Preguntas que puedo resolver con una cromatografía: 1- ¿Qué alcoholes y en qué concentraciones puedo encontrar en un vino? 2- ¿Hay residuos de pesticidas en las cáscaras de naranjas? Mancozeb (preventivo); carbendazim (curativo) 5 ppm 3- ¿Qué aminoácidos se acumulan en las hojas de trigo durante la etapa de llenado de granos?

CROMATOGRAFIA

SEPARAR-IDENTIFICAR-CUANTIFICAR

Permite separar analitos muy similares en sus propiedades físicas y químicas.

Enfermedades fúngicas

Necesitamos diferenciar entre etanol y metanol

CONTENIDOS DE LA CLASE I- Cromatografía: presentación general del método analítico y

presentación de términos nuevos propios de las cromatografías. Fase estacionaria, fase móvil y soporte Diferentes formas de clasificar a los métodos cromatográficos II- Cromatografía en columna: formas de realizarla, parámetro que se

mide. III- Cromatografía plana: formas de realizarla, parámetros que se

miden. IV- Cromatógrafos y cromatogramas: Equipos, descripción y análisis

de los gráficos.

Cla

se 1

C

lase

2

Fase estacionaria contenida en un soporte

Inyección de la muestra: punto de siembra

Muestra: dos analitos muy similares que necesito separar

Descripción general de una cromatografía

Fase estacionaria contenido en un soporte

Inyección de la muestra: punto de siembra

Fase móvil: circula atravesando la fase estacionaria y empuja a la muestra

Descripción general de una cromatografía

Fase estacionaria contenida en un soporte

Fase móvil: circula atravesando la fase estacionaria y empuja a la muestra

Descripción general de una cromatografía

FASE ESTACIONARIA (FE): fija en un soporte sólida o líquida gaseosa cuanto más homogénea sea más eficiente será la separación cromatográfica FASE MÓVIL (FM): «empuja» a la muestra a través de la fase estacionaria líquida o gaseosa sólida FM líquido: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA FM gas: CROMATOGRAFÍA GASEOSA la eficiencia de la separación cromatográfica se relaciona con la velocidad de FM SOPORTE: cromatografía plana: vidrio (capa fina); papel cromatografía en columna: vidrio; vidrio con relleno; capilares

1- Toda cromatografía pone en contacto dos fases inmiscibles. 2- La FM «empuja» a los analitos atravesando la FE.

3- Los analitos se desplazan a diferentes velocidades dependiendo de su afinidad por cada fase.

Clasificación de las cromatografías según el estado de agregación de las fases:

Fase móvil Fase estacionaria Cromatografía

Gas Liquida CGL

Sólida CGS

Líquida Liquida CLL

Sólida CSL

Clasificación de las cromatografías según la forma de contacto entre las fases (lo que depende del soporte):

Plana Columna

Placa de vidrio ó papel Wathman N° 1 Vidrio con relleno ó capilar

FM se mueve por acción capilar o por efecto de la gravedad.

FM se mueve por presión o por gravedad

Parámetro que se mide: Rf Parámetro que se mide: tr ó Vr

Lecho abierto Elución

Revelado Detector

Trabajo práctico

Clasificación de las cromatografías según el equilibrio existente entre las fases (mecanismo de separación):

Nombre Algunas características

C. de Adsorción FE sólida y FM líquido / gas Diferencias en la polaridad

C. de Reparto FE líquido y FM líquido / gas Diferencias en la polaridad

C. de intercambio iónico FE resina (sólido) con grupos cargados unidos covalentemente. FM líquido (gas) Reacción entre iones de carga opuesta.

C. de Exclusión molecular FE gel poroso FM líquido ( gas) Tamaños

C. de Afinidad FE especialmente diseñada para atrapar a un soluto en particular. Muy selectiva

Trabajo práctico

Trabajo práctico

Cromatografía de exclusión molecular: separa por tamaño

Moléculas grandes salen primero de la columna: menos retenidas por la fase estacionaria, tr pequeño.

¿Moléculas pequeñas?

Cómo será el tr???????

