UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

LABORATORIO DE BIOELECTROQUÍMICA

"PREPARACIÓN, CARACTERIZACIÓN ELECTROQUÍMICA Y REACTIVIDAD DE NUEVAS

1,4-DIHIDROPIRIDINAS-4R-SUSTITUIDAS"

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN QUÍMICA

RICARDO ANDRÉS SALAZAR GONZÁLEZ

Directores de tesis: Dr. Luis J. Núñez Vergara Dr. J. Arturo Squella Serrano

SANTIAGO-CHILE

2008

Este trabajo fue posible gracias al apoyo financiero de los proyectos FONDECYT

1050761 y Beca CONICYT de apoyo a la realización de tesis nº23070093. Se

agradece el apoyo de CONICYT, beca para estudiantes de postgrado año 2004 y

beca de término de tesis. A la Universidad de Chile por la beca de arancel de

estudios de doctorado. Al MECESUP y el proyecto UCH 0408 por las becas para

estancias en laboratorios nacionales e internacionales.

Se agradece también la colaboración del Centro de Estudios para el

Desarrollo de la Química (CEPEDEQ) y del Laboratorio de Análisis Antidoping de

la facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile.

Quiero agradecer al grupo de Bioelectroquímica por su colaboración

en el desarrollo de este trabajo. Particularmente agradezco a mis directores de

tesis Arturo Squella y Luis Núñez, por confiar en mí desde un comienzo, por

enseñarme, apoyarme y guiarme, y también por su amistad y confianza.

Agradezco por igual a Soledad Bollo y Claudia Yáñez, a quienes también

considero mis directoras de tesis y sobretodo, grandes amigas. También quiero

agradecer a los profesores Patricio Navarrete y Juan Carlos Sturm por su gran

disposición y colaboración.

A mi madre, porque llena esa palabra en su totalidad.

A mi abuelo, porque me enseña a luchar día a día.

A Paola, porque cualquier lugar es bueno con ella.

Otros agradecimientos…

Y bueno… llegó el momento. Quizá algunos de ustedes sólo lean esta página y por eso espero mencionar a todos quienes de alguna u otra manera estuvieron conmigo durante estos años y que contribuyeron a que esta difícil tarea resultara más agradable, más llevadera y más gratificante. También para todos los que no entendían que hacía yo con 30 años en la Universidad o aquellos que me preguntaban una y otra vez: ¿Cuánto te falta para terminar? Para todos ustedes muchas gracias!!!

Bueno, comencemos… En primer lugar quiero agradecer a mi familia porque siempre me hacen

sentir querido y me demuestran a diario lo orgullosos que están de mí. A mi madre, mi abuelo, mi padre, abuela, tíos y primos. Los amo.

A los mejores amigos del mundo: Paola (curruñis) porque sin dudas estos años no habrían sido tan llevaderos si tú no hubieras estado a mi lado, donde pasamos de todo (momentos buenos, otros malos y otros muy pero muy buenos), y siempre estábamos el uno para el otro… gracias por escucharme, acompañarme, soportarme y quererme; Diana (munrra quetzacoatl), que aunque estabas a gran distancia física, siempre me acompañaste y me dabas ánimos para continuar; Karla (barbie araukana), que con tu particular sentido del humor siempre eras capaz de subirme el ánimo y devolverme la sonrisa aun en los peores momentos; Cristián y Roberto , por todos los buenos momentos pasados en estos años, donde nos reímos del resto y de nosotros mismos, donde nos acompañamos en las buenas, en las malas y en aquellas que es mejor no recordar. También agradezco a Tito, Daniel, Clarita y Marco. Gracias a todos por demostrarme siempre cuanto me quieren y por ser los mejores amigos del mundo.

A todos los profesores que me guiaron y me ayudaron en el desarrollo de la tesis y en mi formación profesional, por su colaboración, sus enseñanzas y por la amistad: Hernán Pessoa, Inés Ahumada, Pablo Richter, Claudio Olea, Alejandro Álvarez, Diego Venegas, Jacqueline Pezoa, Leonardo Guzmán y Marcelo Kogan.

A los profesores Jorge Fuentealba y Luis Aguayo de la Universidad de Concepción y al Profesor Rodolfo Lavilla del Parc Científic de Barcelona por hacerme sentir en casa estando lejos de ésta. A todos aquellos colegas y memoristas del laboratorio de bioelectroquímica que hicieron que los días largos resultaran más agradables. Así también al grupo de Neurofisiología de la Universidad de Concepción y de Biosyner en el Parc Científic de Barcelona.

Agradezco especialmente también a Cecilia, Ximena, Gisella, Benito y José por su gran disposición y colaboración.

Las siguientes publicaciones han sido generadas en el desarrollo de

esta tesis:

1. R. Salazar, P. A. Navarrete-Encina, C. Camargo, J. A. Squella and Luis J.

Núñez-Vergara. “Oxidation of 4-(3-Indolyl) and 4-(5-Indolyl)-1,4-Dihydropyridines

in aprotic and protic media. Reactivity towards alkylperoxyl radicals”. J.

electrochem. Soc. In Press.

2. R. Salazar, P. A. Navarrete-Encina, C. Camargo, J. A. Squella and Luis J.

Núñez-Vergara. “Reactivity of C4-Indolyl substituted 1,4-Dihydropyridines

towards superoxide anion (O2•) in dimethylsulfoxide”. J. Phys. Org. Chem. DOI

10.1002/poc.1453.

3. R. Salazar, P. A. Navarrete-Encina, C. Camargo, J. A. Squella and Luis J.

Núñez-Vergara. “Electrochemical oxidation of C-4-Vanillin and C-4-Isovanillin-

1,4-Dihydropyridines in aprotic medium. Reactivity towards free radicals”. J.

Electroanal. Chem. 622 (2008) 29-36.

Índice

1. Introducción…………….…………………………………………………………….1 2. Hipótesis ………………………………………………………………………………6 3. Objetivos

a. Generales …………………………..…………………………………...……6 b. Específicos ………………………..…………………………………………7

4. Materiales y métodos 4.1. Materiales

4.1.1. Reactivos y solventes …………....…………………………..8 4.1.2. Tampones ...………………………………………………………....8 4.1.3. Material de vidrio …..………………………………………………8 4.1.4. Equipos ..…………………………………………………………….9

4.2. Métodos 4.2.1. Preparación de soluciones de trabajo …….…...…………… 12

4.2.2. Caracterización electroquímica y espectroscópica. Estudio de la reactividad con radicales libres .......……………………12

5. Resultados y discusión 5.1. Preparación de los derivados …………………………………..20 5.2. Medio aprótico …………………………………………………….26

5.3. Reactividad frente al anión radical superóxido …………….58 5.4. Medio prótico ……………………………………………………..81

5.5. Reactividad con radicales alquilperoxilo (ROO•) ABAP-

derivados …………………………………………………………..88 5.6. Análisis conformacional de los compuestos sintetizados ..93

5.7. Estudios biológicos ……………………………………….….....104

6. Breve discusión de los resultados ……………………………………........…110 7. Conclusiones ……………………………………………………....………....…..119 8. Presentaciones a congresos ………………………………………….………..120 9. Referencias bibliográficas ……………………………………………….……..122

Resumen

La presente tesis reporta la síntesis, la caracterización electroquímica en

medio aprótico y prótico, y la reactividad frente a radicales libres nuevos compuestos

1,4-dihidropiridínicos (1,4-DHPs). Los compuestos diseñados presentan dos centros

susceptibles a oxidación: el anillo 1,4-dihidropiridínico y los sustituyentes en la

posición-4 del mismo (indol y o-metoxifenol). Se evaluó el efecto de ambos centros

redox en el proceso oxidativo y la influencia de los sustituyentes frente a radicales

libres (anión radical superóxido y radicales alquilperoxilo). Los estudios por voltametría

de pulso diferencial (VPD), voltametría cíclica (VC) y voltametría de barrido lineal

(sobre electrodo rotatorio), mostraron dos señales simples e irreversibles. En el caso

de las 1,4-DHPs que poseen un sustituyente indol en la posición-4, la primera señal

corresponde a la oxidación del anillo dihidropiridínico y la segunda a la oxidación del

indol. Las 1,4-DHPs con un sustituyente o-metoxifenol presentaron un primer proceso

oxidativo correspondiente a la oxidación del fenol de la posición-4 y el segundo paso

anódico correspondiente a la oxidación del anillo 1,4-DHP.

Experimentos por electrólisis a potencial controlado (EPC) acoplada con

resonancia de espín electrónico (atrapamiento con PBN) confirmaron la generación de

un radical piridinio como intermediario de la reacción electródica y la posible formación

de otro radical que incluye al segundo núcleo redox. El producto final de la EPC fue

estudiado por espectroscopía UV-visible, cromatografía líquida de alta eficiencia

(HPLC) y cromatografía gaseosa con detector de masas (GC-MS). Por esta última

técnica fue posible identificar en medio aprótico y prótico, al derivado piridínico como

producto final de la electro-oxidación.

Mediante VC se estudió la interacción de los derivados frente al O2●

electrogenerado. Por este método, se encontró que los derivados o-metoxifenol 1,4-

DHPs disminuyeron en un 50% la razón de corriente de la cupla O2/ O2●. Mediante

espectroscopía UV-visible se establecieron las constantes cinéticas de pseudo primer

orden para la reacción de los derivados frente al O2●, las que fueron determinadas de

manera indirecta en función de la especie aniónica. Por esta técnica, los derivados C4-

indolil 1,4-DHP fueron los más reactivos. La reactividad frente a los radicales

alquilperoxilo arrojó resultados similares.

En todos los experimentos se comparó los resultados a los compuestos no

sustituidos y 1,4-DHPs comerciales, siendo los compuestos sintetizados, los más

reactivos. El producto final de la reacción entre los derivados y los radicales

estudiados correspondió al derivado piridínico.

Abstract

The present thesis reports the synthesis, electrochemical characterization in

protic and aprotic media, and the reactivity towards free radicals of new 1,4-

Dihydropyridines (1,4-DHPs). The derivatives own two redox centers: the 1,4-

dihydropyridine ring, and the substituents in C4-position, indole and o-methoxyphenol

moieties. It was studied the interaction between both redox centers in the anodic

process and the effect of the inclusion of the subtituents about the reactivity towards

free radicals (superoxide radical anion and alkylperoxyl radicals). Studies by

differential pulse voltammetry (DPV), cyclic voltammetry (CV) and linear sweep

voltammetry on rotating disk electrode, revealed two signals. The C4-Indolyl 1,4-

dihydropyridines showed that the first signal is due to oxidation of the dihydropyridine

ring and the second one is due to oxidation of the indolyl moiety. The oxidation peaks

in the derivatives C4-methoxyphenol substituted can be assigned as follows: -those

appearing at lower potential values belong to the oxidation of the OH group and the

remaining ones correspond to the oxidation of DHP ring.

Controlled potential Electrolized (CPE) studies were conducted in the ESR cell

in the presence of N-tert-butylamine-α-phenylnitrone (PBN). The above splitting

constants for the spin adducts are consistent with the fact that PBN interacts with

carbon-centered radicals and other intermediates probably involving the indole moiety.

The final product of the CPE was assessed by UV-Vis spectroscopy, HPLC and GC-

MS. By means of this latter technique, the pyridine derivative was identified as the final

product of the electro-oxidation both in aprotic and protic media.

Ipa/Ipc (anodic/cathodic current ratio) corresponding to the oxygen/superoxide

anion couple (O2/O2●) was used to assess the reactivity of 1,4-DHPs towards

superoxide anion in dimethyl sulfoxide. Addition of different concentrations of 1,4-

DHPs, significantly decreased the current ratio of the couple, indicating that tested 1,4-

DHPs reacted with the radical. The derivatives V-DHP and I-DHP decreased the

Ipa/Ipc ratio to approximately 50%. By UV-visible spectrophotometry we calculated

apparent kinetic rate constant values in a pseudo first order conditions for the

derivatives towards O2●. C4-Indolyl 1,4-DHPs were more reactive than the commercial

derivatives. The reactivity of the derivatives towards alkylperoxyl radicals shows similar

results. Analyses of the reaction products between 1,4-DHPs derivatives and free

radicals permit us the identification of the pyridine derivative as the final product.

1. Introducción

Las 1,4-dihidropridinas (1,4-DHPs) son fármacos que tienen la característica de

bloquear el Canal de calcio tipo L voltaje dependiente en numerosos tipos celulares

como el músculo esquelético, cardíaco y la musculatura lisa. En consecuencia,

presentan una importancia clínica significativa, lo que ha motivado su desarrollo e

investigación para mejorar su aplicación en patologías cardiovasculares como la

hipertensión y la angina pectoris [i-iii].

Figura 1. Estructura Básica de las 1,4-dihidropiridinas

El farmacóforo de este tipo de bloqueadores de canales de Ca+2 es el anillo

dihidropiridínico y su actividad farmacológica está directamente relacionada con los

sustituyentes presentes en dicho anillo. La presencia de un grupo arilo en posición 4

potencia su actividad antagonista, la cual se ve favorecida con sustituyentes

electroatractores y electrodonores, mientras que grupos éster en las posiciones 3 y 5

influencian la selectividad vascular. Es por esto que modificaciones estructurales

pueden hacer la diferencia sobre la potencia del fármaco y la selectividad sobre los

canales de calcio donde éstos actúan [iv-vi]. Desde el descubrimiento de los efectos farmacológicos de estos compuestos,

se ha generado un gran interés por determinar qué tipo de estructura produce el efecto

óptimo con el propósito de mejorar la potencia en su efecto antagonista/agonista de

canales; y qué relevancia farmacológica tienen algunos cambios estructurales, de

manera de diseñar compuestos más seguros y con menos efectos indeseables. Así, el

1

H N

R 2 H C

R

O

R 2

O

O

R 1

p

m

o

O

Crítico

Grupos alquil y aminoalquil

Función éster paraantagonismo óptimo:-CO2R >COMe>CN>H

Centro quiral:

estereoselectividadAngulo de torsión

del anillo aril

Sustituyentes o ≥ m ≥ pElectroatractorElectrodonor

1

2 34

56

H N

R 2 H C

R

O

R 2

O

O

R 1

p

m

o

O

Crítico

Grupos alquil y aminoalquil

Función éster paraantagonismo óptimo:-CO2R >COMe>CN>H

Centro quiral:

estereoselectividadAngulo de torsión

del anillo aril

Sustituyentes o ≥ m ≥ pElectroatractorElectrodonor

1

2 34

56

estudio de las 1,4-DHPs en este aspecto, ha permitido avanzar sobre el conocimiento

acerca de los posibles mecanismos moleculares que dan cuenta de la transferencia de

protones o átomos de hidrógeno, en reacciones mono- o bi-electrónicas en las que

participan este tipo de coenzimas que cumplen un rol muy importante como cofactores

de diversas óxido-reductasas involucradas en procesos vitales.

Estudios sobre 1,4-DHPs con variaciones en los sustituyentes de las

posiciones 1 y 4, han mostrado que afectan el efecto antagonista sobre los canales de

calcio [vii,viii]. Así por ejemplo, al reemplazar el protón de la posición-1 por grupos

alquilo, el efecto bloqueador sobre canales de calcio, se pierde completamente,

demostrando así la importancia de la existencia del nitrógeno amínico secundario de

la 1,4-DHP. En forma análoga, si se reemplaza en la posición-4 el grupo arilo por

grupos menos voluminosos, como un grupo metilo, se obtienen compuestos agonistas

de canales de calcio, esto es, aumenta la actividad sobre los mismos, facilitando la

entrada de calcio al citoplasma y por lo tanto, produciendo contracción vascular y un

aumento de la presión arterial [ix].

Ahora bien, analizando las 1,4-DHPs desde el punto de vista de la

metabolización en el organismo, se ha encontrado que éstas sufren una rápida y

extensa transformación por la oxidación por enzimas hepáticas, debido a la acción del

sistema CYP 3A dando origen a la piridina correspondiente, la cual es

farmacológicamente inactiva [x-xii]. Es por esta razón, que la oxidación de 1,4-DHPs ha

despertado también un gran interés para la investigación en química orgánica y en

electroquímica. Recientemente, se ha establecido que las 1,4-DHPs son oxidadas

cuando reaccionan con algunos endobióticos de relevancia biológica. Un ejemplo de

lo anterior, lo constituye la reacción de 1,4-DHPs con óxido nítrico (NO), un radical

libre gaseoso que cumple importantes funciones biológicas de regulación dentro del

organismo y que se forma a partir de L-arginina por acción de óxido nítrico sintasa. A

resultados similares, se ha arribado al ensayar donores de NO, tales como, N-metil-N-

nitrosotolueno-p-sulfonamida (MNTS) o S-Nitroso glutatión [xiii,xiv]. En todos los casos,

se ha encontrado como producto final de la reacción, el derivado oxidado de la 1,4-

DHP, esto es, la piridina correspondiente.

Estudios acerca de la oxidación electroquímica de 1,4 DHPs se han realizado

en medio acuoso y en diferentes solventes orgánicos como Dimetilsulfóxido (DMSO),

Acetonitrilo, N-N Dimetilformamida, etc [xv-xxii]. En este medio, se ha reportado que el

mecanismo de electroxidación es de tipo ECEC, donde la primera etapa consiste en la

remoción de un electrón de la molécula inicial de 1,4-DHP lo que lleva a la formación

de un catión radical 1,4-DHP•+. Este catión radical pierde un protón rápidamente

formando un radical neutro, Py•, el cual se oxida a un catión dihidropiridínico -(a un

2

potencial igual o menor que la primera etapa)-, para producir cationes Py+, el que

pierde un segundo protón para formar el derivado piridínico. En medio no acuoso y a

pHs ácidos, se observa el mismo mecanismo, mientras que en medio básico el

mecanismo es del tipo DISP-1. Cualquiera sea el medio en el que se realiza la

electrooxidación, el producto formado corresponde a la piridina [xxiii-xxx].

En la actualidad se sabe con certeza que el daño oxidativo juega un rol crucial

en el envejecimiento y en varios desórdenes patológicos, entre los que se incluyen la

ateromatosis, la inflamación, la diabetes, la hipoxia y muchos desórdenes

neurológicos. En el caso particular de la hipertensión, se ha establecido una relación

causal entre ésta y el estrés oxidativo provocado por los radicales libres. Por lo tanto,

la propiedad adicional como antioxidantes que han manifestado las 1,4-DHPs aparece

como una característica relevante con vistas hacia el futuro, en orden a mejorar su

espectro terapéutico. Se ve entonces la importancia de diseñar nuevas moléculas con

actividad potencial para inhibir los procesos mencionados.

En los últimos años numerosos autores han descrito actividades antioxidantes

para las 1,4 DHPs, lo que involucraría una desactivación de los radicales libres o la

preservación de la actividad de la Superoxido-dismutasa (SOD) [xxxi].

En relación con los estudios sobre los efectos antioxidantes de 1,4-DHPs,

éstos presentan al menos dos características distintivas: a) La primera, es el hecho

que gran parte de ellos se sustentan en un efecto antioxidante de tipo indirecto

[xxxii,xxxiii] o bien se trata de estudios en que se mide el daño sobre algún blanco en

ausencia y en presencia de 1,4-DHP. En general, se estudian daños lipoperoxidativos

sobre membranas lipídicas o bien sobre lipoproteínas que transportan colesterol [xxxiv].

Asimismo, la metodología empleada para determinar los efectos antioxidantes de las

1,4-DHPs son de tipo indirecto [xxxv,xxxvi]. En consecuencia, no se han encontrado en la

literatura estudios sistemáticos sobre relaciones estructura química-actividad con

respecto a la reacción directa entre 1,4-DHPs y radicales libres.

En estudios recientes se ha reportado la reacción directa entre una serie

comercial de 1,4-DHPs y anión superóxido [xxxvii-xxxix]. Estos estudios se condujeron en

medio aprótico (DMSO) utilizando voltametría cíclica como técnica principal,

generando el radical anión superóxido electroquímicamente. A partir de estos estudios

electroquímicos, se concluyó que estas moléculas reaccionan directamente con el

anión radical superóxido y que la reactividad no es afectada en gran medida por los

substituyentes de las posiciones 3 y 5 del anillo. Por otra parte utilizando la

microscopía de barrido electroquímico se establecieron constantes de interacción

entre diferentes 1,4-DHPs y el anión radical superóxido mostrando diferencias en

dicha interacción dependiendo de los substituyentes presentes en las posiciones-3 y 5

3

del anillo dihidropiridínico [xl]. Además se identificó, por cromatografía gaseosa

acoplada a detector de masas, a la piridina como producto final de esta reacción y se

concluye que la presencia del nitrógeno de la posición-1 en la molécula de 1,4-DHP,

resultó ser fundamental para la velocidad de reacción.

Los radicales libres de mayor relevancia biológica son las especies reactivas

del oxigeno (ROS), entre los que destacan el anión radical superóxido (O2●) y el radical

hidroxilo (·OH), ya que estos se generan a partir del propio metabolismo de los

organismos que utilizan el oxigeno como aceptor final de electrones para la producción

energética. En esta tesis se estudió la reactividad de 5 nuevas 1,4-DHPs y otras 3 1,4-

dihidropiridinas de uso comercial frente al anión radical superóxido, debido a que este

es el de mayor abundancia en los sistemas biológicos, pero no el único, y su

generación puede deberse tanto a procesos enzimáticos como no enzimáticos

(esquema 1). El estudio de la reactividad de las dihidropiridinas frente a anion radical

superoxido se realizó en medio no acuso (dimetilsulfoxido) debido a que le otorga

mayor estabilidad a las soluciones de este radical.

Esquema 1. Generación de anión radical superóxido.

4

Compuesto Oxidado Compuesto

Reducido

NADP + NADPH NADPH - citocromo P 450 reductasa

O 2 O 2 .-

H 2 O 2 H 2 O + O 2

S.O.D.

H 2 O

Catalasa

Fe 2+ Cu +

. OH

GSH

GSSG GSH Reductasa

Xantina oxidasa activada

Glutatión Peroxidasa

NADPH NADP +

NO.

ONOO-

El núcleo indol es uno de los sutituyentes que se incluyeron en la posición C4

de las 1,4-DHPs, ya que además de ser electroactivo no es ajeno al organismo puesto

que está presente en algunos neurotransmisores como la melatonina, la serotonina y

triptófano, por nombrar algunos. Además, como núcleo está presente en compuestos

que poseen una gran variedad de propiedades biológicas como anti-inflamatorias,

antibacteriales, anticonvulsionantes y antioxidantes, específicamente como protectores

del sistema nervioso central [xli-xliii]. Por esto, se sintetizaron dos compuestos que

presentan un anillo dihidropiridínico y un anillo indol, teniendo así, dos centros redox

en una misma molécula: 4-(3-indolil)-1,4-dihidropiridina y 4-(5-indolil)-1,4-

dihidropiridina. Previamente, Lavilla y colaboradores reportaron la síntesis, el efecto

farmacológico y la inhibición de EROs de una serie de 4-(3-indolil) dihidropiridinas, las

que mostraron una potencia similar a Nifedipino [xliv].

Los otros sustituyentes considerados en este estudio son derivados de la

vainillina e isovainillina. Vainillina, 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehido, es el mayor

componente de la vainilla, la cual es uno de los savorizantes más importante y más

usado a nivel mundial. En común con muchos otros compuestos fenólicos de bajo

peso molecular, la vainillina presenta propiedades antioxidantes [xlv-xlix]. Vainillina es un

compuesto electroactivo posible de cuantificar electroanalíticamente, tanto en la

vainilla como en los productos finales en los cuales ésta se agrega, mediante

amperometría, voltametria de pulso diferencial u onda cuadrada [ l-lii]. Por otra parte,

recientemente se desarrolló un sensor detector de vainillina basado en electrodos

impresos [liii].

En la presente tesis, se estudió la oxidación electroquímica en medio aprótico y

prótico de dos isómeros del tipo C4-indolil 1,4-DHP y dos isómeros C4-hidróxi-metóxi-

fenil 1,4-DHP. Además, se midió la reactividad de los compuestos frente al anión

radical superóxido en dimetilsulfóxido mediante técnicas electroquímicas y

espectrofotométricas; y de radicales alquilperoxilo ABAP-derivados en medio prótico.

En ambos casos se establecieron las constantes cinéticas aparentes de reactividad. A

modo de comparación y para visualizar el efecto provocado por los sustituyentes en el

anillo dihidropiridínico, es que se estudió electroquímica y espectrofotométricamente el

indol, el guayacol (2-metoxi-fenol) y una 1,4-DHP C4-fenil sustituida, además de tres

1,4-DHPs comerciales (amlodipino, nisoldipino y nimodipino). Se espera que la

inclusión de dos centros redox en una misma molécula afecte tanto el comportamiento

electroquímico como su reactividad frente a los radicales libres propuestos.

5

2.-Hipótesis.

Hipótesis de trabajo.Se espera que la presencia de dos centros redox en una misma molécula

afecte significativamente el comportamiento electroquímico respecto a la oxidación

electroquímica de, por una parte: el anillo 1,4-DHP y el indolil en posición 4; y del anillo

1,4-DHP y el –OH del grupo hidroxi-metoxifenol. Además se espera ver diferencias

significativas entre isómeros de posición. Se espera también que la inclusión de éstos

nuevos sustituyentes en posición 4 del anillo dihidropiridínico sinergice su reactividad

frente a radicales libres.

