Procedimiento de medida de la concentración de insulina

La insulina se determina mediante radioinmunoensayo (RIA). Se trata de una técnica en la que se utilizan radioisótopos para detectar anticuerpos y antígenos. La técnica se basa en el

establecimiento de enlaces competitivos, es decir, una cantidad fija de antígeno marcado radiactivamente y una cantidad inicialmente indeterminada de antígeno de la muestra (en nuestro

caso la insulina), compiten por un número limitado y constante de sitios de enlace específicos del anticuerpo, (la cantidad de anticuerpo siempre es menor que la de antígeno). De esta

manera los antígenos marcados y los no marcados se enlazan con el anticuerpo y forman complejos que precipitan. Posteriormente los antígenos marcados se separan y se determina la

radiactividad del antígeno que ha quedado enlazado. La proporción de antígeno marcado enlazado es inversamente proporcional a la concentración de antígeno no marcado de la muestra.

Los anticuerpos que se utilizan suelen estar unidos a un soporte sólido como por ejemplo un tubo de plástico, y quedan adsorbidos en un número limitado a la pared del tubo.

Por otra parte el antígeno marcado se ha unido covalentemente con un radioisótopo, (generalmente el 125I, que es el símbolo para designar al isótopo de yodo 125).

Las soluciones que contienen los antígenos marcados y no marcados se introducen en el tubo, y durante el periodo de incubación los antígenos compiten entre sí para enlazarse con los

anticuerpos inmovilizados en la pared. Más tarde el líquido se decanta o se aspira para eliminar el antígeno marcado que ha quedado libre en la solución y seguidamente se cuantifica la

radiactividad del complejo antígeno-anticuerpo enlazado en la pared, mediante un contador gamma.

Al mezclar e introducir en el tubo las soluciones que contienen las dos clases de antígenos, se establece la siguiente reacción:

Ag + Ag* + Ac ⇒ AgAc + Ag*Ac

Fracción libre Fracción enlazada

Donde Ag representa el antígeno sin marcar, Ag* el antígeno marcado y Ac el anticuerpo; (figura 1.11).

La concentración de antígeno marcado y de anticuerpo son, como ya se ha dicho, constantes, por lo tanto la única variable será la concentración de antígeno no marcado.

Consecuentemente, cuanto más antígeno no marcado haya, más enlaces AgAc (no marcados) se formarán y menos complejos Ag*Ac (marcados) conseguirán formarse. Es decir, la cantidad

de Ag*Ac será inversamente proporcional a la cantidad de Ag presente.

Ejemplos del texto del libro:

Figura 1.11 Esquema del enlace competitivo

Formación de cuerpos cetónicos

El acetil-CoA formado en la oxidación de los ácidos grasos tiene como destino entrar en el ciclo de Krebs, pero para ello es necesario que exista un equilibrio en las degradaciones de grasas y de

hidratos de carbono. Para que el acetil-CoA pueda entrar en el ciclo de Krebs dependerá de sí el oxalacetato es asequible para unirse al acetil-CoA y formar citrato. Si la degradación de grasas es

mucho mayor que la degradación de hidratos de carbono, tal como sucede en la diabetes mellitus y en el ayuno prolongado, la concentración de oxalacetato será baja debido a que éste se utiliza para

la formación de glucosa (gluconeogénesis). Por otra parte en la diabetes, los tejidos no pueden utilizar la glucosa como fuente de energía y es por eso que en su lugar utilizarán a las grasas.

De todo ello se deduce que habrá poco oxalacetato y no podrá condensarse con el acetil-CoA, entonces éste se degradará por otra vía formando los llamados cuerpos cetónicos, (figura 2.9).

Los cuerpos cetónicos se forman a partir de dos moléculas de acetil-CoA según el esquema representado en la figura 2.10.

C C C

CH2 CH2

COO COO

H

HO O OCH3 CH3

CH3

CH3

NAD H CO2NADH + H+ + +

D-3-hidroxibutirato Acetoacetato Acetona

Acetoacetato

D-3-hidroxibutirato D-3-hidroxibutirato

Acetoacetato

Acetona

Hepatocito Sangre Tejidos

Figura 2.10

Figura 2.10 Formación de cuerpos cetónicos

F =S⎡⎣ ⎤⎦

S⎡⎣ ⎤⎦+ KM

1V=KM

Vmax

· 1S⎡⎣ ⎤⎦+

1Vmax

Un modo más fácil de calcular la constante de Michaelis es el empleo de la ecuación de Lineweaver-Burk:

que representada gráficamente corresponde a una recta, si se toman en ordenadas los valores de 1/V y en abscisas los valores de 1/[S], (figura 5.3).