Frente de la

fase móvil

Línea de

siembra

Fase móvil

(líquido)

Soporte Frente de la

fase móvil

Línea de

siembra

Parámetro

Rf: RELACIÓN DE FRENTES

Rf= distancia recorrida por el analito/distancia

recorrida por la fase móvil

Rfx=dx/dFM

CROMATOGRAFÍA PLANA

REVELADO: permite poner en evidencia donde

quedó cada uno de los analitos separados

C. plana ascendente

Fase estacionaria????

Ejemplos de cromatografía plana

Pigmentos de hojas de espinaca

Pigmentos de cáscara de mandarinas

Control de impurezas

RF como criterio de identificación

Solución X(mm) Y(mm) Rf

Maltosa 20 144 0,1388

Glucosa 30 144 0,2083

Sacarosa 25 144 0,1736

Fructosa 33 144 0,2292

JUGO 20,1;

33,2 144

0,1395;

0,2305

Malt Gluc Sac Fruc JUGO

Placa de vidrio (soporte) con silicagel (FE) FM:butanol-acético-agua Revelado: resorcinol (universal para azúcares)

Línea de siembra

Frente del solvente

Y

X

Trabajo práctico: Cromatografía en papel

El jugo NO tiene glucosa y

sacarosa; posiblemente SI tiene

maltosa y fructosa.

Problema para resolver: La tabla muestra los resultados obtenidos en una cromatografía de papel. Explique el significado de Rf y sus valores extremos. Ordene los analitos de menor a mayor en cuanto a su afinidad por la fase móvil. Justifique.

Analito Rf

Glutamina 0,38

Lisina 0,78

Arginina 0,25

Cuestionario de cromatografía.

https://www.youtube.com/watch?v=WO0OsxaPYs8

Fase estacionaria

Fase móvil

Soporte: columna

muestra(A y B)

Cromatografía en columna

Parámetro en función del tiempo

tr: TIEMPO DE RETENCIÓN

ELUCIÓN

A B

FM= eluyente

Fase estacionaria

Fase móvil

Soporte: columna

muestra(A y B)

Parámetro en función del

volumen de FM que circuló por la

columna

Vr: VOLUMEN DE RETENCIÓN

Cromatografía en columna

ELUCIÓN

A B

FM= eluyente

Cromatografía de intercambio iónico

FE: resina con carga positiva Intercambiadora de aniones

cationes

aniones

FE: resina con carga negativa Intercambiadora de cationes

Trabajo práctico

Fase estacionaria puede ser: Resina con grupos sulfónicos (cargas negativas) Resina con aminas cuaternarias (cargas positivas)

Clase 2 de Cromatografía

CONTENIDOS DE LA CLASE I- Cromatografía: presentación general del método analítico y

presentación de términos nuevos propios de las cromatografías. Fase estacionaria, fase móvil y soporte Diferentes formas de clasificar a los métodos analíticos II- Cromatografía en columna: formas de realizarla, parámetro que se

mide. III- Cromatografía plana: formas de realizarla, parámetros que se

miden. IV- Cromatógrafos y cromatogramas: Equipos, descripción y análisis

de los gráficos.

Cla

se 1

C

lase

2

Fase estacionaria

Fase móvil

Soporte: columna

muestra(A y B)

Parámetro en función del tiempo

que transcurre desde que

inyectamos la muesta hasta que

salen los analitos.

tr: TIEMPO DE RETENCIÓN

Cromatografía en columna

ELUCIÓN

A B

FM= eluyente

Parámetro en función del

volumen de FM que circuló por la

columna.

Vr: VOLUMEN DE RETENCIÓN

Cromatógrafo gaseoso

FM: gas

Tubos de gas y válvulas

reguladoras de presión

Detector de CG: Conductividad térmica FID (detector de ignición a la llama)

Componentes de un cromatógrafo gaseoso

Reservorio de FM (gas)

Cromatógrafo HPLC (cromatografía líquida)

Detectores CL: índice de refracción; espectrofotometría UV-Vis.

Componentes de un HPLC (cromatógrafo líquido de alta resolución)

Reservorio de fase móvil

Ejemplos de cromatogramas registrados en un cromatógrafo

Columna rellena, 10 cm de largo y 0,3 cm diámetro FE: Polímero Acclaim Trinity P2 FM: Acetonitrilo – Buffer pH 4 Temperatura 60° C Caudal: 0,50 mL/min Vol de inyección: 5 µL

Contenido de azúcares en una etapa de la fermentación

Datos del cromatograma:

tr: identifica al analito.