3. Objetivos.

a) Generales .

1. Sintetizar 1,4-DHPs con un sustituyente indol, 4-hidróxi-3-metoxifenil y 3-hidróxi-4-

metoxifenil en la posición-4.

N

H

O

O

O

O

N

H

N

H

O

O

O

O

N

H

N

H

O

O

O

O

OH

OCH3

N

H

O

O

O

O

OCH3

OH

N

H

O

O

O

O

3-Ind-DHP 5-Ind-DHP

V-DHP I-DHP Fenil-DHP

1,4-dihidropiridinas propuestas en esta tesis

2. Evaluar la influencia en el mecanismo electrooxidativo de la coexistencia de dos

centros susceptibles a oxidación en una misma molécula. Caracterizar o

6

determinar productos finales e intermediarios en el proceso electrooxidativo.

3. Establecer los mecanismos involucrados en el apagamiento de los radicales por

parte de las 1,4-DHPs sintetizadas y buscar correlaciones entre potenciales de

oxidación y reactividad con radicales libres.

b) Específicos .

1. Sintetizar derivados de 1,4-DHPs conteniendo un substituyente indol, 4-

hidróxi-3-metoxifenil y 3-hidróxi-4-metoxifenil. Los compuestos sintetizados se

caracterizarán por RMN, IR-FT, análisis elemental.

2. Caracterización de la oxidación electroquímica en medio aprótico y prótico

de la serie de 1,4-DHPs propuesta, a través de técnicas electroquímicas

(voltametría de pulso diferencial, voltametría cíclica, voltametría lineal con

electrodo de disco rotatorio, electrolisis a potencial controlado), espectroscópicas

(UV-Vis, RPE) y cromatográficas (HPLC, GC-MS).

3. Caracterización sistemática de la reactividad de la serie con anión radical

superóxido y radicales alquilperoxil-ABAP derivados, a través de la determinación

de sus reactividades relativas.

4. Determinación de los mecanismos de reacción entre las 1,4-DHPs

sintetizadas y los radicales propuestos. Buscar correlaciones entre potenciales de

oxidación y la reactividad con radicales libres. Se comparará los valores de

constante de reactividad obtenidos con 1,4-DHPs comerciales como amlodipino,

nisoldipino y nimodipino, las cuales son de uso habitual en la clínica.

7

4. Materiales y métodos.

4.1 Materiales. 4.1.2. Reactivos y solventes.

• Acetoacetato de etilo, Merck.

• Ácido acético glacial, p.a. Merck.

• Ácido bórico (99%) p.a., Fluka Chemica.

• Ácido clorhídrico (36%) p.a., Reutter.

• Ácido fosfórico (85%) p.a., Merck.

• Agua purificada para HPLC (Milli-Q).

• (2,2 azobis (2 - amidinopropano)) diclorhidrato (ABAP), 98%. Sigma.

• Cloruro de potasio, p.a., Merck.

• Dimetilsulfóxido (DMSO) p.a., Merck.

• Dimetilsulfóxido (DMSO) p.a., Winkler.

• Dimetilsulfóxido-d6 (DMSO-d6) Sigma.

• Etanol absoluto (99,8%) p.a., Merck.

• Guayacol (98%) p. a., Merck.

• Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio (HFFTBA), Merck.

• Hidróxido de amonio concentrado, Merck.

• Hidróxido de tetrabutilamonio, Merck

• Hidróxido de sodio (pellets), Merck.

• Indol, Aldrich.

• Indol 3-carboxaldehído, Aldrich.

• Indol 5-carboxaldehído, Aldrich.

• Nitrógeno (99%), AGA.

• Nifedipino (99%) p.a., Merk.

• Nitrógeno extra puro, INDURA.

• N,N-Dimetilformamida. p. a., Merck

• Oxígeno (99%), AGA.

• Superóxido de potasio (KO2), Aldrich.

4.1.2. Tampones.

• Britton Robinson 0,04 M, con fuerza ionica ajustada con KCl en una

concentración 0,1 M.

8

4.1.3. Material de vidrio.

• Todo el material de vidrio utilizado fue clase A.

4.1.4. Equipos. a) Equipos usados para el análisis de productos de síntesis:

• Espectroscopía NMR: espectrómetro Bruker Avance DRX 300.

• FT-IR: espectrómetro Bruker IFS 55 Equinox.

• Análisis elemental: Fisons Instrument.

b) Equipos de uso general:

• Balanza de precisión Precisa 40SM-200ª (sensibilidad 0,01 mg).

• Sonicador Bransonic Branson 2210.

• Medidor de pH WTW modelo pMx 3000.

• Agitador magnético Heidolph MR 3002.

• Sistema purificador de agua Milli-Q Ultra- Pure Water System.

c) Sistema voltamétrico y computacional:

• Analizador voltamétrico BAS CV-50W y BAS CV-100W.

• Celda electroquímica BAS (10 mL) protegida de luz.

• Electrodo de trabajo: electrodo de carbón vítreo (glassy carbon MF-2070).

• Electrodo auxiliar: platino BAS MW-1032.

• Electrodo de referencia: Ag/AgClsat BAS RE-5B.

• PC pentium II Gateway para adquisición y tratamiento de datos.

d) Sistema espectroscópico UV-vis:

• Espectrofotómetro UV-vis CHEMSTATION diode array.

• Software 845X UV-Visible System.

• Copyright Agilent Technologies 95-03 para tratamiento y adquisición de datos.

e) Sistema cromatográfico (HPLC):

• Columna cromatográfica Kromasil 100-5C18 (4,6 x 150 mm).

• Precolumna: C-18 µBondapak (30 x 4,6 mm).

• Inyector: 20 µL.

• Bomba Waters 600 Controller Millipore Model code 6CE.

• Detector de arreglo de fotodiodos Waters 996.

9

• Jeringa Hamilton 81065 de 25µL.

• PC 486 Computer Multy Sync 4D con programa MILLENIUM 2,1.

f) Espectroscopía EPR:

• Espectrómetro Bruker ECS 40 XG con 50 kHz de modulación de campo.

• Electrodo de trabajo, malla de Platino confeccionada en el laboratorio.

• Alambre de platino utilizado como contraelectrodo.

g) Cromatografía gaseosa con detector de masas, GC-MS:

• Cromatógrafo gaseoso con detector de masas Hewlett Packard 5890/5972

(Palo Alto, California, USA) y autosampler Hewlett Packard 7673.

• Computador Hewlett Packard Pentium II.

• Columna cromatográfica: Hewlett-Packard Ultra-1,25 m x 0,2 mm i.d. x 0,11

(Little Falls, Wilmington, Delaware, USA).

h) Cálculos teóricos:

• Todos los cálculos se realizaron usando el programa Jaguar 5.5 [liv] y Titan

1.0.8.

i) Registros de Ca+2 intracelular.

• Los transientes espontáneos de Ca+2 fueron detectados con la sonda

fluorescente sensible a Ca2+, Fluo4-AM® (2µM, Molecular Probes). Las

neuronas se colocaron en la cámara de perfusión de un microscopio (Nikon, TE

2000). Los cambios del Ca+2 citosólico fueron registrados con una cámara CCD

(SensiCam, 12BIT CCD PCO) y una interfase Lambda 10-2 (Sutter

Instruments, USA).

j) Registros Electrofisiológicos.

• Los registros de corrientes se realizaron con la técnica de Patch-Clamp en la

configuración de célula entera y fijación de voltaje, para ello se utilizó un

amplificador Axon 200-B (Axon Instrumentos, Union City, CA). Los

microelectrodos de Patch-Clamp se rellenaron con una solución que contienen

(en mM): 140 KCL, 10 BAPTA, 10 HEPES (pH 7.4), 4 MgCl2, 0.3 GTP y 2 ATP-

Na2, 300 mOSM. La solución externa contenía (en mM): 150 NaCl, 5.4 KCL,

2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 10 HEPES (pH 7.4) y 10 glucosa.

10

k) Determinación de CREB fosforilado.

• Para la detección de CREB fosforilado (CREB-P), las neuronas de médula

espinal fueron incubadas con una concentración 50 µM de Nifedipino, 4-Fenil-

DHP y 5-Ind-DHP durante 30 minutos, todos en presencia de un estimulo

depolarizante de alto K+ (60 mM). Una vez transcurrido este tiempo las células

fueron lavadas y tratadas para la medición de la concentración de proteína.

Una cantidad igual de proteína (6 µg) fue analizada por electrofóresis en gel de

polyacrylamide (PAGE). Las proteínas fueron transferidas a nitrocelulosa y el

CREB-P fue identificado mediante la técnica de “wester blot”, que usa un

anticuerpo específico (UpstateTM). La señal de CREB-P fue comparada con la

señal de una proteína cuyo nivel de expresión era el mismo en todas las

condiciones (control de carga), todas las imágenes se analizaron con el

programa ImageJ.

Figura 2. Efecto de las distintas DHPs sobre el nivel de fosforilación de CREB (CREB-P) analizado por western blot.

11

4.2. Métodos.4.2.1. Preparación de soluciones de trabajo.a) Soluciones de 1,4-DHP.

• Se prepararon soluciones stock de cada 1,4-DHP, con una concentración

constante de 0,1 M en DMSO o Etanol. Las soluciones de trabajo fueron

preparadas por dilución de la solución stock hasta obtener la concentración

deseada. Estas soluciones se mantuvieron refrigeradas a -10ºC y protegidas

de la luz para evitar su descomposición.

b) Soluciones tampón.Solución tampón Britton Robinson 0,04 M con fuerza iónica ajustada con KCl 0,1 M.

• Preparada con 1,5 g. de Acido Bórico, 1,7 mL de Acido O-Fosfórico y 1,4 mL

de Acido Acético Glacial, enrasando a un volumen de 1 L con agua destilada.

c) Solución de anión radical superóxido

• Se pesaron 0.071 gramos (1mmol) de KO2 y se disolvieron en 10 mL de

DMSO, quedando en una concentración 0,1 M. La mezcla fue sonicada durante

0.5-3 horas hasta obtener una solución de color amarillo pálido. La solución

almacenada a -40ºC permanece estable durante semanas sin aparente

descomposición. A partir de esta solución madre, se prepararon diferentes

soluciones.

4.2.2. Caracterización electroquímica y espectroscópica. Estudio de la reactividad con radicales libres.

a) Voltametría.

• Para los experimentos voltamétricos, voltametría de pulso diferencial (VPD) y

voltametría de barrido lineal (VBL) se utilizó como concentración de rutina 1

mM de cada 1,4-DHP, de guayacol y de indol en medio aprótico y de 100 µM

en medio prótico. Para voltametría cíclica (VC) las soluciones de trabajo

tuvieron una concentración de 1mM. La celda electroquímica estaba

compuesta de un electrodo estacionario de carbón vítreo, como electrodo de

trabajo (área = 0,0717± 0,004 cm2) para VPD y VC mientras que para VBL se

utilizó un electrodo de disco rotatorio de la misma naturaleza. Como

contraelectrodo se usó un alambre de platino y todos los potenciales fueron

medidos frente a un electrodo de Ag/AgCl. El electrodo de carbon vítreo fue

12

pulido antes de cada medición utilizando alumina de 0.3 and 0.05 µm de

diámetro.

Medio aprótico : se utilizó como solvente DMSO y como electrolito

soporte hexafluorofosfato de tetrabutilamonio (HFFTBA) 0,1 M.

Medio prótico : para este medio todas las soluciones se prepararon en

tampón Britton Robinson (0,04 M; KCl 0,1 M) / Etanol, 70/30. El pH del

medio se ajustó adicionando alícuotas de NaOH o HCl concentrado.

b) Espectrofotometría UV-visible.• Se prepararon soluciones de concentración 100 µM de cada

compuesto en DMSO. Para el estudio de la generación del anión 1,4-DHP, se

agregaron diferentes alícuotas de hidróxido de tetrabutilamonio 0,1 M. Para la

regeneración de la 1,4-DHP se utilizó CH3COOH en solución alcohólica. En

todos los casos los espectros se registraron entre λ = 200 y 1200 nm. En el

caso de medio prótico se comprobó que no existían cambios significativos a lo

estudiado en DMSO y se trabajó en el mismo rango de concentraciones. Las

soluciones stock para este medio se prepararon en etanol.

c) Cálculo del número de electrones transferidos en el proceso oxidativo.

• Estos estudios se basaron en la electrólisis exhaustiva a potencial controlado

de todos los compuestos (tabla 1) usando una celda de tres compartimentos.

Se utilizó una malla de carbón vítreo como electrodo de trabajo, un alambre de

platino como contraelectrodo y un electrodo de Ag/AgCl como electrodo de

referencia.

Para el cálculo del número de electrones se estimó la sumatoria de las cargas

finales (con corrección de la carga basal) de electrólisis sucesivas. Desde la

carga total neta y empleando la ecuación de Faraday (Q neta = n F e, donde

n= número de moles, F= constante de Faraday (96500 C / mol) y e= número de

electrones) se calculó el número de electrones transferidos por mol de 1,4-

DHP. Como las 1,4-DHPs C4 Indolil sustituidas poseen dos señales de

oxidación, al igual que V-DHP e I-DHP, las electrólisis se realizaron aplicando

en primer lugar un potencial aproximadamente 100 mV más alto que el

potencial de pico de la primera señal oxidativa y así obtener el número de

electrones involucrados en ese proceso. Luego, a soluciones nuevas se aplicó

un potencial aproximadamente 100 mV más alto que el potencial de pico de la

segunda señal oxidativa, obteniéndose el número de electrones totales

13

involucrados en la molécula, es decir, involucrando ambos procesos redox que

incluyen la oxidación del anillo 1,4-DHP y la oxidación del sustituyente en la

posición 4 de dicho anillo.

E / mV vs Ag/AgClMedio prótico Medio aprótico

Compuesto pH 3 pH 11Pico I Pico II Pico I Pico II Pico I Pico II

3-Ind-DHP 900 1300 500 750 1100 15005-Ind-DHP 900 1300 500 750 1100 1500fenil-DHP 800 --- 550 --- 1200 ---

V-DHP 800 1200 300 650 900 1280I-DHP 800 1200 300 650 900 1280

Tabla 1: Potenciales aplicados al electrodo de trabajo para el cálculo del número de electrones.

d) Estudio de la reactividad de las 1,4-DHPs frente al anión radical superóxido.

i) Voltametría cíclica. Los experimentos de voltametría cíclica se realizaron en

DMSO + 0,1 M de HFFTBA. Previamente a los experimentos de reactividad, el

DMSO fue secado con tamiz molecular de 3 A°. Se burbujeó oxígeno gaseoso

directamente en la celda de trabajo de manera de obtener una concentración

fija de oxígeno y durante el experimento el oxígeno gaseoso fue burbujeado

superficialmente sobre la solución.

Para obtener una concentración de trabajo 1mM de oxígeno en la celda, en

primer lugar se burbujeó nitrógeno extra puro durante 10 minutos para eliminar

todo el oxígeno presente en la solución. Luego, conociendo la solubilidad del

oxígeno en DMSO [lv,lvi] y utilizando un aparato formado por dos flujómetros

equipados con válvulas de agujas, una para oxígeno y la otra para nitrógeno,

se establecieron los flujos de ambos gases que pasan a través de la celda. Así

fue posible determinar la concentración requerida de oxígeno en la celda de

trabajo [lvii] de acuerdo a la siguiente ecuación:

CO2 = SO2 rO2

rO2 + rN2

donde:

SO2 : solubilidad de O2 en DMSO antes de mezclarse con N2 (2,1 mM).

rO2 : flujo de O2.

rN2 : flujo de nitrógeno.

14

Se fijó la concentración de oxígeno en 1mM en DMSO. Los estudios se

realizaron a 25° C ± 0,1. La velocidad de barrido utilizada fue de 100 mV / s. En

todas las mediciones se compensó la caída ohmica con el fin de minimizar

alguna resistencia no compensada.

La razón de corrientes ipa/ipc fue obtenida para cada voltamograma, aplicando

el método desarrollado por Nicholson [lviii] de acuerdo a la siguiente ecuación:

ipa = (ipa)0 + 0,485 (ips)0 + 0,086 ipc (ipc)0 (ipc)0

donde los datos experimentales utilizados en esa ecuación son:

(ipc)0 : intensidad de la corriente catódica (referida al 0 de corriente).

(ipa)0 : Intensidad de la corriente anódica (referida al 0 de corriente).

(ips)0 : Intensidad de la corriente en el potencial de switching o potencial

de inversión.

Este método se aplica siempre que el potencial de inversión sea mayor que el

potencial de pico catódico 60/n mV, donde n es el número de electrones que se

transfieren en el proceso redox.

i) Espectrofotometría UV-Visible. Los compuestos sintetizados presentan un

máximo de absorción alrededor de los 360 nm. Dicho máximo sufre un efecto

batocrómico en presencia de una base producto de la formación de un

compuesto de color amarillo intenso, debido a la deprotonación de los

nitrógenos amínicos y del fenol. Esta solución amarilla absorbe cerca de los

450 nm. El producto principal de la reacción entre el anión radical superóxido y

las 1,4-DHPs es la piridina correspondiente, la cual absorbe en la zona de los

280 nm. Por su parte, el anión radical superóxido presenta una gran banda de

absorción próxima a los 300 nm, la que interfiere con la absorción de la

piridina. Para solucionar este problema se implementó una metodología

indirecta de cuantificación para la formación de la piridina y así poder

determinar la constante de velocidad de la reacción entre el radical y la 1,4-

DHP.

Dado que el anión radical superóxido es una base fuerte, éste actúa en primera

instancia abstrayendo rápidamente los protones de los Nitrógenos secundarios

tanto del anillo 1,4-DHP como del grupo indolil en 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP, así

como el protón de la posición 1 del anillo dihidropiridínico y el protón del grupo

15

OH en la V-DHP e I-DHP, siguiendo el mismo esquema de reacción de una

base común, es decir formando el anión respectivo, para luego establecer un

equilibrio acido-base entre las 1,4-DHPs y su especie aniónica. A medida que

transcurre la reacción en el tiempo, la banda correspondiente al anión decae

considerablemente, mientras la zona de la 1,4-DHP se mantiene constante, por

lo que asumimos que el anión que desaparece reconstituye la 1,4-DHP que a

su vez es oxida a piridina, de esta manera la velocidad de desaparición del

anión para reconstituir la 1,4-DHP que pasa a piridina, es indirectamente la

velocidad de oxidación de las 1,4-DHP a sus respectivos derivados piridínicos.

Para establecer los valores de las constantes de reactividad de las 1,4-DHPs y

el anión radical superóxido, se consideró la zona de los 450 nm, donde

aparece o desaparece el anión formado a tiempos cortos. Para evaluar los

cambios producidos en su concentración se debieron realizar curvas de

calibración para cada 1,4-DHP de la siguiente manera: Se prepararon 6

soluciones de distintas concentraciones de cada 1,4-DHP (20, 40, 60, 80, 100,

120 y 150 µM) y a cada una se le adicionó un exceso de tetrabutilamonio

hidróxido (OHTBA, el doble de la concentración de 1,4-DHP en la cubeta), de

modo de desplazar todo el equilibrio hacia la formación del anión. Se tomó la

precaución que esto fuera cuantitativo y se consideró que las concentraciones

iniciales de las 1,4-DHPs inmediatamente después de la adición de la base

eran iguales a la del su anión. Así se obtuvo las absorptividades molares de las

especies aniónicas, mediante la ecuación de Lambert Beer.

e) Estudio de la reactividad de las 1,4-DHPs frente a radicales alquilperoxilos ABAP derivados.

Esquema 2: Formación de radicales alquilo y alquilperoxilo

El progreso de la reacción de las 1,4–DHPs con radicales alquilperoxilo fue

seguido por espectrofotometría UV-Vis. La solución resultante se analizó por

16

ABTS

+ O2

+

Cl-C

CH3

CH3

C+H2N

H2N

Cl-C

CH3

CH3

C+H2N

H2N

OO

N

SN N

-O3S

EtN

S

Et

SO3-

37ºC

Cl-C

CH3

CH3

C+H2N

H2N

OO

(734 nm)

N

SN N

-O3S

EtN

S

Et

SO3-

C

CH3

CH3

C+H2N

H2N NH2

N2H+

CH3

CH3

CCNN

Cl-Cl-+ N2

2

Cl-

C

CH3

CH3

C+H2N

H2NABAP

[1]

[2]

[3]

GC – MS. Como generador de radicales libres se utilizó (2,2 azobis (2 -

amidinopropano)) diclorhidrato (ABAP). ABAP es un azocompuesto que a

37ºC y pH 7,4 genera radicales alquilo o alquilperoxilo dependiendo si está en

ausencia o presencia de oxígeno (Esquema 2) [lix,lx].

Soluciones de 20 mM de ABAP en tampón Britton Robinson 0,04 M (KCL 0,1

M)/ DMF, 70 / 30 a pH 7,4 fueron incubadas con 100 μM de cada 1,4-DHP o

NADH a 37ºC por 150 minutos. Previo a cada incubación las soluciones se

burbujearon con oxígeno por 15 minutos. La velocidad de formación de

radicales desde ABAP no sería constante ya que depende de la concentración

de ABAP (velocidad = k [ABAP]. Sin embargo, es posible estimar que a los 150

minutos a 37ºC sólo una pequeña parte de ABAP decae, por lo que la

velocidad de formación de radicales se puede considerar constante. En

solución acuosa a pH 7,4, ABAP tiene una vida media cercana a 175 horas, por

lo tanto la generación de radicales desde este iniciador es constante en las

primeras horas de incubación.

Para calcular la velocidad de reacción se utilizaron las pendientes de los

gráficos concentración de Ln[1,4-DHP] vs tiempo de todos los compuestos

estudiados. Tomando en cuenta que la concentración del ABAP es 200 veces

mayor que la concentración de las 1,4-DHPs, el sistema se consideró como

una reacción de pseudo primer orden para las 1,4-DHPs. De esta forma la

constante cinética de velocidad se calculó directamente a partir de los datos de

la pendiente de los gráficos.

f) Estudio de los productos de EPC y de reacción por cromatografía gaseosa con detector de masas, GC-MS.

Se inyectaron en el cromatógrafo las soluciones electrolizadas de cada 1,4-

DHP en los diferentes medios estudiados y luego de la reacción frente a los

radicales.

Condiciones cromatográficas:

Temperatura de detector: 300 ºC.

Temperatura de inyector: 250ºC.

Razón split: 1/10.

Presión: 13 psi

Flujo de purga: 40 mL min-1.

17

Tiempo de purga: 0,5 ml min-1.

Programa de temperatura:

La rampa de temperatura fue programada desde 130 hasta 305ºC a 15ºC min-1.

La temperatura fue mantenida a 305°C por 5 minutos.

Tiempo de corrida: 16,7 minutos.

Como carrier se utilizó Helio, inyectado con una presión de 35 kPa. El rango de

masa monitoreado fue entre 45 y 550 u.m.a. con una velocidad de barrido de

1scan/s. La energía de ionización fue de 70 eV.

Después de cada experimento, las soluciones finales fueron extraídas con éter

etílico e inyectadas al cromatógrafo sin otros tratamientos. Salvo en el caso de

V-DHP e I-DHP a las cuales con el propósito de mejorar sus características

cromatográficas gaseosas, fueron silanizados con N-metil-N-trimetilsilil-

trifluoroacetamida (MSTFA) previo a la inyección.

g) Seguimiento por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).Se inyectó una alícuota de estándar, de una solución electrolizada o de la celda

de reacción frente al anión radical superóxido de cada 1,4-DHP en el sistema

cromatográfico. Como fase móvil se utilizó una mezcla de aacetonitrilo/ 0,05 M

tampón fosfato (55/45) a pH 4,3. Para cuantificar, se usó el detector de arreglo

de fotodiodo (PDA) a una longitud de onda de 360 nm para las 1,4-DHPs y de

250 nm para los productos de oxidación y reacción frente al anión radical

superóxido. La fase móvil se mantuvo con un flujo de 1 mL/min y se burbujeó

helio constantemente a 30 mL/min.

h) Espectroelectroquímica.

La electrolisis a potencial controlado fue seguida mediante espectrofotometría

UV-Vis. El potencial aplicado corresponde a aproximadamente 100 mV más

positivos que los potenciales de oxidación. Se siguió el curso de la electrolisis

registrando espectros cada 5 minutos.

i) Cálculos teóricos.

• Los cálculos de las geometrías óptimas de los compuestos neutros y

radicalarios, así como el cálculo de potenciales redox en DMSO se realizó

utilizando métodos SCF-DFT, basados en la Teoría de Funcionales de la

Densidad (DFT). Esta teoría se basa principalmente en determinar la densidad

18

electrónica del estado base de un sistema para poder extraer sus propiedades

(conocer la función de onda del sistema, Ψ2=ρ).

• La funcional utilizada corresponde a la funcional híbrida B3LYP[lxi,lxii], y las

bases orbitales analíticas cc-pVTZ(-f)[lxiii] y 631-G*[lxiv].

