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BIENESTAR ANIMAL: IMPLEMENTACIÓN DE LAS 3 Rs EN PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES CON ANIMALES DE INVESTIGACIÓN Inmaculada Noguera Salvá Servei Central de Suport a la Investigació Experimental Universitat de València [email protected]
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BIENESTAR ANIMAL IMPLEMENTACIOacuteN DE LAS 3 Rs EN PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
CON ANIMALES DE INVESTIGACIOacuteN
Inmaculada Noguera SalvaacuteServei Central de Suport a la Investigacioacute Experimental
Universitat de Valegravencia
Inmaculadanoguerauves
iquestCuaacutentos animales se utilizan
httpswwwmapamagobesesganaderiatemasproduccion-y-mercados-ganaderosbienestanimalen-la-investigacioninformes_y_publicacionesaspx
Directiva 201063EU
Informes anuales de la utilizacioacuten de animales en la investigacioacuten y docencia (Espantildea 2017)
bull TOTAL 802976
bull 7362 Roedores
bull 018 perros
bull 41 million cerdos en alimentacioacuten vs 1 investigacioacuten
EEUU
bull 26 million animals in research
bull 95 rodents
bull 9000 million food chickens
bull 150 million cows sheep pig
UKbull 4 million animals used in research bull 7 million RIP rodents considered a pest
Informes anuales de la utilizacioacuten de animales en la investigacioacuten y docencia (Espantildea 2017)
bull TOTAL 802976
bull 7362 Roedores
bull 018 perros
bull 41 million cerdos en alimentacioacuten vs 1 investigacioacuten
EEUU
bull 26 million animals in research
bull 95 rodents
bull 9000 million food chickens
bull 150 million cows sheep pig
UKbull 4 million animals used in research bull 7 million RIP rodents considered a pest
Cuaacutentos animales se utilizan a lo largo de la vida
- 4 Terneras- 40 cerdos- 12 corderos- 1000 pollos
- helliphellip
Cuaacutentos animales se utilizan en investigacioacuten
- 2 ratones
- frac12 rata
Hasta que la comunidad cientiacutefica no pueda abarcar totalmente el concepto de transparencia sin temor a una tergiversacioacuten generalizada no podemos esperar que el puacuteblico en general entienda realmente lo que hacemos
LAS 3 Rs
En 1959 Russell y Burch (Reino Unido) escribieron un artiacuteculo en defensa de los animales sentildealando que algunos procedimientos eran inhumanos per se
Estos autores han introducido el Concepto de las 3 R como la guiacutea principal para el uso responsable de animales en experimentos
LAS TRES Rs
- Reemplazar utilizando teacutecnicas alternativas
- Refinar las teacutecnicas experimentales
- Reducir la cantidad de animales
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Un organismo es maacutes que la suma de sus partes
1 REEMPLAZAR
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
iquestCuaacutentos animales se utilizan
httpswwwmapamagobesesganaderiatemasproduccion-y-mercados-ganaderosbienestanimalen-la-investigacioninformes_y_publicacionesaspx
Directiva 201063EU
Informes anuales de la utilizacioacuten de animales en la investigacioacuten y docencia (Espantildea 2017)
bull TOTAL 802976
bull 7362 Roedores
bull 018 perros
bull 41 million cerdos en alimentacioacuten vs 1 investigacioacuten
EEUU
bull 26 million animals in research
bull 95 rodents
bull 9000 million food chickens
bull 150 million cows sheep pig
UKbull 4 million animals used in research bull 7 million RIP rodents considered a pest
Informes anuales de la utilizacioacuten de animales en la investigacioacuten y docencia (Espantildea 2017)
bull TOTAL 802976
bull 7362 Roedores
bull 018 perros
bull 41 million cerdos en alimentacioacuten vs 1 investigacioacuten
EEUU
bull 26 million animals in research
bull 95 rodents
bull 9000 million food chickens
bull 150 million cows sheep pig
UKbull 4 million animals used in research bull 7 million RIP rodents considered a pest
Cuaacutentos animales se utilizan a lo largo de la vida
- 4 Terneras- 40 cerdos- 12 corderos- 1000 pollos
- helliphellip
Cuaacutentos animales se utilizan en investigacioacuten
- 2 ratones
- frac12 rata
Hasta que la comunidad cientiacutefica no pueda abarcar totalmente el concepto de transparencia sin temor a una tergiversacioacuten generalizada no podemos esperar que el puacuteblico en general entienda realmente lo que hacemos
LAS 3 Rs
En 1959 Russell y Burch (Reino Unido) escribieron un artiacuteculo en defensa de los animales sentildealando que algunos procedimientos eran inhumanos per se
Estos autores han introducido el Concepto de las 3 R como la guiacutea principal para el uso responsable de animales en experimentos
LAS TRES Rs
- Reemplazar utilizando teacutecnicas alternativas
- Refinar las teacutecnicas experimentales
- Reducir la cantidad de animales
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Un organismo es maacutes que la suma de sus partes
1 REEMPLAZAR
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Informes anuales de la utilizacioacuten de animales en la investigacioacuten y docencia (Espantildea 2017)
bull TOTAL 802976
