OPTIMIZACION DE UN METODO DE PCR EN TIEMPO REAL …

206 Medicina Infantil Vol. XXIII N° 3 Septiembre 2016

TRABAJOS ORIGINALES

OPTIMIZACION DE UN METODO DE PCR EN TIEMPO REAL PARA EL DIAGNOSTICO DE INFECCIONES POR MYCOPLASMA PNEUMONIAEBioqs. M. E. Venuta1, M.P. Ochoa1, C. Hernández1, M. E. Cadario2

1 Servicio de Microbiologia. Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan.2 Servicio Bacteriología Clínica.INEI-ANLIS “Dr Carlos G. Malbrán”, Buenos Aires.Recibido: 22/06/2016 — Aceptado: 06/07/2016Correspondencia: M. E. Venuta, [email protected] de los Pozos 1881. CP 1425 CABA.

RESUMENA Mycoplasma pneumoniae se lo ha descrito como causante de diversas patologías, pero la más frecuente es la neumonía de la comunidad, en la que puede asociarse a otros patógenos. Afecta pincipalmente a niños de edad escolar y adultos jóvenes, aunque en las últimas décadas es frecuente hallarlo también en niños menores de 5 años. El daño celular ocurre sobre el epite-lio de bronquios y bronquiolos por acumulación de peróxido de hidrógeno y radicales superóxido producidos durante su meta-bolismo celular. Recientemente se ha reportado que en estos eventos patogénicos también participa una citotoxina conocida como CARDS toxin (community-acquired respiratory distress syndrome) que la bacteria expresa como factor de virulencia, ya que induce una importante respuesta inflamatoria celular. Los métodos moleculares son más sensibles y rápidos que los mé-todos de diagnóstico tradicionales y se consideran de elección. No obstante, para lograr un diagnóstico óptimo, se aconseja la combinación de estos métodos junto con los serológicos. En el presente estudio se optimiza un método de PCR en tiempo real con iniciadores dirigidos a la región del gen que codifica la CARDS toxin. El método demostró ser muy sensible y rápido para el diagnóstico clínico de M. pneumoniae, con una concor-dancia қ: 0,95 con el método convencional de PCR anidada que emplea como target al gen que codifica para la citoadhesina P1. A su vez es mucho menos laborioso e implica un menor riesgo de contaminación, lo que permite el manejo de un alto número de muestras clínicas.

Palabras clave: Mycoplasma pneumoniae, CARDS toxin, PCR en tiempo real.

Medicina Infantil 2016; XXIII: 206 - 212.

ABSTRACTMycoplasma pneumoniae has been described as the cause of different infections, the most common of which is community-acquired pneumonia, possibly associated with other pathogens. Community-acquired pneumonia mainly affects school-age children and young adults, although over the past decades the disease has also been found in children under 5 years of age. Cell damage occurs on the epithelium of the bronchi and bronchioles due to accumulation of hydrogenous peroxide and superoxide radicals produced during cell metabolism. Recently, it has been reported that in these pathogenic events a cytotoxin known as CARDS toxin (community-acquired respiratory distress syndrome) participates, expressed by the bacteria as a factor of virulence, as it induces an important inflammatory cell response. The molecular methods are more sensitive and faster than the traditional diagnostic methods, and are considered the methods of choice; however, for an optimal diagnosis, a combination of these methods together with serological studies is recommended. In the current study, a real-time PCR method with markers targeted to the region of the gene encoding the CARDS toxin was optimized. The method showed to be very sensitive and fast for the clinical diagnosis of M. pneumoniae, with a қ agreement of 0.95 with the conventional nested PCR method that uses the gene encoding cytoadhesin P1 as a target. Additionally, the new method is much easier with a lower risk of contamination, which allows management of a large number of clinical samples.

Key words: Mycoplasma pneumoniae, CARDS toxin, real-time PCR.

Medicina Infantil 2016; XXIII: 206 - 212.