• Se aplicó un modelo de solvente continuo, basado en la solución numérica de

la ecuación de Poisson – Boltzmann[lxv] para los cálculos de energía. Las

estructuras utilizadas son obtenidas por optimización de geometría en fase gas

y posteriormente en fase solución.

j) Estudios biológicos.Medidas de calcio intracelular. Cada imagen fue registrada cada 2 s y el tiempo

de exposición fue de 200 ms. El registro del experimento es de

aproximadamente 500 segundos. Durante este tiempo se realizan los

siguientes pasos:

0 – 100 s: registro de actividad espontánea de las células.

100 -105 s: se agrega solución normal de alto potasio.

100 – 200 s: registro de actividad provocada por la presencia de una mayor

concentración de potasio en el medio.

200 – 300 s: se agrega solución normal, la cual contiene una concentración

de fármaco de 50 µM.

300 – 305 s: se agrega solución normal de alto potasio.

300 – 300 s: registro de actividad provocada por la presencia de una mayor

concentración de potasio en el medio luego de la acción del fármaco.

400 – 500 s: registro de actividad normal de la célula en presencia de solución

normal.

19

5. Resultados y discusión.

5.1. Preparación de los derivados.

La estrategia sintética se basa principalmente en la clásica síntesis de

Hantzsch (1850) y variaciones de la misma [lxvi], la cual se presenta en forma

resumida mediante la siguiente figura:

Figura 3. Síntesis clásica de Hantzch.

Síntesis de C4-Indolil 1,4-DHPs:

A una disolución de 6 mmol de aldehído (Indol-3-carboxaldehído e Indol-5-

carboxaldehído, Figura 4) en etanol (20 mL) se adicionaron 0,015 mol de Acetil acetato

de etilo y 0,01 mol de solución amoniaco. La disolución resultante se mantuvo a reflujo

en constante agitación durante 30 horas, bajo atmósfera de nitrógeno. Posteriormente

se destiló el disolvente al vacío obteniéndose un sólido anaranjado que se purificó por

cristalización en etanol / agua.

R

O

H

O

O

O O

O

O

R

NH4OH

O

O

O

NH4OH

NH2

O

O

NH2

O

OO

O

O

R

NH4OH

N

O

O

O

OR

H

Figura 4. Aldehídos utilizados en la síntesis de las 1,4-DHPs C4-indolil sustituidas. A: Indol-3-carboxaldehído, B: Indol-5-carboxaldehído.

Caracterización de los compuestos.

3-Ind-DHP: 2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-4-(3-Indolil)-1,4-dihidropiridina.

Rendimiento: 73%. Pf.:183-184º C. IR (KBr): δmax 3344.4; 2978.1; 1676.7; 1487.1;

1367.9; 1305.6; 1215.4; 1100.3; 1020.4; 807.2; 744.7. 1H-NMR (300 MHz, DMSO δ6):

δmax 1.18 (t, 6H, 2x -CH2-CH3); 2.31 (s, 6H, 2x -CH3); 4.03 (q, 4H, 2x -O-CH2-CH3); 5.23

(s, 1H, Ar-CH<); 6.975 (m, 3H, J = 7,83 Hz, 3 x Ar-H); 7.33 (d, 2H, J = 7.92 Hz, 2x Ar-

H); 7.92 (d, 2H, J = 7.92 Hz, 2x Ar-H); 8.89 (s, 1H, DHP-N-H); 10.74 (s, 1H, Indol-N-H). 13C-NMR (75 MHz, DMSO δ6): 13.70; 17.64: 29.98; 58.25; 101.43; 110.85; 117.54;

118.91; 119.77; 121.31; 122.17; 125.25; 135.54; 143.58; 166.71. Anal. Elem.

Calculado para: C21H24N2O4: C 68.46; H 6.57; N 7.60. Encontrado: C 67.89; H 6.71; N

7.61.

5-Ind-DHP: 2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-4-(5-Indolil)-1,4-dihidropiridina. Rendimiento: 61%. P. f.:178-180º C. IR (KBr): νmax 3351.2; 2978.5; 1657.6; 1481.6;

1371.4; 1303.5; 1208.2; 1100.5; 1018.2; 727.0. 1H-NMR (300 MHz, DMSO δ6): δmax

1.20 (t, 6H, 2x -CH2-CH3); 2.32 (s, 6H, 2x -CH3); 4.04 (q, 4H, 2x -O-CH2-CH3); 4.99 (s,

1H, Ar-CH<); 6.37 (s, 1H, Ar-H); 7.00 (d, 1H, J=7.92 Hz, 1 x Ar-H); 7.25 (m, 3H, J =

7,56 Hz, 3x Ar-H); 8.76 (s, 1H, DHP-N-H); 10.94 (s, 1H, Indol-N-H). 13C-NMR (75 MHz,

DMSO δ6): 13.74; 17.96: 48.802; 58.37; 100.20; 102.53; 110.01; 117.72; 120.76;

124.49; 127.07; 134.08; 138.52; 143.88; 166.71. Anal. Elem. Calcd. para.: C21H24N2O4:

C 68.46; H 6.57; N 7.60. Encontrado: C 67.00; H 6.85; N 7.38.

N

H

OH

N

H

H

OR=

A B

Síntesis de 1,4-DHPs a partir de derivados de vainillina e isovainillina:

Se calentó a reflujo durante 3 horas, una mezcla de 3,3 mmoles de acetil

acetato de etilo y 4,5 mL de solución amoniacal al 25% en 8,5 mL de etanol. La

solución resultante se adiciona a una mezcla de 3,3 mmoles de Acetil acetato de etilo,

3,3 mmoles del aldehído (vainillina e isovainillina, Figura 5), 5 mL de solución de

amoniaco al 25% y 4 mL de etanol. La mezcla resultante se calentó a reflujo por 15

horas. Se obtuvo un sólido color amarillo pálido, el cual se filtró al vacío y se lavó 3

veces con una mezcla fría de etanol/agua (1:1).

Figura 5. A: Vainillina, B: Isovainillina.

Caracterización de los compuestos.V-DHP: 2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-4-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,4-dihidropiridina. Rendimiento: 80.2 %.m.p.: 161 -163 ºC. IR (KBr): νmax 3350.0; 2982.7;

1680.7; 1652.4; 1489.7; 1369.1; 1303.9; 1271.9; 1216.7; 1121.9; 753.3. 1HNMR (300

MHz, DMSO d6): 1.1 (t, J= 7.0, 6H,2x -CH3); 2.2 (s, 6H, 2x-CH3); 3.7 (s, 3H, OCH3); 4.0

(q, J = 7.0, 4H, -CH2); 4.82 (s, 1H, C-H); 7,7; 6.6 (m, 3H, Ar); 8.6 (s, 1H, N-H); 8,7 (s,

1H, OH). 13CRMN (75 MHz, DMSO-d6): 15.0(2); 18.8(2); 39.0. 56.2. 60.0(2); 103.3(2);

113.2(2); 116.0; 120.5; 131.0; 140.5; 145.7(2); 147,6; 169. Anal. Calcd. para

C20H25O6N: C:63.98; H: 6.71; N: 3.73. Encontrado: C: 63.77; H: 7.55; N: 4.07.

I-DHP: 2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-4-(3-hidroxi--4metoxifenil)-1,4-dihidropiridina. Rendimiento: 61.6 %. m.p.: 166-168 ºC. IR (KBr): νmax 3316.4, 2957.6;

1669.5; 1592.4; 1484.2; 1371.1; 1270.7; 1209.2; 1116.1; 1018.3; 764.8. 1HNMR (300

MHz, DMSO d6): 1.2 (t, J= 7.0, 6H, -CH3); 2.3 (s, 6H, -CH3) 3.6 (s, 3H, OCH3); 4.0 (q, J

OH

O

OH

O

OH

OH

R=

A B

= 7.0, 4H, -CH2); 4.75 (s, 1H, C-H); 7,7; 6.6 (m, 3H, Ar); 8.70 (s, 1H, N-H); 8,72 (s, 1H,

OH). 13CRMN (75 MHz, DMSO-d6): 15.1(2); 19.5(2); 38.6. 58.2. 60.0(2); 102.9(2);

112.4(2); 116.0; 118.5; 133.5; 142.2; 146.1(2); 148.1; 167. Anal. Calcd. para

C20H25O6N: C:63.98; H: 6.71; N: 3.73. Encontrado: C: 63.77; H: 7.59; N: 4.06.

Síntesis del derivado C4-fenil-1,4-dihidropiridína:A una solución de 6,0 mmoles de aminocrotonato de etilo disuelto en 15 en

ácido acético glacial se adicionó gota a gota, una solución que contenía 3,0 mmoles de

benzaldehído disueltos en 5 mL de ácido acético glacial. Una vez adicionado todo el

benzaldehído, se calentó la solución durante 6 horas a 60°C. Una vez transcurridas las

6 horas de agitación se formó un precipitado de color amarillo. La solución se enfrió y

luego se filtró. Se obtuvo un sólido color amarillo, el cual se recristalizó en etanol y se

lavó 3 veces con una mezcla fría de etanol/agua (1:1).

Fenil-DHP: 2,6-Dimethil-3,5-dietoxicarbonil-4-fenil-1,4-dihidropiridina. Rendimiento: 92%. Pf: 150–153 °C. 1H NMR (300 MHz, DMSO d6): dmax 1,16 (t, 6H,

2· –CH2–CH3); 2.26 (s, 6H, 2· –CH3); 3.98 (q, 4H, 2· –O–CH2–CH3); 4.88 (s, 1H, Ar-

CH<); 7.18 (m, 3H, J = 6.975 Hz, 3· Ar-H); 7.22 (d, 2H, J = 8.14 Hz, 2· Ar-H); 8.80 (s,

1H, N–H). 13C NMR (75 MHz, DMSO d6): 10.51; 9.26; 9.07; 7.88; 7.78; 6.18; 2.09;

2.05; 2.04; 1.97; 0.63. Anal. Elem Calc. para C19H23O4N: C:62.28; H: 7.04; N: 4.25.

Encontrado: C: 63.08; H: 6.98; N: 4.33.

5.2. Medio aprótico: DMSO + 0,1 M de HFFTBA.

a) Voltametría y coulombimetría.

Se observó por VPD que los compuestos 4-Indolil sustituidos presentan dos

picos anódicos (Figura 6A). La primera señal de oxidación (pico I) se encontró a +988

mV para 3-Ind-DHP y a +992 mV para 5-Ind-DHP, mientras que el pico II aparece a

+1288 mV para 3-Ind-DHP y a +1292 mV para 5-Ind-DHP. Si comparamos estos

valores con los encontrados para Fenil-DHP que se oxida a +1060 mV y para indol

que tiene un potencial de oxidación de +1200 mV bajo las mismas condiciones

experimentales, podríamos asumir que para 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP la primera de las

señales correspondería a la oxidación del anillo dihidropiridínico, mientras que las

señales a mayores potenciales corresponderían a la oxidación del grupo indol

presente en la posición 4.

Figura 6: A: Voltamogramas de pulso diferencial de 1 mM de cada compuesto en DMSO, HFFTBA 0,1 M. B: Voltamograma cíclico de los compuestos. Velocidad de barrido= 0,1

V/s. DMSO, HFFTBA 0,1 M.

Como se observa en la figura 6A, los potenciales correspondientes a la

oxidación del grupo indolil son desplazados hacia valores más positivos en ambos

compuestos comparados con la molécula de indol (∆= 90 mV, aproximadamente). Por

otra parte, si analizamos la oxidación de la 1,4-DHP podemos concluir que ésta ocurre

más fácil que la 4-fenil-DHP. Estos resultados se pueden explicar debido a que ambos

centros están mutuamente interaccionando en sus respuestas redox. Si el anillo DHP

está enlazado a la posición-3 y -5 del indol, se produce una alta densidad electrónica

en esa posición, dificultando la oxidación del indolil y facilitando la oxidación del anillo

600 800 1000 1200 1400

Pico II

Pico II

Pico I

A

5-Ind-DHP

3-Ind-DHP

Pico I

Indol

Fenil-DHP

5µ A

E (Ag / AgCl) / mV0 200 400 600 800 1000 1200 1400

B

5-Ind-DHP

3-Ind-DHP

Indol

4-Fenil-DHP

10 µ A

E (Ag / AgCl) / mV

DHP. Estos resultados concuerdan con cálculos teóricos moleculares INDO

postulados por Waltman y colaboradores [lxvii], quienes describen que el catión radical

indol, el radical intermediario en la oxidación vía un electrón del indol, se caracteriza

por una alta densidad de espín en las posiciones -1, -3 y -5.

Mediante estudios coulombimétricos, se determinó el número de electrones

involucrados en el proceso oxidativo de ambos compuestos en DMSO. Mediante una

electrolisis a potencial constante (+1500 mV) se obtuvo un promedio de 3 electrones

totales involucrados en la oxidación de ambos centros redox por mol de compuesto. La

electrólisis a +1100 mV determinó que el número de electrones promedio involucrados

durante el primer proceso oxidativo (pico I) es de 2 electrones por mol de 1,4-DHP. Por

lo tanto, de un total de 3 electrones involucrados en la oxidación de 3-Ind-DHP y 5-Ind-

DHP, un total de dos electrones estaría involucrado en la primera señal de oxidación

(pico I, oxidación del anillo dihidropiridínico) y 1 electrón en la oxidación de la señal a

potenciales mayores (pico II, oxidación del grupo indolil). Al finalizar la electrolisis a

+1500 mV, se encontró un depósito verde-azulado depositado sobre la malla de

carbón reticulado que se utilizó como electrodo de trabajo.

Por VC a todas las velocidades de barrido estudiadas (0,1- 3 V/s), los

compuestos 4-Indolil sustituidos presentaron dos señales anódicas irreversibles

(Figura 3B), mientras que la 4-Fenil-DHP y el Indol presentaron una señal anódica

irreversible. Los gráficos logarítmicos de corriente vs velocidad de barrido mostraron

pendientes entre 0,5 y 1,0 en todos los casos; indicando que la corriente está

controlada por un fenómeno mixto (difusión y adsorción). Los potenciales de oxidación

fueron dependientes de la velocidad de barrido, respaldando el carácter irreversible de

la oxidación de estas moléculas en este medio.

Por otra parte, el voltamograma de pulso diferencial de V-DHP (Figura 7A)

muestra dos picos anódicos, el primero de ellos con un potencial de +824 mV y el

segundo a +1118 mV. I-DHP también presentó dos picos de oxidación, sin embargo,

los potenciales fueron más positivos comparados con V-DHP. Los valores de

potenciales de pico de I-DHP fueron Epico I= +884 mV y Epico II= +1174 mV.

Considerando que el potencial de oxidación de la 4-fenil-DHP es de +1064 mV y que

Guayacol (2-metoxifenol) se oxida a +950 mV (Figura 7B) se puede concluir que el

pico que aparece a potenciales menos positivos (pico I) correspondería a la oxidación

del grupo OH y el pico que aparece a potenciales más positivos correspondería a la

oxidación del anillo 1,4-DHP (pico II).

Figura 7. A: Voltamogramas de pulso diferencial de 1 mM de A: V-DHP e I-DHP . B: Fenil-DHP y Guayacol, en DMSO + HFFTBA 0,1 M.

Cambios en los potenciales de oxidación de V-DHP e I-DHP comparado con

los compuestos no substituidos mencionados anteriormente evidencian un

desplazamiento hacia potenciales menos positivos para la oxidación del grupo OH y

un desplazamiento hacia valores más anódicos para la oxidación del anillo 1,4-DHP.

Estos resultados son consistentes con el efecto electrón-donor de ambos grupos

metoxilos y el anillo dihidropiridínico sobre la oxidación del grupo OH. Primero, en el

caso de V-DHP, el anillo dihidropiridínico se encuentra en posición para respecto del

grupo OH, el cual contribuye a aumentar la densidad electrónica de este grupo

facilitando su oxidación. Dicho efecto puede sostenerse al observar la figura 7A, donde

V-DHP exhibe un potencial de oxidación menor que I-DHP (ΔEpico I= 60 mV). Por otra

parte, la oxidación del grupo OH genera el radical fenoxilo, el que finalmente da lugar a

la formación de un derivado quinona [lxviii,lxix], el cual afecta la oxidación del anillo DHP

produciendo un desplazamiento del potencial de oxidación de éste hacia valores más

altos.

Los estudios coulombimétricos, arrojaron un promedio de 3 electrones (por mol

de compuesto) involucrados en el proceso oxidativo total de V-DHP e I-DHP en DMSO

cuando la electrolisis se realizó a +1270 mV. La electrólisis a +900 mV determinó que

el número de electrones promedio involucrados durante el primer proceso oxidativo

(pico I) es de 1 electrón por mol de 1,4-DHP. En conclusión, de los 3 electrones

involucrados en la oxidación de V-DHP e I-DHP, 1 electrón estaría involucrado en la

primera señal de oxidación (pico I, oxidación del grupo -OH) y 2 electrones en la

400 600 800 1000 1200 1400

A

pico II

pico II

pico I

pico I

I-DHP

2µ A

E / mV (Ag / AgCl)

V-DHP

600 800 1000 1200

B

4-Fenil-DHP

Guayacol

2µ A

E / mV (Ag / AgCl)

oxidación de la señal a potenciales más positivos (pico II, oxidación del anillo 1,4-

DHP).

Figura 8: Voltamogramas cíclicos. Oxidación de los compuestos V-DHP (A) e I-DHP (B) (1mM) en DMSO + HFFTBA 0,1 M.

Los experimentos de voltametría cíclica se realizaron a diferentes velocidades

de barrido (100 a 4000 mV / s). Bajo estas condiciones, se obtuvieron señales

anódicas irreversibles como se muestra en la figura 8. Los gráficos de log ip vs log v

arrojaron pendientes cercanas a 0,5 para ambas señales, lo que indica que el proceso

está controlado por difusión. Además, los potenciales de oxidación fueron

dependientes de la velocidad de barrido en todo el rango estudiado, respaldando el

carácter irreversible de la oxidación de los compuestos en este medio.

Con el fin de obtener los coeficientes de difusión de los compuestos, se estudió

la oxidación de éstos a diferentes velocidades de rotación del electrodo por

voltamperometría lineal (figura 9A). Al registrar la corriente límite por VDR vs la raíz de

la velocidad de rotación del electrodo, se obtuvieron rectas que están de acuerdo con

la ecuación de Levich[lxx]. Los valores de coeficientes de difusión obtenidos se

muestran en la tabla 2. En la figura 9B, se muestran los voltamogramas sobre un

electrodo rotatorio de grafito correspondiente a soluciones 1 mM de V-DHP e I-DHP.

Ambos derivados exhiben dos ondas de oxidación (I – II). Los valores de potenciales

de media onda para V-DHP fueron: I=+848 mV, II=+1160 mV; y para I-DHP fueron:

I=+851 mV, II=+1157 mV. La 1,4-DHP C4-fenil sustituida presentó una única onda

anódica cuyo potencial de media onda fue de +1051.mV a una velocidad de rotación

de 500 rpm. Dicha onda corresponde a la oxidación del anillo dihidropiridínico. En

consecuencia, la primera onda corresponde a la oxidación del hidroxilo y la segunda a

la oxidación del anillo DHP. Al comparar entre isómeros no se observan diferencias

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

-50

0

50

100

150

200 A3,0 V / seg

0,1 V / seg

i / µ

A

E / mV (Ag / AgCl)

-200 0 200 400 600 800 1000120014001600

-50

0

50

100

150

200 B4,0 V / seg

0,1 V / seg

i / µ

AE / mV (Ag / AgCl)

significativas entre éstos, sin embargo las 1,4-DHPs C4-Indolil sustituidas presentaron

los valores más bajos, mientras que V-DHP e I-DHP presentaron los valores de

coeficientes de difusión más altos.

Figura 9A: Voltamogramas de barrido lineal con electrodo de disco rotatorio de 1 mM de V-DHP, I-DHP y Fenil-DHP en. DMSO, HFFTBA 0,1 M. Velocidad de rotación del electrodo:

500 rpm. Figura 9B: Voltamogramas lineales a diferentes velocidades de rotación del electrodo. Compuesto 3-Ind-DHP, 1 mM. DMSO, HFFTBA 0,1 M.

Tabla 2: Coeficientes de difusión calculados para los compuestos estudiados. Viscosidad cinemática del DMSO a 25°C: 0,01817 stokes.

Coeficientes de difusión /(cm2 s-1 / 106)

Compuesto DMSO + 0,1 M de HFFTBA

3-Ind-DHP 2,50 ± 0,2

5-Ind-DHP 2,32 ± 0,2

4-Fenil-DHP 2,77 ± 0,1

V-DHP 3,71 ± 0.1

I-DHP 3,22 ± 0.2

400 600 800 1000 1200 1400

B II

II

I

I

V-DHP

4-Fenil-DHP

I-DHP 10 µ A

E / mV (Ag / AgCl)750 900 1050 1200 1350 1500

A

20 µ A

E / mV (Ag / AgCl)

b) Estudios por Resonancia de Espín Electrónico (REE).

Para identificar la generación de posibles intermediarios en el proceso de

oxidación en medio aprótico se realizaron experimentos de electrólisis a potencial

controlado acoplados con REE. Se utilizó como atrapador de radicales libres N-tert-

butilamina-α-fenilnitrona (PBN). La electrólisis de 1mM de los compuestos indolil

sustituidos se realizó de la siguiente manera: Para la fenil-DHP se aplicó un potencial

de +1100 mV debido a que sólo presenta una señal de oxidación la que corresponde a

la oxidación del anillo dihidropiridínico en presencia de un exceso del atrapador.

Como se observa en la figura 10 el espectro REE evidencia la formación de un

nitróxido espín aducto, mostrando un triplete debido al nitrógeno de la nitrona, el que

se desdobla en dobletes debido a los hidrógenos adyacentes.

Figura 10: Espectros REE del aducto PBN-radical piridinio. Radical electroquímicamente generado desde una solución de 1,4-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA. A: Línea base correspondiente a la electrólisis de PBN. B: 1mM de Fenil-DHP + PBN (100 barridos).

Para 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP, en primer lugar se aplicó un potencial 100 mV

más positivo que los potenciales de pico correspondientes al primer pico anódico, que

involucra la oxidación del anillo 1,4-DHP y luego a la misma solución se aplicó un

potencial 100 mV mayor que el potencial de pico correspondiente a la oxidación del

indolil en posición 4, siempre en presencia de un exceso del atrapador PBN. El

espectro REE evidenció la formación del espín aducto en ambos casos al aplicar el

potencial correspondiente a la oxidación del anillo dihidropiridínico (figura 11A y B). Sin

embargo, al aplicar un potencial suficiente para oxidar el indol en posición 4, no se

obtuvo cambios en el espectro de 3-Ind-DHP. Por el contrario, el espectro de 5-Ind-

A

B

A

*

*

B

C

A

*

*

B

C

DHP mostró nuevas señales (* en Figura 11C), lo que podría atribuirse a la formación

de un nuevo espín aducto en el cual esté involucrado en grupo indolil.

Figura 11: Espectros REE del aducto PBN-radical piridinio. Radical electroquímicamente generado desde una solución de 1mM de A: 3-Ind-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA (100

barridos) a +1100mV. B: 5-Ind-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA (100 barridos) a +1100mV. C: 5-Ind-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA (100 barridos) a +1500mV.

Según datos encontrados en la literatura, indol e indoles sustituidos se oxidan

vía 1 electrón - 1 protón para formar un catión radical que en una primera instancia

está centrado en el átomo de Nitrógeno. Este catión radical está en equilibrio

resonante con un radical centrado en el carbono de la posición 3 (Esquema 3).

Esquema 3. Electrooxidación de indol. Formación de un catión radical centrado en nitrógeno en equilibrio con el catión radical centrado en carbono.

Según cálculos teóricos, existe una alta densidad de espín sobre la posición 1

y 3 del indol, lo que explicaría la diferencia en los espectros REE de ambos isómeros.

En el caso de 3-Ind-DHP la posición 3 del indolil está directamente enlazada al anillo

dihidropiridínico por lo que la probabilidad de centrar el radical en dicha posición es

menor, y en el caso de que así fuera existe un gran impedimento estérico para que el

atrapador forme el espín aducto. Por el contrario, la 5-Ind-DHP tiene libre la posición 3

lo que facilitaría el atrapamiento del radical en esa posición por parte del PBN.

Compuesto aN/Gauss aH/Gauss

Fenil-DHP13,2 3,5

3-Ind-DHP 13,9 2,1

5-Ind-DHP 14,0 2,2

Tabla 3: Constantes de acoplamiento aN y aH de los espín aductos formados con PBN durante la electrolisis de los compuestos en estudio en DMSO + 0,1 mM de HFFTBA.

Los valores de constantes de acoplamiento obtenidos durante la electrolisis a

potencial controlado y que se muestran en la tabla 10, son consistentes con que el

atrapador PBN interactuó con radicales libres centrados en carbono, como se describe

para otras 1,4-DHPs y otros compuestos con un atrapador similar [lxxi]. Los espectros

presentaron un ancho de línea que indicaría que el atrapador habría interactuado con

más de una especie radicalaria, lo que se explica por la delocalización del radical

piridinio sobre la posición 2,4 y 6 del anillo dihidropiridínico.

