PRACTICA N° 8 SEMINARIO: PCR EN TIEMPO REAL (qPCR) COMO TECNICA DE DIAGNOSTICO EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y ONCOLOGICAS

1. Prepare una tabla en la que compare las siguientes técnicas moleculares: PCR, qPCR, LCR, bDNA, TMA, Qβ Replicasa y Captura Hibrida, con respecto al tipo de amplificación, diana que utiliza como acido nucleico, el tipo de amplicon y las enzimas principales para cada tipo.

TIPIFICACION DIANA UTILIZADA TIPO DE AMPLICON

PRINCIPALES ENZIMAS

PCR Amplificación de pequeñas regiones específicas de ADN

secuencia de ADN concreta

Secuencias de ADN o ARN

Taq Polimerasa

Qpcr Se añade un componente fluorescente que permite medir la luz. A más luz, más cantidad del ADN detectado

secuencia de ADN concreta

Secuencias de ADN o ARN

Taq Polimerasa

LCR Se basa en la función de una ligasa termoestable

secuencia de ADN concreta

Secuencias de ADN o ARN

Ligasa de Thermus aquaticus

Bdna Se puede utilizar PCR competitiva o PCR cuantitativa

Secuencia de ARN viral

Secuencias de ADN

Taq Polimerasa

TMA Se estudia 1 gen (o su producto) en un gran número de tumores

Un gen en un gran número de tumores.

Secuencias de ADN o ARN

Qb REPLICASA se amplifica la sonda específica que se une a la secuencia de interés

Secuencia de interés

Secuencias de ADN o ARN

Qβ replicasa

CATURA HIBRICA Permite identificar la presencia del virus en las células y determinar el grupo al que

ARN del virus Secuencias de ADN o ARN

pertenece 2. Dos muestras de ADN, A y B, son sujetas a un experimento de qPCR en el cual se analiza el gen B- Actina. La muestra A produce un valor de Ct de 21,8. La muestra B produce un valor de Ct de 23,2. ¿Cuántas veces esta la cantidad de diana en la muestra A aumentada sobre la de la muestra B?

Se utilizó la siguiente formula 2−(ct p−ct ref )

Reemplazando en la formula

2−(23,2−21,8 )= 0,373. El kit de cuantificación absoluta para DNA humano ¨Quantifiler TM Human DNA Quantificaction Kit¨comercializado por Life Technologies para la cuantificación de muestras e DNA forenses contiene un DNA humano estándar con una concentración de 200ng/uL. El protocolo requiere que haga una serie de ocho diluciones del estándar en tampón TE(Tris/EDTA). Las muestras diluidas tendrán concentraciones de DNA de 50, 16.7, 5.56, 1.85, 0.62, 0.21, 0.068 y 0.023 ng/uL. Para cada muestra, prepara las diluciones dispensando 10uL de un tubo en el siguiente.

a) ¿Cuál es el factor de dilución necesario para preparar el primer tubo con DNA a una concentración de 50ng/uL?Usamos la formula C.V= C.V

200ngul×?=50 ng

ul×10ul=2.5

Fd= 10ul2.5ul

=4

b) ¿Cuál es el factor de dilución del segundo tubo con DNA a una concentración de 16.7 ng/ul?

200ngul×?=16.7 ng

ul×10ul=0.835

Fd= 10ul0.835ul

=11.9760

c) En que volumen el tampón TE deberían ser dispensados 10uL de la solución de DNA humano stock (a 200ng/uL) para generar el primer estándar con una concentración de DNA de 50ng/uL?

10−2.5=8.5ul

d) ¿En qué volumen tampón TE deberían ser dispensados 10uL de la dilución a 50ng/uL para preparar el segundo tubo con dilución estándar de manera que su concentración sea 16.7 ng/uL?

50ngul×?=16.7 ng

ul×10ul=3,34

10−3.34=6.66ulde tampon.e) ¿Cuáles son las diluciones que necesita hacer para preparar

toda la serie de diluciones? Dilución 50 ng/ul

200ngul×?=50 ng

ul×10ul=2,25 ul

Dilución 16.7 ng/ul.

200ngul×?=16.7 ng

ul×10ul=0.835ul

Dilución 5.56 ng/ul

200ngul×?=5.56 ng

ul×10ul=0.278ul

Dilución 1.85 ng/ul.

200ngul×?=1.85 ng

ul×10ul=0.093ul

Dilucion 0.62 ng/ul

200ngul×?=0.62 ng

ul×10ul=0.031ul

Dilucion 0.21 ng/ul

200ngul×?=0.21 ng

ul×10ul=0.0105ul

Dilucion 0.068 ng/ul

200ngul×?=0.068 ng

ul×10ul=0.0034ul

Dilucion 0.023 ng/ul

200ngul×?=0.023 ng

ul×10ul=0.0225ul