Obsérvese que la pendiente de la recta viene dado por el valor KM/Vmáx y la ordenada en el origen por 1/Vmáx , por lo tanto podremos calcular con precisión los valores de KM y de Vmáx ya que resulta

fácil medir la pendiente y la ordenada en el origen de la gráfica. Además puede resultar también útil considerar que la recta corta al eje de abscisas en el punto: (-1/KM , 0) y al eje de ordenadas en el

punto (0, 1/Vmáx).

La proporción de centros activos “ocupados” (F) para una concentración dada de sustrato vendrá dada por el cociente entre la velocidad de reacción y la Vmáx, con ello se obtiene la siguiente

ecuación:

Si se conocen la constante KM y la Vmáx de una pareja enzima-sustrato en unas condiciones fijas de trabajo, podremos calcular la velocidad de reacción para cada concentración de sustrato

(normalmente se expresará en % de Vmáx). Conocer este porcentaje resulta útil para calcular la concentración de sustrato que se deberá emplear en una reacción, que deberá ser por lo general alta.

En otros casos la concentración de sustrato no podrá sobrepasar determinado valor, ya que de lo contrario podría inhibir el proceso reactivo, (en la práctica se suele tomar una velocidad de al

menos un 90% de la Vmáx).

La reacción se puede considerar como independiente de la concentración de sustrato (cinética de orden cero), si la concentración de sustrato equivale al menos a 10 veces la constante KM, es decir:

[S] ≥ 10KM

10

1/Vmáx

-1/KM

3

-2

5

71/V · 10

33

5 7

1/[S] · 10

10

Inhibidor competitivoInhibidor no competitivo Inhibidor sin competenciaFigura 5.3

Figura 5.3 Ecuación de Lineweaver-Burk

Sistema renina-angiotensina-aldosterona. La aldosterona es una hormona mineralcorticoide sintetizada en la corteza de las glándulas suparrenales (ver

capítulo 8), su función es aumentar la absorción de sodio en el túbulo distal con la consecuente absorción de agua. Este mecanismo implica un

intercambio de sodio por iones de potasio e iones de hidrógeno.La secreción de aldosterona depende del sistema renina-angiotensina que se activa por la

acción de las células yuxtaglomerulares situadas en el aparato yuxtaglomerular *(1). Estas células captan la disminución de la concentración de sodio

plasmático (quimiorreceptores) y la disminución de la presión arterial (barorreceptores), así como la actividad del sistema nervioso simpático y producen

la liberación de una sustancia llamada renina *(2) que se encuentra en el riñón. La renina actúa de manera que transforma el angiotensinógeno (proteína

del grupo de las α2-globulinas sintetizada en el hígado) en angiotensina-I (AT-I) (transformación que tiene lugar por la sustracción de 10 aminoàcidos del

angiotensinógeno). El angiotensinógeno-I se transforma en angiotensina-II (AT-II) por la acción de un enzima llamado enzima convertidor de la

angiotensina (ECA) *(3). La angiotensina-II así convertida, (que tiene una acción de unos 2 minutos), actúa promoviendo la liberación de aldosterona en

las glándulas suprarrenales. Además la AT-II también actúa promoviendo la liberación de hormona antidiurética (ADH) (ver capítulo 8) en el sistema

hipotálamo-hipofisario, así como produce una importante vasoconstricción directa. La actividad del enzima convertidor de la angiotensina puede ser

inhibida por unos fármacos llamados inhibidores del enzima convertidor de la angiotensina (IECA) y con ello se corta la producción de AT-II y por lo

tanto de aldosterona con la consecuente disminución de la absorción de sodio y agua haciendo que el volumen plasmático disminuya. Estos fármacos

tienen una aplicación muy eficaz en el tratamiento de la hipertensión arterial puesto que no solo actúan disminuyendo la producción de aldosterona sino

que además la no producción de AT-II hace que tampoco se produzca hormona antidiurética y que tampoco se produzca vasoconstricción. La acción de la

hormona antidiurètica (ADH) llamada también vasopresina, consiste en incrementar la permeabilidad del agua en la parte distal del túbulo contorneado

distal y en el túbulo colector produciendo una orina concentrada.