N

H

N

-1e, -1H+

N1

35

c) Caracterización por cromatografía gaseosa acoplada a un detector de masas (GC/MS) de los derivados sintetizados y los productos finales de la oxidación electroquímica.

Los derivados V-DHP e I-DHP fueron silanizados con N-metil-N-trimetilsilil-

trifluoroacetamida (MSTFA) previo a la inyección para mejorar las características

cromatográficas gaseosas.

i) Fragmentación de las 1,4-DHP.

En primer lugar se estudió la fragmentación de los compuestos sintetizados. El

fragmento más abundante corresponde a m/z 252 en todos los derivados, excepto en

la 3-Ind-DHP cuyo fragmento más abundante fue el de m/z 295. El fragmento m/z 252

se forma directamente a partir de los iones, por la pérdida del sustituyente en la

posición-4. Así, todos los derivados que directamente están enlazados a un anillo

aromático tuvieron una similar vía de fragmentación.

Los compuestos Fenil-DHP, 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP presentaron tiempos de

retención de 8,65; 11,92 y de 12,16 minutos , respectivamente. Dicho cromatograma

con el patrón de fragmentación se muestran en las figuras 12, 13 y 14

respectivamente.

Tal como se observa en la Figura 12 para el derivado fenil-DHP junto con el

fragmento más abundante de m/z 252, se observa el fragmento m/z 196 entre un 20 a

30% de abundancia que corresponde a la pérdida del grupo fenilo y la pérdida

completa de ambos grupos etilos en las posiciones 3 y 5, formando los respectivos

ácidos. Por otro lado, la pérdida consecutiva de un grupo etilo y del fenilo produjo un

fragmento de m/z 224 (6-9%). Fragmentos de menor abundancia (menos de un 5%)

son aquellos que poseen el ión molecular de m/z 327, m/z 301 correspondiente a la

pérdida de un grupo etilo y m/z 284 correspondiente a la pérdida de un grupo etoxilo.

La fragmentación se presenta en el esquema 4.

Figura 12. Ión cromatograma del derivado fenil-DHP y espectro de masas de los fragmentos.

7.80 8.00 8.20 8.40 8.60 8.80 9.00 9.20 9.40 9.60 9.8010.0010.2010.400

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000

650000

700000

Time-->

Abundance

Ion 252.00 (251.70 to 252.70): 0902DHP1.D 8.65

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 3800

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000

650000

700000

m/z-->

Abundance

Scan 310 (8.648 min): 0902DHP1.D252

196

224

284300150 32917877 105 12851 268 368352

Esquema 4. Vías de fragmentación del derivado fenil-DHP.

En la Figura 13, se muestra el cromatograma y el espectro de masas del

derivado 3-Ind-DHP. Tal como se observa en dicha figura, los fragmentos de mayor

abundancia resultaron aquellos con m/z 295, m/z 368, m/z 339 y m/z 267. En este

caso el fragmento más abundante es el m/z 295 (100%) que corresponde a la perdida

completa de uno de los sustituyentes en la posición 3 o 5 del anillo 1,4-DHP. Cabe

resaltar que el m/z 368 que corresponde al ión molecular del derivado se encuentra en

un 50%. Entre los patrones de fragmentación el m/z 252 correspondiente a la pérdida

del sustituyente presente en posición C4 se encuentra en un 20% lo que se podría

atribuir a que el anillo dhihidropiridínico está enlazado a la posición 3 del indol y es por

esta razón que las abundancias en los patrones de fragmentación son diferentes para

este derivado.

N

H

O

O

O

O

N

H

O

O

O

O

N

H

HO

O

OH

O

m/z 329

N

H

O

O

OH

O

N

H

O

O O

m/z 252 m/z 196

m/z 301 m/z 284

2x CH3 -CH

2 -

CH3-CH2-O-CH3-CH2-

N

H

O

O

OH

O

CH3-CH2-

m/z 224

Figura 13. Ión cromatograma del derivado 3-Ind-DHP y espectro de masas de los fragmentos.

6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

5500000

6000000

6500000

Time-->

AbundanceIon 295.00 (294.70 to 295.70): 108DHP3.D

11.92

50 100 150 200 250 300 350 400 4500

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

5500000

6000000

m/z-->

AbundanceScan 402 (11.878 min): 108DHP3.D (-)

5163

89

117

150 179

206

221

267

295

323

339

368

393 426446 477490

Esquema 5. Vías de fragmentación del derivado 3-Ind-DHP.

Como se observa en figura 14, los fragmentos de mayor abundancia del

derivado 5-Ind-DHP resultaron ser aquéllos con m/z 252, m/z 368, m/z 295 y m/z 196.

En este caso el fragmento más abundante es el m/z 252 (100%) que corresponde a la

perdida del indol de la posición 4 del anillo 1,4-DHP. El ión molecular de m/z 368 se

encuentra en un 40%. Patrones de similar m/z a los encontrados para 3-Ind-DHP son

menos abundantes. La diferencia entre la abundancia de dichos fragmentos entre

ambos isómeros estaría dada por la posición entre el enlace del anillo 1,4-DHP y el

indol. En el caso de 5-Ind-DHP el enlace está directamente unido al anillo benceno del

indol y por esta razón el fragmento más abundante de m/z 252 coincide con el de la

fenil-DHP.

N

O

O

O

O

H

NH

N

O

O

H

N

H

N

O

O

O

O

H

N

H

N

O

O O

H

N

H

N

HO

O

H

N

H

m/z 222

m/z 267

m/z 295

m/z 368

m/z 339

m/z 323

N

H

N

H

O

O

H2CCH2

CO2

H2CCH2

Figura 14. Ión cromatograma del derivado 5-Ind-DHP y espectro de masas de los fragmentos.

50 100 150 200 250 300 350 400 4500

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

5500000

6000000

6500000

m/z-->

AbundanceScan 412 (12.050 min): 108DHP4.D

53

67

89

117

150178

196

224

252

295

323

339

368

383 406 446 469 499

6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

Time-->

AbundanceIon 368.00 (367.70 to 368.70): 108DHP4.D

12.16

Esquema 6. Vías de fragmentación del derivado 5-Ind-DHP.

Los cromatogramas, los patrones de fragmentación y las vías de fragmentación

propuestas para los compuestos V-DHP e I-DHP luego de la derivatización con

trimetilsilano (TMS) se muestran en las Figuras 15 y 16 y en los esquemas 7 y 8. En

estas Figuras se puede observar que la primera vía general, corresponde a la pérdida

del sustituyente completo de la posición-4, dando lugar a un fragmento común de m/z

252, que corresponde al pico de base con las más altas abundancias (100 %). Los

tiempos de retención (Rt) de ambos compuestos silanizados fueron de 11,8 minutos

para V-DHP y de 11,5 minutos para I-DHP, en las condiciones experimentales

anteriormente descritas.

En la figura 15, se muestra la fragmentación del derivado V-DHP. Tal como se

observa en dicha Figura, los fragmentos de mayor abundancia resultaron aquéllos con

m/z 252, m/z 224 y m/z 196. Los resultados encontrados para el compuesto I-DHP son

mostrados en la figura 16. Se observa que la posición del grupo OH no afectó los

patrones de fragmentación de este compuesto.

N

O

O

O

O

H

N

H

N

O

O

O

O

H

NH

N

O

O

O

O

H

N

O

O

OH

O

H

N

HO

O

OH

O

H

N

O

O

H

NH

m/z 252

m/z 224

m/z 196

m/z 339

m/z 295

m/z 368

N

H

H2CCH2

H2CCH2

H2CCH2

CO2

Figura 15. Ión cromatograma del derivado V-DHP y espectro de masas de los fragmentos.

9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 13.00 13.50 14.000

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000

1200000

1300000

1400000

1500000

Time-->

Abundance

Ion 252.00 (251.70 to 252.70): 238DHP1.D 11.51

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 5500

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000

1200000

1300000

1400000

1500000

m/z-->

Abundance

Scan 1173 (11.506 min): 238DHP1.D (-)252

196

73374

150 418224447

45 316106 344172128 286 470 565510396

Esquema 7. Vías de fragmentación del derivado V-DHP.

N

H

O

O

O

O

OTMS

O

N

H

OH

O

O

O

OTMS

O

N

H

O

HO

O

OTMS

O

N

H

O

O

O

O

N

H

OH

O

HO

O

N

H

OH

O

O

O

m/z 447

m/z 252

m/z 224 m/z 196

m/z 418

m/z 374

OTMS

O

CH3-CH2-

2x CH3 -CH

2 -

CH3-CH

2-

CH3-CH2-H2O

Figura 16. Ión cromatograma del derivado I-DHP y espectro de masas de los fragmentos.

9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 13.00 13.500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000

650000

700000

750000

Time-->

Abundance

Ion 252.00 (251.70 to 252.70): 238DHP2.D 11.57

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 5500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000

650000

700000

m/z-->

Abundance

Scan 1181 (11.557 min): 238DHP2.D (-)252

196

73374 418

150 224447

31610645 344285 477 552 591528

Esquema 8. Vías de fragmentación del derivado I-DHP.

ii) Fragmentación e identificación de productos generados en la electrolisis a potencial controlado.

Las soluciones electrolizadas en las condiciones experimentales descritas

anteriormente fueron analizadas también por CG-MS. En todos los casos, los tiempos

de retención de los compuestos oxidados (piridinas) disminuyeron respecto de los

derivados sintetizados (1,4-dihidropiridinas). Una de las características principales de

estas vías es que de acuerdo a la fragmentación no se pierde el sustituyente de la

posición-4 (grupos fenilo, indolil, 2-metóxifenol y 3-metóxifenol) a diferencia de la

fragmentación en los compuestos 1,4-DHPs. En este caso, la fragmentación implica

principalmente la pérdida parcial o total de los sustituyentes de las posiciones 3 y 5 de

las piridinas respectivas. Probablemente, la formación de piridina impide la reacción de

N

H

O

O

O

O

O

OTMS

N

H

O

O

O

O

N

H

OH

O

HO

O

N

H

OH

O

O

O

O

OTMS

N

H

O

HO

O

O

OTMS

O

OTMS

2 x CH3-CH2-

m/z 447

m/z 252

m/z 196

CH3-CH

2-

CH3-CH2-H2O m/z 418

m/z 374

eliminación del sustituyente de la posición-4, estabilizando la carga interna

favoreciendo la deslocalización en todo el sistema.

Figura 17. Ión cromatograma del derivado fenil-DHP electrolizado a 1200 mV durante 90 minutos en DMSO + 0,1 M de HFFTBA, y espectro de masas de los fragmentos.

5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.500

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

Time-->

AbundanceIon 327.00 (326.70 to 327.70): 2310DHP7.D

7.47

50 100 150 200 250 300 350 400 4500

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

m/z-->

AbundanceScan 143 (7.468 min): 2310DHP7.D

5677

105115

139

180

210

236

254

282

312

327

355 402 429446463 489

Esquema 9. Vías de fragmentación del derivado oxidado de fenil-DHP en DMSO aplicando un potencial de 1200 mV.

En todos los casos, el fragmento más abundante corresponde a los iones

moleculares, M+. En la figura 17 se muestra el cromatograma y la fragmentación del

derivado oxidado fenil-DHP, el cual presenta un tiempo de retención de 7,4 minutos.

Tal como muestra la Figura, los fragmentos de mayor abundancia resultaron ser el ión

molecular, M+ 327, los fragmentos de m/z 254 (pérdida simultánea de un grupo etoxi y

etilo de las posiciones 3 y 5, m/z 236 (pérdida simultánea de los dos grupos etoxi de

las posiciones 3 y 5) y m/z 282 (pérdida del un grupo etilo).

N

O

O

O

O

N

O

O

O

N

O

O

N

OO

N

O

N

CH 3-CH 2-O

-

-CO

2x CH3 -CH

2 -O -

-CO

-CO

m/z 327

m/z 282

m/z 254

m/z 236

m/z 210m/z 180

Figura 18. Ión cromatograma del derivado 3-Ind-DHP electrolizado a 1100 mV durante 90 minutos en DMSO + 0,1 M de HFFTBA, y espectro de masas de los fragmentos.

6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Time-->

AbundanceIon 366.00 (365.70 to 366.70): 2310DHP8.D

10.41

50 100 150 200 250 300 350 400 4500

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

2000000

m/z-->

AbundanceScan 315 (10.396 min): 2310DHP8.D

56 73 100126

142178

207219

247

291321

338

366

401 429446461 489

Esquema 10. Vías de fragmentación del derivado oxidado a 1100 mV de 3-Ind-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA.

Por otra parte, los cromatogramas y los patrones de fragmentación de los

productos indolil sustituidos oxidados a 1100 mV se muestran en las figuras 18 y 19.

En ambos casos, se observa el ión molécular como el fragmento más abundante con

un m/z 366 (100%). Otros fragmentos encontrados son m/z 321 (30%) correspondiente

a la pérdida de uno de los grupos etoxilo de las posiciones 3 o 5, m/z 293 (25%)

formado por la pérdida de un grupo CO y m/z 248 (20%) debido a la pérdida de un

segundo grupo etoxilo. La vía de fragmentación propuesta se muestra en el esquema

7. Luego, al realizar la electrolisis del mismo compuesto a 1500 mV, no se obtuvo un

cromatograma definido y como se mencionó anteriormente se observó la formación de

un residuo azulado absorbido sobre la malla de carbón utilizada como electrodo de

trabajo en la EPC.

N

O

NH

O O

O

N

O

NH

O

O

N

O

NH

O

N

O

NH

CH3 -CH

2 -O -

-CO

CH3 -CH

2 -O -

m/z 366

m/z 321

m/z 293

m/z 248

Figura 19. Ión cromatograma del derivado 5-Ind-DHP electrolizado a 1200 mV durante 90 minutos en DMSO + 0,1 M de HFFTBA, y espectro de masas de los fragmentos.

50 100 150 200 250 300 350 400 4500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000

650000

700000

750000

m/z-->

AbundanceScan 343 (10.872 min): 2310DHP9.D (-)

4773

103 133152178 207

219

248

275

321

338

366

405 430447 475489

6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.000

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000

1200000

1300000

1400000

Time-->

AbundanceIon 366.00 (365.70 to 366.70): 2310DHP9.D

10.86

Esquema 11. Vías de fragmentación del derivado oxidado a 1100 mV de 5-Ind-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA.

Por otra parte, la solución electrolizada a 1100 mV de 5-Ind-DHP presentó una

única señal cromatográfica a 10,8 minutos y el patrón de fragmentación presentó como

fragmento más abundante al ión molecular con un m/z de 366 (100%). Luego se

observa un fragmento con m/z 275 correspondiente a la pérdida de los grupos etoxilos

(de las posiciones 3 y 5), luego un m/z 248 debido a la perdida de CO y luego la

pérdida de otro CO dando lugar a un fragmento con m/z 220.

N

O

O

O

O

N

H

N

O O

N

H

N

O

N

H

N

N

H

2x CH3 -CH

2 -O -

-CO

-CO

m/z 366

m/z 276

m/z 248

m/z 220

Figura 20. Ión cromatograma del derivado V-DHP electrolizado a 1280 mV durante 90 minutos en DMSO + 0,1 M de HFFTBA, y espectro de masas de los fragmentos.

7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

Time-->

Abundance

Ion 445.00 (444.70 to 445.70): 163DHP2.D 8.82

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 6000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000

m/z-->

Abundance

Scan 747 (8.810 min): 163DHP2.D73

445415

324298 35445 268227197148115 387172 535567475 594508

Figura 21. Ión cromatograma del derivado I-DHP electrolizado a 1280 mV durante 90 minutos en DMSO + 0,1 M de HFFTBA, y espectro de masas de los fragmentos.

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 6000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

220000

m/z-->

Abundance

Scan 736 (8.741 min): 163DHP5.D445

73

415384

298 35432445 270228198154115 496528 562471 586

8.00 8.20 8.40 8.60 8.80 9.00 9.20 9.40 9.60 9.80 10.0010.2010.4010.600

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

220000

Time-->

Abundance

Ion 445.00 (444.70 to 445.70): 163DHP5.D 8.75

Esquema 12. Vías de fragmentación del derivado oxidado a 1280 mV de V-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA.

Los compuestos V-DHP e I-DHP oxidados a 980 mV no presentaron cambios

en el ión cromatograma ni en el patrón de fragmentación respecto a las figuras 20 y

21. Sin embargo, al aplicar un potencial constante de 1280 mV, los tiempos de

retención disminuyeron a 8,8 y 8,7 minutos para V-DHP e I-DHP respectivamente.

Ambos compuestos oxidados presentaron un similar patrón de fragmentación como el

que se muestra en el esquema 11. Se puede observar en el patrón, el fragmento más

abundante correspondiente al ión molecular cuyo m/z es de 445 (derivado silanizado).

Se observan además, otros dos fragmentos, el primero de ellos con un m/z 415 que

corresponde a la pérdida del grupo metoxilo vecino al grupo –OTMS y otro fragmento

derivado del anterior en el cual se pierden los grupos O-CH2-CH3 de las posiciones 3 y

5 del anillo piridínico (m/z 324).

N

O

O

O

O

OTMS

O

N

O

O

O

O

OTMS

N

OO

OTMSCH 3-O

-

2x CH3-CH2-O-

m/z 415

m/z 445

m/z 324

d) Caracterización por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de los derivados sintetizados y los productos finales de la oxidación electroquímica.

Esta técnica se utilizó para seguir la electrólisis de los compuestos y estudiar la

posibilidad de cuantificar no sólo el decaimiento de la concentración del derivado 1,4-

DHP, sino en lo posible la piridina u otro producto que se forma en el curso de la

electrolisis.

Se encontró que era posible separar el compuesto sintetizado y el derivado

oxidado a través de la siguiente fase móvil: acetonitrilo/tampón fosfato [55/45] a pH

4,3, con un flujo de 1 mL/min a 35 ºC. Se puede observar una única señal

cromatográfica para los derivados sintetizados en las condiciones experimentales

mencionadas anteriormente. Los derivados de la vainillina e isovainillina presentaron

tiempos de retención cercanos a los 4 minutos, mientras que las C4-indolil DHPs

presentaron tiempos de retención mayores, cercanos a los 6 minutos (Figura 22, Tabla

2).

Figura 22: Señales cromatográficas (HPLC) de los derivados. Detector arreglo de fotodiodos. Fase móvil: acetonitrilo/tampón fosfato pH 4,3; 55/45. flujo: 1 mL/min, 35 ºC.

Un caso aparte fue el cromatograma de la fenil-DHP la cual presentó un tiempo

de retención mucho mayor que los otros derivados. Como se puede observar en la

figura 19, dicho compuesto presentó un tiempo de retención en la columna cercano a

los 8,5 minutos.

3 4 5 6 7 8 9 10

5-Ind-DHP

3-Ind-DHP

tiempo / min.3 4 5 6 7 8 9 10

I-DHP

V-DHP

tiempo / min

Los tiempos de retención y las longitudes de onda máxima a los cuales se

midió la absorción de los derivados se muestran en la tabla 2.

Figura 23: Cromatograma (HPLC) de fenil-DHP. Detector arreglo de fotodiodos. Fase móvil: acetonitrilo/tampón fosfato pH 4,3; 55/45. flujo: 1 mL/min, 35 ºC.

Tabla 3: Características UV-visible y cromatográficas de las 1,4-DHPs[a]Características espectrales UV-vis de las 1,4-DHPs.

[b] Promedio de los tiempos de retención determinados por detector de arreglo de fotodiodos.

En la figura 24A, se ilustra la evolución temporal de las señales encontradas

para la electrólisis a potencial controlado a 1100 mV para el derivado 3-Ind-DHP

seguida con detector de arreglo de fotodiodos (λ 254 nm). Se observa que a tiempo

Compuesto λ max[a]

1,4-DHPTr / min

1,4-DHP[b]

3-Ind-DHP 355 5,9

5-Ind-DHP 356 5,5

V-DHP 288-372 3,9

I-DHP 352 4,1

Fenil-DHP 354 8,5

3 4 5 6 7 8 9 10

Fenil-DHP

tiempo / min.

5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5

A

gfedcba

0,5 UA

tiempo / minutos

7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0

B

7

65

4

3

2

1

0,2 UA

tiempo / minutos

cero de electrolisis hay una única señal con un tiempo de retención de 5,9 minutos

correspondiente al compuesto 1,4-dihidropiridínico. A medida que transcurre el tiempo

de electrolisis dicha señal disminuye su intensidad y aparece una nueva señal a un

tiempo de retención mayor de 6,2 minutos, la que correspondería al oxidado piridínico.

Luego al aplicar el potencial de 1500 mV, ambas señales desaparecen y nuevamente

se observa la formación de un residuo azulado sobre la malla de carbón utilizada como

electrodo de trabajo. Se observó un resultado similar para 5-Ind-DHP, esto es, sólo

dos señales cromatográficas, la primera correspondiente a la 1,4-DHP con un tiempo

de retención de 5,5 minutos y luego del derivado oxidado a un tiempo de retención

mayor de 5,9 minutos. En el caso de la fenil-DHP, también se observó una señal

correspondiente a la piridina cuando el derivado es oxidado e 1200 mV (figura 24B).

Figura 24. A: Curso temporal de una electrólisis a potencial controlado aplicando +1200 mV del compuesto 3-Ind-DHP (1 mM) en DMSO + 0,1 M de HFFTBA; (a) Señal original, (b) 10 minutos (c) 20 minutos, (d) 30 minutos, (e) 40 minutos, (f) 50 minutos, (g) 60 minutos.

B: Curso temporal de la EPC a 1200 mV de fenil-DHP (1 mM) en DMSO + 0,1 M de HFFTBA. Detector de arreglo de fotodiodo (λ=250 nm). Fase móvil: acetonitrilo/tampón

fosfato pH 4,3; 55/45. flujo: 1 mL/min, 35 ºC.

En el caso de los derivados de la vainillina e isovainillina, en el que en primer

lugar se oxida el sustituyente en posición C4 no se observaron cambios

cromatográficos en las condiciones experimentales. Luego al oxidar a un potencial

mayor de 1280 mV, aparece la nueva señal correspondiente al derivado piridínico.

En resumen, en todos los casos se obtuvieron las dos señales descritas

anteriormente, en las cuales el producto piridínico presentó tiempos de retenciones

mayores que los derivados 1,4-DHP. A partir de estos experimentos podemos concluir

5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5

A

gfedcba

0,5 UA

tiempo / minutos

7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0

B

7

65

4

3

2

1

0,2 UA

tiempo / minutos

que a través de esta técnica es posible también seguir la electrolisis en las condiciones

experimentales descritas en esta Tesis. Los valores de tiempos de retención de cada

uno de los compuestos oxidados aparecen en la tabla 4.

Compuesto Tr / min. 1,4-DHP

[a]

Potencial de pico

[b] /mV

Tr / min Prod. oxidado[c

]

3-Ind-DHP 5,9 +1100 6,2

5-Ind-DHP 5,5 +1100 5,9

V-DHP 3,9 +1280 4,3

I-DHP 4,1 +1280 4,3

Fenil-DHP 8,5 +1200 9,5

Tabla 4. Tiempos de retención determinados por detector de arreglo de fotodiodos obtenidos para los productos sintetizados y los productos electrolizados en DMSO + 0,1

M HFFTBA. Fase Móvil: acetonitrilo/tampón fosfato [55/45] a pH 4,3, con un flujo de 1 mL/min a 35 ºC.

[a] Promedio de los tiempos de retención de 1,4-DHPs a λ = 350 – 360 nm.[b] Potencial aplicado durante la electrolisis a potencial controlado.

[c] Promedio de los tiempos de retención de los productos de la EPC a λ = 250 nm.

e) Espectroelectroquímica.Estos experimentos se realizaron para determinar la presencia de especies

intermediarias o productos finales in situ durante la EPC por cambios en el espectro

UV-Vis de los compuestos durante 120 minutos. Todos los compuestos presentan una

gran banda de absorción en el rango de los 350-360 nm. 3-Ind-DHP tiene un máximo

de absorción en los 353 nm y al aplicar un potencial de 1100 mV se produce una

disminución considerable en dicha banda original a 353 nm conforme aumenta el

tiempo de electrólisis. Además se observa un incremento en la zona de los 270-330

nm (Figura 25-A y B)

Figura 25. A: Espectro UV-Vis del curso de la electólisis a potencial controlado de 3-Ind-DHP.Potencial aplicado durante los primeros 60 minutos: +1100 mV. Potencial aplicado

en los posteriores 60 segundos: +1500 mV. DMSO + 0,1 M de HFFTBA. B: Espectro diferencial de A. C: Decaimiento de la absorbancia máxima a 353 nm de A.

Por otra parte, aplicando un potencial de +1500 mV, el cual es superior al

segundo pico anódico encontrado por VPD, no se observaron cambios en el espectro

(Figura 25-C). La figura 21-B muestra el espectro diferencial de 3-Ind-DHP como una

función del tiempo de electrólisis. Las bandas UV-Vis entre 270 y 330 nm

corresponden al derivado piridínico. El resultado del estudio espectroelectroquímico de

5-Ind-DHP fue muy similar. Claramente durante este experimento no se observaron

especies intermediarias, sin embargo la señal formada a 270-330 nm corresponde al

derivado oxidado, la piridina respectiva.

