS DE MAMIFEROSTIPO CRETROVIRUS TIPO DRETROVIRUS AVILARES TIPO CVIRUS ESPULMOSOS

GRUPO HTLV-BLV - Virus Linfotrófico de Células T humanas tipo 1 y 2(HTLV1 y 2)

LENTIVIRUS VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA DE PRIMATES- Virus de la Inmunodeficiencia Humana Tipos 1 y 2 (VIH1y 2)- Virus de la Inmunodeficiencia de los Simios (VIS)

*Classification and Nomenclature of Viruses. Fifth Report of the International Committee onTaxocomy Edited by Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. Arch. Virol. Sp1.2.1991

TABLA 2CLASIFICACION DE LA O.M.S. DE LA INFECCION POR VIH EN LOS ADULTOS*

ESTADIO 1Paciente asintomáticoAdenopatías generalizadas persistentesNivel 1: asintomático, actividad normalESTADIO 2Pérdida de peso de menos del 10% del peso habitualManifestaciones cutáneas mínimas (dermatitis seborreica, prurito, onicomicosis, úlceras orales,quielitis angular)Herpes zoster durante los últimos 5 añosInfecciones respiratorias altas recurrentesY/o nivel 2: presencia de síntomas, actividad normalESTADIO 3Pérdida de peso de más del 10% del peso habitualDiarrea crónica no explicada de más de 1 mes de evoluciónFiebre prolongada (constante o intermitente) no explicada de más de 1 mes de evoluciónCandidiasis oral vellosaTuberculosis pulmonar durante el último añoInfecciones bacterianas severasY/o nivel 3: paciente encamado menos del 50% del tiempo el último mesESTADIO 4Pérdida de más del 10% del peso habitual más diarrea crónica (>1 mes) no explicada odebilidad crónica y fiebre crónica (>1 mes) no explicadaNeumonía por P.cariniiToxoplasma cerebralCriptosporidiosis con diarrea de más de 1 mesCriptococosis extrapulmonarEnfermedad por CMV con afectación de otros órganos aparte del hígado, bazo y ganglioslinfáticosInfección mucocutánea por virus del herpes simple de más de 1 mes de duración o visceral decualquier duraciónLeucoencefalopatía multifocal progresivaCualquier micosis endémica diseminadaCandidiasis esofágica, traqueal, bronquial o pulmonarInfección diseminada por micobacterias atípicasSepsis por Salmonella sp. diferente a S. TyphiTuberculosis extrapulmonarLinfomaSarcoma de kaposiEncefalopatía por VIHY/o nivel 4: paciente encamado más del 50% del tiempo el último me

*.- Wky Epidem Rec 1990; 65:221-8

TABLA 2 BISCLASIFICACIÓN DE LA INFECCIÓN POR EL VIH

CD4 CATEGORIA CLÍNICA>= 500/MM³ A1 B1 C1

200-499 mm³ A2 B2 C2<200/mm³ A3 B3 C3

En punteado categorías incluidas en la definición de SIDA.

TABLA 3CARACTERISTICAS DE LAS PRUEBAS PARA DIAGNOSTICO Y CRIBADO DE LA INFECCION VIH

CARACTERISTICAS UTILIDADTIPO DETECNICA ANTIGENO

VIH1-VIH2 PRINCIPIO SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD LECTURASENCILLEZDEEJECUCION

AUTORIZACION

EIA 1ªG Lisado viral Indirecto Buena. Captatodo tipo de Ac +++ Objetiva Media Parcial

EIA 2ª G P.R./P.S. IndirectoCompetitivo Elevada +++ Objetiva Media Total o Parcial

EIA 3ª G P.R./P.S.- Sandwich La más elevada ++++ Objetiva Media Total o Parcial

Diagnóstico y Cribado. Nºmedio alto de muestras

AGLUTINACION Lisado viral.P.R./P.S. Sandwich Elevada ++ Subjetiva Elevada No

Pocas muestras. Pocadotación instrumental.Estudios de prevalencia

EIA DEMEMBRANA P.R./P.S.