ECA

AT-IAngiotensinógeno

Renina

AldosteronaADH

AT-II

Vasoconstricción directa

Estimulan

Sistemasimpático

Presión baja enbarorreceptores

+ -Na (Cl ) bajo en mácula densa

2

+

H ONa

Figura 6.3

Figura 6.3 Sistema renina-angiotensina-aldosterona

El método ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) corresponde a una técnica del tipo enzimoinmunoanálisis de fase sólida en donde entran en

juego la formación de complejos inmunes unidos a enzimas capaces de catalizar el paso de un sustrato a producto y que además el anticuerpo se encuentra

adsorbido a una fase sólida como por ejemplo la pared interna de un tubo.

Existen dos clases de técnicas ELISA: la técnica competitiva y la no competitiva.

En el primer caso, el antígeno (sustancia objeto de análisis) compite con un antígeno de igual naturaleza marcado con un enzima, por una cantidad

limitada de anticuerpos específicos que se hallan adsorbidos a la pared de un tubo (de modo análogo a la técnica RIA descrita en el apartado 6 del capítulo

1). Pasado un tiempo de incubación, se eliminan mediante lavado con sustancias eluyentes apropiadas, los antígenos marcados que no han quedado

unidos al anticuerpo y seguidamente se añade un sustrato que el enzima convierte en producto. El producto así obtenido se cuantifica

espectrofotométricamente o fluorimétricamente y se cumple que la actividad enzimática o bien la formación de producto, es inversamente proporcional a

la concentración del antígeno problema de la muestra, (figura 7.6). Se construye una gráfica donde en ordenadas se representan los valores de absorbancia

de un conjunto de soluciones estándar, y en abscisas las concentraciones respectivas de antígeno. También es posible analizar anticuerpos en lugar de

antígenos, en este caso es el anticuerpo problema quien compite con un anticuerpo marcado con enzima, por un número limitado de antígenos

inmovilizados en la pared del tubo.

La técnica ELISA no competitiva se suele denominar también IEMA (ensayo enzimoinmunométrico) o técnica del “sandwich” y son muy utilizados para

detectar antígenos que tienen al menos dos lugares de unión con anticuerpos (dos determinantes antigénicos).

Figura 7.6 ELISA competitivo

Determinación de la gonadotropina coriónica humana

La gonadotropina coriónica humana (HCG) se produce en las células sincitiotrofoblásticas de la placenta y es detectable en la circulación materna a partir de un día después de la

implantación del óvulo. Los niveles de HCG se incrementan rápidamente alcanzando un máximo en los primeros 70-90 días de la gestación, a partir de los cuales se reducen un

poco pero se mantienen perfectamente detectables hasta el final del embarazo.

Existen técnicas ELISA tipo sandwich en fase sólida en las que se observa una coloración de la sustancia final a simple vista. La positividad o negatividad de la prueba se basa en la

comparación del color obtenido a partir de una muestra de orina, con un color de referencia. La sensibilidad de la muestra aumenta con muestras de orina concentrada, hecho que

se consigue con la restricción del consumo de líquidos y obteniendo la muestra en la primera micción de la mañana. La prueba puede dar resultados falsos positivos por la presencia

de proteínas, eritrocitos, leucocitos y bacterias en la muestra, así como por la toma de determinados fármacos

La prueba de la hemaglutinación pasiva determina también la presencia o no de HCG en la muestra, se basa en las propiedades antigénicas de la molécula de HCG derivadas del

hecho que sea una proteína. La técnica utiliza hematíes cargados de HCG que actúa como antígeno, estos hematíes al igual que el suero con anticuerpos anti-HCG (antisuero), se

preparan y comercializan en laboratorios especializados.

El procedimiento consiste en mezclar la muestra de orina con una cantidad determinada de antisuero, añadiéndose después una suspensión de hematíes cargados con HCG. En

ausencia de embarazo, el antisuero neutralizará a los hematíes cargados con HCG y producirá una hemaglutinación. Contrariamente, si en la muestra existe HCG (embarazo), el

antisuero se neutralizará con la HCG presente y no tendrá lugar la hemaglutinación, (figura 8.12).

Para la ejecución de la prueba se utiliza un tubo de cristal o plástico provisto de un pequeño espejo a través del cual se puede observar la ausencia o la presencia de hemaglutinación.

En el caso de hemaglutinación se observará la formación de un anillo de hematíes que se produce en el fondo del tubo al sedimentar los eritrocitos.

Los hematíes son hoy en día sustituidos por partículas de látex cargadas con HCG, y el tubo de vidrio por una lámina donde se deposita una gota de orina y después dos gotas de una

suspensión que contiene látex cargado con HCG. Obsérvese en ambas variantes de la técnica, que una reacción de hemaglutinación positiva significa una prueba de embarazo

negativa y viceversa.