En el caso de V-DHP e I-DHP se aplicó en primer lugar un potencial de 900

mV, el cual, como se ha mencionado anteriormente, es un potencial mayor que el

potencial de pico encontrado por VPD para el primer pico anódico. Durante el tiempo

en que se aplicó dicho potencial, no se observaron cambios significativos en el

espectro UV-Vis como se observa en la figura 26 para I-DHP. Sin embargo, al aplicar

un potencial superior al segundo pico de oxidación (específicamente se aplicó 1270

mV), se produce una notoria disminución de la banda original a 354 nm conforme

avanza el tiempo de electrólisis. Se puede observar también que junto con la

0 20 40 60 80 100 120

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2 C

BA

250 300 350 400

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

∆ A

bsor

banc

ia /

UA

λ / nm

250 300 350 400 450

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

Absor

banci

a / UA

λ / nm

Eapp= 1500 mVEapp= 1100 mV

Abs

orba

ncia

/UA

tiempo /min

disminución de dicha banda a 354 nm existe un aumento en la absorción a 270 y 303

nm. En el inserto de la figura 22 se observa el espectro diferencial de la electrólisis de

I-DHP en función del tiempo. Cómo se puede observar, la aparición de nuevas bandas

con máximos en 273 y 303 nm son más notorias. Dichas señales corresponden al

derivado piridínico. Claramente, durante la electrólisis a 900 y 1270 mV no se

observaron especies intermediarias. El curso de la electrólisis de V-DHP presentó un

comportamiento similar.

Figura 26: Gráfico diferencial de los máximos de absorbancia encontrados en el espectro UV-Visible durante la EPC a 900 y 1270 mV de 100 µM de I-DHP durante 120 minutos.

Inserto: Espectro diferencial de I-DHP durante la EPC a potenciales de 900 y 1270 mV. DMSO + 0,1 M de HFFTBA.

0 20 40 60 80 100 120 140

-0.9

-0.6

-0.3

0.0

0.3

0.6

0.9

300 350 400-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6 λ = 270 nm

λ = 303 nm

λ = 354 nm

∆Abs

orba

nce

/ UA

λ / nm

Eaplicado = +1270 mVEaplicado = +900 mV

λ 303

λ 270

λ 354∆Ab

sorb

an

cia

/ U

A

tiempo / min

5.3. Reactividad frente al anión radical superóxido.

Se estudió la interacción de los derivados sintetizados y tres 1,4-DHPs

comerciales (amlodipino, nimodipino y nisoldipino) frente al anión radical superóxido

mediante estudios electroquímicos y espectrofotométricos.

a) Experimentos electroquímicos.Mediante voltametría cíclica se estudió la electrogeneración del anión radical

superóxido a través del barrido catódico por la reducción de oxígeno molecular

disuelto en la solución de trabajo y la interacción con las moléculas sintetizadas. En

primer lugar se estudió la cupla O2/O2● para una concentración de O2 1 mM

(concentración de trabajo). Los valores de razón de corriente, Ipa/Ipc, y de ∆Ep de la

cupla O2/O2● fueron determinados para cada voltamograma. Los valores de ∆Ep a

diferentes velocidades de barrido mostraron un comportamiento lineal respecto a la

velocidad de barrido (Figura 27), lo cual se ajusta muy bien a datos encontrados en la

literatura para procesos con características cuasireversibles [39,lxxii]. La velocidad de

barrido utilizada para estudiar la interacción frente a las 1,4-DHPs fue 100 mV / s.

Figura 27. A: Voltamogramas cíclicos de 1 mM de O2 en DMSO + 0,1 M de HFFTBA a diferentes velocidades de barrido (50 – 1500 mV). B: Dependencia del ∆Ep con el

cuadrado de la velocidad de barrido.

-300 -400 -500 -600 -700 -800

ν

10 µ A

E / mV (Ag / AgCl)0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

r = 0,9973

ν 1/2 / V1/2 s− 1 / 2

∆Ep

/ mV

(Ag

/ AgC

l)

La razón de corrientes ipa/ipc refleja la tendencia de una especie

electroquimicamente generada, para dar reacciones químicas posteriores como podría

ser la interacción con 1,4-DHPs si éstas están presentes en solución. En las figuras 28

y 29 se muestran los voltamogramas cíclicos de la cupla O2/O2● en presencia de

diferentes concentraciones de las 1,4-DHPs (0,5 – 50 mM). Como se puede observar,

después de la adición de los compuestos, la corriente de pico correspondiente a la

oxidación de O2● (corriente anodica (ipa), regeneración de oxígeno) disminuye,

mientras que la corriente de reducción (corriente catódica (ipc), formación de O2●)

aumenta levemente. Estos resultados evidencian que los compuestos reaccionan con

el O2●, esto es, que el O2

● generado en DMSO es atrapado, de manera concentración-

dependiente, lo que se observa con la disminución pronunciada de la ipa a medida que

aumenta la concentración de 1,4-DHPs. En términos cuantitativos 3-Ind-DHP y 5-Ind-

DHP disminuyen la razón de corriente en un 15% y 20% respectivamente cuando la

concentración presente en solución es de 50 mM (figura 28 A y B).

Figura 28 . Voltamogramas cíclicos correspondientes a la cupla O2/O2• : (a) 1 mM of O2 (b)

+ 1,0 mM (c) +10,0 mM (d) +30,0 mM y (e) +50,0 mM of 3-Ind-DHP (A) y 5-Ind-DHP (B). Velocidad de barrido 100 mV s-1, en DMSO + 0.1 M de HFFTBA.

-300 -400 -500 -600 -700 -800

Be

d

c

b

a10 µ A

E / mV (Ag / AgCl)-300 -400 -500 -600 -700 -800

Ae

d

c

b

a10 µ A

E / mV (Ag / AgCl)

Por otra parte, la corriente de pico anódica de la cupla O2/O2● desaparece por

completo cuando la celda contiene una concentración 30mM de V-DHP e I-DHP,

disminuyendo la razón ipa/ipc en un porcentaje mayor al 50% a bajas concentraciones,

no encontrando diferencias significativas entre ellos (Figura 29). En el caso de los

compuestos Fenil-DHP, amplodipino, nimodipino y nisoldipino la razón de corriente

disminuye en un 30% a concentración 50mM para todos los casos. En la literatura está

demostrado que el superóxido actúa como una base de Bronsted abstrayendo el

Hidrógeno presente en la posición 1 del anillo 1,4-DHP del Nisoldipino, por lo que

mediante dicha reacción el fármaco actuaría como atrapador del radical [39]. Un efecto

similar está descrito para indol y derivados, donde el Hidrógeno en posición 1 actúa

como protón donor frente al O2• [lxxiii], y está ampliamente demostrado que fenoles

sustituidos con grupos metoxilos presentan actividad atrapadora de radicales [lxxiv].

Figura 29. (A) Voltamogramas cíclicos correspondientes a la cupla O2/O2• : (a) 1 mM de O2

(b) + 0,5 mM (c) +1,0 mM (d) +5,0 mM y (e) +10,0 mM V-DHP. (B) Voltamograma cíclico correspondiente a la cupla O2/O2

• : (a) 1,0 mM of O2 (b) + 1,0 mM (c) + 5,0 mM (d) +10,0 mM y (e) +30,0 mM I-DHP. Velocidad de barrido 100 mV s-1, en DMSO + 0.1 M de HFFTBA.

-300 -400 -500 -600 -700 -800

Ae

d

c

b

a

10µ A

E / mV (Ag / AgCl)-300 -400 -500 -600 -700 -800

B e

d

c

b

a10 µ A

E / mV (Ag / AgCl)

En la figura 30, las razones de corriente, Ipa/Ipc, son graficadas en función de

la concentración de las 1,4-DHPs sintetizadas y las 1,4-DHPs comerciales. Se puede

concluir de este gráfico, que existe una directa interacción entre el anión radical

superóxido electroquímicamente generado in situ y los compuestos, lo cual se

evidencia por la disminución de las razones de corriente Ipa/Ipc a medida que

aumenta la concentración, y donde se puede observar que los compuestos V-DHP e I-

DHP presentaron la mayor interacción frente al radical, disminuyendo la razón de

corriente en más de un 50% a concentraciones menores a 50 mM. Por otra parte, las

1,4-DHPs C4-Indolil sustituidas presentaron una menor interacción frente al anión

radical, y éste resultado es similar al observado para la Fenil-DHP, Amlodipino,

Nisoldipino y Nimodipino en las mismas condiciones experimentales. Si bien, todos los

compuestos en estudio mostraron una interacción con el anión radical generado sobre

la superficie del electrodo, la diferencia encontrada entre éstos (principalmente entre

V-DHP e I-DHP frente a 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP) se debería a factores de difusión de

los compuestos hacía la superficie del electrodo, a la presencia de grupos electrón-

donores y a factores estéricos.

Figura 30. Razón de corrientes ipa/ipc de la cupla O2/O2• en presencia de diferentes

concentraciones de los derivados 1,4-DHPs. Concentración de O2 1 mM en DMSO + 0.1 M de HFFTBA. Velocidad de barrido: 100 mV s-1.

0 10 20 30 40 50

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

I-DHPV-DHP

NisoldipinoAmlodipinoNimodipinoFenil-DHP5-Ind-DHP

3-Ind-DHP

[1,4-DHP] / mM

ipa

/ ipc

b) Experimentos espectrofotométricos.Para calcular las constantes cinéticas aparentes para la reactividad entre los

derivados sintetizados y algunas 1,4-DHPs comerciales frente al anión radical

superóxido se utilizó una metodología indirecta basada en espectroscopia UV-Visible,

la cual se sustenta en los siguientes hallazgos experimentales:

1. “El anion superóxido se comporta como base” [lxxv].

Se registró el espectro 1H-NMR de cada uno de los compuestos en ausencia y

en presencia de KO2 (en DMSO-d6) observándose la completa pérdida de la señal en

8,8 ppm correspondiente al Hidrógeno en posición-1 del anillo dihidropiridínico (DHP-

H) como se muestra en la figura 31.

Figura 31. Espectro 1H-RMN correspondiente al derivado fenil-DHP (A). (B) fenil-DHP + 20 mM O2

•_ disuelto en DMSO-d6.

En el caso de las 1,4-DHPs C4-Indolil sustituidas, la señal correspondiente al

protón de la posición 1 de la dihidropiridina y de la posición 1 del indolil desaparecieron

12 10 8 6 4 2 0

B

A

C4-H

1 2 1 0 8 6 4 2 0p p m

C4-HDHP-H

ppm

en presencia de la sal de superóxido. Como se observa en la figura 32A, el espectro 1HRMN de 3-Ind-DHP en DMSO-d6, la señal en 8,9 ppm corresponde al Hidrógeno en

posición 1 del anillo dihidropiridínico (DHP-NH) y en 10,8 ppm la correspondiente al

Hidrógeno en posición 1 del grupo indol (Ind-NH). Luego, a la misma muestra se

agregó un exceso de superóxido de potasio disuelto en DMSO-d6 y se observó la

completa desaparición de las señales correspondientes a los Hidrógenos DHP-H e

Ind-H, junto con la aparición de un fuerte color amarillo en la mezcla. En la figura 32 B

y C se muestran ambos espectros ampliados. Un comportamiento similar se observó

en el espectro 1HNMR de 5-Ind-DHP bajo las mismas condiciones experimentales. De

este experimento se puede concluir que la especie que se forma por la adición de

superóxido de potasio a soluciones de 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP corresponde a un

dianión centrado en ambos Nitrógenos secundarios.

Figura 32. Espectro 1H-RMN correspondiente al derivado 3-Ind-DHP (A). (B) Espectro extendido. (A) + 20 mM O2

•_ disuelto en DMSO-d6 (C).

12 10 8 6 4 2 0

A

ppm

12 11 10 9 8 7 6 5

B

IND-H

DHP-H

C4-H

ppm12 11 10 9 8 7 6 5

C *C4-H

ppm

Un efecto similar se observó para los compuestos V-DHP e I-DHP, donde la

deprotonación del nitrógeno secundario del anillo dihidropiridínico (DHP-H) y el fenol

del sustituyente posición-4 (R-OH) se muestra en la Figura 33 para V-DHP. Junto con

la desaparición de la señal correspondiente al Hidrógeno DHP-H en 8,7 ppm y la

desaparición de la señal R-OH en 8,6 ppm, se observó un ensanchamiento del resto

de las señales del espectro.

Figura 33. Espectro 1H-RMN correspondiente al derivado V-DHP (A). (B) Espectro extendido. (A) + 20 mM O2

•_ disuelto en DMSO-d6 (C).

En todos los espectros 1HRMN en presencia de la sal de superóxido, la señal

correspondiente al átomo de Hidrógeno en posición 4 del anillo dihidropiridínico (C4-H)

permanece intacta. Implicando que a tiempos cortos no hay oxidación por parte del

radical. Además la solución que contiene la especie aniónica presenta un fuerte color

amarillo.

10 8 6 4 2 0ppm

9 8 7 6 5

C4-H

ppm9 8 7 6 5

R-O-HDHP-H

C4-H

1HNMR (300 MHz, DMSO d6): 1.1 (t, J= 7.0, 6H,2x -CH3); 2.2 (s, 6H, 2x-CH3); 3.7 (s, 3H, OCH3); 4.0 (q, J = 7.0, 4H, -CH2); 4.82 (s, 1H, C-H); 7,7; 6.6 (m, 3H, Ar); 8.6 (s, 1H, N-H); 8,7 (s, 1H, OH).

ppm

2. “La especie aniónica formada entre los compuestos sintetizados y el

anión radical superóxido presenta una longitud de onda diferente a la especie protonada”.

Figura 34. A: Espectro UV-Vis de 100 µM de 5-Ind-DHP (a) en presencia de 20 mM de KO2

(b). B: Espectro UV-Vis de 100 µM de V-DHP (a) en presencia de 20 mM de KO2 (b).

Como se mencionó anteriormente, una vez que se agregó la sal de superóxido

a las 1,4-DHPs, se forma la especie aniónica, lo que implica un cambio de color en la

solución. Este cambio es posible de apreciar en el espectro UV-Vis de los compuestos,

que presentan una banda característica a una longitud de onda cercana a los 360 nm

y que en presencia del superóxido de potasio sufre un efecto batocrómico, mostrando

una nueva banda a una longitud cercana a los 450 nm y con una mayor absorbancia,

tal como se observa en la Figura 34 para 3-Ind-DHP (A) y V-DHP (B). Todos los

compuestos, incluyendo a nisoldipino, nimodipino y amlodipino mostraron un

comportamiento similar.

Para confirmar lo recientemente planteado, se utilizó una base orgánica (Hidróxido de

tetrabutil amonio, OHTBA) bajo las mismas condiciones experimentales. En la figura

35 se muestra el espectro UV-Vis de 100 µM de 5-Ind-DHP en DMSO la cual muestra

una longitud de onda máxima de absorción en 356 nm. Posteriormente se adicionaron

concentraciones crecientes de OHTBA y se observó que la señal en 356 nm disminuye

y aparece una nueva señal a 446 nm conforme aumentaba la concentración de base,

lo que coincide con los resultados encontrados frente al superóxido. Finalmente se

agregó OHTBA hasta la completa formación de la especie aniónica (figura 35B). Para

moléculas similares se ha establecido que el anión de la 1,4-DHP tiene un patrón de

250 300 350 400 450 500 550

A

λ 446

λ 356

b

a

0.2 UA

λ / nm250 300 350 400 450 500 550

B

b

a

λ 444 nm

λ 291 nm

λ 354 nm

0,2 UA

λ / nm

absorción UV-Visible diferente al de la 1,4-DHP. Los valores de pKa y de indol en

DMSO son 19.0 [lxxvi] y 21.0 [lxxvii], respectivamente. En consecuencia, el primer paso de

la interacción entre el O2● y los derivados corresponde a la abstracción de ambos

protones en la posición 1 del anillo DHP y del indol en las condiciones experimentales

en las cuales se realizó la reacción.

Figura 35. A: espectro UV-Vis de 100 µM de 5-Ind-DHP en DMSO. B: Espectros UV-Vis de 100 µM de 5-Ind-DHP en presencia de concentraciones crecientes de OHTBA en DMSO.

En el caso de V-DHP e I-DHP se observó la desaparición de la señal de

absorción a 360 nm y la aparición de una banda a aproximadamente 450 nm, cuando

se agregó el OHTBA. Dicha banda desapareció completamente cuando a la celda se

agregó una solución alcohólica de CH3COOH, revirtiendo el proceso completamente,

restituyendo así la banda original a 360 nm como se muestra en la figura 36A. Cuando

se adicionó primero CH3COOH alcohólico no se evidenciaron cambios en el espectro

UV-Vis. Dicho fenómeno se repitió en todos los derivados con similares resultados.

Al estudiar la electro-oxidación de los compuestos, los resultados revelan que

para soluciones 1 mM de V-DHP e I-DHP, la adición de 3mM de OHTBA en una

solución 1 mM de I-DHP (Figura 36B) produjo la desaparición de la señal en +873 mV,

mientras que el pico en +1166 mV permanece prácticamente constante.

Conjuntamente con la desaparición de la señal en +873 mV se observó la aparición de

una nueva señal en –59,7 mV. Por otra parte, la adición de CH3COOH alcohólico sobre

la misma solución, revirtió el proceso completamente. Resultados similares se

obtuvieron para las otras DHPs. Cuando se adicionó primero CH3COOH alcohólico no

se evidenciaron cambios en el comportamiento electroquímico.

250 300 350 400 450

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4 Aλ

máx 356 nm

Abso

rban

cia

/ UA

λ / nm250 300 350 400 450 500 550

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5B

356 nm

446 nm

Abso

rban

cia

/ UA

λ / nm

Figura 36. A: Espectro UV-Vis de 0,1 mM de I-DHP en DMSO. (a) señal original, (b) a en presencia de 0,7mM de OHTBA y (c) b en presencia de 0, 7 mM de CH3COOH. B:

Voltamperogramas de pulso diferencial de 1 mM de I-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA. (a) señal original, (b) a en presencia de 7mM de OHTBA y (c) b en presencia de 7 mM de

CH3COOH.

Por lo tanto, estos resultados implican cambios en las especies electroactivas

como consecuencia de la adición de una base o de un ácido, sugiriendo un equilibrio

de disociación como el que se describe en los esquemas 12 y 13. La señal

voltamétrica y espectroscópica original (≈1000 mV, pico I y a λ≈ 360 nm,

respectivamente) correspondería a la oxidación de la especie I. La especie no

protonada II, sería la responsable de la señal que aparece a ≈ 59 mV y a 450 nm.

Esquema 12. Equilibrio Acido-Base de V-DHP

-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400

B

c

b

a

5 µ A

E / mV250 300 350 400 450 500 550

A

c

b

a

λ 291nm

λ 443nm

λ 353nm1 UA

λ / nm

N

H

O

OO

O

OH

O

N

O

OO

O

O-

O

Base

Acido

Esquema 13. Equilibrio Acido-Base de 5-Ind-DHP

En conclusión, al agregar una base fuerte como el anión radical superóxido o el

OHTBA se genera una especie dianión, donde la carga negativa está centrada en los

átomos de Nitrógeno y Oxigeno. Esta especie vuelve a generar el compuesto neutro

una vez que se agrega ácido al medio.

Se obtuvieron los valores de coeficientes de absorbilidad molar (ε) para las

especies neutras y aniónicas de acurdo al procedimiento descrito en materiales y

métodos. Para esto, se prepararon soluciones de distintas concentraciones de cada

1,4-DHP a las cuales se les adicionó un exceso de la base (TBA-OH), de modo de

desplazar complemente el equilibrio hacia la formación del anión. En la tabla 3 se

muestran los valores de absorbilidad molar en DMSO, los cuales corresponden los

derivados dihidropiridínicos y las absorbilidades molares correspondientes a los

aniones obtenidos en presencia de DMSO + OHTBA. Se puede concluir que existen

diferencias significativas entre los valores de absorbilidades molares de las especies

aniónicas y aquéllas de los derivados originales. Prácticamente la especie aniónica

tiene el doble del valor de la especie neutra.

N

H

O

OO

O

N

Base

Acido

H

N

O

OO

O

N

ε / M-1 cm-1

Compuesto λ=345-360nm λ=445-460nm3-Ind-DHP 10161 ± 16 16674 ± 225-Ind-DHP 8966 ± 20 15968 ± 28

4-Fenil-DHP 6900 ± 14 12625 ± 16V-DHP 6701 ± 18 12920 ± 15

I-DHP 7102 ± 2 11095 ± 14Amlodipino 5992 ± 8 11243 ± 10Nisoldipino

Nimodipino

3332 ± 5

6612 ± 9

9976 ± 11

9983 ± 9

Tabla 5: Absorbilidad molar de las 1,4-DHPs y su especie deprotonada.

Una vez caracterizada la especie aniónica se procedió a realizar el experimento

cinético, esto es, la reacción de la serie de 1,4-DHPs con superóxido de potasio. Para

esto se utilizaron soluciones 100 µM de 1,4-DHP en presencia de un exceso de

superóxido de potasio. La reacción fue seguida por espectrofotometría UV-Vis durante

un tiempo de 5 a 6 horas.

3. “La evolución temporal de la reacción entre el radical superóxido y las

1,4-DHPs reveló que la intensidad de la banda UV-Visible correspondiente al anión dihidropiridínico entre λ= 440-450 nm formado por la reacción

ácido-base con el radical, disminuye significativamente”.

Figura 37. (A) Espectros UV-Visible para la reactividad de 0.1 mM 5-IND-DHP con 20 mM anión superóxido en DMSO. (B) Espectros UV-Visible para la reactividad de 0.1 mM Fenil-

DHP con 20 mM anión superóxido en DMSO.

Conforme transcurre el tiempo de reacción, la banda en la zona de los 450 nm

disminuye en intensidad, lo que indica que existe reacción entre la especie aniónica

formada en el comienzo de la reacción y el anión radical superóxido. En el caso de las

1,4-DHPs C4 indolil sustituidas, la disminución de la banda ocurre de manera más

pronunciada respecto de los otros compuestos, llegando incluso a desaparecer por

completo la banda a 450 nm para ambas 1,4-DHPs (figura 37A). Para la Fenil-DHP

(figura 37B), V-DHP e I-DHP, la disminución de la banda correspondiente a la especie

aniónica disminuye en un 20% luego de 5 horas de reacción, y cerca de un 5% para

los compuestos comerciales. En todos los casos, junto con la disminución en los 450

nm aparece una nueva banda en la zona de los 300 nm. Dicha nueva banda

correspondería al producto de la reacción.

250 300 350 400 450 500 550

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 A308 nm

446 nm

Abso

rban

cia / U

A

λ / nm250 300 350 400 450 500 550

0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

1.8

2.1 B

303 nm

447 nm

Abso

rban

cia / U

A

λ / nm

4. “Los espectros UV-Visible exhibieron dos puntos isosbésticos”.

Figura 38. Espectros UV-Visible diferenciales de la reactividad de 0.1 mM 3-Ind-DHP (A) y 5-Ind-DHP (B) con 20 mM anión superóxido en DMSO.

En la figura 38A y B se muestran los espectros diferenciales de 3-Ind-DHP y 5-

Ind-DHP. Como se puede observar, la banda correspondiente al anión se consume a

medida que transcurre el tiempo de reacción (zona 450 nm, absorbancias negativas),

mientras que una banda en la zona entre 300 y 400 nm aumenta (absorbancias

positivas), que correspondería al producto de reacción. Es posible observar la

presencia de dos puntos isosbésticos en ambas figuras (donde la absorbancia es

cero). Esta característica indica que hay dos especies principales durante la reacción,

que en este caso correspondería a la especie que está reaccionando y al producto de

reacción [lxxviii].

250 300 350 400 450 500 550 600-1.5

-1.2

-0.9

-0.6

-0.3

0.0

0.3

0.6

0.9 Bλ 308 nm

λ 446 nm

∆ Ab

sorb

anci

a / U

Aλ / nm

300 350 400 450 500 550 600

-1.2

-0.9

-0.6

-0.3

0.0

0.3

0.6

0.9A

λ 455

λ 389

∆ Ab

sorb

anci

a / U

A

λ / nm

5. “Los resultados de los análisis de los productos de la reacción entre el

superóxido y las 1,4-DHPs por CG/MS sustentan que el anillo 1,4-dihidropiridínico se oxidó hasta el derivado piridínico”.

Para identificar el o los productos de la reacción entre el anión radical

superóxido y los derivados 1,4-DHPs, se utilizó la técnica de cromatografía gaseosa

acoplada a un detector de masas (GC/MS). Así, todas las 1,4-DHPs que reaccionaron

durante 5 horas a 37°C con 20 mM de superóxido de potasio en DMSO, presentaron

las siguientes características: (a) Los tiempos de retención en la columna fueron

coincidentes con los tiempos de retención de los compuestos electrolizados a

potencial constante; (b) Los patrones de fragmentación fueron los mismos que los

encontrados para los compuestos electrolizados (a 1200 mV para la fenil-DHP, a 1100

mV para las indolil DHP y a 1280 para V-DHP e I-DHP); (c) en todos los patrones de

fragmentación la especie más abundante correspondió al ión molecular con un m/z

327 para la fenil-DHP, un m/z 366 para 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP y un m/z 445 para V-

DHP e I-DHP derivatizados con TMS.