Tiras deNitrocelulosa/EIA indirecto

Poco valorada Poco valorada Subjetiva Media No Diagnóstico diferenciaciónentre VIH1 y VIH2

FLUORIMETRICA P.R./P.S. Emisión defluorescencia

No suficientemente valorada

No suficientemente valorada Objetiva Media Total o Parcial Posiblemente similar a EIA

de 2ª y 3ª G

TABLA 4PRUEBAS DE CONFIRMACION SEROLOGICA DE LA INFECCION VIH

CARACTERISTICA WB IFI RIPALectura Subjetiva* Subjetiva SubjetivaAutomatización Parcial No NoDificultad Media Baja AltaSensibilidad +++ ++ ++++Especificidad +++ ++ ++++Rapidez ++ +++ +INDICACIONESWB Confirmación de todo tipo de sueros VIH 1 y VIH 2IFI Confirmación en grupos de alta prevalencia VIH 1

RIPA Confirmación de referencia en nuestras especialmenteproblemáticas. Investigación

TABLA 5BANDAS DE REACTIVIDAD FRENTE A VIH EN LA TECNICA DE WESTERN BLOT

NATURALEZA/DESCRIPCION VIH 1 VIH 2 ASPECTO DE LA BANDA REACTIVAa

gp precursora (env) gp160 gp140 Ancha (3-4 mm). Ligeramente difusagp externa (env) gp120 gp125b Ancha (3-4 mm). Ligeramente difusa

transcriptasa reversa (pol) p66 p68Moderadamente estrecha (1-2 mm). Nítidas. Entre la p66 ylas p55 y 51 suelen existir bandas de antígeno de origencelularEstrechas y nítidas

precursora (gag) p55 p56 Estrechas y nítidastranscritasa reversa (pol) p51 p53 Estrechas y nítidasgp transmembrana gp41 gp36 Ancha (5-6 mm). Francamente difusaendonucleasa p32 p34c Ancha (3-4 mm). generalmente nítidaproteína del core(gag) p24 p26 Ancha(4-5 mm). Nítidamatriz (gag) p17 p16 Ancha (4-5 mm). Difusac

matriz (gag) p9 Ancha (3-4 mm). Francamente difusac

a.- Cuando existe reactividad franca.b.- Identificación como gp105 en algunos equipos diagnósticos.c.- Pueden no aparecer en algunos equipos diagnósticos.

TABLA 6PAUTAS DE LECTURA

1º.- Identificación de bandas específicas virales de reactividad.2º.- Valoración de la reactividad de cada banda3º.- Anotación de resultados individualizados por muestra.4º.- Aplicación del criterio de interpretación.5º.- Resultados e informe.

TABLA 7CRITERIOS DE POSITIVIDAD PARA VIH POR LA TECNICA DE WB

CRITERIO REACTIVIDAD FRENTE AL MENOSOrganización Mundial de la Salud (OMS) Dos glucoproteínas cualquiera de: gp160/gp120/gp41Food and Drug Administration (FDA) p24 + p32 + (gp41 o gp120 o gp160)Cruz Roja Americana Una proteína de cada gen estructural (env, gag y pol)Consortium for Retrovirus Serology andStandardization (CRSS)

p24 + (gp41 o gp120 o gp160) ó p32 +(gp41 o gp120 ogp160)

Association of State and Territorial Public HeathLaboratory Directors/Center for Disease Control

p24 + (gp41 o gp120 o gp160) ó gp41 + (gp120 ogp160)

TABLA 8CAUSAS DE REACTIVIDADES ANORMALES* EN EL WB DE VIH1

REACTIVIDAD FRENTE A CAUSAS APUNTADAS Y COMUNICADASp17 - Reacción cruzada frente a antígenos de timo y placentap24 - Reacción precoz en casosde seroconversión

- Reacción homóloga al antígeno gagde VIH 2- Reacción cruzada con otros lentivirus- Reacción abarrante en multíparas

p51-55 - Complejo HLAgp41 estrecha - Actina de la línea celular utilizada para cultivar el virus empleado como Ag

