Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular

Dr. Andrés Báez-Astúa, PhD.

Hospital Dr. Rafael A. Calderón Guardia

02 de octubre del 2012

• Introducción

• Genética del Cáncer

• Métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

• Fluorescencia in situ para estudios en cáncer

• Citometría de Flujo

• Cultivo de tumores

• Proyectos de investigación y colaboraciones

CONTENIDO

NIH launches project to map cancer genome

Unlocking cancer genesTCGA – The Cancer Genome Atlas Pilot Launched

Unraveling cancer

Cancer’s Reach

•Men have an almost 1 in 2 lifetime risk of developing cancer.

Source: Cancer Facts & Figures 2004, American Cancer Society

In the United States:

Women have a more than 1 in 3 lifetime risk of developing cancer.

Imagen cortesía de Nature, Feb. 15, 2001

A Defining Moment in the Nation’s “war on cancer” — Unprecedented Potential for

Exponential Progress Toward Personalized Medicine (Molecular Oncology)

ClinicalData

Molecular Data

Data Generation: Unprecedented ScaleData Generation: Unprecedented Scale

Databases (Current and Developing): partial genomes; SNPs; gene expression profiles; gene sequence; chromosome changes; copy number changes; chemical genomic libraries; epigenomics; “signatures”; disease biomarkers; pathologic; imaging – various types; chemical libraries; proteins (mass spec); proteins (chips); biospecimens/biorepositories; patient records; antibodies; pathology; molecular pathology; clinical trials; adverse events; pharmacogenomics; molecular epidemology; ...........

.

• El estudio de cambios moleculares han llevado históricamente a la identificación de oncogenes y supresores tumorales. Clarke MF. Pathol Biol, 2006

• Los tumores se desarrollan por acumulación de alteraciones moleculares y genómicas. Futreal P. Nature Reviews Cancer 2004

• El Proyecto Genoma Humano facilitó el enfoque hacia el estudio de alrededor de 30,000 genes que codifican proteínas. McKusick VA. Annu Rev Genomics Hum Genet, 2005

• Un paso limitante del ritmo de descubrimientos de nuevos oncogenes y genes supresores ha sido la falta de enfoques eficaces para su identificación. Garnis C. Molecular Cancer, 2004

Introducción

Genes de Cáncer

• Afectan positivamente (Oncogenes) o negativamente (Supresores) el crecimiento celular.

• Oncogénesis: el cáncer emerge a través de una serie de alteraciones somáticas en el ADN.

• Consecuencia de errores de replicación del ADN aleatorios, exposición a cancerígenos o por procesos de reparación del ADN defectuosos.

• Asociación familiar de cáncer ocurre en ciertas familias que portan una mutación de línea germinal en un gen de cáncer.

Genómica bioinformática, secuenciación genómica, ingeniería genética, terapia genética, genómica comparada, epigenética

Transcriptómica expresión genética, regulación de mARN

Proteómica separación, identificación, cuantificación, análisis de secuenciación, proteómica estructural, proteómica de interacción, modificación protéica, proteómica celular

Pharmacogenómica correlación de expresión genética o polimorfismos con eficacia y toxicidad de una droga

Aplicación de Bases Moleculares

Objetivo General

Brindar servicio de apoyo a la red oncológica a través

de un centro altamente especializado en técnicas

avanzadas de biología celular y molecular aplicadas a

la prevención, diagnóstico, tratamiento y seguimiento

de personas con riesgo o portadoras de

enfermedades neoplásicas

Beneficios de los Estudios Moleculares en Cáncer

Incrementar la sensibilidad y reproducibilidad diagnóstica

Descubrir pocas células con cambios genéticos para estimular cambios de exposición a factores de riesgo, intervención temprana o quimio-prevención

Identificar moléculas tumorales para dirigir un tratamiento idóneo

Detección de enfermedad residual mínima o recurrente

Distinguir entre metástasis de un tumor o un segundo primario

Conocer mejor la biología de las neoplasias más importantes en nuestro medio

Better targeted diagnosticsBetter targeted diagnostics(In-vitro diagnostics, imaging)(In-vitro diagnostics, imaging)