bull 7362 Roedores
bull 018 perros
bull 41 million cerdos en alimentacioacuten vs 1 investigacioacuten
EEUU
bull 26 million animals in research
bull 95 rodents
bull 9000 million food chickens
bull 150 million cows sheep pig
UKbull 4 million animals used in research bull 7 million RIP rodents considered a pest
Informes anuales de la utilizacioacuten de animales en la investigacioacuten y docencia (Espantildea 2017)
bull TOTAL 802976
bull 7362 Roedores
bull 018 perros
bull 41 million cerdos en alimentacioacuten vs 1 investigacioacuten
EEUU
bull 26 million animals in research
bull 95 rodents
bull 9000 million food chickens
bull 150 million cows sheep pig
UKbull 4 million animals used in research bull 7 million RIP rodents considered a pest
Cuaacutentos animales se utilizan a lo largo de la vida
- 4 Terneras- 40 cerdos- 12 corderos- 1000 pollos
- helliphellip
Cuaacutentos animales se utilizan en investigacioacuten
- 2 ratones
- frac12 rata
Hasta que la comunidad cientiacutefica no pueda abarcar totalmente el concepto de transparencia sin temor a una tergiversacioacuten generalizada no podemos esperar que el puacuteblico en general entienda realmente lo que hacemos
LAS 3 Rs
En 1959 Russell y Burch (Reino Unido) escribieron un artiacuteculo en defensa de los animales sentildealando que algunos procedimientos eran inhumanos per se
Estos autores han introducido el Concepto de las 3 R como la guiacutea principal para el uso responsable de animales en experimentos
LAS TRES Rs
- Reemplazar utilizando teacutecnicas alternativas
- Refinar las teacutecnicas experimentales
- Reducir la cantidad de animales
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Un organismo es maacutes que la suma de sus partes
1 REEMPLAZAR
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Informes anuales de la utilizacioacuten de animales en la investigacioacuten y docencia (Espantildea 2017)
bull TOTAL 802976
bull 7362 Roedores
bull 018 perros
bull 41 million cerdos en alimentacioacuten vs 1 investigacioacuten
EEUU
bull 26 million animals in research
bull 95 rodents
bull 9000 million food chickens
bull 150 million cows sheep pig
UKbull 4 million animals used in research bull 7 million RIP rodents considered a pest
Cuaacutentos animales se utilizan a lo largo de la vida
- 4 Terneras- 40 cerdos- 12 corderos- 1000 pollos
- helliphellip
Cuaacutentos animales se utilizan en investigacioacuten
- 2 ratones
- frac12 rata
Hasta que la comunidad cientiacutefica no pueda abarcar totalmente el concepto de transparencia sin temor a una tergiversacioacuten generalizada no podemos esperar que el puacuteblico en general entienda realmente lo que hacemos
LAS 3 Rs
En 1959 Russell y Burch (Reino Unido) escribieron un artiacuteculo en defensa de los animales sentildealando que algunos procedimientos eran inhumanos per se
Estos autores han introducido el Concepto de las 3 R como la guiacutea principal para el uso responsable de animales en experimentos
LAS TRES Rs
- Reemplazar utilizando teacutecnicas alternativas
- Refinar las teacutecnicas experimentales
- Reducir la cantidad de animales
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Un organismo es maacutes que la suma de sus partes
1 REEMPLAZAR
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Cuaacutentos animales se utilizan a lo largo de la vida
- 4 Terneras- 40 cerdos- 12 corderos- 1000 pollos
- helliphellip
Cuaacutentos animales se utilizan en investigacioacuten
- 2 ratones
- frac12 rata
Hasta que la comunidad cientiacutefica no pueda abarcar totalmente el concepto de transparencia sin temor a una tergiversacioacuten generalizada no podemos esperar que el puacuteblico en general entienda realmente lo que hacemos
LAS 3 Rs
En 1959 Russell y Burch (Reino Unido) escribieron un artiacuteculo en defensa de los animales sentildealando que algunos procedimientos eran inhumanos per se
Estos autores han introducido el Concepto de las 3 R como la guiacutea principal para el uso responsable de animales en experimentos
LAS TRES Rs
- Reemplazar utilizando teacutecnicas alternativas
- Refinar las teacutecnicas experimentales
- Reducir la cantidad de animales
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Un organismo es maacutes que la suma de sus partes
1 REEMPLAZAR
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Cuaacutentos animales se utilizan en investigacioacuten
- 2 ratones
- frac12 rata
Hasta que la comunidad cientiacutefica no pueda abarcar totalmente el concepto de transparencia sin temor a una tergiversacioacuten generalizada no podemos esperar que el puacuteblico en general entienda realmente lo que hacemos
LAS 3 Rs
En 1959 Russell y Burch (Reino Unido) escribieron un artiacuteculo en defensa de los animales sentildealando que algunos procedimientos eran inhumanos per se
Estos autores han introducido el Concepto de las 3 R como la guiacutea principal para el uso responsable de animales en experimentos
LAS TRES Rs
- Reemplazar utilizando teacutecnicas alternativas
