Prctica 1: Separacin de pigmentos foliares. Anatoma foliar

Extraccin y separacin de pigmentos foliares

En esta prctica vamos a separar pigmentos foliares, de esta manera podremos clasificar la planta y mediante la cromatografa podremos saber qu tipos de pigmentos tiene. El principal objetivo es saber distinguir si la planta posee carotenos, clorofila y antocianina dependiendo de los colores obtenidos. Posteriormente lo someteremos a una lmpara incandescente y observaremos su fluorescencia. Procedimiento y resultados

1. Homogenizar el tejido vegetal en un mortero con 20 ml de etanol al 95%, aadindole una pizca deCO3Ca para neutralizar los tejidos cidos y prevenir la prdida parcial de Mg2+ de las clorofilas.

2. Filtrar a travs de papel de filtro en un embudo. La solucin

resultante contiene una mezcla de pigmentos (clorofila a y b, diversos carotenoides, etc) y numerosas molculas incoloras solubles en etanol.

3. Para realizar la cromatografa en papel, tomar una pequea fraccin del extracto y ponerlo en la placa Petri. Depositar sobre ella un trozo de papel de filtro en forma de "V" tumbada. Esperar a la separacin de los pigmentos por cromatografa.

4. Tomar 5 ml del extracto y ponerlo en un tubo de ensayo limpio. Aadir 5 ml de ter de petrleo, agitar para mezclarlo bien y esperar a que se produzca la separacin de dos fases de distinto color.

Xantofilas

Carotenoides

Clorofila a

Clorofila B

5. Ayudndonos de la pipeta Pasteur, recoger la capa superior (fase etrea) que contiene las clorofilas y poner en un nuevo tubo de ensayo. En la capa inferior (etanol) han quedado los carotenoides.

6. Aadir 5 ml de metanol acuoso al 92% v/v y mezclar. Esperar a la separacin de dos fases, una superior de un tono ms intenso y que corresponde a la clorofila a, mientras que en la inferior permanece la clorofila b.

Fase etrea (Clorofilas)

Carotenoides

En el foco de luz comprobamos cual de los tubos de ensayo presenta color rojizo, y vemos que el que tiene clorofila a (1 tubo) es el que desprende cierto color rojizo.

Cuestiones Por qu las plantas son verdes?

Clorofila a

Clorofila b

Porque contienen clorofila. La clorofila es verde porque es capaz de absorber la luz violeta, roja y azul, y reflejar la verde. Por qu se produce la distribucin cromatogrfica obtenida de los pigmentos? Se produce debido a que aquellos que tienen una mayor afinidad con el etanol tienden a ascender con mayor velocidad que los dems. El grosor de las bandas depende de la cantidad del pigmento en la disolucin. A qu se debe el fraccionamiento de los pigmentos en los distintos disolventes orgnicos? Es debido a la distintas polaridad y afinidad de los distintos disolventes orgnicos con los pigmentos. Cmo explicaras el resultado obtenido en el experimento de fluorescencia? Se produce a que la clorofila cuando es expuesta a la lmpara absorbe rojo y azul que no puede transmitirlo para realizar la fotosntesis y por tanto lo desprende en color rojizo. Qu te sugieren estas imgenes? Imagen 1 Esta imagen es una representa una molcula de clorofila. La estructura de las molculas de clorofila tiene dos partes: un anillo de porfirina y una cadena larga llamada fitol. El fitol es una cadena hidrocarbonada con carcter hidrfobo. La cadena del fitol sirve para anclar la molcula de clorofila en la estructura anfiptica de los complejos moleculares en que residen las clorofilas. El color verde de la clorofila es debido a la absorcin de luz realizada por aquellas molculas que contienen dobles enlaces. Imagen 2

Esta imagen corresponde a la de un cloroplasto. A ste le est llegando la luz solar siendo absorbida por la clorofila que la refleja en forma de radiacin verde. Imagen 3. En esta imagen vemos como los pigmentos de clorofila (a y b) y carotenos tienen una mayor absorbancia de la radiacin de onda corta que de la radiacin de onda larga. Qu ocurrira si iluminas a una planta nicamente con luz monocromtica de longitud de onda 525 nm. ?

