UNIVERSIDAD DE LAS AMERICAS

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA DE MEDICINA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA Nro. 8

Fecha: 27 de noviembre del 2015.

Paralelo: MED 403

Tema: Identificación de Bacilos

Gram negativos (Enterobacterias).

Objetivos • Objetivo General:

- Identificar y diferenciar enterobacterias.

• Objetivos Específicos:

- Reconocer las características metabólicas, actividad enzimática y

liberación de productos de desecho en diferentes medios de cultivo.

- Comprender la utilidad de los medios de cultivo diferenciales en la

identificación de bacterias.

- Leer e interpretar los cambios de coloración, turbidez y reacciones

producidas en cada prueba bioquímica.

- Usar tiras de Microgen para identificación de enterobacterias.

Reacciones bioquímicas para

identificación de bacilos gram negativos.

• La mayor parte de las bacterias modifican el medio

ambiente que las rodea al captar sustancias para su

crecimiento y al liberar productos metabólicos como

enzimas, exotoxinas, productos de desecho, etc.

• Las bacterias pueden oxidar diferentes compuestos para

obtener energía. Compuestos orgánicos como:

polisacáridos, hexosas, pentosas,tetrosas, polialcoholes,

ácidos orgánicos, aminoácidos, purinas, pirimidinas

• Cuando hay una oxidación completa de un compuesto

orgánico se llama respiración. Cuando hay una oxidación

incompleta de un compuesto orgánico hay fermentación.

Microbiología Basada en la Experimentación. Gamazo, C., Sánchez, S. y Camacho, A. (2013)

Respiración. • Es la oxidación completa de un compuesto químico orgánico. Cuando hay

reacciones completas en aerobiosis se obtiene el rendimiento energético más

alto (mayor ATP).

• Cada átomo de carbono reducido de un compuesto, es oxidado a CO2, por

ejemplo en la glucólisis, la glucosa es oxidada hasta ácido pirúvico para entrar

en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos para su oxidación completa.

• Luego de la cadena de transporte de electrones, el último aceptor de electrones

es una molécula inorgánica y dependiendo cual es la molécula, la respiración

puede ser:

• Aerobia: cuando es el O2 que se reduce luego a H2O.

• Anaerobia: cuando el aceptor es una molécula diferente del oxígeno como

nitratos que produce nitritos, sulfatos que se reduce a ácido sulfhídrico, CO2

que produce metano

Microbiología Basada en la Experimentación. Gamazo, C., Sánchez, S. y Camacho, A. (2013)

Fermentación.

• Consiste en la oxidación parcial de un compuesto orgánico. No

todos los átomos de carbono de dicho compuesto son oxidados,

dando como resultado un producto intermedio como el pirúvico

que resulta de la glucólisis. Dependiendo de la enzima de la que

disponga la bacteria reducirá el pirúvico a diferentes compuestos.

Si la bacteria lo reduce a láctico, habrá fermentación láctica, si

reducen a etanol, habrá fermentación alcohólica.

• En este caso dependiendo del aceptor orgánico final de

electrones puede reducir el pirúvico a: propiónico, láctico, etanol,

butírico, glicerol, butanol, butanodiol, mezcla de ácidos, etc. Se

trata de productos de desecho que la bacteria debe excretar.

Microbiología Basada en la Experimentación. Gamazo, C., Sánchez, S. y Camacho, A. (2013)

Bacilos Gram Negativos

Prueba de la oxidasa • Fundamento: Detecta la presencia de citocromo en la bacteria. Los citocromos

(proteínas de la cadena de transporte de electrones), son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como ultimo proceso de la cadena respiratoria, transfiere electrones hidrógeno al oxígeno, con la formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en microorganismos aerobios, microaerófilos y anaerobios facultativos.

• Procedimiento:

• Interpretación: azul positivo, rosado negativo.

Colocar en

portaobjetos

fragmento de

tira oxidasa

Colocar la

colonia

sobre el

papel de

oxidasa

Con un asa

o mejor

palillo de

madera

tomar una

colonia

Observar si

hay cambio

de color a

azul.

http://dianayjulian.galeon.com/bioquimicas.htm

Bacilos gram negativos Oxidasa

negativos (Enterobacterias).

Fermentación de Lactosa

SIM

La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias, que degrada el aminoácido triptófano a indol.

Es un medio semisólido destinado a

verificar la movilidad, producción de

indol y de sulfuro de hidrógeno en un

mismo tubo.