- Reacción homóloga a gp36 de VIH 2- Reacción homóloga a la proteína fusionante de paramyxovirus

gp120/160 - Multímetro de gp41 de VIH 1

* En personas seronegativas a VIH 1

TABLA9RECOMENDACIONES DE LA O.M.S. PARA LA DETERMINACION DE ANTICUERPOS VIH

OBJETIVO PREVALENCIA ESTRATEGIATRANSFUSION/ DONACION TODAS LAS PREVALENCIAS I

CRS/SIDA TODAS LAS PREVALENCIAS IIASINTOMATICO >10% IIDIAGNOSTICO

<10% III>10% ISEROVIGILANCIA <10% II

FIGURA 1ESTRATEGIA DEL DESPISTAJE SEROLOGICO DE LA INFECCIÓN VIH EN LA DONACION

DE SANGRE

TABLA 10CONDICIONES DE CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA

METODOS DE CUANTIFICACIÓN DE CARGA VIRAL DE VIH

PARAMETROS AMPLICOR HIV-1MONITOR

NASBA HIV-1 RNAQT

QUANTIPLEXHIV RNA

AnticoagulanteTiempo máximo de sangresangre completa sinseparar el plasmaTiempo máximo delplasma a Tª (18-20º C)Tiempo máximo delplasma a 4-8º C(frigorífico)Tiempo máximo delplasma a -20ºC(congelador)Tiempo máximo delplasma a -80ºC(criocongelador)Congelar/descongelarplasma almacenadoTransporte delplasma:temper,ambienterefrigerado (8-10ºC)con acum. de fríocongelado (-20ºC)en hielo seco

EDTA, citrado6h

24h

7 días

7 días

7 días

2 veces máximo

nosí

sí

EDTA, citrado, heparina4h

2-4h. sin tampón de lisis24h. en tampón de lisisNo se recomienda sin

tampón de lisis7 días en tampón de lisis

mesesen tampón de lisis

mesesen tampón de lisis

no se recomienda esteproceso

nono

síen tampón de lisis

EDTA4h.

30 min.

30 min.

72 h.

meses

no se recomiendaeste

proceso

nono

sí

TABLA 11CARACTERISTICAS TECNICAS DE LOS METODOS CUANTITATIVOS DE CARGA

VIRAL DE VIH

PARAMETROS AMPLICOR HIV-1MONITOR

NASBA HIV-1 RNAQT

QUANTIPLEXHIV RNA v.2

Método aplicado

Sensibilidad(copias/ml)Rango dinámico delmétodo (copias/ml)Reproductividad*(Coeficiente devariación)intraensayointerenseyointerlaboratoriointerloteDetección de lossubtipos de VIH-1 delgrupo MDetección de VIH-2Detección del VIH-1 grupoOVolumen de plasma

Método de detección

Cálculos de interpretaciónde los resultados

Control de calidadinterno (estándar deRNA)Controles del reactivo

Automatización

RT-PCR

400-200

400-750.000(diluir si>750.000)

3,5-28%9-45%18-43%

(consultar bibliografía)B

no/?no/?

200 µl

colorimétrica(peroxidasa)

lectura a 450 nmcálculo manual

sí(uno por cadadeterminación)

sí(control positivo alto,

positivo bajo, y negativo)no

Amolificación isotérmicadel ARN

4.000 (con 100 µl)400 (con 1 ml)

400-107

<0,3 log<0,15 log<0,3 log<0,15 log

A-H

no/?no/?

100 µl (para 4.000 cp/ml)1 ml (para 400 cp/ml)

electroquimioluminiscencia

(rutenio)lectura y cálculo

controladopor programa informático

(cerrado)***sí

(tres por cadadeterminación)

si(control positivo)

no

Amplificación de señalpor hibridación molecular

500-240

500-800.000(diluir si>800.000)

12-25%**17-39%

(consultar bibliografía)(consultar bibliografía)

A-F

nono/?2 ml

quimioluminiscencia(fosfatasa)

lectura y cálculorealizado

por programa informático(abierto)+

sí(cuatro por cada serie)

sí(contrl positivo alto,

positivo bajo y negativo)no

(*) suministrados por las empresas, para mayor información se recomienda revisar bibliografíaseleccionada;(**) en el método Quantiplex la muestra es analizada por duplicado;(***) cerrado, significaque no es posible acceder al cálculo de los datos;(+) abierto, significa que es accesible el cálculo de losdatos;(?) significa que no hay datos definitivos.