Que la planta no absorbera a penas nada de luz y emitira su color verde habitual. Glosario: Pigmento: Un pigmento es una sustancia que refleja un color de luz diferente al color de la luz absorbida. Cloroplasto: Los cloroplastos son los orgnulos celulares que en los organismos eucariontes fotosintetizadores se ocupan de la fotosntesis. - Cromoplasto. Los cromoplastos son un tipo de plastos, orgnulos propios de la clula vegetal, que almacenan los pigmentos a los que se deben los colores, anaranjados o rojos, de flores, races o frutos. Cromoplasto: Son un tipo de plastos, orgnulos propios de la clula vegetal, que almacenan los pigmentos a los que se deben los colores, anaranjados o rojos, de flores, races o frutos. Carotenoides: Los carotenoides son pigmentos orgnicos del grupo de los isoprenoides. Su color, que vara desde amarillo plido, pasando por anaranjado, hasta rojo oscuro, se encuentra directamente relacionado con su estructura.

Antocianinas: Las antocianinas son pigmentos hidrosolubles que se hallan en las vacuolas de las clulas vegetales y que otorgan el color rojo, prpura o azul a las hojas, flores y frutos. Cromatografa: Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Espectro de absorcin: muestra la fraccin de la radiacin electromagntica incidente que un material absorbe dentro de un rango de frecuencias. Fluorescencia: es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energa en forma de radiaciones electromagnticas y luego emitir parte de esa energa en forma de radiacin electromagntica de longitud de onda diferente.

Observacin de la anatoma foliar

Relacin con el metabolismo fotosinttico

Materiales.

Hojas de plantas C3 , C4 y CAM Portas y cubres Bistur Microscopio Agua destilada

Procedimiento experimental.

1. Realizar cortes transversales de tres tipos de hojas, intentado hacer

dichos cortes lo ms finos posibles para una optima observacin a

travs del microscopio. Para cortar la hoja de la planta C4 se

utilizar un trozo apical del tallo, en el que se encuentran varias

hojas enrolladas (hojas amplexicaules), o se doblarn las hojas en

varias partes para incrementar la superficie de corte.

2. Una vez realizados los cortes sern montados en el porta con una

gota de agua, se coloca el cubre y se realizar la observacin.

Resultados.

Observacin CAM:

Estas plantas tienen dos carboxilaciones separadas temporalmente:

Fijacin nocturna de CO2. Esta primera fase se da en la noche, cuando tienen los estomas abiertos. A travs de ellos la planta capta CO2 atmosfrico y la fosfoenolpiruvatocarboxilasa lo incorpora por carboxilacin al fosfoenolpiruvato que se transforma en oxalacetato, se desprende un grupo forfato; el oxaloacetato formado de la prefijacin de CO2 es reducido en el citosol a malato mediante la NAD-malato deshidrogenasa, el malato es bombeado con gasto de energa a las vacuolas, donde se va acumulando como cido mlico y es almacenado, provocando que el contenido vacuolar sea muy cido (cerca de pH 3) durante la noche.

Con la salida del sol, los estomas se cierran previniendo la prdida de agua e impidiendo la adquisicin de CO2. El cido mlico sale de la

Epidermis

Clornquima

Haz vascular

vacuola y se descarboxila liberando el CO2 y cido pirvico el cual es devuelto al ciclo tras ser fosforilado con ATP, produciendo nuevamente fosfoenolpiruvato. Ya que los estomas estn cerrados, el CO2 liberado internamente no puede escapar de la hoja y en lugar de esto es reducido a carbohidrato por la operacin del ciclo C3 PCR. La concentracin elevada en el interior de CO2 suprime efectivamente la oxigenacin-fotorrepiratoria de la ribulosa 1-5 bifosfato y favorece la carboxilacin.3

Este mecanismo de concentracin de CO2 permite disminuir la probabilidad de que entre un O2 en el sitio activo de la RuBisCO por lo que la eficiencia fotosinttica es mayor. Las plantas CAM suelen ser crasas (no todas) y relegadas a ambientes secos (tambin existen CAM acuticas); esto es debido a su bajo rendimiento total fotosinttico (ya que la absorcin de dixido de carbono est limitado a la cantidad de MA que se puede almacenar en la vacuola) por lo que son malas competidoras con las plantas C3 o C4. Existen plantas CAM constitutivas o adaptativas (estas ltimas slo tienen metabolismo cido de crasulceas bajo estrs hdrico, etc.).