De estos resultados se puede concluir que el único producto de reacción entre los

compuestos sintetizados y el anión radical superóxido en DMSO corresponde al

respectivo derivado piridínico.

6. “La 1,4-DHP es la que reacciona con el anión radical superóxido”. Cuando se agregó una concentración equimolar de una base fuerte (OHTBA) a las

soluciones de 1,4-DHPs, se observó la formación de la especie aniónica. A esas

soluciones se adicionó una alícuota del stock de superóxido de potasio y no se

observó la formación del producto piridínico

La evolución de la reacción entre 20 mM de superóxido de potasio y 0.1 mM de

cada 1,4-DHP en DMSO a 37 °C con agitación constante fue registrada durante 5

horas a intervalos de 10 minutos. Las condiciones experimentales en las cuales se

llevaron a cabo los estudios cinéticos, es de pseudo primer orden, donde la

concentración del anión radical superóxido fue al menos 200 veces mayor a la de la

1,4-DHP en estudio.

Como ya se mencionó anteriormente, todos los derivados sintetizados exhiben

una banda con un máximo de absorbancia en la zona entre 350-360 nm. Los

compuestos 3-Ind-DHP, V-DHP e I-DHP exhiben una banda adicional en la zona 270-

280 nm.

Tomando en cuenta las pruebas experimentales detalladas anteriormente y

teniendo la certeza de haber encontrado reacción entre las 1,4-DHPs sintetizadas y

comerciales con el anión radical superóxido, concluimos que no era posible seguir la

reactividad en términos cuantitativos a través de los cambios en la absorción de los

derivados 1,4-DHP a la longitud de onda en la cual absorben ( λ= 360 nm), o de la

aparición del derivado piridínico que absorbe en una longitud de onda cercana a los

280 nm, lo cual está impedido debido a que el propio anión radical superóxido

presenta una intensa banda de absorción próxima a los 300 nm y que también

interfiere en cualquier determinación cuantitativa en esa zona del espectro. Por esta

razón, se planteó una metodología basada en los cambios de absorbilidad molar de la

especie aniónica, es decir los cambios registrados en la zona de los 440- 460 nm. La

metodología asume de manera indirecta, que la velocidad de desaparición de la

especie aniónica es equivalente a la velocidad de oxidación de la 1,4-DHP para formar

el derivado piridínico. Por lo tanto, las constantes cinéticas aparentes para la reacción

entre las 1,4-DHPs sintetizadas y el anión radical superóxido fueron determinadas a

partir de estos cambios.

Tal como se observa en las figuras 37 y 38, la banda a 455 nm para 3-Ind-

DHP, a 446 nm para 5-Ind-DHP y a 447 nm para la fenil-DHP decae significativamente

después de la adición del radical. Considerando que el anión radical superóxido se

encuentra en exceso en el medio de reacción, implica que todas las 1,4-DHPs en

solución se encuentran en su forma aniónica y por lo tanto es posible asumir que dicho

anión que está desapareciendo, repone la 1,4-DHP que se está oxidando a la piridina.

De esta manera, la velocidad de desaparición de la especie aniónica corresponde

indirectamente a la velocidad de oxidación de las 1,4-DHPs a sus respectivos

derivados piridínicos.

Con estos antecedentes se planteó el siguiente desarrollo cinético que nos

permitió calcular, las constantes aparentes cinéticas de la reacción en condiciones de

pseudo primer orden:

[DHP] + [O2●] → [Piridina]

La ley de velocidad con la cual aparece la piridina está dada por la expresión:

d[Piridina] = k [DHP]n [O2●] m, quedando entonces:

dt

d[Piridina] = k’ [DHP], en que k’= k [O2●] m

dt

Considerando los siguientes pasos en función de los resultados experimentales:

Equilibrio ácido-base:

k3

proceso oxidativo: DHP + 2O2● piridina + 2HO2

-

d [piiridina] = k3 [DHP] n [O2●] m, luego

dt

d [piiridina] = k’ [DHP], donde k’= k3 [O2●] m asumiendo primer orden cinético.

dt

Sin embargo, si la concentración de la 1,4-DHP es << O2●, en el estadio estacionario

d [DHP] = k1 [DHP-] - k2 [DHP] – k’ [DHP] = 0 dt

sabiendo que [DHP] = k1[DHP-] / (k2 + k’)

y -d [DHP - ] = d [piridina] = - k’ k1 [DHP - ] dt dt (k2 + k’)

k ’’ = k’ k1

(k2 + k’)

-d [DHP -] = -k’’ [DHP-] dt

d[DHP -] = k’’ t [DHP -]

Integrando:

ln [DHP-] = - k’’ t + ln [DHP -]0

k1

k2

DHP DHP –

Si la información preliminar de que m =1 es correcta, entonces al graficar ln

[DHP-] v/s tiempo, se debería obtener una línea recta con pendiente negativa e igual a

k’’. A partir de la cual entonces es posible calcular una constante de velocidad relativa,

que tiene implícita la constante de equilibrio de la reacción, tal como se procede en

casos de mecanismos complejos que involucran un equilibrio [lxxix].

Los valores de absorbilidad molar de los derivados fueron empleados en la

determinación cuantitativa de las concentraciones de la especie aniónica y el posterior

cálculo de las constantes cinéticas para la reacción entre el radical libre y las 1,4-

DHPs.

Las constantes cinéticas aparentes se obtuvieron a partir de las pendientes de

los gráficos log [DHP- , anión] versus tiempo (figura 39), y los resultados se muestran

en la Tabla 6.

Figura 39. Evolución del ln [DHP_] versus tiempo para el derivado 5-Ind-DHP

Los derivados indolil sustituidos, presentaron la mayor reactividad frente al

anión radical superóxido con una constante de 2,25 x 10-4 segundos-1para 3-Ind-DHP y

de 1,79 x 10-4 segundos-1 para 5-Ind-DHP. Si éstos valores son comparados con el de

la constante del derivado Fenil-DHP, la 3-Ind-DHP resultó ser 6 veces más reactiva,

mientras que la 5-Ind-DHP 5,7 veces. Por otra parte, los valores de constantes

obtenidos para V-DHP e I-DHP son mucho menores que los indolil sustituidos y similar

0 5000 10000 15000 20000-11.5

-11.0

-10.5

-10.0

-9.5

-9.0

Ln(D

HP

- )

tiempo / seg

r=-0,99992r2=0,99984

a la fenil-DHP. Notablemente, todos los derivados sintetizados fueron más reactivos

que las 1,4-dihidropiridinas comerciales, amlodipino, nisoldipino y nimodipino.

Nuevamente, se aprecia que la estrategia de síntesis de incluir un grupo indolil o

metoxifenil en la posición-4 del anillo 1,4-dihidropiridina, produce un aumento

significativo en la reactividad frente al anión radical superóxido y que la posición de

dicho sustituyente es relevante en su reactividad frente al radical.

En la tabla 6, se muestran los valores de constante de reactividad obtenidos

para todos los compuestos frente al radical superóxido en DMSO a 37°C. El valor de

constante más alto es el de 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP. Todos los compuestos

sintetizados presentaron una reactividad mayor que nisoldipino, nimodipino y

amlodipino, 1,4-DHPs comerciales con demostrada actividad antioxidante.

Compuesto k ’’ (a) (seg-1) x 10-4 Relativo a Nisoldipino(b)

3-Ind-DHP 2,25 ± 0,04 16,15-Ind-DHP 1,79 ± 0,06 12,8

4-Fenil-DHP

V-DHP

I-DHP

0,38 ± 0,03

0,21 ± 0,02

0,62 ± 0,05

2,7

1,5

4,4Amlodipino 0,15 ± 0,02 3,6Nisoldipino

Nimodipino

0,14 ± 0,01

0,03 ± 0.01

1,0

0,2

Tabla 6. Constantes cinéticas de la serie en estudio frente al anión radical superóxido en DMSO a 37°C.

(a) Constante de reactividad asumiendo un primer orden cinético para la reacción entre 1,4-DHP y KO2.

(b) Razón: constante de reactividad de 1,4-DHP / constante de reactividad de Nisoldipino en presencia de KO2.

Finalmente, un gráfico que relaciona de manera lineal, los valores de

constantes cinéticas aparentes vs. los potenciales de oxidación del anillo

dihidropiridínico (Figura 40) muestra que aquel compuesto que posee el menor

potencial de oxidación es el que presenta el valor de constante cinética más alto.

Figura 40. Relación entre las constantes cinéticas aparentes k” y los potenciales de oxidación del anillo dihidropiridínico de los derivados.

El curso en el tiempo de la reacción entre los derivados frente al anión radical

superóxido en las mismas condiciones del experimento espectrofotométrico fue

seguido también mediante HPLC. Como se puede observar en la figura 41, el

compuesto 5-Ind-DHP exhibe una señal cromatográfica a 5,5 minutos, tal como se

mencionó anteriormente. Luego de la adición del radical libre (20 mM de KO2) se

produce la aparición de una nueva señal a 5,8 minutos, la cual corresponde a la

piridina respectiva. El curso de la reacción fue seguido durante 5 horas al igual que el

estudio espectrofotométrico, y se inyectó la solución en el cromatógrafo en intervalos

de una hora (Figura 41a-39f). La oxidación de 5-Ind-DHP por superóxido de potasio

terminó a las 5 horas (Figura 41f). Al comparar las características cromatográficas de

los productos oxidados, es decir, las soluciones después de 5 horas de reacción con

KO2 y las soluciones electrolizadas a los potenciales correspondientes a la oxidación

del anillo dihidropiridínico, éstos resultaron ser de similares características

cromatográficas como se puede observar en la Tabla 7, donde el tiempo de retención

de la solución de reacción coincide con el tiempo de retención de las soluciones

electrolizadas (Tabla 4). Estos datos confirman mediante otra técnica que el producto

corresponde al derivado piridínico.

950 1000 1050 1100 1150 1200 1250

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

R=0,85

I-DHP

V-DHP

Fenil-DHP

5-Ind-DHP

3-Ind-DHP

NisoldipinoAmlodipino

Nimodipino

E / mV (Ag / AgCl)

k" s

-1/ 1

0 -6

Figura 41. Curso de la reacción entre 0,1 mM de 5-Ind-DHP y 20 mM de KO2 en DMSO a 37°C, seguida por HPLC con detector de arreglo de fotodiodo (λ=250 nm). Fase móvil Acetonitrilo / Tampón fosfato (55/45) a pH 4,3. Flujo 1 mL/min a 35°C. (a) 5-Ind-DHP. Mezcla de reacción: (b) t= 0, (b) t= 1 hora, (c) t= 2 horas (d) 3 horas (e) 4 horas (f) 5

horas.

Compuesto Tr / minProd. de reacción[a]

3-Ind-DHP 6,2

5-Ind-DHP 5,9

V-DHP 4,2

I-DHP 4,3

Fenil-DHP 9,6

Tabla 7: Tiempos de retención por detector de arreglo de fotodiodos (λ = 250 nm) obtenidos para los productos de reacción frente al anión radical superóxido en DMSO.

Cabe resaltar, que no fue posible identificar la especie aniónica mediante ésta

técnica, debido a que la fase móvil utilizada (Acetonitrilo / Tampón fosfato (55/45))

5 6 7 8 9

0.1 UA

f

e

d

c

b

a

tiempo / min

posee un pH=4,3 por lo que una vez extraída la alícuota desde el medio de reacción

de los derivados frente al anión radical superóxido, el equilibrio se ve desplazado hacia

la especie protonada.

Resumiendo, a partir de los experimentos voltamétricos y espectroscópicos se

demostró la reactividad de los derivados frente al anión radical superóxido. En los

experimentos voltamétricos (VPD y VC), se observaron diferencias respecto al rango

de concentraciones utilizadas. Así, en los experimentos de VC, el O2● es

electroquímicamente generado in situ sobre la superficie del electrodo, en una solución

que contiene Oxígeno disuelto. De este modo, solo las 1,4-DHPs que alcanzan la

superficie del electrodo reaccionan con el anión radical electroquímicamente generado

y disminuyen, por lo tanto, la corriente anódica. En el caso de los experimentos de

VPD, el anion superóxido (KO2) se adhirió a la solución junto con los derivados 1,4-

DHPs. Y como se demostró previamente, es la especie aniónica la que alcanza la

superficie del electrodo y es posteriormente oxidada a piridina, por lo que es necesario

una menor concentración de los derivados para observar cambios en los

voltamogramas. Los resultados espectrofotométricos permitieron calcular las

constantes de reactividad de pseudo primer orden para todos los derivados frente al

anión radical superóxido, mediante un método indirecto, esto es, a partir de la especie

aniónica. Se puede concluir entonces, que la inclusión de un grupo indolil en la

posición-4 de anillo dihidropiridínico favorece la reactividad frente al radical respecto

de los otros compuestos estudiados (sintetizados y comerciales), en las condiciones

experimentales usadas.

En el esquema 14 se propone un mecanismo lógico para la oxidación de la

dihidropiridina a piridina, la cual fue identificada por GC-MS como el producto final de

la reacción.

Esquema 14. Mecanismo propuesto de la reacción de los derivados frente al anión radical superóxido.

NH

R5

R4

R3

N

R5

R4

R3

+ HO2O2

H

N

R5

R4

R3

H

N

R5

R4

R3

H

O2

N

R5

R4

R3

+ HO2

N

R5

R4

R3

5.4. Medio prótico: Tampón Britton Robinson 0,04 M – etanol (70-30) + KCl 0,1M.a) Voltametría y coulombimetría.

Se estudió la dependencia del proceso de oxidación de los compuestos mediante

voltametría de pulso diferencial en tampón Britton-Robinson 0.04 M / etanol, 70/30 y

ajustando la fuerza iónica con KCl a 0.1 M, en un intervalo de pH de 2 a 12.

Figura 42: Voltamogramas de pulso diferencial de soluciones 0,1 mM de A: 3-Ind-DHP, B: 5-Ind-DHP, C: Fenil-DHP y D: indol. En tampón Britton Robinson 0,04 M / etanol, 70/30.

Los derivados C4-indolil sustituidos exhibieron dos picos de oxidación bien

definidos en todo el rango de pH estudiado (pico I y II) al igual que en medio aprótico.

En la Figura 42A se muestra el voltamograma de pulso diferencial a pH 7 de la 3-Ind-

DHP, el pico I con un valor de Ep= 590 mV que corresponde a la oxidación del anillo

dihidropiridinico y el pico II a un Ep= 865 mV correspondiente a la oxidación del grupo

indolil de la posición-4. En el caso de 5-Ind-DHP, el pico I tiene un valor más anódico

que 3-Ind-DHP con un Ep= 662 mV y el pico II un Ep= 872 mV, correspondiente a la

oxidación del anillo dihidropiridina y a la oxidación del grupo indolil, respectivamente.

0 200 400 600 800 1000 1200

pico II

pico I

E / mV (Ag / AgCl)

B

0 200 400 600 800 1000 1200

pico II

pico I

2µ A

E / mV (Ag / AgCl)

A

0 200 400 600 800 1000 1200

2µ A

E / mV (Ag / AgCl)

C

0 200 400 600 800 1000 1200E / mV (Ag / AgCl)

D

fenil-DHP e indol, presentaron un único pico anódico en todo el rango de pH (Figuras

42C y D, respectivamente). En las figuras 43A y B se muestra el comportamiento de

los Ep (I y II) versus el pH para 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP. Se observa, que en ambos

casos, el pico I fue independiente del pH entre valores de 2 < pH < 4, pero a pH > 4

fue pH dependiente. Por otra parte, el pico II fue pH-dependiente en todo el rango de

pH estudiado (2 - 12). Estos resultados implican que en ambos compuestos el proceso

de oxidación que corresponde a la señal I involucra dos mecanismos diferentes. En la

zona independiente del pH (zona ácida) no habría protones involucrados en la etapa

determinante de la velocidad ni en alguna etapa previa, pero en la zona de pH-

dependiente (pH alcalino) los protones sí estarían involucrados en la etapa

determinante de la velocidad o en alguna etapa previa. En el caso de la oxidación del

pico II solo habría un mecanismo involucrado en todo el rango de pH. Por otra parte, la

Fenil-DHP y el indol mostraron un único pico anódico que corresponden a la oxidación

del anillo 1,4-dihidropiridínico y de la molécula de indol, respectivamente. La

electrooxidación de la Fenil-DHP fue similar al mostrado por el pico I, es decir, el

potencial de pico no varió entre el rango 2 < pH< 4. Sin embargo se hizo dependiente

del pH a valores de pH > 4. Por otra parte, la oxidación de indol fue pH-dependiente en

todo el rango estudiado (pH 2 – 12), comparable a lo encontrado en la molécula en la

que coexisten los dos grupos electroactivos, esto es, el pico II.

Figura 43: Dependencia del potencial de pico (VPD) con el pH. Gráfico A: compuesto 3-Ind-DHP. Gráfico B: compuesto 5-Ind-DHP.

Al igual que en medio aprótico, el primer pico (pico I) correspondería a la

oxidación del anillo dihidropiridínico y el pico II correspondería a la oxidación del indol.

Como se puede observar, la inclusión de un indol en la posición 4 del anillo 1,4-DHP

2 4 6 8 10 12300

450

600

750

900

1050B

pico II

pico I

Ep /

mV

(Ag

/ AgC

l)

pH2 4 6 8 10 12

300

450

600

750

900

1050

1200 Apico II

pico I

Ep /

mV

(Ag

/ AgC

l)

pH

desplaza el potencial de oxidación de éste, a potenciales menos anódicos comparado

con la fenil-DHP. Por otra parte, el potencial de oxidación del grupo indolil se desplaza

hacia potenciales más positivos en ambos derivados en relación con la molécula de

indol.

Si se comparan los valores de potencial de oxidación del anillo dihidropiridínico

en términos de la facilidad de oxidación, se obtiene el siguiente orden: 3-Ind-DHP (554

mV) > 5-Ind-DHP (655 mV) > fenil-DHP (660 mV). Este orden podría ser explicado por

la influencia que ejercería el sustituyente indol sobre el anillo dihidropiridínico y la

posición a la cual está enlazado. El sustituyente indolil en la posición-4 del anillo

dihidropiridínico aumenta la densidad electrónica y en consecuencia, favorece la

oxidación, esto es, los potenciales de oxidación de este compuesto son menos

anódicos (menos positivos). La oxidación del indol a pH 7.4 ocurrió a un valor de Ep=

740 mV. Este resultado indica que al menos a este pH, la oxidación del grupo indolil

presente en el anillo dihidropiridínico, ocurre a valores significativamente más positivos

que el indol, demostrando que la presencia del anillo dihidropiridínico retrasa la

oxidación del indolil evidenciando el efecto que tiene la coexistencia de dos centros

redox en estas moléculas. En conclusión, los potenciales de oxidación del grupo indolil

a pH 7.4 presentan el siguiente orden: indol (740 mV) > 3-Ind-DHP (860 mV) > 5-Ind-

DHP (870 mV).

El número de electrones transferidos de los derivados en medio prótico se

determinó por EPC a pH 3 y 11. De esta manera, soluciones exactamente pesadas de

los derivados indolil-DHPs fueron electrolizadas a potencial constante en el medio

electrolítico previamente descrito. A pH 3 se aplicó un potencial de 900 mV y el

número de electrones transferidos en el primer proceso oxidativo resultó ser 2,16 ±

0,20. Este valor está de acuerdo con el mecanismo de oxidación del anillo

dihidropiridínico en medio ácido y aprótico que ocurre vía 2 electrones – 2 protones.

Cuando nuevas soluciones se electrolizaron a 1300 mV al mismo pH, se obtuvo un

valor total de 3,44 ± 0,30 electrones. Este último valor correspondería a la oxidación de

los dos grupos electroactivos, es decir, la oxidación del anillo 1,4-DHP (2 electrones –

2 protones) y la oxidación del grupo indolil que involucra 1-electrón – 1-protón. Por otra

parte, a pH 11 se encontró un valor total de 2,5 ± 0,20 electrones cuando las

soluciones se electrolizaron a 700 mV. En ambos pHs se observó la formación de un

depósito azul sobre la malla de carbono utilizada como electrodo de trabajo al aplicar

el potencial correspondiente a la oxidación del segundo centro redox.

Las soluciones electrolizadas en medio prótico fueron analizadas también por

CG-MS. Los cromatogramas y los patrones de fragmentación coinciden con los

obtenidos en medio aprótico, encontrándose los siguientes resultados: (a) tiempos de

retención menores para los compuestos electrolizados respecto de los derivados

sintetizados; (b) la presencia de fragmentos con el sustituyente de la posición-4

(grupos fenilo, indolil y 2-metóxifenol); (c) el ion molecular M+, fue uno de los

fragmentos más abundantes. Los cromatogramas y los patrones de fragmentación

fueron similares a los presentados en las figuras 12-14 Para las 1,4-DHPs C4-indolil

sustituidas no se observa un cromatograma definido luego de electrolizar a potenciales

mayores que el correspondiente al segundo pico obtenido por VPD a ningún pH, y se

observó nuevamente la formación de un producto sobre la superficie de carbón de la

malla utilizada como electrodo de trabajo.

Concluyendo, en este medio el orden de oxidación de los centros redox

coincide con el encontrado en medio aprótico, siendo la primera señal correspondiente

a la oxidación del anillo dihidropiridínico y el segundo pico, la oxidación del grupo

indolil. Se encontró el derivado piridínico como producto de la oxidación electroquímica

del pico I. El producto fue identificado por GC/MS. Al oxidar los compuestos a un

potencial mayor que el segundo pico anódico se observó la formación de una película

azul sobre la malla de carbón utilizada como electrodo de trabajo.

Figura 44: Voltamogramas cíclicos de 1mM de los compuestos 4-Indolil sustituidos. Tampón Britton Robinson 0,04 M / etanol 70/30, pH 7,0. Velocidad de barrido 0,25 V/s.

En orden a investigar el comportamiento voltamétrico en diferentes escalas de

tiempo, se realizaron experimentos por voltametría cíclica (VC). Se realizaron estudios

a distintos pH (3; 7 y 11) y velocidades de barrido (0,1- 5 V/s), encontrándose en todos

los casos resultados muy similares, esto es, las ondas de oxidación fueron de carácter

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

3-Ind-DHP

5-Ind-DHP

50 µ A

E / mV (Ag / AgCl)

irreversible en esas condiciones. Se distinguieron dos ondas anódicas

correspondientes a la oxidación del anillo DHP y la oxidación del grupo indolil de la

posición-4.

En todos los casos los gráficos log ip vs log V exhibieron pendientes cercanas

a 0,8; indicando que la corriente es controlada por un proceso mixto (difusión y

adsorción). Además, los potenciales de pico (Ep) fueron dependientes de la velocidad

de barrido, dando cuenta de un proceso de carácter irreversible.

En el caso de V-DHP se observaron tres picos en medio ácido los cuales se

desplazaron a valores menos positivos conforme aumentaba la basicidad del medio. I-

DHP presentó sólo dos picos en todo el rango de pH estudiado (2-12). En la Figura

45A se muestran los voltamogramas de pulso diferencial a pH 3, 7 y 11 de V-DHP.

Fenil-DHP y guayacol, presentaron un único pico anódico en todo el rango de pH . En

las figuras 45B y C se muestra el comportamiento de los Ep (I y II) versus el pH para

V-DHP e I-DHP. Se observa, que en el caso de V-DHP, no existe un claro

comportamiento debido a que se observaron dos señales poco definidas a valores de

potencial mayores de 600 mV, sin embargo, el pico I fue dependiente del pH en todo el

rango estudiado. Por otra parte, I-DHP presentó una dependencia en todo el rango de

pH para el pico I y dos tendencias para el pico II. Por otra parte, la Fenil-DHP y el

guayacol mostraron un único pico anódico que corresponden a la oxidación del anillo

1,4-dihidropiridínico y del OH del o-metoxifenol, respectivamente. Al comparar los

resultados con la electrooxidación de la Fenil-DHP, en este caso, el comportamiento

fue similar al mostrado por el pico II, es decir, que el potencial de pico prácticamente

no varió entre los valores 2 < pH< 4, volviéndose relativamente pH-dependiente a

valores de pH > 4. Guayacol presentó un único pico anódico el que fue pH

dependiente en todo el rango de pH estudiado, similar al patrón mostrado por el pico I.

A pH 7, el guayacol presentó un potencial de pico de 424 mV, esto es, 40 a 50 mV

más que el encontrado para el pico I de V-DHP e I-DHP, por lo que en este medio

también se observa que la presencia del anillo 1,4-DHP favorece la oxidación del

fenol, desplazando los potenciales hacia valores menos anódicos. Por el contrario, el

potencial de pico de la segunda señal de V-DHP e I-DHP, correspondiente al anillo

dihidropiridínico, es desplazada a potenciales más anódicos respecto de la Fenil-DHP.