INTRODUCCIONMycoplasma pneumoniae es una bacteria aero-

bia estricta, que tiene como único huésped el ser humano. Es un patógeno eminentemente extra-celular, cuya supervivencia depende de una aso-ciación íntima con las células epiteliales del tracto respiratorio del hombre, mediado fundamentalmente a través de la citoadhesina P1. Se lo ha descrito como causante de diversas patologías, pero la más frecuente es la neumonía de la comunidad, en la

TO Mycoplasma set 2016.indd 206 12/09/16 05:40

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PCR en diagnóstico de infecciones por Mycoplasma 207

que puede asociarse a otros patógenos1. Si bien en algunos casos se trata de procesos autolimitados, muchas veces requieren hospitalización y en ese sentido, es particularmente relevante la neumonía en pacientes inmunocomprometidos, donde se han reportado casos fulminantes2. Afecta pincipalmente a niños en edad escolar y adultos jóvenes, aunque en las últimas décadas es frecuente hallarlo también en niños menores de 5 años con presentaciones clínicas diferentes3. Aproximadamente un 25% de individuos infectados con M. pneumoniae pueden presentar complicaciones extrapulmonares a dife-rentes tiempos respecto del comienzo de los sínto-mas respiratorios e incluso en ausencia de ellos. Si bien muchos de estos casos se deben a reacciones de autoinmunidad, el uso de métodos moleculares demostró al menos la presencia de material gené-tico de estos microorganismos en diversos tejidos y líquidos biológicos4.

La transmisión es de persona a persona a través de aerosoles esparcidos por la tos y la necesidad de un contacto estrecho y continuado hace que las infecciones se den con mayor frecuencia en el ám-bito familiar, guarderías o colegios. El daño celular ocurre sobre el epitelio de bronquios y bronquiolos por acumulación de peróxido de hidrógeno y radica-les superóxido producidos durante su metabolismo celular, ocasionando ciliostasis y destrucción del epitelio con inflamación peribronquial y perivascu-lar5. Recientemente se ha reportado que en estos eventos patogénicos también participa una citotoxi-na conocida como CARDS toxin (community-acqui-red respiratory distress syndrome) que la bacteria expresa como factor de virulencia, ya que induce una importante respuesta inflamatoria celular6.

Aunque M. pneumoniae se considera agente pa-tógeno y no comensal, se sabe que hay infecciones asintomáticas y que, tras una infección aguda, la bacteria puede tardar semanas o incluso meses en ser eliminada de la vía respiratoria7. La prevalencia real de la portación asintomática en niños sanos es desconocida. Mientras que algunos estudios han detectado tasas bajas de portación (0,1-13%) en individuos sanos, otros autores han observado que es infrecuente aún durante el curso de un brote8,9. La infección se puede adquirir varias veces a lo largo de la vida, lo que depende de variaciones en las proteínas de la superficie bacteriana5,10.

Dentro de los métodos de diagnóstico, el cultivo tiene 100% de especificidad, pero es lento, complejo y los requerimientos de esta bacteria hacen que su sensibilidad sea extremadamente baja y depende de la calidad del laboratorio y de la muestra (<60%)11. La detección de antígenos también es poco sensible e incluso produce reacciones cruzadas. Los méto-dos serológicos tienen el inconveniente de requerir muestras en fase aguda y convalesciente, de poco valor para el manejo del paciente y en la mayoría de

los casos, difíciles de obtener. Además, presentan el problema de su uso en pacientes inmunodeprimi-dos que a veces no pueden generar una respuesta inmunológica medible. Por otra parte, en adultos, la exposición repetida puede anular la respuesta inmune generando resultados falsamente negativos. No obstante, la determinación de IgM en pediatría tendría una buena correlación con infección aguda por M. pneumoniae12,13. Hay que tener en cuenta que los anticuerpos pueden aparecer recién después de dos semanas del comienzo de los síntomas y que se pueden generar reacciones cruzadas con otros micoplasmas11. Por último, los métodos moleculares son rápidos, altamente específicos y sensibles, de-tectan ADN o ARN de M. pneumoniae en muestras clínicas por PCR convencional o en tiempo real. Existen diferentes blancos (targets); el más emplea-do con fines diagnósticos es el gen P1 que codifica para una proteína citoadherente inmunodominante específica y actualmente también la región del gen que codifica para la CARDS toxin. Estos métodos tienen la ventaja de no requerir bacterias viables y son aplicables a pacientes de cualquier edad y condición (niños, ancianos, inmunodeprimidos, etc.) con primoinfección o reinfección14,15,16.

