“Bases genéticas de la resistencia bacteriana. Estructura genómica y evolución hacia la extrema resistencia en infecciones

crónicas de P. aeruginosa. ”

IMPaMCONICET-UBA

Instituto de Investigaciones en

Microbiología y Parasitología MédicaCONICET

Curso Precongreso

Congreso de la Sociedad Chilena de Infectología 2015

Daniela CentrónLaboratorio de Investigaciones de Mecanismos de Resistencia a Antibióticos,

IMPAM UBA/CONICET,Facultad de Medicina,

Universidad de Buenos Aires.

Describir las vías moleculares de la evolución hacia la

extrema resistencia antibiótica (XDR) en las

infecciones crónicas de P. aeruginosa.Particularmente:

• Conocer el/los hábitats de P. aeruginosa y las patologías

que puede causar al ser humano.

• Conocer la problemática de la resistencia a antibióticos.

• Describir los mecanismos de mutaciones, ADN móvil y

dinámica poblacional que llevan a la XDR en esta especie.

• Cómo opera el sistema Integrón/Cassettes.

• Cuáles son las características de la adaptación a la

cronicidad en P. aeruginosa.

• Identificar el rol de la Transferencia Horizontal de la

Resistencia Antibiótica en las infecciones crónicas de P.

aeruginosa.

Tópicos de la charla

Descripta por primera vez como Bacillus pyocyaneus en

1882. Es ubicua en la biosfera, puede estar en suelos, H2O

dulce o salada, con predilección por ambientes húmedos.

Coloniza desinfectantes, jabones, colirios, sistemas de

ventilación, equipos de terapia respiratoria......

de vez en cuando migra de su entorno natural

P. aeruginosa y su adaptación a

diferentes nichos ecológicos.

Infección respiratoria crónica en pacientes con patologías de base

(Fibrosis Quística, Bronquiectasias, EPOC).

Produce infecciones en pacientes de la comunidad: enterocolitis necrotizante,

otitis media maligna e infecciones urinarias.

Es uno de los principales patógenos nosocomiales ya que produce neumonía,

sepsis, infección de heridas, infección urinaria…

Resistencia natural de P. aeruginosa

Cloranfenicol

Tetraciclinas

Macrólidos

Glicopéptidos

Trimetoprima

Sulfametoxazol

Acido nalidixico

Aminopenicilinas

Aminop. + inhibidores

Cefalosporinas 1ra y

2da

Cefoxitina

Cefotaxima y Ticarcilina-clavulánico

presentan sensibilidad in vitro,

resistencia in vivo

(Hancock R et al., 1998; Girlich D et al., 2004; Lister et al., 2009)

Expresión basal de bombas

de expulsión (MexAB-OprM)

Impermeabilidad

β-lactamasas cromosómicas

blaAMPC

blaOXA-50

Resistencia multifactorial

actuando en

forma concertada

“resistoma intrínseco”“independiente de exposición previa

a antibióticos y no debido a eventos

de THG”

(Livermore DM.Clin. Microb Rev.8,4:557-584, 1995, Boletín N 158 de la AAM, pág.5-7, 2003)

Pseudomonas aeruginosaEs uno de los 6 microorganismos más

agresivos y con mayor resistencia a

antibióticos. Pertenece al grupo

ESCAPE(Infectious Diseases Society of America).

Escherichia coli (20.5%),

Pseudomonas aeruginosa (11.8%),

Klebsiella pneumoniae (8%),

Acinetobacter spp. (7.5%),

entre otros (Según datos del SIR)

en Argentina, Chile, y en el mundo, altos porcentajes de

resistencia a antibióticos....

Pseudomonas aeruginosa

(Magiorakos et al, 2012)

Fenotipo MDR

multirresistente

Adquisición de resistencia

en al

menos un ATB en 3 familias

de antibióticos

Fenotipo XDR

resistencia extrema

Adquisición de resistencia

en al

menos un ATB en todas las

familias menos dos

familias de antibióticos

Fenotipo PDR

pandroga resistencia

Adquisición de resistencia a todos los ATBs

en todas las familias de antibióticos

Evolución genómica bacteriana

ancestro

Reducción

genómica

por eventos de

deleción

Mutaciones,

rearreglos

genómicos,

y duplicación de

genes

Transferencia

Horizontal

Genética

(THG)