Es útil para diferenciar

miembros de la familia

Enterobacteriaceae.

Al añadir al medio SIM el

reactivo de Kovacks o de

Erlich que contiene p-

dimetilaminobenzaldehído,

reacciona tanto con el indol

como con el triptófano

produciendo compuestos de

color rojizo.

Prueba de INDOL: • Fundamento:El indol, es uno de los productos de la degradación metabólicas del

amino acido triptofano. Las bacterias que producen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de Indol, acido piruvico y amoniaco. La prueba del indo esta basada en la formación de un complejo rojo cuando el Indol reacciona con el grupo aldehído p-dimetilaminobenzaldehido. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs. MEDIO DE CULTIVO: agar SIM o caldo triptofano

• Procedimiento: Inocular al medio realizando siembra por picadura hasta la mitad del medio a partir del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37 grados C. al finalizar este periodo añadir 5 gotas del reactivo de Kovacs por la pared del tubo.

• Interpretación: El desarrollo de un color rojo-fucsia en la interfase del reactivo y de los medio segundos después añadir el reactivo de Kovacs indica la presencia de indol y por lo tanto una prueba positiva.

SIM

SH2+ Ind+

Mot+

SH2+ Ind-

Mot-

SH2- Ind+

Mot+ SH2- Ind-

Mot-

Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra.

Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.

Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio

Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.

Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich.

Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Bacilos gram negativos Oxidasa negativos

(Enterobacterias).

Fermentadoras de Lactosa.

Indol positivas:

Escherichia coli

Klepsiella oxytoca

Prueba Citrato

Determinar que una bacteria es capaz de utilizar citrato como única fuente de Carbono Y compuestos amoniales como única fuente de Nitrógeno.

Se cultiva en agar Citrato de simmons. Que contiene Citrato de Sodio y Azul de timol como indicador.

Negativo

E. coli

Positivo

Klepsiella

Enterobacter

Bacilos gram negativos Oxidasa negativos

(Enterobacterias).

Fermentadoras de Lactosa.

Indol negativa:

Enterobacter cloacae

ROJO DE METILO – VOGES PROSKAUER:

• Fundamento: El acido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la fermentación de la glucosa, es metabolizado aún mas a través de cierto numero de vías metabólicas. Una de ellas da como resultado la producción de acetoína (acetil-metil-carbinol) un producto final de reacción neutra. En presencia de oxigeno e KOH al 40%, la acetoína es convertida en diacetilo y el α naftol sirve como catalizador para producir un complejo de color rojo.

• Procedimiento: Se usa el mismo caldo de enriquecimiento para las dos pruebas (2ml), se hace la inoculación del microorganismo, y se lleva a incubar a 35ºC durante como mínimo 24-72hs..

• Luego se lo divide en dos partes, una para la prueba de RM y otra para la de VP. • Rojo de metilo: se agregan 3 gotas del reactivo de metilo, si en la superficie del medio

aparece un color rojo intenso es RM (+) = microorganismos que utilizan la glucosa fermentándola hasta llegar a un pH menor a 4,4.

• VP: Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los reactivos se agreguen en este orden. El tubo se sacude suavemente y luego se deja quieto de 10 a 15 min. La aparición de color rojo = prueba (+) (presencia de acetil-metil-carbinol).

Prueba de RM y VP

Rojo de Metilo

Sembrar en

medio MRVP

Incubar a 35

grados por

24-48 horas

Añadir 5 a 6

gotas de rojo de

metilo

Observar

resultados

inmediatamente

Positivo: Rojo

brillante a pH 4,0 Negativo: Amarillo o

colores intermedios

Enterobacterias (anaerobios facultativos), utilizarán la glucosa en 2 fases:

1. Metabolismo aeróbico (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio

2. Metabolismo anaeróbico (fermentación) que puede ser de 2 tipos dependiendo de los productos finales

obtenidos:

2.1 fermentación ácido-mixta: productos finales son etanol y ácidos orgánicos (fórmico, acético, láctico y

succínico que son detectados añadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de metilo (rojo a pH 4.0).

2.2 fermentación butilén glicólica: productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol,

produciéndose acetoína como intermediario. Si la fermentación que se ha llevado a cabo produce acetoína

puede ser detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que reaccionarán con este compuesto produciendo

rojo característico.

TDA (detección de enzima

triptofano desaminasa) • Producción de ácido indolpirúvico por la enzima

triptófano desaminasa utilizando como sustrato

triptófano dando un color rojo cereza cuando se

añaden iones férricos. Negativo: color pajizo.