En la actualidad, el diagnóstico óptimo de es-tas infecciones aconseja el empleo de los métodos moleculares conjuntamente con los serológicos, los cuales permiten la confirmación etiológica, si bien frecuentemente de modo retrospectivo17.

El objetivo de este trabajo fue optimizar un méto-do de PCR cualitativa en tiempo real para el diagnós-tico de infecciones producidas por M. pneumoniae e implementarlo en lugar del ensayo de PCR anidada convencional que utilizamos en la actualidad en el Servicio de Microbiología. Esto se hizo con el fin de lograr mayor rapidez y practicidad en el diagnóstico de este agente en muestras clínicas provenientes de pacientes pediátricos ya que representa una de las determinaciones con alta demanda en nuestro laboratorio.

MATERIALES Y METODOSPara la detección genómica de M. pneumoniae

por el método de PCR en tiempo real, se decidió trabajar con iniciadores dirigidos a la región del gen que codifica para CARDS toxin, de acuerdo al trabajo publicado por Thurman et al.16, en formato duplex. Esto se realizó junto con la determinación del gen constitutivo RNAsa P como control interno endógeno, para controlar la calidad y la ausencia de inhibidores en la muestra.

Una vez optimizado el método, se realizó la vali-dación del mismo ensayando muestras clínicas res-piratorias en forma simultánea junto con el método de PCR anidada convencional actualmente utilizado en nuestro servicio para el diagnóstico de este pa-tógeno, como método de referencia14.




Para el análisis de los resultados obtenidos se utilizó el programa estadístico SPSS y la compara-ción entre los métodos de PCR anidada y RT-PCR se realizó mediante el test de concordancia Kappa de Cohen: κ18, con un nivel de significación p < 0,05.

La interpretación del valor de κ se realizó según la siguiente escala: pobre = < 0,20; débil = 0,21-0,40; moderada = 0,41-0,60; buena = 0,61-0,80 y muy buena = 0,81-1,0019.

Extracción de ácidos nucleicosSe utilizó el método comercial de QIAamp DNA

Mini Kit (QIAGEN) siguiendo el protocolo de purifi-cación de tejidos, según las instrucciones del fabri-cante. El ADN obtenido se resuspendió en 100 µl de tampón de elusión y se conservó a – 20 ºC hasta la realización del ensayo. El ADN se cuantificó en un fluorímetro ND-1000 (Nano Drop) utilizando 1 µl del extracto purificado.

Tipo de muestrasPara optimizar la concentración de iniciadores

(primers) y sondas (probes) empleados, se realizó el ensayo en formato simple (singleplex) y múltiple (multiplex) para M. pneumoniae y RNAsaP, utilizan-do 7 extractos de ácidos nucleicos conservados a –20ºC, provenientes de muestras clínicas respirato-rias que habían arrojado un resultado positivo con el método de PCR anidada convencional.

Para establecer los parámetros de sensibilidad, rango lineal y eficiencia de la reacción, se emplea-ron dos tipos de muestras. Por un lado se utilizó una suspensión de M. pneumoniae ATCC 15531 proveniente de un cultivo en agar PPLO (A), y por otra parte se empleó un pool de extractos de ADN purificados de muestras respiratorias clínicas posi-tivas por PCR anidada (B).

PCR en tiempo realEl ensayo se realizó utilizando un equipo de de-

tección ABI PRISM™ 7500 de Applied Biosystems, con detección simultánea de dos fluoróforos dife-

rentes (FAM para la secuencia blanco y VIC para el gen RNAsa P) en un volumen de reacción de 25 µl que contenía: 2x Taqman Universal PCR Master Mix (con dUTP y AmpErase UNG, además de ROX como referencia pasiva de fluorescencia) de Applied Biosystems, con 5 µl ADN como templado.

Se emplearon las condiciones de ciclado uni-versal: 2 min. a 50ºC (para la degradación de am-plicones contaminantes potencialmente presentes, que podrían contener dUTP), 10 min. a 95ºC (para la inactivación de la uracil N’- glicosilasa o UNG y activación de la AmpliTaq Gold ADN polimerasa) y 45 ciclos de 15 seg. a 95ºC y 1 min. a 60ºC (para la amplificación de la secuencia blanco específica). Se definió como línea de base o threshold line (th) un valor de 0,1 para ambos blancos, a partir de la cual la fluorescencia generada se considera específica.

PCR anidadaDicho método es el actualmente empleado en

nuestro servicio para el diagnóstico de M. pneu-moniae. Es una modificación del método descrito por Talkington et al.14 que emplea como blanco el gen que codifica la citoadhesina P1 y genera un producto de amplificación de 107 bp, visualizado en UV luego de una corrida electroforética en gel de agarosa al 2% en TBE 1X, con una sensibilidad del orden de las 40 copias genómicas.

Optimización de la PCR en tiempo realSe optimizó la reacción empleando la mínima

concentración de iniciadores y sonda que en el en-sayo multiplex arrojó un valor similar de Ct (ciclo de amplificación en el cual la fluorescencia generada en la reacción cruza una línea de base) al obteni-do en el ensayo singleplex para ambos targets. Se detalla a continuación la secuencia de iniciadores y sonda fluorescentes (TaqMan®), como así también las concentraciones finales optimizadas para cada uno de ellos. Tabla 1.

Para la construcción de las curvas estándar se procedió a realizar 7 diluciones seriadas al décimo

TABLA 1: SECUENCIA DE INICIADORES Y SONDA FLUORESCENTES (TAQMAN®) Y CONCENTRACIONES FINALES OPTI-MIZADAS PARA CADA UNO DE ELLOS.

Gen blanco Primer/Probe

Secuencia de primer 5´→3´ Producto (bp)

Multiplex Primer / Probe Conc. final

(nmol/l)

CARDS toxin

MP181-F TTT GGT AGC TGG TTA CGG GAA T

73700

MP181-R GGT CGG CAC GAA TTT CAT ATA AG

MP181-P* FAM-TGT ACC AGA GCA CCC CAG AAG GGC T-TAMRA 250

RNAsaP

RNAsaP-F AGA TTT GGA CCT GCG AGC G

6250

RNAsaP-R GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT

RNAsaP-P* VIC-TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG-TAMRA 50




con agua ultrapura, libre de DNasa-RNasas de las dos muestras utilizadas para tal fin. A saber, con la muestra A se realizó la PCR en tiempo real en formato singleplex en un rango de concentración entre 27.5 ng/tubo a 27.5 fg/tubo, mientras que con la muestra B el ensayo se realizó en formato multi-plex en un rango de concentración de 212 ng/tubo a 212 fg/tubo. Ambas reacciones se realizaron por triplicado durante 3 días consecutivos con las con-diciones anteriormente descritas. Como controles negativos, se emplearon tubos que contenían todos los componentes de la mezcla de reacción y agua como templado.