Bacteria intracelular

obligada

Todo tipo de nicho

ecológico

Bacteria extracelular

en contacto con otras

bacterias

Evolución hacia XDR en P. aeruginosa

Fenotipo Pandroga ResistenteIntegrones/Cassettes

ADN Móvil

Dinámica poblacional

Mutaciones/Reducción

Sistema Integrón/Cassettes

Ingeniería genética in vivo

Pc

attI

(Stokes and Hall, 1989)

2343 cassettes diferentes en 50 m2 de superficie de suelo

Los cassettes

(Michael y col., 2003, Partridge y col., 2009)

Resistencia a ß-lactámicosResistencia a aminoglicósidosResistencia a cloranfenicolResistencia a trimetoprimaResistencia a estreptotricinaResistencia a rifampicinaResistencia a eritromicinaResistencia a fluoroquinolonasResistencia a antisépticos

MLST

http://pubmlst.org/paeruginosa

Estructura poblacional de P. aeruginosa

Argentina ST621 con IMP-13

ChecoslovaquiaST235 con aacA7-aadA6-orfD,ST357 con blaIMP-7

ST175 con aadB-aadA13ST132 con aacA4

Rusia, Suecia, Hungria y GreciaST235 con blaVIM

Corea del Sur ST235 con blaIMP-6-qac-aacA4-blaOXA-1-aadA1

JapónST235 con In113 blaIMP-1- aacA28-aadA1aST357 con In994 blaIMP-1

AlemaniaST622 (CC235) con blaIMP-35- blaOXA-35- aacA6

(Empel y col., 2007; Nemec y col., 2010 ; Garcia-Castillo y col., 2011; Havrak y col., 2011; Maatallah y col., 2011; Yoo y col., 2011; Poumaras y col., 2013; Mano y col., 2015);

Rumania, Austria, Belgica y Francia

ST621 con IMP-13

Alta asociación entre integrones de clase 1 y secuenciotiposespecíficos evidencia la transmisión de un linaje preexistente.

Expansión de clones epidémicos exitosos

Genoma “core”

Pangenoma

Genoma “flotante

o accesorio”

Resistencia adquirida por ADN Móvil en

P. aeruginosa

Elementos móviles

Retrotransposones

Secuencias de Inserción

Transposones

Transposones conjugativos

Bacteriófagos

Sistema cassettes/integrones

El 80% de la resistencia

antibiótica

es debido al

“Moviloma”

Resistencia adquirida por ADN Móvil en

P. aeruginosa

Mutators!

30-60% de los pacientes con Fibrosis Quística (FQ)

57% en pacientes con bronquiectasias o EPOC

P. aeruginosa es capaz de persistir en el pulmón del paciente con

FQ, adaptarse a la respuesta inmunitaria del propio paciente y

resistir a todos los tratamientos antibióticos que se le administran.

Frecuencias de mutación

espontánea incrementadas

100-1000 veces por deficiencias

en los sistemas de reparación del

ADN

Adaptación por mutaciones

Enfermedad hereditaria autosómica recesiva más

frecuente en la población de origen caucásico.

La primera causa de afección pulmonar crónica en la

infancia

1/2500-1/5000 nacidos vivos

Mejor modelo de infección crónica de

P. aeruginosa:

FIBROSIS QUíSTICA

Temprana mortalidad

Alteraciones digestivas

70% niños fallecían antes

del año de vida por

complicaciones digestivas

Tratamientos específicos

-Deficiencias digestivas-

1936

1970

(Goss, CH y Rosenfeld, 2004; www.cff.org/news/general_news)

FIBROSIS QUíSTICA

Welsh, MJ and Smith, AE. Cystic Fibrosis. Scientific American. 273 (6): 52,

1995.

Colonización

patogénica

pulmonar

Alta morbilidad y

mortalidad

causante del 95 % de los fallecimientos

1970

2015

FIBROSIS QUíSTICA

Adaptado de Gibson, RL, Burns, JL, and Ramsey, BW. Pathophysiology and Management of PulmonaryInfections in Cystic Fibrosis. AJRCCM 168 (918-951); 2003.

Evolución temporal de las

colonizaciones patogénicas

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

% c

ep

as r

esi

ste

nte

s

Cepas FQ hipermutadoras

(Oliver et al, Science 2000)

Hipermutación y multirresistencia en pacientes con FQ

Cepas FQ NOhipermutadoras

Cepas NO FQ

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Número de antibióticos

2 3 4 5 6 7

% cepas resistentes

Adaptación por mutaciones

• Las elementos móviles no se identificaron

en la adaptación genómica.