Estas plantas resuelven el problema de prdida de agua durante la fotosntesis al abrir sus estomas solo durante la noche cuando la temperatura es menor y la humedad del ambiente es comparativamente alta

Observacin C3

Las plantas denominadas C3 en el haz encontramos una capa de clulas aplanadas que conforman la cutcula, tiene una funcin protectora, por el envs, entre estas clulas se sitan las clulas guardia que dejan espacios, los estomas por donde ingresa y salen fluidos como el CO2, una fila de clulas vegetales alargadas conforman el parnquima en empalizada, cada una de las clulas que conforman el parnquima se encarga de realizar fotosntesis. El metabolismo C3 es una serie de reacciones en las cuales participan gran cantidad de molculas y enzimas para finalmente obtener los carbohidratos necesarios para la nutricin y algunos compuestos de desecho. El ciclo de Calvin es tambin llamado ciclo C3, ya que aqu por medio del ATP y NADPH formado en la primera etapa de la fotosntesis (fase lumnica), es utilizado para la fijacin del CO2, en un compuesto de tres tomos de carbono, el 3-Fosfoglicerato, proceso el cual ocurre en una segunda etapa de la fotosntesis, denominada fase oscura. En esta reaccin bioqumica toma gran relevancia una enzima rubisco que combina una molcula de CO2 con el material de partida, un azcar de

Epidermis

Mesfilo

cinco carbonos llamado RIbulosa-1,5-bifosfato, obteniendo as dos molculas de 3-fosfoglicerato.

Observaciones C4:

Clulas buliformes

Haz vascular

Vaina mestomtica

Clornquima

El proceso de metabolismo consiste en la captacin del dixido de carbono en las clulas del mesfilo de la planta pero el CO2, en vez de utilizarse inmediatamente en el ciclo de Calvin, reacciona con el fosfoenolpiruvato (PEP) gracias a la catlisis de la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa. El producto final de la reaccin entre el PEP y el CO2 es el oxalacetato, que posteriormente se convierte en malato. El malato se transporta hacia las clulas de la vaina, donde es descarboxilado, produciendo el CO2 necesario para el ciclo de Calvin, adems de piruvato. Este ltimo pasa nuevamente al mesfilo donde se transforma por medio de ATP en fosfoenolpiruvato, para quedar nuevamente disponible para el ciclo. La ventaja de este proceso radica en el hecho de que al estar la rubisco encerrada en las clulas de la vaina se le impide la posibilidad de que reaccione con oxgeno en situaciones en las cuales la concentracin de CO2 sea muy baja, por lo cual se reduce considerablemente la prdida de energa y de CO2 a travs de la fotorrespiracin. Incluso las molculas de dixido de carbono generadas por la fotorrespiracin se reutilizan a travs del PEP, que captura aquellas en el mesfilo para que ingresen al ciclo de Calvin.

Qu te sugieren estas imgenes? Imagen 1 Es una planta de tipo CAM. Las cuales son ms eficientes. Imagen 2 Es una planta de tipo C4 y son las ms productivas. Imagen 3 Es una planta de tipo C3, son las ms abundantes y estn en climas hmedos y templados. Imagen 4 Es una planta de tipo C4, son las ms productivas. Qu ventajas ofrece cada metabolismo? Las tipo CAM son ms eficientes, las C4 son las ms productivas y las C3 son las ms abundantes. Glosario Metabolismo: es el conjunto de reacciones bioqumicas y procesos fsicoqumicos que ocurren en una clula y en el organismo. Fotosntesis: es la conversin de materia inorgnica en materia orgnica gracias a la energa que aporta la luz. Parnquima: tejido vegetal constituido por clulas de forma aproximadamente esfrica o cbica y con espacios de separacin. Clulas del haz: cara superior de la hoja, normalmente ms brillante y lisa, y con nervadura menos patente que en la cara inferior o envs. Clulas de la vaina: ensanchamiento del pecolo o de la hoja que envuelve el tallo.

Metabolismo cido de Crasulceas (CAM): el nombre de metabolismo cido hace referencia a la acumulacin de cidos orgnicos durante la noche por las plantas que poseen este mecanismo de fijacin de carbono. Esta va metablica es semejante a la va C4, sin embargo en la va CAM la separacin de los dos carboxilaciones no es espacial, como ocurre en las plantas C4, sino temporal. Carboxilacin: este mecanismo de concentracin de dixido de carbono permite disminuir la probabilidad de que entre un O2 en el sitio activo de la rubisco por lo que la eficiencia fotosinttica es mayor. Descarboxilacin: es la reaccin qumica en la cual un grupo carboxilo es eliminado de un compuesto en forma de dixido de carbono (CO2).

David Martnez Requena Grupo 2