- Refinar las teacutecnicas experimentales
- Reducir la cantidad de animales
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Un organismo es maacutes que la suma de sus partes
1 REEMPLAZAR
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Hasta que la comunidad cientiacutefica no pueda abarcar totalmente el concepto de transparencia sin temor a una tergiversacioacuten generalizada no podemos esperar que el puacuteblico en general entienda realmente lo que hacemos
LAS 3 Rs
En 1959 Russell y Burch (Reino Unido) escribieron un artiacuteculo en defensa de los animales sentildealando que algunos procedimientos eran inhumanos per se
Estos autores han introducido el Concepto de las 3 R como la guiacutea principal para el uso responsable de animales en experimentos
LAS TRES Rs
- Reemplazar utilizando teacutecnicas alternativas
- Refinar las teacutecnicas experimentales
- Reducir la cantidad de animales
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Un organismo es maacutes que la suma de sus partes
1 REEMPLAZAR
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
LAS 3 Rs
En 1959 Russell y Burch (Reino Unido) escribieron un artiacuteculo en defensa de los animales sentildealando que algunos procedimientos eran inhumanos per se
Estos autores han introducido el Concepto de las 3 R como la guiacutea principal para el uso responsable de animales en experimentos
LAS TRES Rs
- Reemplazar utilizando teacutecnicas alternativas
- Refinar las teacutecnicas experimentales
- Reducir la cantidad de animales
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Un organismo es maacutes que la suma de sus partes
1 REEMPLAZAR
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
LAS TRES Rs
- Reemplazar utilizando teacutecnicas alternativas
- Refinar las teacutecnicas experimentales
- Reducir la cantidad de animales
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Un organismo es maacutes que la suma de sus partes
1 REEMPLAZAR
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Un organismo es maacutes que la suma de sus partes
1 REEMPLAZAR
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Reemplazo de animales vivos por teacutecnicas in
vitro videos simuladores etc
para obtener el mismo resultado
1 REEMPLAZAR
Un organismo es maacutes que la suma de sus partes
1 REEMPLAZAR
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Un organismo es maacutes que la suma de sus partes
1 REEMPLAZAR
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
httpwwwremanetnet
1 REEMPLAZAR
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
1 REEMPLAZAR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
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iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
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glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
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Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
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Posicioacuten del animal y proteccioacuten
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Posicioacuten del animal y proteccioacuten
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Ex vivo validacioacuten
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IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
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Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
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Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener una informacioacuten determinada en cada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
2 REDUCIR
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
2 REDUCIR
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Utilizar el menor nuacutemero posible de animales para obtener resultados encada procedimiento-Disentildeo y analisis de experimentos-Programas bioestadiacutesticos-Estandarizacioacuten de procedimientos experimentales BPL-Disminuir la variabilidad de los resultados
Condiciones ambientalesCondicion de los animalesControl de la calidad de los alimentos camashellip
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
VENTILATED RACKS
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
1 -ES ENGENDRADO Y PRODUCIDO EN CONDICIONES CONTROLADAS
2 - ES MANTENIDO EN UN ENTORNO CONTROLADO
3 - POSEE CLAROS ANTECEDENTES GENEacuteTICOS Y MICROBIOLOacuteGICOS
4 - POSEE UNA COMPROBACIOacuteN SISTEMAacuteTICA DE ESTOS ANTECEDENTES
Animales con estatus salud y geneacutetico definido
2 REDUCIR
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Utilizacioacuten de animales definidos mantenidos en situaciones definidas y estables
ndash Por la interferencia con los resultados
ndash Para asegurar la fiabilidad de los resultados
ndash Para certificar la calidad de los resultados
2 REDUCIR
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
3 REFINAMIENTO