Área bajo el pico: indica la

cantidad de analito.

Ancho de la base: relacionado

con la eficiencia de la

cromatografía.

Análisis de un cromatograma

V´r = Vr-VM (VM volumen muerto de la columna)

tr = tiempo de retención Vr = volumen de retención t´r = tr-tM (tM tiempo muerto de la columna)

Área del triangulo:

base x altura

2

Línea de base: corresponde a la salida de fase móvil sin ningún analito.

Ancho de la base del pico: W

1-

2-

3-

4-

W

Parámetro

cuantitativo Área bajo la curva Parámetro cualitativo

Tiempo de retención

A B

C patrones

muestra desconocida

Señ

al d

e d

etec

tor

Tiempo ó Volumen

Rs = (trB – trA) (WA + WB ) 2

W:ancho del pico Cuanto más ancho es el pico más va a comprometer a la resolución.

RESOLUCIÓN

Rs >1,5 OK

Alta eficiencia

Baja eficiencia

Alta eficiencia

Baja eficiencia

Los picos deben ser agudos, es decir W pequeños

Una baja eficiencia terminará complicando la resolución, es decir los picos no se separan.

Eficiencia de una columna: Teoría de los platos teóricos Según la teoría de los platos teóricos…..la eficiencia de la columna para un determinado analito se relaciona con el número de equilibrios que se pueden establecer dentro de la columna (N).

N: Número de platos teóricos H: Altura equivalente del plato teórico

H = L/N (L es la longitud de la columna)

Eficiencia de la columna N H

Señ

al d

e d

etec

tor

Tiempo (min)

L= 5 cm tr W

Pico 1 5 7,2

Pico 2 12,5 6

L= 10 cm tr W

Paracetamol 2,665 0,34

Ibuprofen 3,673 0,22

1- Calcular la eficiencia de la columna para cada analito (N y H). 2- Calcular la resolución de los picos.

B: difusión longitudinal

¿Qué factores determinan el ancho de los picos? (y por lo tanto la eficiencia de la columna?)

FE: tamaño de partículas y

empaquetamiento

Coeficiente de difusión de los analitos en

ambas fases, por lo tanto de la

TEMPERATURA

VELOCIDAD CON QUE CIRCULA LA FM

C: RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE MASA

FE y FM

Temperatura

VELOCIDAD CON QUE CIRCULA LA FM

¿Qué puedo modificar experimentalmente?

µ

Hmin

µop

difusión en remolino

H

Velocidad con que circula la fasemóvil: µ

Problemas a resolver: 1- En el caso de una cromatografía en columna a) ¿Cuáles son los parámetros que puede obtener de un cromatograma? b) ¿Cómo puedo obtener la eficiencia y la resolución de una columna a partir de

estos datos? c) ¿Cuáles son los factores que pueden modificar la eficiencia de una columna?

Justifique su respuesta.

2- La tabla muestra los resultados obtenidos del cromatograma correspondiente al análisis de ácidos grasos presentes en semillas de maracuyá. Calcule la eficiencia de la cromatografía para cada uno de los analitos obtenidos. Calcule la resolución de la columna para cada par de analitos indicando si han sido resueltos. Indique cuál es el analito con mayor afinidad por la fase estacionaria y cuál es el que tiene mayor afinidad por la fase móvil, justifique su respuesta.

analito tr W

palmítico 13,67 2

esteárico 15,63 3

oleico 15,96 5

linoleico 16 5

linolénico 17,65 9

Bibliografía Química analítica cuantitativa. R.A.Day, JR.A.L. Underwood. 5ta. Edición. Prentice-Hall Hispanoamericana, S.A.1r. Edición 1989. Capítulos 17 y 18. https://www.youtube.com/watch?v=dXR9wcK-LUo High Performance Liquid Chromatography HPLC . Fecha de acceso 16/05/18 https://www.youtube.com/watch?v=e_ZAsfZ1AUo Cromatografía gaseosa en español. Fecha de acceso 16/05/18