En el análisis de las curvas se tuvieron en cuenta los siguientes parámetros:• Pendientede lacurva (slope): se utiliza para

evaluar la eficiencia de la reacción.• Coeficiente de regresión r: ofrece un control

de la adecuada distribución lineal de la curva.• Intercepción(Y-intercept): se utiliza para eva-

luar la sensibilidad de la reacción. Mientras me-nor sea el valor de Ct en la ecuación de regre-sión, mayor será la sensibilidad del sistema.Para conocer el límite de detección del ensayo,

se realizaron tres diluciones seriadas al medio lue-go del último punto en que se detectó ADN de M.

pneumoniae con valores similares de Ct tanto para la muestra proveniente de la cepa ATCC 15531 en formato singleplex, como para la proveniente del pool en formato multiplex. Todas las diluciones se analizaron por triplicado en tres días consecutivos y en las condiciones descritas anteriormente.

RESULTADOSEn las Figuras 1, 2 y 3 se observan las curvas de

amplificación obtenidas con los dos tipos de mues-tras ensayadas y el gráfico de sus respectivas cur-vas estándar considerando los Ct promedio de cada una de las réplicas correspondientes a cada una de las concentraciones de ADN utilizadas.

. DISCUSION

De acuerdo a los resultados obtenidos podemos observar que el ensayo de PCR en tiempo real en formato singleplex, para la muestra de ADN a partir de la cepa de M. pneumoniae ATCC 15531, demos-tró un rango lineal (r2= 0,997) en seis magnitudes de concentración (rango de 27,5 ng/tubo a 275 fg/tubo) con una eficiencia del 100% ( slope = -3,28) y con Y-Intercept de 24,08, para el gen de CARDS toxin.

Por otra parte, los resultados obtenidos del ensa-yo de RT-PCR en formato multiplex para la muestra

Conc DNA (ng/tubo) Log 10 DNA Ct promedio M. pneumoniae ATCC 15531

27,5 1,439 19,8

2,75 0,439 22,3

0,275 -0,561 25,6

2.75x10-2 -1,561 29,2

2.75x10-3 -2,561 32,7

2.75x10-4 -3,561 35,8

2.75x10-5 ND ND

Figura1: Curva de amplificación de la PCR en tiempo real singleplex para CARDS toxin en ABI 7500 y la curva estándar obtenida para las diluciones de la cepa de Mycoplasma penumoniae ATCC 15531. En la tabla se indica el rango de las con-centraciones de ADN ensayadas con los Ct promedio para cada una de ellas. ND: no determinado.




de ADN a partir del pool de extractos positivos, de-mostró un rango lineal (r2

= 0,999) en 4 magnitudes de concentración (rango de 212 ng/tubo a 212 pg/tubo) para el gen de CARDS toxin mientras que para el gen de RNasa P se observó un rango li-neal (r2

= 0.993) en 6 magnitudes de concentración

(rango de 212 ng/tubo a 2,12 pg/tubo). Para ambos blancos se obtuvo una eficiencia del 90% (slope = -3,6), con Y-Intercept de 33,9 para CARDS toxin y de 31,9 para RNasa P.

Se determinó como límite de detección LOD, a la más baja dilución en la que >50% de los replicados

Figura 2: Curvas de amplificacion de PCR en tiempo real para CARDS toxin de Mycoplasma pneumoniae y RNasa P del ensayo, en formato multiplex en ABI 7500 provenientes de las diluciones del pool de extractos positivos.

Conc. ADN ng/tubo Log10 ADN Ct promedio M. Pneumoniae Muestra pool Ct promedio RNAsa P

212 2,33 25,5 23,4

21,2 1,33 29,1 27,0

2,12 0,33 32,7 30,8

2,12x10-1 - 0,67 36,5 34,7

2,12x10-2 -1,67 ND 38,7

2,12x10-3 -2,67 ND 40,7

2,12x10-4 -3,67 ND ND

Figura3:Rango de concentraciones de ADN total de las diluciones ensayadas provenientes del pool de extractos con sus correspondientes Ct promedio y las curvas estándar de Mycoplasma pneumoniae y RNAsa P de la PCR en tiempo real mul-tiplex en ABI 7500. ND: no determinado.




tenían valores de Ct positivos. Este LOD fue de 68 fg de ADN para la cepa de M. pneumoniae ATCC (RT-PCR singleplex) y de 53 pg de ADN genómico total para el pool de extractos (RT-PCR multiplex).