Figura 8.12 Prueba de hemaglutinación pasiva para la detección del embarazo

2)La codeína es:

a)un analgésico y un antiinflamatorio a la vez

b)un AINE

c)un analgésico derivado del opio

d)un analgésico menor

3)Una de las siguientes técnicas es más efectiva para el análisis de los AINE:

a)cromatografía de gas-sólido

b)HPLC

c)cromatografía de capa fina

d)fotometría de llama

4)Una de las siguientes técnicas no se utiliza para la determinación del paracetamol en plasma:

a)cromatografía de gas-líquido

b)HPLC

c)EMIT

d)FP (fluoroinmunoanálisis de polarización)

Un ejemplode preguntas tipo test:

Respuestas correctas: 2d-3b-4a

1)Calcular la concentración del ion bicarbonato y la concentración de dióxido de carbono total, a partir de los datos analíticos siguientes: pH = 7,3 ; pCO2 = 22 mmHg.

2)Calcular el hiato aniónico a partir de los datos siguientes: pH = 7,2 ; pCO2 = 23 torr ; Cloruros: 101 mmol/L ; sodio: 136 mmol/L.

Un ejemplo de problemas para resolver:

HCO3−⎡

⎣⎤⎦=

24 · pCO2

H +⎡⎣

⎤⎦

=24 · 23

63,1= 8,7 mmol/L

HCO3−⎡

⎣⎤⎦=

24 · 2250,1

=10,53 mmol / LH +⎡⎣

⎤⎦= 24 · pCO2

HCO3−⎡

⎣⎤⎦

1) Calculamos primeramente la concentración de hidrogeniones:

[H+] = anti log (-pH) = anti log (-7,3) = 5,01 · 10-8 mol/L

A continuación convertimos este valor en nanomoles/L:

Finalmente aplicamos la fórmula:

Y además: [CO2]total ≈ [HCO3-] = 10,53 mmol/L _______________________________________________________ 2)En primer lugar calculamos la concentración de hidrogeniones: [H+] = anti log (-pH) = anti log (7,2) = 6,31 · 10-8 mol/L ⇒ 63,1 nmol/L Seguidamente aplicamos la fórmula:

Por último calculamos el anion gap: Hiato aniónico = Na+ -(Cl- + HCO3-) = 136 – (101 + 8,7) = 26,3

5,01 · 10−8mol / L · 109nmol1 mol

= 50,1 nmol / L

Resoluciones de los problemas:

CONTENIDOS

Fisiopatología hepática Estudio de la capacidad de síntesis hepática Estudio de la capacidad de eliminación hepática Marcadores séricos de las hepatitis víricas y otros antígenos y anticuerpos Otros indicadores: α-fetoproteína y excreción de bromosulftaleína Patrones de alteración hepática

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Describir la morfología hepática desde los puntos de vista macroscópico y microscópico Enumerar las funciones principales del hígado Definir las maneras de evaluar la capacidad de síntesis hepática Describir el metabolismo de la bilirrubina y de los ácidos biliares Definir las maneras de evaluar la capacidad de eliminación hepática Describir las características patológicas más relevantes de las hepatitis víricas Describir los marcadores séricos de las hepatitis víricas y su utilidad diagnóstica Definir la utilidad de la determinación de la α-fetoproteína y la prueba de la bromosulftaleína Describir los patrones de alteración hepática con relación a las principales patologías

Un ejemplo de contenidos y de objectivos específicos:

CRITERIOS Y ACTIVIDADES DE EVALUACIÓN

Enumerar los compuestos nitrogenados no proteicos Definir la equivalencia entre BUN y concentración sanguínea de urea Definir el origen y el metabolismo de la creatinina y la creatina Describir las finalidades biológicas de la urea, la creatinina, la creatina y el ácido úrico Describir los procedimientos de medición de la urea Describir los procedimientos de medición de la creatinina y la creatina Describir los procedimientos de medición del ácido úrico Describir las patologías asociadas con las concentraciones anormales de los compuestos intermediarios

PROPUESTA DE ACTIVIDAD DE REFUERZO Contestar detalladamente a las siguientes preguntas: ¿Cuál es el órgano por el que se excreta la mayoría de compuestos nitrogenados no proteicos? ¿Cuál es el compuesto que constituye aproximadamente el 50 % de los solutos que contiene la orina normal? ¿Qué significa la palabra azoemia? ¿Cuál es el compuesto intermediario con el que mejor se reproduce el estado del funcionalismo renal? ¿Qué significa la palabra rabdomiolisis?

Un ejemplo de criterios y actividades de evaluación y de refuerzo: