Approccio analitico multi-integrato nella di ti d ll i f i d HPVdiagnostica della infezione da HPV

EVENTI RESIDENZIALI 2015INCONTRI CON IL TERRITORIO. GESTIONE DEL PAZIENTE DAL MEDICO DI

BASE AL RICOVERO IN STRUTTURA SANITARIA

INFEZIONE INFEZIONE DA VIRUS DA VIRUS HPVHPVGraziella Graziella CalugiCalugi

INFEZIONE DA PAPILLOMAVIRUS UMANO (HPV)

L’infezione da HPV è una delle più frequenti infezioni sessualmente trasmesse.

Il virus è causa per lo sviluppo del cancro della cervice uterina.

Il cancro del collo dell’utero è ancora oggi la seconda neoplasia per incidenza e mortalità femminile al mondo.

Lo studio dell’infezione e ruolo patogenetico di HPV è stato importante ai fi i d ll il di fini dello sviluppo di metodi diagnostici e di vaccini necessari per la prevenzione per la prevenzione della neoplasia.

FILOGENESI HPV

Famiglia: Famiglia: Papillomaviridae;

Supergruppi o “generi”: indicati con una lettera indicati con una lettera greca

Gruppi o “specie”: raggruppano tipi distinti raggruppano tipi distinti a livello genomico, ma simili nelle proprietà biologichebiologiche.

Alpha-papillomavirus: tropismo anogenitale, si di ti g i b l distinguono in base al loro potere oncogeno in High Risk (HR) e Low Risk (LR)

De Villier et al. Virology 2004

Risk (LR)

PAPILLOMAVIRUS UMANO (HPV)PAPILLOMAVIRUS UMANO (HPV)

Virus nudi a simmetria icosaedrica di piccole dimensioni (55nm);

2 proteine strutturali:

L1 proteina capsidica maggiore, peso molecolare di 55 kDa; rappresenta l’80% delle proteine capsidichekDa; rappresenta l 80% delle proteine capsidiche

L2 proteina capsidica minore, peso molecolare di 70 kDa; rappresenta il restante 20% delle proteine capsidichecapsidiche

Genoma:

DNA circolare doppio filamento di circa 8000 bp;

8 sequenze geniche: Early (E1, E2, E4, E5, E6, E7) e Late (L1, L2)( , )

LCR (regione non codificante)

Storia Naturale dell’ Infezione da HPV

Ciclo di replicazione e della progressione dell’HPV all’interno dell’epitelio

EZIOPATOGENESI VIRALE

7Woodman et al., Nature Review 7;11‐22, 2007

REPLICAZIONE VIRALE

Inibizione trascrizione di E6/E7 Integrazione

URR E6/E7 E1/E2 E4 E5 L1 L2

Trasformazione eimmortalizzazione

Replicazione DNAFattori cellulari

Infezione

Strato corneo

Caduta delle cellule epiteliali che contengono il virus

DNA viralenel nucleo della cellula infetta come

episoma

Strato corneo

Assemblaggio virale

Cheratinocita basale

Replicazione accelerata di  DNA virale in cellule più differenziate

normale

Strato basale

Episoma

Replicazione Cellulare Apoptosi e Riparazione del danno cellulare

E2F

E2FDanno

E2F

E2FE2F

E2Fgenico

E2F

PRB

E7 E6

PRB P53

9

ONCOGENESI VIRALE

persistent HPV Cell cycle progressionpersistent HPV infection

Cell cycle progression

Promoter p16 IN4aPromoter p16 IN4a

HSIL P16 +

TERMINI CITOLOGICI ED ISTOLOGICI

ASCUS, atypical squamous cells of undetermined significance;ASC H t i l ll f d t i d i ifi t l d H SILASC-H: atypical squamous cells of undetermined significance, cannot esclude H-SILLSIL or HSIL, low- or high-grade squamous intraepithelial lesion.

Schledermann D et al. D. Cyt.2008; 36: 453–459 .

Approccio analitico multi-integrato nella diagnostica della infezione da HPV

Scopo del lavoro Messa a punto di un protocollo analiticomulti-integrato per la caratterizzazione delle infezioni HPV a rischio di progressione

Protocollo analitico multi-integrato

Screening citologico “LBC”

Test immuno-citochimico per P16INK4a

Test molecolare HPV DNA con genotipizzazione

1 campione

Test molecolare HPV DNA con genotipizzazione

Test molecolare HPV RNA

Approccio analitico multi-integrato nella diagnostica della infezione da HPVdella infezione da HPV

• Popolazione studiata= 161 casi

43%

9%

29%

18%

Il sistema ThinPrepIl sistema ThinPrep

Il campione viene processato tramite lo strumento ThinPrep 3000p p pIl sistema separa le cellule da sangue, muco e detriti non diagnosticiRandomizza e risospende le cellule creando un campione rappresentativo

Immuno-citochimica p16INK4aImmuno-citochimica p16INK4a

Dal ThinPrep viene preparato un secondo vetrino.

Il dosaggio della proteina p16 è stato effettuato Il dosaggio della proteina p16 è stato effettuato mediante l’uso del KIT CINtec attraverso l’uso di

anticorpo murino anti-umano, rivelazione cromogena dell’ immuno-complesso e successiva colorazione con dell immuno complesso e successiva colorazione con

ematossilina-eosina

Carcinoma squamoso P16 +

HPV DNAHPV DNA

Estrazione del DNA (1ml)Estrazione del DNA (1ml)

Estrazione su colonne di silice

Amplifica ione End Point o Realtime regione L1Amplificazione End Point o Realtime regione L1

“Primer set” MY09-11, GP5-6+, Beta Globina

HPV DNA

Amplificazione dell’ appropriato target molecolare

T l l DNA i “L ”Target molecolare DNA: geni “Late”in particolare il gene L1

Detection dell’ appropriato target molecolare

Corsa elettroforetica su gel di Agarosio al 2%Corsa elettroforetica su gel di Agarosio al 2%Detection della presenza o assenza del target

+ Polo elettrico -+ Polo elettrico -

Real Time Fluorescent PCR

Corsa elettroforetica capillare della PCR di sequenzaCorsa elettroforetica capillare della PCR di sequenza

Il prodotto di PCR di sequenza migra per elettroforesi capillare su sequenziatore automatico.

Confronto delle Sequenze ottenute con Sequenze Consensus Genotipo Specifiche in NCBI D t b NCBI Database

HPV RNA

• Estrazione RNA (1ml)

Biglie di silice magnetica estrattore semi-automatico mini-Mag, Biomerieux

Amplificazione NucliSENS EasyQ HPV 1.1

Real-time con metodica NASBA, e sonde “scorpions” per trascritti E6-E7 dei virotipi HR 16, 18, 31, 33, 45.

E’ presente anche un controllo interno “Gene U1A”

HPV RNAHPV U1A‐16 HPV 18-31 HPV 45‐33

C‐C‐ C‐

C+ C+ C+

Risultati HPV-DNARisultati HPV-DNA

Risultati p16Risultati p16

Risultati: HPV DNA RNA P16Risultati: HPV DNA-RNA-P16

Necessità del clinicoNecessità del clinico

Di i ‘ i b li i ’ i l i i•Distinguere tra ‘minor abnormalities’ e stati patologici

ASC‐US

LSIL

CIN 2‐3Rischio progressione

25

Uso del test HPV nel follow‐up della paziente trattata per neoplasia 

i l

Uso del test HPV nella gestione del

cervicale

Uso del test HPV nella gestione del Paziente con Pap test anormale 

Uso del test HPV come test di screening del cervico‐carcinoma

Colposcopia

P16 HPV DNAPositivoPositivoH-SIL

ASC-HNegativo Negativo

ASC H

Ripetizione Prelievo

HPV RNA

Negativo Positivo

ASCUSL-SIL

HPV DNAPositivo

L SIL

GenotipoGenotipo

Negativo

Ripetere a 1 annoRipetere a 1 anno ColposcopiaColposcopia

HPV 16, 18, 31, 33, 45

Ripetere a sei mesiRipetere a sei mesi

PositivoNegativo

HPV RNAHPV RNA

Uso del test HPV nella gestione del Paziente con Pap test anormale 

PositivoCitologia negativa HPV DNA HPV RNACitologia negativa HPV DNA HPV RNA

Positivo

P i iPositivo

Ripetere a 6 mesiRipetere a 6 mesiRipetere a 1 annoRipetere a 1 anno

Uso del test HPV come test di screening del cervico‐carcinoma

RingraziamentiRingraziamentiggI Calugi’sCalugi’s

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