Figura 45. A: VPD de 0,1 mM de V-DHP en Tampón Britton Robinson 0,04 M / etanol a pH 3, 7 y 11. B: Ep / pH de V-DHP. C. Ep / pH de I-DHP.

En orden a investigar el comportamiento voltamétrico en diferentes escalas de

tiempo, se realizaron experimentos por voltametría cíclica (VC). Se distinguieron dos

0 200 400 600 800 1000 1200

A

peak III

peak II

peak II

peak IIpeak I

peak I

peak I

pH 11

pH 7

pH 31µ A

E / mV (Ag / AgCl)

2 4 6 8 10 120

200

400

600

800

1000

1200 B pico I pico II pico III

E /

mV

/A

g /

Ag

Cl)

pH

2 4 6 8 10 12

200

400

600

800

1000C

E /

mV

(A

g /

Ag

Cl)

pH

pico I pico II

ondas anódicas correspondientes a la oxidación del –OH del sustituyente en posición-

4 y a la oxidación del anillo dihidropiridínico (Figura 46A). Se realizaron estudios a

distintos pH (3; 7 y 11) y velocidades de barrido (0,1- 5 V/s), encontrándose en todos

los casos resultados muy similares, esto es, las ondas de oxidación fueron de carácter

irreversible en esas condiciones.

En todos los casos los gráficos log ip vs log V exhibieron pendientes cercanas

a 0,5 (Figura 46B); indicando que la corriente es controlada por un proceso de

difusión. Además, los potenciales de pico (Ep) fueron dependientes de la velocidad de

barrido, confirmando la irreversibilidad del proceso.

Figura 46. A: Voltamogramas cíclicos a diferentes velocidaddes de 0,1 mM de I-DHP en Tampón Britton Robinson a pH 11. Vel. Barrido: 100 – 3000 mV / seg. B: Gráfico log i vs

log v. de A.

El número de electrones transferidos de los derivados en este medio se

determinó por EPC a pH 3 y 11. De esta manera, soluciones exactamente pesadas de

los derivados V-DHP e I-DHP fueron electrolizadas a potencial constante en tampón

Britton Robinson 0,04M / etanol (70/30). A pH 3 se aplicó un potencial de 800 mV y el

número de electrones transferidos en el primer proceso oxidativo resultó ser 1,10 ±

0,15. Este valor está de acuerdo con el mecanismo de oxidación del fenol al radical

fenoxilo que posteriormente deriva a la formación de una quinona. Cuando nuevas

soluciones se electrolizaron a 1200 mV en el mismo pH, se obtuvo un valor total de

3,04 ± 0,21 electrones. Este último valor correspondería a la oxidación de la molécula

completa, es decir, a la oxidación del fenol (vía 1-electrón – 1-protón) y a la oxidación

del anillo dihidropiridínico vía 2 electrones – 2 protones. Por otra parte, a pH 11 se

-200 0 200 400 600 800

A

20µ A

E / mV (Ag / AgCl)1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4B

log

i peak

I

log v

encontró un valor total de 2,2 ± 0,11 electrones cuando las soluciones se electrolizaron

a 650 mV a pH 11.

5.5. Reactividad con radicales alquilperoxilo (ROO • ) ABAP-derivados.

Considerando que los radicales alquilperoxilo juegan un importante rol en los

procesos químicos y biológicos del organismo humano, esto es, están involucrados en

variadas reacciones en cadena, como por ejemplo la lipoperoxidación lipídica, el daño

a proteínas y fenómenos de toxicidad en general, se estudió la reactividad de los

compuestos sintetizados con radicales alquilperoxilo.

Como generador de radicales se utilizó ABAP (2,2’-azobis (2-amidinopropano

diclorhidrato, esquema 1), un azocompuesto que se descompone térmicamente en

tampón acuoso a pH 7.4 y 37 ºC, y que en la presencia de oxígeno genera radicales

alquilperoxilo.

Para evaluar la reactividad se empleó espectroscopía UV-Visible y

cromatografía gaseosa acoplada a masas (GC/MS). El curso temporal de la reacción

se siguió por cambios en las bandas originales de absorción UV-Vis de los

compuestos, esto es, entre λ= 345–360 nm. Los resultados revelaron que la adición

de los derivados 1,4-DHP a una mezcla acuosa conteniendo los radicales

alquilperoxilo (ROO•), disminuyeron significativamente las bandas de absorción en

función del tiempo de reacción.

En la Figura 47A, C y E se muestra la evolución temporal de la intensidad de la

banda de absorción máxima cercana a los 360 nm de 3-Ind-DHP (A), de Fenil-DHP (C)

y de V-DHP (E) en presencia de un exceso del generador de radicales se observa una

disminución significativa de la intensidad de las bandas. Paralelo con este cambio se

observa la aparición de una nueva banda cercana a los 280 nm que corresponde a la

piridina. Estos cambios espectrales se aprecian de mejor manera en las Figuras 47B,

D y F, las cuales muestran los espectros diferenciales correspondientes a las bandas

más relevantes.

En estos espectros se observa claramente la presencia de puntos isosbésticos

que indican la presencia de dos especies principales, la 1,4-DHP que se consume en

la reacción frente a los radicales y el producto de la reacción, el derivado piridínico.

El tratamiento cinético aplicado para obtener las constantes de reactividad

frente a los radicales alquilperoxilo, comprende la condición de pseudo primer orden

para la reacción y consideran constante la descomposición de ABAP que se encuentra

en una proporción 200 veces mayor que la concentración de los derivados 1,4-DHPs:

ABAP 2ROO●

Así, la siguiente expresión fue usada para determinar las constantes cinéticas

aparentes:

1,4DHP + ROO● PIRIDINA

De acuerdo a la ley de velocidad:

vPIRIDINA = k [ROO●] [1,4-DHP].

En nuestras condiciones experimentales: [ROO●] >>[DHP], donde

vPIRIDINA = k' [1,4-DHP], con k' = k [ROO●]

vPIRIDINA = -v[1,4-DHP] = - d[1,4-DHP] / dt = k' [1,4-DHP]

d [1,4-DHP] / [1,4-DHP] = -k' dt,

Considerando los límites de integración [1,4-DHP]0 a t=0 y [1,4-DHP] a t=t

respectivamente, luego

∫d [1,4-DHP] / [1,4-DHP] = -∫ k' dt

ln [1,4-DHP] = -k' t + ln [1,4-DHP]0

Como se puede observar en la figura 48, los gráficos de Ln[1,4-DHP] versus

tiempo son una línea recta con pendiente igual a k'. La linealidad de los gráficos,

superior a r= 0.9994 para todos los derivados, soporta la condición de pseudo primer

orden asumida para la reacción.

Las constantes de velocidad para las 1,4-DHPs frente a los radicales alquilperoxilo

ABAP-derivados, fueron calculadas a partir de cinco experimentos independientes. Los

valores de k´obtenidos fueron comparados con las 1,4-DHPs comerciales a través de

la razón:

r = k´1,4-DHP sintetizadas/ k´ 1,4-DHPcomerciales

Finalmente, las soluciones control (en ausencia de ABAP) no mostraron cambios en el

espectro original de los compuestos ni en sus espectros de masa.

Para comparar la reactividad, se utilizaron los valores de constantes cinéticas

obtenidas para los derivados propuestos y los comerciales (Tabla 8). Se puede

observar que nuevamente los derivados C4-Indolil sustituidos presentaron la mayor

reactividad, siendo 5 a 6 veces más reactivos que nisoldipino.

Se comprobó por GC-MS que el único producto de la reacción fue el derivado

piridinico.

Figura 47. A: Espectro de 100 uM de 3-Ind-DHP + radical alquilperoxilo ABAP derivado. B: Espectro diferencial de A. C: Espectro de 100 uM de 4-Fenil-DHP + radical

alquilperoxilo ABAP derivado. D: Espectro diferencial de C. E: Espectro de 100 uM de V-DHP + radical alquilperoxilo ABAP derivado. F: Espectro diferencial de E. Tampón

Britton-Robinson 0,04 M /DMF 70/30 a pH 7,4, 120 minutos, 37 °C.

250 300 350 400

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0A

Abs

orba

ncia

/ U

A

λ / nm250 300 350 400 450 500 550 600

-1.0

-0.5

0.0

0.5 B

λ / nm

∆Abs

orba

ncia

/ U

A

270 300 330 360 390 420-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4D

∆Abs

orba

ncia

/ UA

λ / nm240 270 300 330 360 390 420

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4 C

Abso

rban

cia

/ UA

λ / nm

260 280 300 320 340 360 380 400 420

-0.3

0.0

0.3

0.6 F

Abso

rban

cia / U

A

λ / nm240 270 300 330 360 390 420

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6E

Abso

rban

cia /

UA

λ / nm

Figura 48. Gráfico ln[1,4-DHP] versus tiempo para la reacción de A: 3-Ind-DHP y B: I-DHP frente a los radicales alquilperoxilo ABAP derivados en tampón Britton Robinson 0,04 M /

DMF; 70/30 a pH 7.4 a 37ºC.

Tabla 8. Constantes cinéticas aparentes para la reacción entre 1,4-DHPs C4-sustituidas y radicales alquilperoxilo ABAP-derivados en tampón Britton Robinson 0,04 M / DMF; 70/30

a pH 7.4 a 37ºC.

Compuesto ak / 10-3 / s-1 b k/Nisoldipino cEp

Fenil-DHP 0,05 ± 0,005 2,5 6443-Ind-DHP 0,12 ± 0,004 6,0 5965-Ind-DHP

V-DHPI-DHP

0,11 ± 0,0080,08 ± 0,0070,07 ± 0,005

5,54,03,5

648---

755Nisoldipino 0,02 ± 0,009 1,0 681Amlodipino 0,03 ± 0,007 1,5 725Nimodipino 0,03 ± 0,005 2,0 736

a Constantes cinética aparentes calculadas de los gráficos de ln[1,4-DHP] versus tiempo para la reacción frente a los radicales alquilperoxilo. Los valores corresponden a cinco medidas

independientes.b Razón entre las constantes cinéticas aparentes de las 1,4-DHPs estudiadas y la constante

cinética aparente obtenida para nisoldipino en las mismas condiciones experimentales.c Potenciales de oxidación obtenidos por VPD en tampon Britton-Robinson /etanol: 70/30 at pH

7,4.

En conclusión, la inclusión de un sustituyente indol y o-metoxifenol favorece la

reactividad de las 1,4-DHPs respecto de la Fenil-DHP y las 1,4-DHPs comerciales.

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000-9.65

-9.60

-9.55

-9.50

-9.45

-9.40

-9.35

-9.30

-9.25

-9.20 B

Ln[I-

DHP

]

tiempo / seg.0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

-9.8

-9.7

-9.6

-9.5

-9.4

-9.3

-9.2

-9.1 Aln

[3-In

d-DH

P]

tiempo / seg.

5.6 Análisis conformacional de los compuestos sintetizados.

a) Optimización de las estructuras.

En la literatura, existen diversos estudios teóricos y experimentales acerca de

la relación estructura-actividad de 1,4-DHPs, las cuales indican que la naturaleza y la

posición de los sustituyentes en el anillo dihidropiridínico juegan un rol muy importante

sobre la actividad biológica de estos fármacos, pudiendo en algunos casos predecir la

actividad biológica de determinadas drogas usando modelos matemáticos que

relacionan su estructura química [lxxx,lxxxi]. Trabajos acerca de cálculos y análisis

estructurales por rayos X de compuestos 1,4-DHPs, muestran que el anillo

dihidropiridínico adquiere la conformación tipo bote, que es la más estable y que el

sustituyente arílico en C4 puede ocupar una posición pseudoaxial o ecuatorial [lxxxii,lxxxiii].

Por otra parte, los grupos carbonilos de los ésteres en las posiciones 3 y 5 adoptan

principalmente tres conformaciones esenciales: trans-trans, cis-trans y cis-cis

(respecto a los dobles enlaces del anillo dihidropiridínico).El volumen de cada derivado

se muestran en la tabla 9.

Compuesto V° (Å 3)Fenil-DHP 385,813-Ind-DHP 421,645-Ind-DHP 420,75

V-DHP 425,07I-DHP 426,27

Tabla 9. Volúmenes obtenidos para los derivados en fase gas utilizando la base orbital ccpVTZ.

Las estructuras optimizadas de la serie en estudio muestran que todos los

derivados presentan la conformación tipo bote para el anillo dihidropiridínico,

independiente de si el sustituyente es un grupo fenilo, un grupo indolil o un grupo

metoxifenol, observándose diferentes desviaciones del C4 y el N1 respecto del plano

definido por la base del bote por C2-C3-C5-C6.

Si el sustituyente en el C4 es un fenilo, como en el caso de la Fenil-DHP, éste

adquiere una posición axial por encima del anillo 1,4-DHP, quedando de esta manera,

tanto el anillo dihidropiridínico como el fenilo, perpendicular uno con el otro. La

distancia de los átomos N1 y C4 respecto al plano formado por la base del bote se

muestran en la tabla 10. Respecto de los grupos carbonilos, ambos se encuentran en

posición trans respecto de los dobles enlaces del anillo 1,4-DHP (trans-trans). En la

figura 49 se muestra la estructura optimizada de Fenil-DHP.

Figura 49. (A) fenil-DHP; (B) Vista frontal de la estrutura optimizada de fenil-DHP; (C) Vista lateral de la estrutura optimizada de fenil-DHP; (D) Mejor plano medio formado por

los átomos C2-C3-C5-C6 del anillo 1,4-DHP. La ilustración muestra a los átomos de carbono en color gris, hidrógeno en blanco, oxígeno en rojo y nitrógeno en azul.

En el caso de 3-Ind-DHP el grupo indolil se encuentra axial y perpendicular al

anillo dihidropiridínico (figura 50). La posición de los grupos carbonilos en las

posiciones 3 y 5 es cis respecto de los dobles enlaces del anillo dihidropiridínico,

quedando ambos grupos etoxicarbonil hacia el lado contrario del grupo indol,

espacialmente hacia abajo respecto al plano C2-C3-C5-C6. Las distancias respecto

del plano base del bote para el C4 es de 0,27 Å y para el N1 es de 0,09 Å (Tabla 10).

Figura 50. (A) 3-Ind-DHP; (B) Vista frontal de la estrutura optimizada de 3-Ind-DHP; (C) Vista lateral de la estrutura optimizada de 3-Ind-DHP; (D) Mejor plano medio formado por

los átomos C2-C3-C5-C6 del anillo 1,4-DHP. La ilustración muestra a los átomos de carbono en color gris, hidrógeno en blanco, oxígeno en rojo y nitrógeno en azul.

Tanto para el compuesto 3-Ind-DHP como el 5-Ind-DHP el grupo indolil se

encuentra axial en el anillo dihidropiridínico. A diferencia de 3-Ind-DHP, en el

compuesto 5-Ind-DHP el plano del grupo indolil se encuentra formando un ángulo de

87,36°con el plano del anillo DHP (figura 51 y 52). Por otra parte, los sustituyentes

etoxicarbonil en las posiciones 3 y 5 se extienden hacia ambos costados del anillo

dihidropiridínico, con los grupos carbonilos en posición trans respecto de los dobles

enlaces de la base del bote. Puede observarse en la figura 51-D que la estructura tipo

bote es más pronunciada que en el isómero 3-Ind-DHP, lo que queda confirmado con

las distancias del C4 en 0,60 Å y el N1 en 0,27 Å, respecto del plano C2-C3-C5-C6.

Figura 51. (A) 5-Ind-DHP; (B) Vista frontal de la estrutura optimizada de 5-Ind-DHP; (C) Vista lateral de la estrutura optimizada de 5-Ind-DHP; (D) Mejor plano medio formado por

los átomos C2-C3-C5-C6 del anillo 1,4-DHP. La ilustración muestra a los átomos de carbono en color gris, hidrógeno en blanco, oxígeno en rojo y nitrógeno en azul.

Figura 52. (A y B) Estructura optimizada de 5-Ind-DHP. En azul se muestra el plano formado por la base del bote del anillo dihidropiridínico (C2-C3-C5-C6) y en rojo el plano

formado por el sustituyente en el C4 (indol).

Por su parte, los derivados con un sustituyente metoxifenol presentaron claras

diferencias en las estructuras optimizadas. En primer lugar, V-DHP presentó una

estructura tipo bote con una distancia entre el C4 y el mejor plano medio formado por

la base del bote (átomos C2-C3-C5-C6) de 0,69 Å y el N1 respecto al mismo plano

presentó una distancia de 0,36 Å (Figura 53). El sustituyente en posición 4 se

encuentra axial, prácticamente en el mismo plano respecto al anillo dihidropiridínico

formando un ángulo de 146° (tomando como un segundo plano el anillo fenólico). Los

sustituyentes etoxicarbonil están orientados hacia la parte posterior del plano del bote

y los grupos carbonilos presentan una orientación cis respecto de los dobles enlaces

del anillo dihidropiridínico.

Figura 53. (A) V-DHP; (B) Vista frontal de la estructura optimizada de V-DHP; (C) Vista lateral de la estrutura optimizada de V-DHP; (D) Plano formado por los enlaces dobles del

anillo 1,4-DHP (C2-C3-C5-C6). La ilustración muestra a los átomos de carbono en color gris, hidrógeno en blanco, oxígeno en rojo y nitrógeno en azul.

Figura 54. (A) I-DHP; (B) Vista frontal de la estrutura optimizada de I-DHP; (C) Vista lateral de la estrutura optimizada de I-DHP; (D) Mejor plano medio formado por los átomos C2-C3-C5-C6 del anillo 1,4-DHP. La ilustración muestra a los átomos de carbono en color

gris, hidrógeno en blanco, oxígeno en rojo y nitrógeno en azul.

El grupo metoxifenol en la posición 4 del anillo 1,4-DHP se encuentra axial y en

un plano perpendicular en la estructura optimizada de I-DHP. En este compuesto se

observó que los sustituyentes etoxicarbonil de las posiciones 3 y 5 del anillo

dihidropiridínico presentan orientaciones distintas, el sustituyente presente en la

posición 3 se encuentra orientado por sobre el plano de la base del bote, mientras que

el que se encuentra en la posición 5 se encuentra orientado hacia la parte posterior del

mismo.

Figura 55. (A y B) Estructura optimizada de I-DHP. En azul se muestra el mejor plano medio formado por los átomos C2-C3-C5-C6 del anillo dihidropiridínico y en rojo el plano formado por el sustituyente en el C4 (metoxifenol).

En resumen, dado que en todos los derivados se encontró una conformación

tipo bote en el anillo 1,4-DHP, se resumen las distancias entre el plano base del bote

respecto a los átomos N1 y C4 en la siguiente tabla:

Compuesto Distancia N1-plano

(Å)

Distancia C4-plano

(Å)Fenil-DHP 0,38 0,173-Ind-DHP 0,09 0,275-Ind-DHP 0,27 0,60

V-DHP 0,36 0,68I-DHP 0,18 0,29

Tabla 10. Energía calculada para las estructuras optimizadas de las moléculas propuestas y la distancia vertical (Å) de los átomos de C4 y N1 a la base del bote

formado por los cuatro átomos de carbono del anillo dihidropiridínico con enlaces dobles (C2-C3-C5-C6).

De acuerdo al análisis estructural de los derivados, se observaron diferencias

claras respecto a la geometría dependiendo del sustituyente presente en la posición

C4 del anillo 1,4-dihidropiridínico, esto es que todas las moléculas presentan una

estructura tipo bote, y esta estructura es más marcada dependiendo del sustituyente.

Este tipo de conformación es apropiada para su acción antagonista de los canales de

calcio.

b) Cálculo del potencial de oxidación de Fenil-DHP

De acuerdo a los datos experimentales encontrados en esta tesis, el

compuesto Fenil-DHP se oxida vía 2 electrones-2 protones en DMSO. El mecanismo

propuesto consta de una primera etapa de tipo electroquímica donde la 1,4-DHP

pierde un electrón formando el catión radical piridinio.

Etapa 1

La segunda etapa es de tipo química. El catión radical piridinio pierde un

protón (H ubicado en el Carbono 4) formando el radical piridinio.

Etapa 2

La tercera etapa es de tipo electroquímica, en ésta se forma el catión piridinio

por la pérdida de un electrón.

Etapa 3

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3+ e-

+•

4-Fenil-1,4-DHP Catión Radical

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3+ e-

+•

4-Fenil-1,4-DHP Catión Radical

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3

+•

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3+ H+

•

Radical

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3

+•

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3+ H+

•

Radical

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3

•

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3+ e-

+

Catión

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3

•

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3+ e-

+

Catión

La cuarta y última etapa es la formación del producto de la oxidación, el

derivado piridínico, el cual se forma por la salida del protón de la posición 1.

Etapa 4

Mediante este mecanismo y en función de las energías obtenidas para cada

una de las especies del mismo, es que se determinará el potencial de oxidación

teórico. La determinación del potencial teórico se basa en el proceso de quitar

electrones a la especie reducida, la que tiene N electrones para producir una especie

oxidada con N-1 electrones y calcular las diferencias de energía para ambas

especies.

Así, mediante un ciclo de energía libre, se calculan los potenciales redox.

Esquema 15. Ciclo termodinámico para el cálculo de potenciales de oxidación.

En el ciclo 15 aparecen los siguientes términos:

EA: electroafinidad vertical, corresponde a la diferencia entre la especia

oxidada y la especie reducida.

∆GSolvatación: energía de solvatación, calculado a partir de la diferencia entre la

especie en fase solvente y en fase gas.

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3+N CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3 + H+

4-Fenil-Piridina

NH

CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3+N CH3CH3

O

OCH3 O

O

CH3 + H+

4-Fenil-Piridina

De este modo, la ecuación termodinámica que define el potencial redox es:

E = EA + ∆ZPE + ∆(∆GSolvatación) + ∆Gevr

Donde EA y ∆GSolvatación fueron definidos anteriormente, ∆Gevr corresponde a las

contribuciones térmicas, es decir las contribuciones de energía libre rotacional,

vibracional y electrónica y ∆ZPE es la diferencia de la corrección de punto cero.

El potencial de oxidación experimental fue obtenido en DMSO con HFFTBA como

electrolito soporte, lo cual es muy diferente a medir el potencial en DMSO puro. Para el

cálculo de potencial de oxidación teórico se usa DMSO puro como solvente en el

modelo de solvatación contínua. Y de referencia se usó el potencial de Ag/AgCl 0,2223

V.

Como se describió anteriormente, la oxidación de las 1,4-DHPs en DMSO ocurre vía

dos electrones dos protones:

DHP → Py + 2H+ + 2e-

Y presenta un único pico de oxidación a +1064 mV en DMSO sobre un electrodo de

carbono vítreo respecto a la referencia de Ag / AgCl.

Figura 56. Voltamograma de pulso diferencial de 0,1 M de Fenil-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA.

Los valores de potencial teóricos obtenidos fueron los siguientes:

4-Fenil-DHP10 µ A10 µ A

600 800 1000 1200 1400E (Ag / AgCl) / mV

600 800 1000 1200 1400E (Ag / AgCl) / mV

1.- Utilizando la base cc-pVTZ:

Primera etapa electroquímica: +1330 mV.

Segunda etapa electroquímica: -680 mV.

2.- Utilizando la base 6-31G*:

Primera etapa electroquímica: +1516 mV.

Segunda etapa electroquímica: -451 mV.

5.7 E studios biológicos.

a) Fluorescencia Las células utilizadas en el estudio fueron previamente incubadas con 2 µM de la

sonda Fluo4-AM®[lxxxiv], la cual, en contacto con iones Ca+2 intracelular forma un

complejo fluorescente, el cual es proporcional a la concentración del ión y que es

ampliamente utilizada para cuantificar Ca+2 intracelular en rangos de concentración de

100 nM a 1µM. De esta manera, se determina la cantidad de calcio en el interior de la

célula en presencia y en ausencia de distintas concentraciones de los derivados en

estudio.

Para toda la serie propuesta de moléculas, en los 100 primeros segundos de

registro de la actividad neuronal, éstas presentan actividad espontánea de Ca2+, la cual

se observa como un incremento en intensidad de fluorescencia. Al perfundir las

neuronas con una solución de alto potasio, es posible observar un drástico incremento

en la fluorescencia, la cual recupera su nivel de reposo tiempo después de retirar el

estimulo depolarizante (solución con alto K+). En la misma neurona, pasados los 300

segundos se perfunde, en la solución externa, las moléculas en estudio, observándose

que per ce no inducen ninguna respuesta especial durante este tiempo.

Posteriormente, al adicionar solución con alto potasio, se observa una disminución en

la intensidad de fluorescencia, producto del efecto de las 1,4-DHPs ensayadas. En la

figura 57, se observa un 30% de disminución en la intensidad de fluorescencia luego

de la acción de I-DHP.

Figura 57. Registro de incrementos en la fluorescencia de Ca+2 en células hipocampales luego de la perfusión de I-DHP (50µM).