Colonia pura

diluida en 3ml.

de solución

salina

Incubar a

35-37

grados por

18-24 horas

Con pipeta

Pasteur añadir

3 a 4 gotas de

colonia en el

pocillo 12

Añadir 1gota de

reactivo TDA y

leer el resultado

luego de 60

segundos

Positivo: Rojo

cereza Negativo: Pajizo

Microgen Sistema de identificación

de bacilos gram

negativos:

enterobacterias y un

extenso rango de bacilos

oxidasa positivos.

Realizando varias

pruebas bioquímicas

simultáneamente.

Método Microgen

Colonia pura

diluir en 3ml. de

solución salina

En los pocillos 1,2 y 3

colocar 3-4 gotas de

aceite mineral, cubrir

con la tira adhesiva

Con pipeta

Pasteur añadir

3 a 4 gotas de

colonia en cada

pocillo

Procedimiento de Inoculación en tiras GN A

Procedimiento de Lectura y Adición de Reactivos

Verificando la

cartilla de

color registrar

los resultados

positivos

En el pocillo 7

añadir 1 gota de

NitratoA y 1 gota

de Nitrato B, luego

de 60 seg. leer y

anotar. Completar

todos los

resultados.

En el pocillo

8 añadir 2

gotas de

reactivo de

Kovac, leer

y anotar

Verificar que la

cepa es

oxidasa

negativa.

Incubar a

35-37

grados por

18-24 horas

En el pocillo 10

añadir 1 gota

de VP I y 1

gota de VP II,

luego de 15

min. leer y

anotar

En el pocillo

12 añadir 1

gota de

reactivo TDA

y leer el

resultado

luego de 60

seg.

Interpretación de resultados Microgen

• Sumar las reacciones positivas de cada triplete que dará

lugar a un solo dígito.

• Con el número de cada triplete conformamos un código

con el que se identifica la bacteria usando un software o

en tablas pre-establecidas.

Prueba TSI ( tres azúcares -hierro)

Es una prueba usada para evidenciar varias características enzimáticas de las bacterias como: la fermentación de la

glucosa, lactosa y sacarosa y la producción de H2S por parte de la

bacteria sumándole producción de gas El medio contiene Glucosa 0.1%,

Lactosa 1%, Sacarosa 1 y peptonas. El indicador es el rojo de fenol.

Prueba TSI ( tres azúcares -hierro)

tomar la colonia

Se realizar

punción y luego

se estría

• Se debe considerar los cambio de color en el pico y en el fondo del tubo.

FENILALANINA

Es un medio para la diferenciación de bacilos entéricos sobre la base de su capacidad para producir ácido fenilpirúvico por desaminación oxidativa.

Este medio se diseñó para diferenciar los miembros de Proteeae de otros miembros de Enterobacteriaceae por la capacidad de los organismos de los géneros de Proteeae para la desaminación de la fenilalanina en ácido fenilpirúvico mediante actividad enzimática

Observar la producción de

color verde (reacción positiva)

en un plazo de 1 – 5 min

Enterobacterias -

UREA: • Fundamento: Sirve para poner de

manifiesto aquellos microorganismo que poseen la enzima ureasa.

• Procedimiento: El medio fraccionado en pico de flauta contiene urea y rojo de fenol como indicador, el color original del medio es amarillo (o sea ácido) La siembra se realiza con ansa de punta tanto en profundidad como en la superficie. Se deja incubar 24 hs a 35º C.

• Interpretación: Si el microorganismo es

productor de ureasa, desdobla la urea produciendo amoníaco, consecuentemente produce alcalinidad que se manifiesta porque el medio toma un color fucsia.

MALONATO:

• Fundamento: El malonato de sodio, es una sal orgánica que es utilizada por las bacterias como única fuente de carbono Si un microorganismo es capaz de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono, al mismo tiempo que utilizar el sulfato de amonio como fuente de nitrógeno, se produce un aumento de la alcalinidad que se debe a la formación de Hidróxido de sodio (NaOH).

• Procedimiento: inocular 1-2 asadas del microorganismo en el Caldo Malonato, incubar a 37º C por 24 horas.

• Interpretación: Ensayo positivo: reacción alcalina (azul). Ensayo negativo: no hay cambio de color (verde). Ensayo negativo: reacción ácida, sólo fermentación de glucosa (amarillo).

comprende cuatro géneros (Klebsiella, Enterobacter, Hafnia y Serratia).