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Perfeccionar las teacutecnicas experimentales con el fin de mejorar tanto el bienestar de los animales como la calidad de los resultados
- Enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisioloacutegicas y de comportamiento
- Teacutecnicas adecuadas de anestesia y analgesia
3 REFINAMIENTO
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
REFINAR
3 REFINAMIENTO
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
3 REFINAMIENTO
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
1- Resolucioacuten temporal y espacial
2- Profundidad de penetracioacuten3- Tipo de radiacioacuten empleada en la generacioacuten de imagen
(ionozante no ionizante)
4- Disponibilidad de sondas moleculares inyectables yo biocompatibles
5- Liacutemites de deteccioacuten
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Multimodal Rayos X y fluorescencia
Sentildeal bioluminiscente sobre la imagen de rayos X en un modelo de infeccioacuten por biofilm de Xen29
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Reemplazo
Reduccioacuten
Refinamiento
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
IMAGEN OacutePTICA Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
A 525 nm laser
(GFP) no penetra en
los tejidos
B 640 nm laser (RFP F
luc) penetra en los tejidos
Transparencia de los tejidosTeacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
iquestQue imagen oacuteptica proporciona mayor sensibilidad
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica BioluminiscenciaFluorescencia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
glioma
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
COMPARACIOacuteN DOSIS RESPUESTA DE D-Luciferin
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
COMPARACIOacuteN D-Luciferin IP vs IV
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Intensidad brillo ceacutelulas
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Utilizar animales sin pelo blancos o depilados
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Incluir un control animal adecuado
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Anestesia
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Posicioacuten del animal y proteccioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Ex vivo validacioacuten
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Bioluminescence Imaging in Mouse Models Quantifies β Cell Mass in thePancreas and After Islet TransplantationJohn Virostko12 Aramandla Radhika3
Greg Poffenberger3 Zhongyi Chen3
Marcela Brissova3 Joshua Gilchrist3
Brian Coleman3 Maureen Gannon345 E Duco Jansen2 and Alvin C Powers346
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Liacuteneas celulares que expresan de forma constitutiva luciferasa
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
IMAGEN OacutePTICA BIOLUMINISCENCIA
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Se marcan diferentes moleacuteculas con proteiacutenas fluorescentes
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reporters in Animal ModelsTamara Troy Dragana Jekic-McMullen Lidia Sambucetti and Brad RiceMolecular ImagingVol 3 No 1 January 2004 pp 9ndash23
Alfalfa-free rodent food
Regular rodentfood
Autofluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables oacutepticamente invisibles
en el momento de la administracioacuten pero se
activan in vivo mediante proteasas especiacuteficas que
se utilizan como biomarcadores de la enfermedad
Metaloproteasas (metaacutestasis artritis reumatoide
enf cardiovasculares)
Actividad elastasa producida por neutroacutefilos
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
Teacutecnicas imagen no invasivas
Introduccioacuten
Imagen oacuteptica Bioluminiscencia
Fluorescencia
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
diana permitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
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SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas se unen a la moleacutecula
dianapermitiendo la visualizacioacuten una vez
excretado el exceso de reactivo
Fosfatidilserinas de membrana (estadiacuteos tempranos
de apoptosis)
Contra la integrina avb3 (arteriosclerosis y
angiogeacutenesis)
Sonda especiacutefica de cox-2 (sobreexpresada en
liacuteneas tumorales y procesos inflamatorios)
Sondas Vasculares
IMAGEN OacutePTICA FLUORESCENCIA
SONDAS FLUORESCENTES
Sondas activables
Sondas dirigidas
Sondas Vasculares permiten visualizacioacuten
enfermedades vasculares permeabilidad vascular
y angiogeacutenesis
Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
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- Medidas a tomar
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1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
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Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
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y angiogeacutenesis
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En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