El “screening” general del efecto de todas las 1,4-DHPs ensayas, sobre la

disminución de la señal de Ca+2 intracelular, se muestra en la figura 58. Se puede

observar que Nifedipino presenta el mayor efecto bloqueador de canales ya que el

porcentaje de disminución en la intensidad de fluorescencia es superior al 70% del

K +

K +100 s

100 UAFI-DHP

control (aplicación de solución de alto potasio sola). Del grupo de fármacos

sintetizados, sólo la Fenil-DHP supera el 50% de bloqueo en las condiciones

estudiadas. Le sigue 5-Ind-DHP, con un efecto cercano al 50%. Los otros compuestos

no superan el 40% de disminución en la intensidad de la fluorescencia observada. Los

resultados fueron obtenidos en diferentes registros (n=5), para células hipocampales y

espinales cultivadas entre el 3 y el 16 de Noviembre del 2006.

Figura 58. Porcentaje de bloqueo en los incrementos en el Ca2+ intracelular, obtenidos luego de la adición de

50 µM de cada compuesto de la serie de 1,4-DHPs.

Curvas dosis-respuesta.

Figura 59: A. Curva dosis-respuesta de 5-Ind-DHP sobre células hipocampales. B. Registro original de Ca+2 intracelular antes y después de la pre-incubación con 50µM de

5-Ind-DHP.

De acuerdo a los resultados obtenidos para la serie completa, se procedió a

realizar una curva dosis–respuesta para dos de los compuestos en estudio que

mostraron un mayor porcentaje de bloqueo (Figura 59A). Utilizando concentraciones

B

K+K+50 s

50 AUF 5-Ind-DHP

10 1000

20

40

60

80

100A

IC50=45,8mM

% In

tens

idad

Flu

ores

enci

a

log Concentración / µ M

0

20

40

60

80

100

3-I

nd

-DH

P

V-D

HP

I-D

HP

5-I

nd

-DH

P

4-F

en

il-D

HP

Nife

dip

ino

Co

ntr

ol

%

In

ten

sid

ad

Flu

ore

sen

cia

en un rango entre 3 y 300 µM, se obtuvo una concentración inhibitoria 50 (IC50) de

17,8µM ± 1,8 para la Fenil-DHP y de 45,8µM ± 1,8 para la 5-Ind-DHP. Los resultados

fueron obtenidos en diferentes registros (n=4), para las neuronas cultivadas entre el 3

y el 16 de Noviembre del 2006. En la figura 59-B se observa el efecto producido por 5-

Ind-DHP (50µM) sobre células hipocampales.

b) P ruebas electrofisiológicas.

Figura 60. Registros de actividad eléctrica espontánea obtenidos por patch clamp. A: Actividad eléctrica espontánea en condiciones control (sin estimulo externo). B:

Actividad espontánea en presencia de 50 µM de Fenil-DHP.

El estudio electrofisiológico se realizó sobre neuronas hipocampales y

espinales, las cuales presentaron una actividad sináptica espontánea (Figura 60A), la

cual mostró una disminución de su frecuencia y amplitud mientras las células estaban

en presencia de las 1,4-DHPs (figura 60B: en presencia de 50µM de Fenil-DHP). Es

posible observar que en presencia del derivado 1,4-DHP disminuye la frecuencia del

actividad sináptica espontánea y levemente la intensidad de las señales.

Al aplicar un estímulo depolarizante de alto potasio (60mM), se obtuvieron los

registros de corrientes de calcio antes y después de la aplicación del compuesto. Se

observa que en presencia de los compuestos utilizados existe una disminución en la

intensidad de la corriente obtenida.

5 s

500 pA

5 s

500 pA

A

B

200 pA200 pA

Figura 61. Registros electrofisiológicos de corrientes de Ca2+ inducidas por un estímulo depolarizante de alto K+, en ausencia y presencia de Nifedipino.

Para el caso de Nifedipino, se observó una disminución por sobre el 35% en

la intensidad de la señal electrofisiológica (Figura 61). En el caso de la Fenil DHP y la

5-Ind-DHP el bloqueo es cercano de 20% (Figura 62 y 63, respectivamente).

Figura 62. Registros electrofisiológicos de corrientes de Ca2+ inducidas por un estímulo depolarizante de alto K+, en ausencia y presencia de Fenil-DHP. El porcentaje máximo

de bloqueo es cercano al 20%.

Figura 63. Registros electrofisiológicos de corrientes de Ca2+ inducidas por un estímulo depolarizante de alto K+, en ausencia y presencia de 5-Indol-DHP. El porcentaje máximo

de bloqueo es cercano al 20%.

c) Determinación de CREB fosforilado.

CREB es una proteína con función en la transcripción de genes. Esta descrito

que al aumentar el Ca2+ intracelular se activan ciertas otras proteínas que incorporan

grupos fosfatos a CREB. Al estar CREB fosforilado puede actuar como factor de

transcripción. Es por eso que CREB se ha usado como una señal de la activación de

proteínas intracelulares que tienen que ver con el Ca2+. Por esta razón se utilizaron 3

200 pA200 pA

derivados 1,4-DHPs de la serie y se evaluó el efecto provocado por éstas sobre la

fosforilación de CREB.

Figura 64. Cuantificación de CREB-P en presencia de 50µM de Fenil-DHP, 5-Ind-DHP y Nifedipino.

En el experimento en sí, lo que se obtiene como resultado es una señal en un

film fotográfico. Esta señal (intensidad de píxeles) se cuantifica en el programa Imagen

J. A mayor intensidad, es mayor la cantidad de proteína que es reconocida por el

anticuerpo, en este caso anticuerpo contra CREB fosforilado (CREB-P). Esta

cuantificación se normaliza al analizar las mismas muestras, pero ahora con un

anticuerpo que reconoce a una proteína cuyo nivel no es alterado, en este caso

tubulina (una proteína que forma parte del citoesqueleto de las células). Lo que se

muestra entonces, es la intensidad de CREB-P normalizado (Figura 64). Se puede

observar que no existe un comportamiento uniforme para las tres repeticiones. Lo

claro es que todas provocaron una disminución respecto del blanco. El promedio es

presentado en la figura 65.

D E F G0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

CR

EB

-P

/ T

ubu

lin

a

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Nifedipino4-Fenil-DHP5-Ind-DHPControl

CR

EB

-P

/ T

ub

ulin

a

0,75

0,8

0,85

0,9

0,95

1

1,05

Cont Ind Fenil Nife Cont Ind Fenil Nife Cont Ind Fenil Nife

ContIndFenilNifeContIndFenilNifeContIndFenilNife

Figura 65. Promedio de intensidad de CREB-P obtenida para las mediciones con 50µM de 1,4-DHPs.

En resumen, todos los derivados 1,4-DHPs estudiados presentaron un efecto

bloqueador sobre canales de calcio en neuronas, sin embargo ninguno de ellos

presentó un efecto superior al Nifedipino, bajo las mismas condiciones experimentales.

Entre los derivados sintetizados, la Fenil-DHP y 5-Ind-DHP exhibieron una respuesta

superior al 50% de bloqueo de canales a una concentración 50µM. Siendo en todos

los casos un efecto bloqueador dependiente de la concentración.

La aplicación de 1,4-DHPs disminuye la intensidad de la corriente

electrofisiológica y la frecuencia de la actividad sináptica espontánea. Nuevamente

Nifedipino es el que provoca una mayor disminución de las señales.

Mediante el método de fosforilación de CREB se observó una disminución en

la intensidad de las señales al aplicar 5-Ind-DHP, Fenil-DHP y Nifedipino. En este caso

el efecto no es significativo entre los compuestos.

6. Breve d iscusión de los resultados • Los cambios estructurales en posición-4 de la 1,4-dihidropiridina afectaron su

comportamiento voltamétrico en términos del proceso de oxidación de los dos

centros que coexisten en las moléculas. La coexistencia de dos centros redox en

los derivados produjo una interacción mutua en la cual se favorece la oxidación

del anillo 1,4-DHP y se dificulta la oxidación del grupo indol para los compuestos

C4-Indolil sustituidos (Tabla 11). El efecto contrario lo provoca el sustituyente o-

metoxifenol en V-DHP e I-DHP donde la oxidación del fenol se ve favorecida y la

del anillo dihidropiridínico se desplaza a potenciales más anódicos (Tabla 12).

Este efecto, es particularmente significativo en el caso de la oxidación del anillo

1,4-dihidropiridínico comparado con los compuestos de referencia Fenil-DHP,

indol y guayacol bajo las mismas condiciones experimentales.

Tabla 11. Potenciales de pico para la oxidación sobre carbon vítreo en medio aprótico (DMSO + 0.1 M HFFTBA) y prótico (Tampón Britton Robinson 0,04 M /etanol (70/30) a pH3

y pH 11).aDiferencia de los potenciales de pico del anillo 1,4-DHP respecto al derivado 4-Fenil-

DHP.bDiferencia de los potenciales de pico del sustituyente indolil respecto al indol.

Medio Aprótico E/ mV (Ag/AgCl)Derivado Pico I aΔEp-DHP Pico II bΔE p-Indol

3-Ind-DHP 944 -120 1280 +805-Ind-DHP 992 -72 1288 +88

Fenil-DHP 1064 - - -

Indol - - 1200 -

Medio prótico pH3 Pico I aΔEp-DHP Pico II bΔEp-Indol3-Ind-DHP 754 -126 1112 +162

5-IndDHP 774 -106 1088 +138

Fenil-DHP 880 - - -

Indol - - 950 -

Medio prótico pH11 Pico I aΔEp-DHP Pico II bΔEp-Indol

3-Ind-DHP 398 -42 606 +65

5-Ind-DHP 425 -15 628 +87

Fenil-DHP 440 - - -

Indol - - 541 -

Tabla 12. Potenciales de pico para la oxidación sobre carbon vítreo en medio aprótico (DMSO + 0.1 M HFFTBA) y prótico (Tampón Britton Robinson 0,04 M /etanol (70/30) a pH3

y pH 11).aDiferencia de los potenciales de pico del sustituyente o-metoxifenol respecto al

guayacol.bDiferencia de los potenciales de pico del anillo 1,4-DHP respecto al derivado Fenil-DHP.

• En medio aprótico y prótico los derivados C4 indolil y metoxifenol sustituidos

exhibieron dos señales de oxidación (excepto V-DHP), las que correspondieron

a la oxidación del anillo 1,4-dihidropiridínico y el grupo indolil e hidroxilo de la

posición-4.

• En medio aprótico por VPD fue posible diferenciar la oxidación correspondiente

al equilibrio entre las especies protonada y aniónica correspondientes a los

grupos electroactivos: amina secundaria (1,4-DHP e indol) y grupo hidroxilo. La

presencia de dichos aniones se comprobó también por 1H-RMN y UV-Vis.

Medio Aprótico E/ mV (Ag/AgCl)Derivado Pico I aΔEp-Fenol Pico II bΔEp-DHP

V-DHP 824 -126 1118 +58I-DHP 884 -66 1174 +114

Fenil-DHP - - 1064 -

Guayacol 950 - - -

Medio prótico pH3 Pico I aΔEp-Fenol Pico II bΔEp-DHPV-DHP 606 -70 - -

I-DHP 615 -61 939 +138

Fenil-DHP - - 880 -

Guayacol 676 - - -

Medio prótico pH11 Pico I aΔEp-Fenol Pico II bΔEp-DHP

V-DHP 181 -55 513 +65

I-DHP 135 -101 495 +87

Fenil-DHP - - 440 -

Guayacol 236 - - -

• En medio aprótico (DMSO) se atrapó el radical dihidropiridilo como

intermediario de la reacción electródica del primer proceso oxidativo para los

derivados C4-indolil sustituidos, utilizando PBN como atrapador de espín.

Basados en los valores de las constantes de acoplamiento encontradas, se

puede concluir que PBN interactuó con un radical centrado en carbono, lo que

concuerda con los resultados encontrados con los cálculos teóricos. Se

observaron cambios en el espectro ESR cuando se aplicó un potencial de pico

superior al potencial de oxidación del segundo núcleo redox de 5-Ind-DHP,

donde posiblemente el PBN atrapó un nuevo radical centrado en carbono en el

cual estaría involucrado el grupo indol. Dicho comportamiento no se observó

para 3-Ind-DHP.

No fue posible obtener los espectros de ESR para los derivados V-DHP e I-

DHP bajo las condiciones experimentales utilizadas.

• Estudios coulombiométricos en medio prótico en todo el rango de pH (2 - 12) y

en medio aprótico nos permitieron obtener el número de electrones

involucrados en ambos procesos redox. En medio aprótico: Fenil-DHP=2

electrones; 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP= 3,4 electrones (2 electrones

correspondientes a la oxidación del anillo dihidropiridínico y uno

correspondiente al indol); V-DHP e I-DHP 3,2 electrones (1 electrón

correspondiente a la oxidación del fenol y dos electrones para el proceso

oxidativo que involucra el anillo 1,4-DHP).

• En el caso de los derivados C4-Indolil-DHP se observó la formación de un

depósito azul sobre la malla de carbón vítreo utilizada como electrodo de

trabajo cuando se aplicó un potencial de oxidación mayor que el

correspondiente al segundo pico anódico y que implica la oxidación de ambos

centros redox. Se realizaron diferentes pruebas para identificar o caracterizar

este producto (HPLC, GC-MS y espectroelectroquímica), sin embargo no fue

posible obtener resultados concluyentes.

• Mediante la técnica cromatografía gaseosa acoplada a detección de masas

(GC-MS) se identificó el derivado piridínico como producto final de la reacción

de oxidación electródica del anillo 1,4-dihidropiridínico tanto en medio prótico

como aprótico.

• Así, de acuerdo a los resultados obtenidos y a datos encontrados en la

literatura[lxxxv,lxxxvi], es posible postular los mecanismos concernientes a la oxidación

electroquímica de los compuestos estudiados. Todos los compuestos en medio

acuoso, siguieron un mecanismo diferente si el medio involucrado es ácido o básico.

Así, se considera de manera independiente, la electro oxidación de ambos centros

redox. Analizando el proceso anódico que involucra la oxidación del anillo 1,4-

dihidropiridínico a piridina, se asume un mecanismo de tipo ECE (esquema 16) si la

oxidación ocurre en medio ácido y un mecanismo de disproporcionación, DISP1

(esquema 17) si el proceso oxidativo ocurre en medio básico. En medio ácido la etapa

determinante de la velocidad (edv), sería la transferencia del primer electrón de la 1,4-

DHP. En medio básico la etapa determinante de la velocidad (edv), es la

desprotonación del catión radical pridinio; lo que está de acuerdo con la dependencia

del potencial de pico obtenido por VPD con el pH del medio.

Esquema 16: Mecanismo ECE, postulado para la oxidación del anillo dihidropiridínico de los

compuestos en la zona de pH ácida (menor a 4).

N

H

R

O

O

O

OH

N

H

R

O

O

O

OH

N

H

R

O

O

O

O

N

H

R

O

O

O

O

e. d. v + e-

N

H

R

O

O

O

OH

+ H+

N

H

R

O

O

O

O

+ e-

[ ] RTF

ox eDHPkFi2

1 4,1φ∆

×−=

Esquema 17: Mecanismo DISP1, postulado para la oxidación del anillo dihidropiridínico en la zona alcalina de pH (sobre pH 8).

Aplicando la aproximación de estado estacionario para los mecanismos

anteriormente postulados de acuerdo a los esquemas 16 y 17 se tiene que los

factores que contribuyen a la corriente de pico anódica para la primera etapa

del mecanismo del esquema 16 (Corriente independiente del pH) son:

, con β=1/2

En la zona de pH alcalino, los factores que contribuyen a la corriente de pico

anódica para la segunda etapa del mecanismo del esquema 7 (Corriente

dependiente del pH) son:

En medio no acuoso, el anillo 1,4-DHP se oxidó de acuerdo al esquema 17

(ECEC).

[ ] [ ]RTF

ox eOHDHPkkkFi

φ∆

− ××−= 4,11

12

N

H

R

O

O

O

OH

N

H

R

O

O

O

OH

N

H

R

O

O

O

O

e. d. v

+ e-

N

H

R

O

O

O

OH

+ H2O+ OH-

N

H

R

O

O

O

O

N

H

R

O

O

O

OH

+

N

R

O

O

O

O

+ 1,4-DHP + H+

1,4-DHP

Esquema 18: Mecanismo ECEC, postulado para la oxidación del anillo dihidropiridínico en medio no acuoso.

En el caso de los derivados indolil sustituidos, luego de la oxidación del anillo

dihidropiridínico ocurre la oxidación del grupo indolil de acuerdo a los datos

experimentales mostrados en esta tesis. La oxidación ocurre vía 1-electrón-1

protón y es dependiente del pH del medio. En ambos medios electrolíticos se

formó un producto sobre la malla de carbono usada como electrodo de trabajo.

Por lo tanto se puede asumir que la etapa determinante de la velocidad sería la

salida del protón de la segunda etapa de acuerdo al mecanismo mostrado en el

esquema 19.

R

NH

O

O

O

O R

NH

O

O

O

Oe. d. v

+ e-

R

NH

O

O

O

O R

NH

O

O

O

O + H+

R

NH

O

O

O

O R

NH

O

O

O

O

R

NH

O

O

O

O R

N

O

O

O

O

+ e-

H H

+ H+

H

Esquema 19. Mecanismo EC, postulado para la oxidación del anillo indolil.

En el caso de los derivados de la vainillina e isovainillina, la primera

señal oxidativa corresponde a la oxidación del fenol. De acuerdo a datos

bibliográficos, la oxidación de fenoles ocurre vía 1-electrón- 1-protón para dar

como producto de la electro oxidación el derivado quinona. El mecanismo

propuesto para la oxidación de V-DHP e I-DHP en ambos medios electrolíticos

se muestra en el esquema 20, donde la etapa determinante de la velocidad

sería la deprotonación del catión radical.

N

O

O

O

O

NH

+ e-

N

O

O

O

O

NH

N

O

O

O

O

NH

e. d. v

N

O

O

O

O

N

+ H+

N

O

O

O

O

N

Producto

Esquema 20. Mecanismo EC, postulado para la oxidación del fenol.

• Los derivados sintetizados exhibieron una reactividad significativa frente a los

radicales libres estudiados de importancia farmacológica. Así, la reactividad

frente al anión radical superóxido y a los radicales alquilperoxilo ABAP-

derivados fue significativamente mayor que las 1,4-dihidropiridinas comerciales

actualmente en uso clínico a nivel mundial. La inclusión de los sustituyentes

indol y o-metoxifenol en la posición-4 del anillo 1,4-dihidropiridina potenció

significativamente la reactividad hacia los radicales estudiados. Cabe destacar

que se implementó un método indirecto para obtener las constantes de

reactividad entre los derivados y el anión radical superóxido en función de las

OH

OCH3

DHP

OH

OCH3

DHP

+ e-

OH

OCH3

DHP

O

OCH3

DHP

+ H +

O

OCH3

DHP

Quinona

e. d. v

especies aniónicas de los derivados. La reactividad frente al O2● se observó

también por VC, a través de la disminución de la razón de corrientes de anión

radical superóxido electro-generado.

• Los derivados 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP resultaron ser los más reactivos frente

al anión radical superóxido. Todos los derivados sintetizados fueron más

reactivos que las 1,4-DHPs comerciales frente a los radicales alquilperoxilo

ABAP derivados.

• Se identificó por GC/MS el derivado piridínico como producto de la reacción

entre los radicales estudiados (alquilperoxilo ABAP-derivados y el anión

superóxido) y las 1,4-DHPs.

• Los resultados electroquímicos y de reactividad fueron soportados por otras

técnicas como HPLC, espectroelectroquímica, ESR, etc.

• El estudio estructural de la geometría optimizada de los derivados mostró

diferencias claras respecto al sustituyente presente. Se calculó el potencial

anódico de la Fenil-DHP, el cual se acerca al resultado experimental.

• Los derivados presentaron acción bloquedora de los canales de calcio, siendo

en determinadas condiciones, similar a nifedipino.

7. Conclusiones.

• La inclusión de dos centros redox en una misma molécula (indol-1,4-DHP y

o-metoxifenol-1,4-DHP) afecta el comportamiento electroquímico de cada

centro comparado con los compuestos no sustituidos (Fenil-DHP, indol y

guayacol), provocando un desplazamiento en los potenciales de pico.

• La inclusión de un sustituyente indol favorece la oxidación del anillo 1,4-

DHP en medio prótico y aprótico respecto de un sustituyente fenil. La

piridina electrogenerada desplaza el potencial de oxidación del grupo indolil

respecto al indol.

• La presencia del anillo 1,4-DHP desplaza el potencial de oxidación, hacia

valores menos anódicos, del grupo fenol en los derivados V-DHP e I-DHP

respecto del guayacol. Contrario sucede con el anillo 1,4-DHP, el cual

mostró potenciales de oxidación mayores al encontrado para la Fenil-DHP.

• Los sustituyentes propuestos en el diseño de los compuestos favorecieron

la reactividad frente al anión radical superóxido y los radicales alquilperoxilo

ABAP-derivados, comparado con la Fenil-DHP, y los compuestos

comerciales: nisoldipino, nimodipino y amlodipino.

• El producto del primer proceso de oxidación (pico I) y de la reacción frente

a los radicales libres correspondió al derivado piridínico, el cual fue

identificado por GC-MS.

• De la información obtenida por cálculos de optimización de la geometría se

puede concluir que todos las moléculas presentan una estructura tipo bote.

Esta tipo de conformación es la que resulta más adecuada para los efectos

antagonistas sobre los canales de calcio.

• A partir de los ensayos farmacológicos realizados en células hipocampales,

se puede concluir que todos los compuestos tienen actividad sobre los

movimientos de calcio en dichas células.

Presentaciones a congresos.

Intern acionales

1. R. Salazar. P. Navarrete., J. A. Squella & L. J. Núñez-Vergara. “C4-Indolil 1,4-

Dihidropiridinas: Caracterización electroquímica, espectroscópica y su

reactividad con O2●. XVIII Congreso de la Sociedad Iberoamericana de

Electroquímica, SIBAE. 10 - 14 de Marzo 2008. Medellín, Colombia.

2. Ricardo Salazar. P. Navarrete., J. A. Squella & L. J. Núñez-Vergara.

“Electrochemical Characterization and Reactivity towards O2• of new 4-indolyl

1,4-dihydropyridines”. 3rd. West of Mediterranean Chemistry. (13 – 15 de Junio

2007). Montpellier, Francia.

3. Ricardo Salazar. P. Navarrete., J. A. Squella & L. J. Núñez-Vergara.

“Electrochemical Characterization of new 4-indolyl 1,4-dihydropyridines”. 57th

Annual Meeting of the Internacional Society of Electrochemistry, ISE. 27 de

Agosto al 1 de Septiembre 2006. Edimburgo, Escocia.

4. R. Salazar. M. López. P. Navarrete. L. J. Núñez-Vergara. J. A. Squella.

“Caracterización electroquímica y reactividad de 4-(4-hidroxi-3-metoxifenil) y 4-

(3-hidroxi-4-metoxifenil)-2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-1,4-dihidropiridinas”. XVII

Congreso de la Sociedad Iberoamericana de Electroquímica, SIBAE. 3 - 7 de

abril 2006. La Plata, Argentina.

a) Nacionales.

1. R. Salazar., P. Navarrete., J. A. Squella. & L. J. Núñez-Vergara. “Caracterización

electroquímica y espectroscópica de C4-Indolil 1,4-Dihidropiridinas”. XXVII

Jornadas Chilenas de Química. (20 – 23 Noviembre del 2007). Chillán, Chile.

2. R. Salazar., P. Navarrete., J. A. Squella. & L. J. Núñez-Vergara. “Reactividad de

nuevas 1,4-Dihidropiridinas frente al anion radical superóxido”. VIII Jornadas de

investigación en ciencia y tecnología (03 de Abril del 2007), Facultad de Ciencias

químicas y farmacéuticas, Universidad de Chile. Santiago, Chile

3. R. Salazar., A. Besoaín., P. Navarrete., L. J. Núñez-Vergara., J. A. Squella.

“Caracterización electroquímica en medio no acuoso de nuevas 1,4-

Dihidropiridínas y su interacción con radicales libres”. VIII Jornadas de

investigación en ciencia y tecnología (03 de Abril del 2007), Facultad de Ciencias

químicas y farmacéuticas, Universidad de Chile. Santiago, Chile

4. R. Salazar., M. López., P. Navarrete., L. J. Núñez-Vergara., J. A. Squella.

“Determinación de la Absorbilidad molar de nuevos compuestos orgánicos y su

aplicación a estudios cinéticos”. VIII encuentro de Química Analítica y Ambiental

(16 – 19 de Octubre 2006). Universidad de Arturo Prat, Iquique, Chile.

5. R. Salazar. P. Navarrete. J. A. Squella., C. Camargo., L. J. Núñez-Vergara.

“Reactividad de nuevas 1,4-dihidropiridinas con radicales alquilperoxilo”. XXVI

Jornadas Chilenas de Química (10-13 Enero 2006), Universidad de Concepción,

Concepción, Chile.

6. R. Salazar. M. López. P. Navarrete. L. J. Núñez-Vergara. J. A. Squella.

“Caracterización electroquímica de 4-(4-hidroxi-3-metoxifenil) y 4-(3-hidroxi-4-

metoxifenil)-2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-1,4-dihidropiridinas”. XXVI Jornadas

Chilenas de Química (10-13 Enero 2006), Universidad de Concepción,

Concepción, Chile.

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