Al comparar los diferentes parámetros de las curvas estandares construidas en el presente tra-bajo con respecto a los obtenidos por los autores del protocolo original, se observó que los valores relacionados con la eficiencia de la reacción (s) y el coeficiente de regresión (r) se encontraban dentro de los valores aceptables y eran muy similares a los de referencia. Al respecto, debe tenerse en cuen-ta que se modificaron los marcajes en las sondas y se introdujeron modificaciones en la plataforma empleada.

Considerando los buenos resultados obtenidos en el presente estudio, se procedió a realizar la validación del método, para lo cual se analizaron en forma simultánea 200 muestras clínicas respirato-rias de pacientes pediátricos con sospecha de infec-ción por M. pneumoniae, tanto ambulatorios como internados en el Hospital de Pediatría Garrahan por la metodología de PCR anidada convencional y la metodología de PCR en tiempo real aquí descrita.

De un total de 200 muestras, 36 de 38 y 161 de 162 fueron positivas y negativas por ambos métodos respectivamente (Tabla 2); con estos resultados se obtuvo un índice Kappa de 0,95 (Tabla 3) con el cual se determina una muy buena correlación entre los métodos evaluados. En las muestras positivas se observó un rango de Ct para M. pneumoniae de 17,4 a 43,5 con un Ct promedio de 32,6 y para RNasa P un rango de 21 a 33,1 con un Ct promedio de 25,9. En las muestras negativas el rango de Ct para RNasa P fue de 21 a 35 con un Ct promedio de 25,7.

De acuerdo a los resultados obtenidos, una mues-tra se considera negativa para M. pneumoniae cuan-do no hay un incremento en el signo de fluorescencia dentro de los 45 ciclos de la reacción y para validarla como tal, el Ct de RNasa P debe ser ≤ 35, mientras que se considera positiva toda muestra que arroje un Ct<44 para el gen de CARDS toxin independien-temente del Ct obtenido para la RNasa P.

Los métodos moleculares son más sensibles y más rápidos que los métodos diagnósticos tradicio-nales en obtener resultados y en general presentan muy buena especificidad. Por ello, estos métodos se consideran de elección ya que tienen un potencial importante para reducir “la brecha diagnóstica” y colaborar en la orientación terapeútica. No obstante, para lograr un diagnóstico óptimo se aconseja la combinación de estos métodos junto con los sero-lógicos (IgM e IgG) tal como lo señalan recientes publicaciones13, 17.

El método de PCR en tiempo real aquí optimi-zado, utilizando como blanco el gen que codifica para la CARDS toxin, demostró ser muy sensible y rápido para el diagnóstico clínico de M. pneumo-niae, con una concordancia қ: 0,95 con el método convencional de PCR anidada, que emplea como blanco al gen que codifica para la citoadhesina P1. A su vez es mucho menos laborioso y presenta un menor riesgo de contaminación, lo que permite el manejo de un alto número de muestras clínicas.

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PCR anidada

Negativo Positivo Total

RT-PCR

Negativo Recuento 161 2 163

% del total 80,5 1,0 81,5

Positivo Recuento 1 36 37

% del total 0,5 18,0 18,5

Total Recuento 162 38 200

% del total 81,0 19,0 100

TABLA 2: TABLA DE CONTIGENCIA DE LOS RESULTADOS POR METODOLOGIA DE PCR NESTED VS REAL TIME PCR PARA EL GEN CARDS TX DE MYCOPLASMA PNEUMONIAE.

TABLA 3: INDICE DE CONCORDANCIA KAPPA.

Medidas simétricas

Valor Error típ.

asint.a

T aproximada

Significación aproximada

Medida de acuerdo Kappa

0,951 0,028 13,448 0,000

N° de casos válidos

200

a. Error típico asintótico asumiendo la hipótesis alternativa.b. Empleando el error típico asintótico basado en la hipótesis nula.




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