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2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
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1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
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1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
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TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
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3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
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Bioluminiscencia vs Fluorescencia
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
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3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
3 REFINAMIENTO
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
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1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
En cuanto a la refinacioacuten de los meacutetodos el documento pone el ejemplo de unasproteiacutenas fluorescentes desarrolladas a partir de lucieacuternagas por investigadores de la Redde Enfermedades Tropicales perteneciente al Instituto de Salud Carlos III en Madrid
Los investigadores han creado una cepa del paraacutesito que
provoca la leishmaniasis con esta proteiacutena fluorescente
Cada antildeo la enfermedad asociada a los perros en los paiacutesesricos mata a unas 30000 personas en los paiacuteses pobresGracias a la proteiacutena los cientiacuteficos pueden ver la evolucioacutende la infeccioacuten con un detector de luz sin necesidad dematar animales constantemente El meacutetodo aseguranreduce hasta un 60 los sacrificios
3 REFINAMIENTO
TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
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TECNICAS PARA REDUCIR EL SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLOS DE SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
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DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
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DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
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1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Tiene como objetivo anticiparse a los posibles problemas de salud y bienestar que puedenderivarse de la realizacioacuten de un procedimiento experimental Por ello no existe unprotocolo de supervisioacuten estaacutendar para todos los procedimientos y debe personalizarse entodos los casosEste protocolo debe definirse cuando se disentildea el estudio teniendo en consideracioacuten losoacuterganos o sistemas que con mayor probabilidad pueden verse afectados debido al tipo deprocedimiento
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
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DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
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TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
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3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
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1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
bull CONSUMO AGUA Y COMIDAbull ASPECTObull COMPORTAMIENTO ESPONTANEObull COMPORTAMIENTO PROVOCADObull SIGNOS CLINICOS
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
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DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
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1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
- Que debemos revisar
- Quien Con que frecuencia
- Medidas a tomar
- Hoja de valoracioacuten (opcional)
- Trabajo conjunto investigadores-teacutecnicos-supervisores de salud y bienestar-CEEA
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
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DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
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GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
Al realizar un protocolo de supervisioacuten debemos pensar en
SUFRIMIENTO RESTRICCIOacuteN DE LA CONDUCTA
DOLOR
ESTRES
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
Las medidas correctivas sugeridas basadas en la puntuacioacuten obtenida para cada animal son las siguientes
0-4 Normal 5-9 Monitorizacioacuten cuidadosa considerar analgesicos10-14 Sufrimiento Analgesicos (eutanasia)15-20 Dolor severo Eutanasia (suprimir procedimiento)
Morton y Griffiths (Vet Rec 116431-436 1985)
Research demonstrates that changes in facial expression provide a means of assessing pain in mice
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
DOLOR PRECAUCIOacuteN
Un procedimiento que nos cause dolor o distres muyprobablemente causara dolor a otros animales
1-Indicadores de dolor
fisioloacutegicos
conductuales
2- Sistemas de evaluacioacuten de dolor