Genero : Klebsiella

• Recibió ese nombre en honor a Edwin Klebs, microbiólogo alemán de

fines del siglo XIX.

• Klebsiella esta compuesta por especies que forman tres grupos

fileticos:

Klebsiella

Grupo I

Grupo II

Grupo III

• K. pneumoniae subespecies pneumoniae, rhinoscleromatis y ozaenae.

• K.granulomatis

• K. ornithinolytica

• K. planticola

• K. trevisanii

• K. terrígena.

• (este grupo es transferido al nuevo genero Raoultella en honor al bacteriólogo frances Didier Raoult).

• K. oxytoca

Las especies de Klebsiella y Raoultella están

ampliamente distribuidas en la naturaleza y en el

tubo digestivo.

Cuando se recuperan colonias

grandes con una consistencia

mucoide en las placas de

aislamiento se debe de

sospechar que es una especie

de Klebsiella.

En agar MacConkey, las

colonias se presentan

grandes, mucoides y rojas, y

el pigmento rojo suele

difundirse en el agar lo que

indica fermentación de

lactosa.

• Las especies de aislamiento clínico

frecuente son Klebsiella pneumoniae

subespecie pneumoniae y K. oxytoca.

Klebsiella pneumoniae subespecie

pneumoniae

Gram negativo

Anaerobio facultativo

Encapsulado

Inmóvil

Fermentación de lactosa

Se encuentra en la flora

normal de la boca, la piel y los

intestinos.

• Puede causar la neumonía enfermedad que causa cambios destructivos a la inflamación y la hemorragia pulmonar humano con la muerte celular (necrosis) que a veces produce, esputo con sangre, mucosa (esputo jalea de grosella).

• Al igual que con muchas bacterias, el tratamiento

recomendado ha cambiado ya que el organismo ha

desarrollado resistencias. A menudo son resistentes a

múltiples antibióticos. La evidencia actual implica un plásmido

como la fuente de los genes de resistencia.

• Resistente a ampicilina, carbenicilina y ticarcilina.

• Debido ala producción de enzimas beta-lactamasas hacen

que sean resistentes a los agentes beta-lactamicos, incluidas

las cefalosporinas de tercera generación.

• Sensible a amoxicilina-clavulánico y fluorquinolona

• PRUEBAS BIOQUIMICAS EN Klebsiella pneumoniae

Indol (-) Lisina (+)

• Voges-Proskauer (+) Arginina (-)

Ureasa (+) Ornitina (-)

fermenta: lactosa

sacarosa, sorbitol

adonitol y arabinosa.

Citrato (+)

Pertenece a la familia Enterobacteriaceae.

Bacilo Gram negativo.

Anaerobio facultativo.

Móvil, no forma esporas.

Fermenta Glucosa y Lactosa.

Catalasa +, Oxidasa -

Habitan normalmente en el intestino grueso,

suelo, agua y materia en descomposición.

http://www.cdc.gov/ecoli/general/index.html

Patogenicidad

Morfología de la Colonia Bacteriana

• Color verde metálico característico de E. coli

• Colonias aisladas, medianas, circulares, convexas, moradas, contorno verde-metálico, bordes redondeados.

http://trinitynews.ie/wp/wp-

content/uploads/2013/10/E-Coli.jpeg

Enterobacter cloacae

Normal en la

microbiota

intestinal, puede

vivir en suelo,

agua, alimentos,

aguas servidas.

Infecciones de tracto urinario y tracto

respiratorio, menos común en

infecciones intra-abdominales.

Infección de tejidos blandos, piel,

endocarditis, meningitis, artritisy

osteomielitis, en personas con sistema

inmune debilitado.

Bacilos gram negativos.

Anaerobios facultativos.

Catalasa positivos.

Mótiles.

Fermentadores de

glucosa con producción

de gas. Urea positiva

(alrededor del 65%).

Lactosa, sucrosa, manitol

y celobiosa positiva.

Voges-Proskauer positiva. citrato

de Simmons positiva. Arginina y

ornitina positiva.

Resistencia natural a: aminopenicilinas

(ampicilina) y a cefalosporinas de

primera generación (cefalexina,

cefazolina) porque produce una

cefalosporinasa cromosomica inducible

http://www.microbiologyinpictures.com/enterobacter%20cloacae.html

http://es.slideshare.net/luzmerymd3/enterobacterias-klebsiella-salmonella-serratia