Look for genetic links to diseaseLook for genetic links to disease

TreatmentTreatment

Monitoring and preventionMonitoring and prevention

Treatment selectionTreatment selection

Treatment monitoringTreatment monitoring(In-vitro diagnostics, imaging)(In-vitro diagnostics, imaging)

treat

detect

track

predict

pinpoint

personalize

Vision: 21st Century Personalized Medicine

Personalized Medicine Is Transforming Discovery/Development/Delivery

Ensayos Basados en PCR

Evaluar pérdida de regulación celular por

• Alteraciones en secuencias

• Metilación de ADN

• Infecciones virales

Genes que controlan división celular, reparación celular, apoptosis y angiogénesis

Ensayos PCR cuantitativa Tiempo Real (Real Time-Polimerase Chain Reaction):

Identificación presuntiva de SNP’s e inestabilidad de microsatélites en cáncer de colon.

Caracterización oncogenes relacionados con cáncer de mama hereditario: BRCA1 y BRCA2.

Alteraciones en oncogenes/genes supresores en cáncer de cérvix (p53, pRb, p16INK4a).

Carcinoma de Colon No-Polipomatoso Hereditario: MLH1, MLH2, MSH6.

Poliposis Familiar Adenomatosa: gen APC.

Expresión de factores biológicos (citocinas, factores de crecimiento, moléculas indicadoras de muerte celular alterada).

Microarreglos (microarrays) de expresión genética

cDNA Arrays: generados por PCROligonucleotide Arrays: proceso fotolitográfico o directamente oligos25% de estudios con microarrays son en cáncerDepende de factores difíciles de controlar

e.g. infiltración estromal y de células inflamatorias ARN de tejido premaligno escaso se puede amplificar en cADN

Metodologías para Análisis Genómico Global Perfil de Expresión

Pollack JR. et al Nature Genetics, 1999.

Modelos de Progresión de Cáncer

Cáncer de mama

Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.

Modelos de Progresión de Cáncer

Cáncer de próstata

Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.

Carcinoma pulmonar de células escamosas (NSCLC)

Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.

Modelos de Progresión de Cáncer

Cáncer colorectal

Inestabilidad microsatélite: genes de reparación

Inestabilidad cromosómica: APC y -catenina

Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.

Modelos de Progresión de Cáncer

EGFR

KRAS

Growth factors

Cell membrane

Monoclonal antibodies

• Cetuximab (Erbitux)• Panitumumab (Vectibix)

Y

Cell proliferation and survival

– Mutations in KRAS leads to resistance to anti-EGFR antibodies due to constantly active KRAS

– KRAS mutations are complex, multiposition mutations

– The most common KRAS activating mutations are found in codons 12, 13 and 61

– The KRAS status of a tumor may be indicative of prognosis and predictive of response to certain drugs

KRAS mutation status

Wild typeKRAS

Codons

GGT GGCTGT AGCCGT CGCAGT TGCGTT GACGCT GTCGAT

12 13CAAAAAGAACGACCACTACACCAT

61

wt

Sequence to analyze: GGT GGC GTA GG

Mutations of importance within codons 12, 13 and 61 of the KRAS gene

Example of analysis of position 2 in codon 12

PyroMark KRAS AssayQuantitive results and sequence information

KRAS silvestre

KRAS Mutante

codon 12

KRAS Resultados cuantitativos einformación de secuencia

Codon 12 mutación: GGT > GAT

Codones

GGT GGCTGT AGCCGT CGCAGT TGCGTT GACGCT GTCGAT

12 13CAAAAAGAACGACCACTACACCAT

61

wt

Sequence to analyze: GGT GGC GTA GG

Mutaciones de importancia en codones 12, 13 y 61 del gen KRAS

Ejemplo de análisis de posición 2 en codon 12

Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)

PCR distrajo la conciencia de otras tecnologías prometedoras como la hibridación in situ

1990’s Técnicas de fluorescencia revolucionan microscopía de luz

Revela info. acerca de cambios cromosómicos e.g. pérdida o ganancia de material genético

Debe ser interpretada en el contexto del ambiente celular y morfológico combinando la info. morfo-histológica y molecular para lograr un Dx