observaciones de conducta indicativas de dolor
escala subjetiva de dolor
3- Tratamiento
PREVENIR SU APARICIOacuteN
DOLOR PRECAUCIOacuteN
TECNICAS PARA REDUCIR SUFRIMIENTO
1- PROTOCOLO SUPERVISIOacuteN
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
peso corporal
httpswwwccaccaDocumentsStandardsGuidelinesAppropriate_endpointpdf
3- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Nota cuando un animal obtiene una puntuacioacuten de 3 en maacutes de un paraacutemetro todos los 3s se convierten en 4s
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Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse Dale J Langford et alNature Methods 7 447-449 (2010)
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2- CRITERIOS DE PUNTO FINALEstablece la desviacioacuten de los paraacutemetros que indica que un animal debe salir
del experimentoIndicador maacutes temprano en un experimento con animales de un nivel de dolor
o distreacutes tal que independientemente de los objetivos cientiacuteficos del estudio debeconsiderarse para evitar o limitar dicho dolor o distreacutes tomando acciones como aliviaral animal de dicho malestar retirarlo del estudio o en uacuteltimo caso sacrificarlohumanitariamente
El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
- La muerte como criterio de punto final
2- CRITERIOS DE PUNTO FINAL
1- El animal no proporciona maacutes informacioacuten uacutetil
2- Sufrimiento mayor al beneficio
3- Sufrimiento demasiado elevado
4- Criterios de punto final ldquosustitutivordquo
1- Paraacutemetros que predicen el final de un experimento
2- Evitan que el animal tenga que llegar a ese estado final
3- Son
signos cliacutenicos
temperatura
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Ejemplos de criterios de punto final
Deterioro condicioacuten corporal
bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
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El objetivo de los criterios de punto final es por tanto limitar el sufrimiento de los animales a lo estrictamente necesario Es moralmente obligatorio buscar indicadores de deterioro del animal para evitar dicho sufrimiento innecesario y por supuesto la muerte
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Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
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Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
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- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
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Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
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Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
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- afirmar que los animales seraacuten sacrificados cuando esteacuten moribundos no es un punto final humanitario adecuado
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Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
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bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
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signos cliacutenicos
temperatura
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bullObjetivo y faacutecil de usar para evaluar el estado de los animales utilizados en investigacioacuten en especial los estudiosdonde los animales pueden experimentar alguacuten grado de debilidad a medida que avanza el estudio
Peacuterdida de peso
bullRaacutepida peacuterdida de peso de 15-20 por ciento en pocos diacuteas Esto requiere el monitoreo frecuente de peso corporalbullPeacuterdida gradual de peso durante un periacuteodo prolongado de tiempo conduce a emaciacioacuten El grado de peacuterdida depeso debe ser especificado en teacuterminos de o de la cantidad (gramos kg etc)
Nota Ciertas condiciones debilitantes tales como el crecimiento de tumores y la ascitis pueden enmascarar lapeacuterdida de peso realLLEVAR CUIDADO CON ANIMALES EN CRECIMIENTO
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
PROTOCOLO DE SUPERVISIOacuteN
wwwccacca
GRACIAS POR SU ATENCIOacuteN
Incapacidad de levantarse o deambularbullSe correlaciona con la incapacidad para acceder a los alimentos o al aguabullEs visualmente evidente objetiva y faacutecil de evaluar
Tamantildeo de tumorbullPor lo general se fijan criterios como la medicioacuten del diaacutemetro de la masa o el procentaje del peso corporaldel animal En el caso de ratones tumor mayor que 15 cm de diaacutemetro o con un peso mayor que el 10 delpeso corporal
Respiracioacuten con dificultadbullEl animal muestra aumento de la frecuencia respiratoria yo del esfuerzo para respirar La dificultad suele iracompantildeada de un fuerte componente abdominal para respirar
DeshidratacioacutenbullLa piel pierde su elasticidad
Tumores ulcerados necroacuteticos o infectadosbullPresencia de grandes heridas abiertas
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