• Se calcula una reducción de 22.637 pares

de bases por año en las cepas

patogénicas de pacientes FQ versus 3723

en cepas de P. aeruginosa en otros

nichos.

• Hipermutación

• Mutaciones adaptativas

• Reducción genómica

• y la Transferencia Horizontal

Genética???Florencia Rappisardi, Angélica Galán,

Verónica Alvarez,

Elisabet Vilacoba y Cecilia Quiroga

Mecanismos moleculares que

llevan a la extrema resistencia

en P. aeruginosa durante

infecciones crónicas

Estudio Epidemiológico

De 102 pacientes con Fibrosis Quística, 25

infectados con P. aeruginosa durante más de

6 años con más de 10 muestras de esputo en

nuestro laboratorio (2005-2012).

Años Cepas Totales Cepas con intI1

Primeros 2 años 26 1

Desde el 2do al 4to año 44 14

Desde el 4to al 6to año 30 22

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

hasta 2 de 2 a 4 de 4 a 6

Cepas Totales

Cepas con intI1

A medida que aumenta la cronicidad de la infección de P. aeruginosa, aumenta la frecuencia de cepas con integrones de clase 1.

Aislamientos Gen bla Fecha

PAE 906-PAE 907 11/2005

PAE 969-PAE 970 09/2006

PAE 974

PAE 975

10/2006

PAE 977 11/2006

PAE 980-PAE 981-PAE 982 blaVIM-205/2007

Paciente FQ 1

Paciente infectado con P. aeruginosa

4 Genomas completos secuenciados

Paciente FQ 1

Pae 969

Pae 975

Pae 977Pae 981

Distribución de Islas Genómicas

• Mutación en mucB que le otorgafenotipo mucoide a Pae 981.

• Reducción genómica de20.000 pares de bases.

• Adquisición de un integróninsertado en un transposónportador de la carbapenemasa blaVIM-2.

Las cepas Pae 975 y 981

son isogénicas, excepto por:

La Transferencia Horizontal Genética

Mediada por integrones de clase 1 MDR

está involucrada en la adaptación de

P. aeruginosa al pulmón del paciente FQ.

Paciente FQ 1

Resistencia adquirida por ADN Móvil

en P. aeruginosa

Integrones de clase 1

localizados

en islas genómicas

en P. aeruginosa

de infecciones

intrahospitalarias

Tn6162

Tn6163

Integrón de clase 1 con blaGES-1 en la isla PAPI-1

Paciente FQ 2

Evolución genómica bacteriana

hacia fenotipos MDR y XDR

ancestro

Reducción

genómica

por eventos de

deleción

Mutaciones,

rearreglos

genómicos,

y duplicación de

genes

Transferencia

Horizontal

Genética

(THG)

Bacteria intracelular

obligada

Todo tipo de nicho

ecológico

Bacteria extracelular

en contacto con otras

bacterias

La THG mediada por los integrones

de clase 1 es una pieza importante

hacia la MDR y XDR de P. aeruginosa,

no solo en cepas intrshospitalarias,

sino también en cepas de infecciones

crónicas.

MUCHAS GRACIAS!!!!!!

GRACIASLab “Flotante”

Dr. Maurizio Labbate (Australia)

Dr. Paul H. Roy (Canadá)

Dr Gerardo Gonzalez Rocha (Chile)

Dr. Alejandro Petroni (Argentina)

Dra. Carolina Márquez (Uruguay)

Dra. Sara Kaufman (Argentina)

Dr. Pablo Power (Argentina)

Dr. Mariano Pistorio (Argentina)

Dra Ma. Fernanda Falcone Dias

(Brasil)

Lab “Core”

Dra. M. Paula Quiroga

Dra. Cecilia Quiroga

Dra M. Cecilia Rodríguez

Dra M. Soledad Ramírez

Lic. Angélica Galán

Lic. Luciana Chamosa

Lic. Florencia Rapisardi

Lic. Verónica Álvarez

CONICET, UBA, ISID, IUMS, ASM, FUNDACIÓN A. ROEMMERS y ANPCyT

LABORATORIO DE INVESTIGACIONES EN MECANISMOS DE RESISTENCIA

A ANTIBIÓTICOS,

2015

Historia de las cepas “transmisibles”

y de los clones “epidémicos”

(Fothergill, JL y col., 2012; Romling U y col., 2005; )

Cepas epidémicas: cuando se registran

cepas similares en diferentes regiones.