Herramienta esencial para el Dx y manejo de variedad de tumores sólidos y malignidades hematológicas

Visualización microscópica los DNA cromosómicos (hasta 1-2 Kb)

Sonda marcada con un compuesto fluorescente que emite señal

Cada señal corresponde al número presente de genes

Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)

Pheno Path Labs, 2005

VENTAJAS:

Técnica directa es relativamente rápida y sensible

Dirigido a molécula relativamente estable

No requiere cultivo celular

Resultado más fácil de interpretar que cariotipos complejos

Puede combinarse con inmunotinciones

DESVENTAJAS:

Requiere cámara y sistema captura de imágines

Número limitado de sondas comercialmente disponibles

Sólo casos moderadamente o altamente cargados de células anormales

Proporciona información sobre sondas analizadas, no detecta otras aberraciones

Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)

Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)

Estado de Amplificación HER-2 Ca de Mama

Señal naranja: HER2

Señal verde: CEP17

No amplificado

4x

7x

Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)

Estado de Amplificación gen HER-2 Ca de Mama

54%

38%

19%

0%

Vogel C, et al. Proc Am Soc Clin Oncol.2001

Mass R, et al. Proc Am Soc Clin Oncol.2001

Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)

POBLACIÓN FISH-POSITIVA

de pacientes FISH positivos serían negativos por IHC (0/1+)

Falsos negativos privan a un paciente de una terapia potencialmente beneficiosa

EN RESUMEN: FISH en selección de terapia para Ca de mama

POBLACIÓN IHC-POSITIVA

de pacientes IHC-positivos (2/3+) serían negativos por FISH

Falsos positivos conducen a tratamientos médicos costosos de poca efectividad

Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)

Monitoreo Recurrencia Cáncer de Vejiga

Pérdida de p16 es una de las alteraciones más importantes en Ca urotelial (9p21)

Aneuploidía cromosomas 3, 7 y 17

Microscopía de Fluorescencia

• Fluorescencia de Hibridización in situ (FISH)

• Cáncer de mama: HER-2, TOP2A.

• Cáncer de próstata: c-myc.

• Cáncer de pulmón: LSI EGFR, LSI c-myc, CEP 6.

• Adenocarcinoma de colon: Urokinase, c-myc.

• Aplicación general en tumores: p53, p16.

Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)

1960’s Kametsky y colaboradores desarrollan concepto Stanford.

Citometría de Flujo es una técnica usada en sangre, muestras linfoides y tisulares.

Asociación de poblaciones celulares (“sorting”)

Tamaño celular (FSC)

Granularidad celular (SSC)

Emisión de fluorescencia

Medición de ploidía o análisis de ADN

Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)

585 nm

650 nm

530 nm

Delimitación de poblaciones (Gating)

Forward Scatter

Sid

e S

catte

r

Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)

Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)

Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)

PI Fluorescence

DNA Analysis

2N2N 4N4N 4000 200 600 800 1000

Cou

nts

0

75

15

0 2

25

30

0

Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)

PI Fluorescence

0 200 400 600 800 1000

Coun

ts0

75

15

0 2

25 3

00

Aneuploid peakAneuploid peak

DNA index 1.21DNA index 1.21

DNA Analysis

Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)

Aplicaciones rutinarias de citometría.

•Conteo absoluto de células

•Análisis de ADN y ARN

•Análisis de expresión de genes indicadores

•Cuantificación antigénica

•Detección de apoptosis

•Discriminación de células no-viables

•Inmunofenotipeo

•Estudios funcionales de linfocitos

•Medición de proteínas intracelulares

•Medición de calcio intracelular

Citometría de FlujoFluorescence Activated Cell Sorter (FACS)

Cultivo de Tejidos

• Estudios para determinar resistencia a agentes citotóxicos.

• Cultivo de tumores sólidos para estudio de marcadores de sobrevida celular/apoptosis.

• Aislamiento de linfocitos y monocitos para ensayos de citotoxicidad in vitro contra antígenos tumorales (evidenciar presencia de respuesta inmune).

• Preparación de células y cDNA para banco de tumores.

• Manejo estéril general de biopsias.

Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.

Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.