Ej.: LESB58 y AES.

Cepas transmisibles: cuando se identifican

cepas que se transfirieron entre pacientes.

Ej.: LESB58, AES-1, MES y DK2.

En ambos tipos de cepas, la segregación

de pacientes

limitó la transmisión.

1986: Primera sugerencia

de cepaepidémica

1994: Clon C Identificado

en Europa

2001: cepa MESIdentificada en

UK (Manchester)

2004: Relevamiento nacional en UK revela

Cepas clonales LES, MES, Mid1, Stoke, Trent y Sheffield

2008: AES-3aislada enAustralia

1993: cepa transmisiblede B. cenocepacia

1996: Identificaciónde LES en UK

2001: Clondominante en

colonias deverano enHolanda

2002: AES-1 esidentificada en Australia

2004: AES-2 esidentificada en Australia

2008: LES esidentificada

en USA

2009: LES essecuenciada

Cepa LESB58 (Liverpool Epidemic Strain).

• Primer cepa de P. aeruginosa

resistente a ceftazidima aislada

de pacientes con FQ.

• El clon LES es el más frecuente en

pacientes FQ de UK y Escocia.

• Fue descripto en menor frecuencia

también en USA, Canadá y Australia.

• Es altamente transmissible.

De paciente FQ a ambos padres no-FQ

De paciente FQ a mascota gato

• Siempre fue identificada en pacientes

con FQ.

(Scott and Pitt 2004; Edenborough et al. 2004; McCallum et al. 2001; Panagea et al. 2005, Al Aloul et al. 2004;

McCallum et al. 2002; Mohan et al. 2008; Salunkhe et al. 2005; Fothergill et al. 2007; Kukavica-Ibrulj et al. 2008)

Cepas LESB58 (Liverpool Epidemic Strain).• Está asociado a mayor mortalidad

en los pacientes con FQ.

• Exhibe mayor sobrevivencia en

superficies secas que otras cepas.

• Es hiperpoductor de biofilm.

• Posee un inusual fenotipo, con

precoz expresión del Sistema

del regulón del “quorum sensing”.

• El clon LES es hallado en pacientes FQ

de UK, Escocia, USA, Canadá y Australia.

• Es altamente transmissible.

De paciente FQ a ambos padres no-FQ

De paciente FQ a mascota gato

(Scott and Pitt 2004; Edenborough et al. 2004; McCallum et al. 2001; Panagea et al. 2005, Al Aloul et al. 2004;

McCallum et al. 2002; Mohan et al. 2008; Salunkhe et al. 2005; Fothergill et al. 2007; Kukavica-Ibrulj et al. 2008)

El biofilm, la ciudad

de las bacterias……

Rasgos cooperativos y coordinados entre bacterias

Genómica comparativa de

cepas LES.

(Jeukens J y col., PLosOne, 2014)

• Algunos de los aislamientos de ambos

continentes son indistinguibles tanto

a nivel genómico como fenotípico.

• Sintenia conservada entre 7 genomas

de UK y Canadá.

• Presencia de mini-isla (7.4 kb)

específica de cepas LES.

• Mientras que el genoma core se halla

conservado entre las cepas, se

identificó alta variabilidad en el genoma

accesorio.

Mecanismos involucrados en la

evolución hacia la cronicidad

Mecanismos genéticos

• Hipermutación

• Mutaciones adaptativas

• Reducción genómica

Mecanismos poblacionales

• Coexistencia de linajes

• Crecimiento en Biofilms

9 pacientes360 genomas

secuenciados de P. aeruginosa

La divergencia genética de los

linajes de P. aeruginosa dentro de los pacientes resultó

mayor que entre pacientes

Tambien mutantes aflagelados,

modificaciones del LPS y colonias enanas

(SCV).

Se observan cambios

fenotípicos:

Se observa una gran biodiversidad fenotípica, tanto a nivel

de cultivo como por microscopía.

Los estadíos hacia la cronicidad incluyen

tanto adaptación genómica de un linaje como coexistencia de

linajes.

Adaptación Genómica. Aparece el fenotipo

mucoide, generalmente en

mutaciones del gen mucA.

La conversión al morfotipo mucoide otorga resistencia tanto

a los tratamientos antibióticos como a la propia respuesta

inmunitaria del paciente.